JPH07506843A

JPH07506843A - 小動物の転移モデル

Info

Publication number: JPH07506843A
Application number: JP6519967A
Authority: JP
Inventors: ナミカワ，レイコ; キョーイズミ，セイシ; シュティベルマン，エミリア; マクセン，ジョセフ　エム．
Original assignee: システミックス，インコーポレイティド
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 1995-07-27
Also published as: KR950701230A; EP0652777A4; EP0652777A1; CA2134110A1; US5643551A; AU669975B2; WO1994020147A1; AU6031594A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】小動物の転移モデル回正１ゑ肝歴校対工玉湘上、髪皿この出願は、１９９３年３月４日提出の米国特許出願第０８１０２７．１４８号の一部継続出願である。

庄−輪挟止分野本発明の分野は、異種移植からなる免疫無防備化哺乳動物、および転移の分析におけるそれらの使用に関する。

背−員現役の腫瘍学者が直面する最も重大な問題の１つは、−次部位から多数の遠隔部位への悪性腫瘍細胞の転移である。手術は一次腫瘍に対してしばしば有効であるが、癌が転移している場合すべての悪性組織を切除することができない。

！Ｉｌ瘍の転移のメカニズムを理解することを目的とした現在の研究は、モデル系として薩歯類の新生物を使用してきている。道徳的および倫理的理由で生体内のヒト新生物を実験的に研究することは不可能であった。ヒト悪性細胞をヌードマウスの皮下部位の中に移植するヘテロ移植系を研究する試みがなされてきているが、それらは転移腫瘍をめったに生成しない。

しかしながら、最近の研究は異種移植における移植部位の重要性を示した。ヒト腫瘍をヌードマウスの正しい解剖学的部位の中に（例えば、腎臓癌細胞を腎臓の中に、あるいは結腸癌細胞を肺臓または盲腸の中に）移植するとき、転移が生成することがある。これが示唆するように、悪性細胞と取り囲む環境との間の相互作用は転移活性を調節することができる。

悪性細胞が増殖しそしてヒト器官系の間を動くことができる、ヒト腫瘍のための動物モデルを準備することが望ましい、これは、コントａ−ルされた、再現性ある条件下の抗転移薬物および治療の評価を可能とする。

皿仮エエ文猷８１６　ｙ４色腫細胞の分離および転移特性は、Ｂｒ１ｌｅｓおよびＫｏｒｎｆ　１ｅｌｄ。

Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｉｎ５ｔ、、　６０＋　１２１７　（１９７８）に記載されている。この細胞系の侵入性変異型の論考は、１．　Ｈａｒｔ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、＋　９７゜５８７−６００　（１９７９）、およびＧ、　Ｐｏ５ｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　４０＋　１６３６−１６４４　（１９８０）に記載されている。

結腸直腸の癌の転移特性はＲ，Ｇｉａｖａｚｚｉ　ら（１９８６）、　Ｒ，Ｂｒｅｓａｌｉｅｒら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３９．６２５−６３０　（１９８６）中で論考されており、そし、て転移の変異型の選択はに、門ｏｒｉｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　４８＋１９４３−１９４８　（１９８８）、およびに、　Ｍｏｒｉｋａｗａ　ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　４８＋６８６３−６８７１　（＋９８８）　（７）中に見出される。

Ｘ、　Ｆｕ　ら、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　８８゜９３４５−９３４９　（１９９１）は、完全な患者の検体で正常位的に構成されたヌードマウスにおけるヒト転移結腸癌のモデルを記載している。

ヌードマウスおよびシンド（ｓｃｉｄ）マウスにおけるヒト腫瘍の増殖のための他のモデルは、Ｓ、　Ｎａ１ｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６．４１０９−．４１１５　（１９８６）、１．　Ｆｉｄｌｅｒ　ら、Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ＋　９＋１４９−１６５　（１９９０）、およびＢ、　Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　５１＋　２１９３−２１９８　（１９９１）　；　Ｇｉａｖａｚｚｉ　ら、前掲、４６．１９２８−１９３３　（１９８６）　；Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４８．６８６３６８７１　（１９８Ｂ）の中に見出すことができる。

溌１しり【ｈ実験条件下にヒト腫瘍細胞の転移を開始するための方法、組成物および動物が提供される。これにより、転移に関連する現象を評価して、転移の事象に対する予防的および治療的の両者の因子および／または条件を決定することができる。

非ヒト補乳動物は、免疫無防備化されており、そしてヒト転移細胞とコロニー化することができるヒト異種器官または組織を有することによって特徴づけられる。正常のヒト組織を移植した後、腫瘍細胞をキメラ動物の中に導入する６次いで、腫瘍は、ヒト宿主におけるように、増殖しそして転移することができる。

豊足■焦盪■豆凱免疫無防備化哺乳動物が生存可能なヒト異種組織を有する、方法、組成物および動物を準備する。健康な正常のヒト組織は、新生物および転移の事象の進行の発生を可能とするヒト！１ｍ瘍細胞のための増殖環境を提供する。とくに宿主に適用される治療、および腫瘍の増殖および転移に対して向けられた薬物をコントロールしたかつ再現性ある方法で評価することができる。また、転移のメカニズムおよび転移のプロセスにおいである役割を演する分子を研究することができる。

所望の免疫無能力を有する免疫無防備化哺乳動物宿主は存在するか、あるいはつくることができる。有意な因子は、免疫無防備化宿主が異種＆Ｉｌ織または細胞に対して免疫応答を自然に、あるいは導入された器官と組み合わせて、マウントすることができないことである。したがって、宿主が免疫無防備化されているが、移植後、コンピテントＢ細胞、とくに血漿細胞、またはＴ細胞、とくにＣＤ４ゝおよび／またはＣＤ８’　Ｔａ１ｌ胞を産生ずる能力により証明されるように、免疫応答をマウントすることができないことは不十分である。免疫グロブリンの遺伝的欠陥およびＴ細胞レセプター遺伝子の再配置の結果、機能的同系１３およびＴリンパ球を欠如することにおいて免疫無防備化された宿主、例えば、マウスはとくに重要である。現在入手可能な宿主は、匹旦／５ａｉｄとして知られており、重症の合併型免疫欠損を有する宿主、示した位置における遺伝的欠陥の導入のためにリコンビナーゼの適格性を欠如するＲａｇ−１’および、／またはＲａＢ−２′宿主を包含するや宿主は、通常免疫適格宿主の正常の寿命の約２５％より少ない、通常正常の寿命の約１〜２０％の年令をもつであろう。一般に、宿主は少なくとも約３適齢であり、そして所望の部位におけるドナー哺乳動物細胞の導入のために操作するために十分に大きい。例えば、約３〜１０適齢、通常４〜８週齢のマウスを使用する。宿主内の組織の増殖は器官とともに変化するであろう。

哺乳動物宿主は普通の方法で成長するであろう。哺乳動物宿主の免疫無防備化状態の程度に依存して、哺乳動物宿主は変化する程度に感染に対して保護されることができる。ある場合において、無菌の環境または予防的抗体を適用することができる。予防的抗体は、５ＣＩＤマウスに・ついて、５ＩＩＩｌの懸濁液中の２５〜７５Ｂのトリメトプリムおよび１００〜３００　ｍｇのスルファメトキサゾールを使用して、各週３日の投与で達成することができる。あるいは、帝王切開の誘導後、微生物不含の環境の中で他の動物から潜在的異種宿主を隔離することは満足すべきことであることがある。キメラ宿主の供絣および維持は大部分について普通の技術に従う。

霊長類、とくにヒト組織の導入のために種々の部位を選択することができるゆ好ましくは、部位は！Ｉｌ瘍細胞の導入のための血液またはリンパ系における便利な部位から下流であろう。さらに、部位は血管新生、および、好ましくは、同様によくリンパ管の接続を提供すべきである。適用を見出した部位は、膝窩、腎臓包、頚部領域、とくに外側領域、腹膜腔、皮下領域、乳脂肪パッドなどを包含する。

霊長ａｍ織の充実移植片は長期間機能することができる。種々の細胞を使用することができ、このような細胞は次のものを包含する；造血素、間質、肺、線維芽、上皮、ニューロン、幹細胞、あるいは次の特定の充実器官に関連する他の細胞、例えば、骨髄、肺臓、虫垂、扁桃、腸、肺、ＧＡｌ、Ｔ　（腸関連リンパ組織）　、ＭＡＬＴ　（粘膜関連リンパ組織）、舌、粘膜組織、副腎、胸腺、肝Ｒ（胸腺と組み合わせて）、中枢神経系組織、を髄、甲状腺、下垂体、視床体下部、骨、破骨細胞および骨芽細胞を包含する、筋肉、筋芽細胞、筋細胞、ニューロン組織など。

組織は死亡の約４８時間以内に得られた新鮮な組織、あるいは新しく凍結したｍｓｉ、死亡の約１２時間以内に凍結しかつ約−１Ｏ℃以下、通常はぼ液体窒素の温度（−７０°Ｃ）において無限に維持された組織であることができる。組織はキメラ宿主の中に移植された器官からのものであることができ、ここで組織は移植の２〜４週またはそれより長い期間後に取り出すことができる。この方法において、宿主源から本来得られた組織は大きく拡大し、得ることができるキメラ宿主の合計の数を実質的に増加することができる。キメラ宿主から得られる組織を、ヒト源から得られる組織に類偵する方法で処置することができる。組織は器官の一部分または完全な器官として準備することができ、一般に約０．２〜４Ｉｌ１ｍ、より通常的１〜２１１Ｉｌの間質要素を含むか、あるいは含まず、こうして切片は移植のために使用される、通常約１５〜２０ゲージのトロカールの中に容易に適合することができる０通常、組織は延長した期間の間生体外で培養されていないものである。ある場合において、ドナーおよび宿主の血管、リンパ管などを吻合することによって、器官移植片全体を移植することができる。

外来組織の細胞、ならびに外来分散細胞、例えば、分散胎児肝臓は通常中なくとも２週、通常中なくとも４週の間存在し、そして３力月またはそれ以上の期間にわたって連続的に存在することができる。大部分について、正常の細胞、組織、および／または器官は少なくとも３〜６力月、しばしば少なくともｌＯカ月の間安定に維持しそして機能的であることができる。

外来組織の細胞は免疫適格宿主の中で生存可能に止まることができ、そして異種宿主の中で機能することができる。すなわち、正常の代謝プロセスの外に、細胞はリガンドに対して応答し５、シグナルを変換し、適当な産生物を分泌し、そしてそれらの野生型宿主の中の同系細胞により実行されるように、正常の機能を実行するであろう。さらに、器官が含まれる場合、細胞は器官の族のために適当な構成をもつ組織の塊を定めるであろう。

通常、宿主の中に導入する＆１織を増殖させ、そして血管新生させ、そしてこのような組織は望ましくは腫瘍細胞の導入前に接続されたリンパ管を有するであろう。一般に、少なくとも１週、好ましくは少なくとも約２週を経過させる。通常、ＩＩＩ瘍細胞を移植の２０ｉ１１！ｌ内、より浦常移植の１０週内に導入し、この期間は組織が収穫前に生存可能であることを保証するように選択する。

一次＆ｌｌ織の型から他の器官への細胞の内転移を研究するために、２以上のヤの組織を準備することが望ましいことがある。腫瘍のために一次組織、ならびに転移のために二次的部位である組織を移植するであろう。例えば、肺癌細胞の骨髄への転移を研究するために、ヒト肺および骨組織の両者を移植する。

腫瘍細胞はヒトにおいて生ずる異なる悪性腫瘍の任意の１つであることができる。研究できる腫瘍細胞のクラスの中には、肉腫、リンパ腫、腺癌、５ＣＬＣ（小細胞肺癌）、神経腫、白血病、基底細胞癌などがある。と（に特定の器官に転移化する傾向がある腫瘍、例えば、５ＣＬＣ１乳癌などはとくに重要である。

腫瘍細胞は、通常患者のバイオプシーから得られる新鮮な組織、あるいは患者からの取り出しの約１２時間以内に凍結しかつ約−１０℃以下、通常はぼ液体窒素の温度（−７０°Ｃ）において貯蔵した新しく凍結した組織、または培養した細胞であることができる。組織は器官または充実腫瘍の一部分、または細胞懸濁液であることができる。

腫瘍細胞の投与法は腫瘍細胞の型に依存するであろう、ある場合において、とくに培養した細胞について、投与法は懸濁であろう。

これは全身的に、任意の便利な静脈または血管を通して注射するか、あるいは異種器官の部位の中に直接注射することができる。他の場合、とくに充実腫瘍のバイオプシーが細胞源である場合において、それは固体の塊、通常約０．５〜４ｓｎ、より通常約１〜２１１１１の塊として移植されるであろう。

前述の方法でヒト腫瘍細胞の導入後、動物を成長させる。腫瘍細胞を通常２〜６力月間の期間の間増殖および転移させる。

腫瘍細胞の増殖および転移の間に、転移の速度、大きさまたは分布に影響を与えるであろう治療の養生法で動物を処置することができる。このような処置は、付着分子に対して向けられた中和性抗体のような因子または成長因子レセプター・、あるいは転移に必要なプロセスを阻害する他の化合物を包含することができる。これらのプロセスは、−次腫瘍の血管新生（脈管形成）、−次腫瘍の部位における細胞外マトリックスの破壊、循環またはリンパ系の中への悪性細胞の管外苛出、転移部位における悪性細胞の付着、および！ｌＩ瘍史胞の増殖または分化を包含することができる。研究できる因子は、細胞障害性因子、抗腫管形成因子、分化誘発因子、抗有糸分裂および有糸分裂因ｆ−、ホーミング（ｈｏＩＲ４ｎｇ）インヒビターなど庖包含する。

腫瘍細胞の起源および疾患の進行段階を評価するだめの腫瘍細胞のフェノタイピッノブは、標準の組織学的方法により、免疫組織化学、抗体染色あるいはｌ？ＮＡおよび／またばｌ］ＮＡプローブを使用するイ゛／サイチュ・ハイブリダイゼーソツンにより実施することができる。

正確な方法は本発明に対して臨界的でなく、そして研究する正確なＮＩＢの夕・イブに依存するであろう。研究することができる他の特性は、腫瘍の攻撃性、薬物養生の応答、表現型の変化およびこのような変化に関連する遺伝子、転移に関連する因子などを包含する。

確立された異種器官の移植片を殺１１１ｍと区別するために、ＨＬＡマーカーを使用することができる。２つの異種組織の間の不一致は、後の口に細胞の起源を決定する方法を促供する。ＨＬＡタイプは、クラスＩおよびクラス■の抗原を包含する、ヒト）ＩＬ＾位置の対立遺伝子のいずれかに対して向けられた適当な抗体で染色することによって容易に決定できる。

疾患の進行は、キメラ動物中で増殖後の転移のフォーカスの数および大きさを測定することによって定量できる。このようなフォーカスは影響を受けた組織の肉眼の組織学的検査によるか、あるいは免疫組織学的染色により数えることができる。

殺腫瘍の数は、また、組織の中のドナー誘導細胞の百分率を計算することによって推定できる。これは細胞を宿主細胞のマーカーに対して特異的な試薬で細胞を標識化することによって測定できる。

これは前述したようにＨＬ＾型別により便利に実施することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例により本発明は限定されない。

実−−験」−一勅責省ま沖−Ｑ切上１」［病狙−胞９増−埴およ（転暴林料本よ一丈方法患者の試料。骨髄様白血病の患者からの贋・髄（Ｂ？り試料を告知同意（ｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔ）　で得た。　ＡＭＬのケー・スからの細胞は初期の診断Ｌ−おいて獲得し、そしてフランス−アメリカ−英国（ＦＡＲ）基準に従いＭｌ（３リース）、？！２（１ケース）、Ｍ３（３ゲース）、およびＭ４　（１）ｒ−ス）として分類した。慢性儒髄性白血病（ＣＭＬ）の患者（ｐｔ、Ｉ）は、８Ｍ試料において３０％の芽細胞集団をもつ骨髄性芽細胞の発症（ＣＭＬ− ＢＣ）期であると診断された。単核細胞をフィコール−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ− Ｐａｑｕｅ）　（ファーマシア）により分離し、次いで１０％ＤＭＳＯおよび１０％胎児子ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰにＴ−１６４０（ギブコ）中で凍結保存した。融解後、細胞を１０％ＦＢＳを含有するＲＰ？Ｉ［−１６４０で洗浄し、そしてフロー号イトメトリー分析および移植のために使用した。５ＣＩＤ　ｈｕマウス。ホモ接合Ｃ，Ｂ−１７ｓｃｉｄ／５ｃｉｄマウス（ＳＣＩＤ）を飼育し、抗生物質で処置し、そして６〜８週齢のときに使用した。妊娠１９〜２３週の胎児の大腿骨および脛骨を断片に切断し、そして５ＣＩＤマウスの中に皮下的に移植した。個々の胎児ドナーの胸腺から調製した細胞懸濁液を肛Ａアロタイプについて分析した。

白血病細胞の注射。融解後、白血病患者の骨髄細胞（０，４〜２．０×１０６生存可能な細胞）を２０ｍ１ノ１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０（７）中に再懸濁し、そしてマイクロリットルの注射器（ハミルトン・カンパニー）でヒト胎児骨の移植片の中に直接注射した。すべての場合において、骨移植片は白血病細胞の注射の６〜８週前に皮下に移植した。ヒト骨移植片中の細胞起源を後に追跡できるように、骨および白血病ドナーの組み合わせを共通に分布したＨＬＡアロタイプについて異種であった。

二次受容体への白血病細胞の生体内通路は同様な方法で実施した。

細胞懸濁液を後述するように白血病細胞を注射した骨から調製した。

次いで、適当なＩＩＬＡアロタイプをもつ他の５ＣＩＤ−ｈｕマウスの骨移植片の中に細胞（０，５２，０Ｘ１０’　）を注射した。

抗体。ｈＨＣクラスＩ抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）をＦＩＴＣまたはＰＥで直接接合した。これらはＦＩＴＣ−１６／３２（型形成ＨＬ＾クラスＩ決定基）　、ＰＨ−１１Ａ２．１　（ＨＬＡ−Ａ２．　Ｂ１７）、　ＰＨ−ＢＢ７．２　（ＨＬＡ−＾２）、　ＰＨ−ＢＢ７．１　（ＨＬＡ−８７，８ｗ４２）　、およびＰＥ−Ｍａ２Ｏ，２（ＨＬＡ−８７，Ｂ、ｌｏ＞　（１７）を包含した。ＦＩＴＣ抗ＬｅｕＭ１　（ＣＤ１５）。

ＰＥ抗ＬｅｕＭ９　（ＣＤ３３）、　ＰＥ抗Ｌｅｕ１２　（ＣＤ１９）、　ＦＩＴＣ抗ＣＡＬＬＡ　（ＣＤＩＯ）、およびＦＩＴＣ抗肛ｅｌ　（ＣＤ４５）をデクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー°システム（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。

フローサイトメトリー、単細胞の懸濁液を、ヒト骨および／または腫瘍から、１０％ＦＢＳを含有する冷ＲＰ旧−１６４０中で組織をハサミで細かく切ることによって調製した０次いで、細胞を塩化アンモニウムで処置して赤血球を溶解し、そして免疫蛍光のために染色した。

マウス末梢採血および骨髄からの細胞を同様によく検査した。分析前に、ヨウ化プロビジウムを１ｋｇ／ｍｌの最終濃度で添加して死亡した細胞を選択的にゲート・アウト（ｇａｔｅ　ｏｕｔ）　した、　ＦＡＣ５ｃａｎシステムを使用してマルチパラメーターのフローサイトメトリーを実施した。個々の試料において患者のＩＩＬＡアロタイプ陽性細陽性細胞７ヒ計細胞の百分率として、白血病細胞の百分率を計算した。各実験において、アイソタイプ合致抗体をネガティブ対照として含めた：白血病子孫細胞の活性を研究するように計画した実験において、５ＣＩＤ　−ｈｕマウスから白血病細胞をＰＥ−Ｃ［１３３およびＦＩＴＣ−ＣＤ１５で染色し、そしてＣＤ３３”　ＣＤ１５−およびＣＩ＋３３”ＣＤ１５” ″の集団に選別した。細胞の懸濁液を選別の間に４°Ｃに維持してＣＤ１５抗原の損失を回避した。

中間レヘルのＣＤ１５発現をもつ細胞を集めなかった。

歴史、細胞遠心のスライドを調製し、そしてライト・ギエムサ（Ｗｒｉｇｈｔ− Ｇｔｅｓｓａ）染色で染色した。

オール−ｔｒａｎｓ　レチノイン酸の投与、オール−ｔｒａｎｓ　レチノイン酸（ＲＡ）（シグマ・ケミカル）を無水エタノール中に１０−ｇ／■ｌの初期原濃度で懸濁した。各投与において２３ｍ１の原溶液を３００　ｍｌの葎留水の中に添加することによってオール−ｔｒａｎｓ　ＲＡを新しく調製し、そして栄養針を通る毎日経口的に投与した（０．４５Ｂ／日）、すべての希釈は柔らかな光の中で実施し、そして栄養注射器をアルミニウム箔で包んだ、各マウスにおいて明白な腫瘍が発生したとき（注射後１Ｂ、　２２、および２４週）処置を開始した。

５ＣＩＤ　ｈｕマウスの　へのヒトＡ　のＣＭＬ　、ｍ、、髄性芽細胞発症の１つのケースおよびＡＭＬ患者の７ケースからの凍結保存した８Ｍ細胞を、５ＣＩＤ−ｈｕマウスのヒト胎児骨の断片の中に直接注射した。注射したヒトＢＭならびにマウスＢＭにおけるヒト白血病細胞の増殖を、注射４〜５６週後フローサイトメＩ・リーにより分析した。−次注射の結果を表１に要約する。

ＣＩ’ｌＬ　患者（Ｐｔ、１）からの８Ｍ増殖を、注射した４匹の動物のうちのＯ４ｎ　４において観察した。Ｐｔ、］は１比＾−Ｂ？”であったので、この、働者から誘導された細胞は肛＾アロタイプＭｏＡｂ、　Ｍａ２Ｏ，２により定めることができた。注射１４週後、ヒトＢＭ移植片から回収された細胞のほぼ３０％はＭａ２Ｏ，２’　ＣＩ’ｌＬ細胞であったが、４０％は骨ドナー起源のＭ８４０．２正常ヒト造血素細胞であった。注射２０週後、骨移植片を取り囲む腫瘍が形成した。腫瘍細胞から調製した細胞はほとんどのＭａ２Ｏ，２”　、　ｌ” ｔ、１誘導細胞であった。これらのＣＭＬ細胞は、骨髄マーカーＣＤ３３およびＣＤ１５を使用する組み合わせた染色（Ｃ［１３３−ＣＤ１．５−　。

ＣＤ３３’　５　、およびＣＤ３３’　ＣＩ）１５”　）により定められた３つの明確な集団を含有した。ライト・ギエムサ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅ＋ｍ５ａ）染色したサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）　１ｉ製物において観察された主要な細胞のタイプは、好酸球、好塩基球および好中球の系列の芽細胞および骨髄細胞であった。顆粒球の巨核球および成熟する形態はまれに発見された。

組織学的検査において、核の異常性をもつ異型芽細胞、顆粒球、および巨核球腫瘍組織は骨髄空間を完全に置換し、そして正常の造血素のフォーカスは残らなかったことが証明された。　ＣＤ３３およびＣＤ１５マーカーを使用する表現型によりならびに細胞学および組織学により定められたＣＭＬ細胞の細胞の組成は、３０週以降に分析したすべての３匹の動物において非常に類似した。ヒト骨髄におけるＣＭＬ細胞の広範な増殖にかかわらず、ＣＭＬ細胞は検査した４匹のマウスのいずれのマウス骨髄においても検出することができなかった。

５ＣＩＤ−ｈｕマウスの中に注射したＭＩ　ＡＭＬの３つのケースの間で、２つ（Ｐｔ、２およびＰｔ、３）はヒト骨髄において広範な増殖を示した（表１）。

Ｐｔ、２からの細胞を注射した６匹の５ＣＩＤ−ｈｕマウスのうちの６匹は、１４週までに注射したヒト骨移植片の回りに明白な腫瘍を生成した。フローサイトメトリー分析は、移植前後におけるＰｔ。

２からのＡＭＬ細胞上の骨髄マーカーＣＤ３３およびＣ［１１５の発現がＣＤ３３　”ＣＤ１５−およびＣＤ３３’　ＣＤ１５’の２つの集団とほとんど同一であることを明らかにした。これらの２つの集団は、Ｐｔ、２がらの＾ＭＬ細胞をもつ動物において再現的に観察された。ＰＬ、２誘導細胞を認識するＭｏＡｂ、　ＭＢ４０．２で染色することによって、白血病ドナーの起源を確証した。この実施例において、右および左の側腹部に２つのヒト骨移植片をもつ５ＣＩＤ−ｈｕマウスを使用した。　ＡＭＬ細胞を移植片の一方の中にのみ注射したので、注射しなかったヒト骨移植片の中への白血病細胞の広がりを研究した。注射しなかったヒト骨移植片はＭ８４０．２’ＡＭＬ細胞を回収されたヒト細胞集団の３０〜９０％のレベルで含有したが、ＡＭＬ細胞はマウス骨髄において検出されなかった。

ＡＭＬ細胞の増殖はＰｔ、３細胞を移植した４匹のマウスのうちの３匹、ｐｔ、５細胞を移植した４匹のマウスのうちの２匹およびＰｔ、８細胞を移植した３匹のマウスのうちの３匹において観察された。これらの細胞のＩ（ＬＡタイプは、試験したアロタイプの抗体について陰性であったＰｔ、５のものを除外して、患者起源であることが確証された。５ＣＩＤ−ｈｕマウスにおいてヒト骨髄中で増殖する芽細胞はＣＤ３３抗原を発現し、それらの骨髄起源を証明した。検査したマウスのいずれもそれらの骨髄の中に白血病細胞をもたなかった。

Ａ３として診断されたＡＭＬの２つのケースからの細胞を、また、移植した（表１）。融解後、わずかに７ＸＩＯ’の生存可能な細胞が患者Ｐｔ、６の８Ｍ細胞から回収され、そして５Ｘ１０’の細胞を１匹の５Ｃ１０−ｈｕマウスの中に注射した。　４０週に実施した分析は、移植片から回収された細胞のわずかに１０％がヒト起源であることを証明した。

しかしながら、これらの細胞の大部分は注射したＡ？ＩＬ細胞の特性、すなわち、ＣＤ３３’　ＣＤ１５”表現型、芽細胞の散乱のプロフィル、およびＰｔ、６　（ＨＬＡ−８７）のＨＬ八へロタイプを有した。他のＡ３ケース（Ｐｔ。

７）からの細胞を注射した２匹の動物のうちの２匹に首尾よく移植された。　５ＣＩＤ−ｈｕママウス中増殖する細胞は、ＭｏＡｂ　ＭＡ２．１およびＢＢ７．２により検出されたＰｔ、７　（ＩＩＬＡ−Ａ２）のＨＬＡタイプを維持した。

ＭｏＡｂ　ＣＤ３３およびＣＤ１５で染色された５ＣＩＤ−ｈｕママウス中増殖する芽細胞の表面の表現型は、注射前に分析した８Ｍ細胞のそれに類似した。

前骨髄性白血病細胞の細胞学的特徴は、また、細胞質中の豊富なアズール親和性顆粒で維持された。

要約すると、１つを除外してすべてにおいて、骨髄性白血病細胞の検出可能な増殖は注射したヒトＢＨにおいて再現的に観察された。

早期の時点における組織学的検査は、正常の造血素細胞と共存する骨髄腔の内側の局在化した白血病性芽細胞の増殖を証明した。明白な腫瘍は、Ｐｔ、１，２．３，５．７および８からの細胞を注射した動物において骨移植片の回りに増殖した。巨視的に、これらの腫瘍はＰＡＢ分類におけるサブタイプに無関係に緑色がかった色を有した。

骨断片は組織学により腫瘍の中央部分にまだ観察することができた。

これらの腫瘍から新しく調製した細胞懸濁液は、直接注射により二次５ＣＩＤ− ｈｕ宿主のヒト骨移植片の中に首尾よく転移することができた（表１）。白血病細胞の表面の表現型および組織学的特徴は、二次継代において安定に維持された。腫瘍を支持する動物の末梢血液からの細胞を、骨髄性白血病細胞に対して反応性の抗体の種々の組み合わせを使用してフローサイトメトリーにより分析した。

Ｐｔ、３細胞の二次継代をもつ２匹の動物を除外して、この方法により腫瘍細胞は検出することができなかった。これらの動物において、末梢血液において合計の核化細胞の１％および４％はＣＤ３３およびＰｔ、３のＨＬＡアロタイプ（ＭＡ２．１およびＢ８７．２）について陽性であった。

５ＣＩＤマウスの　に　たヒ　ｔｉ　のヒ　ＡＭＬ　の　お　びＡＭＬ患者の骨髄から得られた白血病細胞（適当な条件下に液体窒素の中に貯蔵した）を融解し、そして２Ｘ１０ｂの生存可能な細胞をハミルトン（Ｈａｍｉ　Ｉ　ｔｏｎ）注射器で、５ＣＩＤマウスに皮下的に移植されたヒト胎児骨の中に直接注射した。白血病細胞および骨のドナーのＨＬＡタイプを、共通に分布したＨＬＡアロタイプに対して特異的な抗体、例えば、肛Ａ−Ａ２およびＩＩＬＡ− Ｂ７で検査した。白血病ドナーおよび骨のドナーの組み合わせは、それらがＨＬＡマーカーで判別できるように選択した。動物に、腫瘍細胞の注射８〜１０週前に、同一ドナーからの２編の胎児骨を皮下的に距離を置いて移植した。２つの骨の間の白血病細胞の動きを後に観察できるように、白血病細胞を骨の一方のみに注射した。

白血病細胞の注射３〜８力月後に、動物を分析した。単一の細胞懸濁液を個々の骨断片からおよびマウス大腿骨から調製し、患者のタイプのＨＬＡアロタイプを包含する注射したヒトＡＭＬ細胞を検出するために、種々の抗原に対する抗体で染色し、そしてＦＡＣ３により分析した。注射した骨から回収した細胞のほとんどすべては、注射した白血病細胞のＨＬＡタイプについて陽性であることが示された。それらは、また、骨髄マーカーＣＤ３３について陽性であり、そしてＡＭＬ細胞の形態学的特性を有した。注射しなかったヒト骨から回収したヒト細胞のほぼ５０％はＡＭＬ細胞に対して反応性の抗体について陽性であり、白血病細胞が注射した骨から動き、次いでそれらの転移した細胞は注射しなかったヒト骨髄の内側で増殖していたことを示した。同一の動物のマウス骨髄において、ヒト白血病細胞は検出することができなかった。５人の患者からの白血病細胞は同様な結果を与えた、すなわち、白血病細胞は遠い部位におけるヒト骨髄の中に広がっていたが、マウス骨髄の中に広がってぃなかった。

これらの結果が証明するように、種特異的悪性細胞の動きおよび増殖はこの動物モデルにおいて再現的に観察することができる。

オール−ｔｒａｎｓレチノイン　１」まｊ１伯−証菊Ｕ嬶匹！この投与量は、１００　ｃ＋ｗｔのマウス体表面積を仮定して、臨床的に使用した投与量（４５＋＋ｇ／＊２／日）に基づいて選択した。処置の３〜９日後に、白血病細胞の表現型および細胞学的変化を検査した。正常の骨髄の分化の経路において、顆粒球の系列に向かう成熟はＣ０１５抗原の獲得により特徴づけられる。Ａ３患者からの細胞を使用する生体外実験において、ＣＤ１５は前骨髄性白血病細胞の分化に適当なマーカーであることが示された。Ｐｔ、８のヒドラーゼの大部分はＣＤ３３　”ＣＤ１５−であったので、顆粒球分化の抗原、Ｃ［１１５の発現をＲ＾処装により誘発できると予測することができる。

ここに記載する実験において、ＣＤ３３　”ＣＤ１５−およびＣＤ３３３Ｃ［１１５”の百分率は１００％ＣＤ３３　’の細胞の合計に対して正規化した。腫瘍（二次継代）の小片を処置の第３日に生検し、そして分析した。有意なＣＤ１５の発現の変化または細胞学的変化は、もとの細胞および対照（処置なしの一次および二次の継代細胞）に比較して観察された。

処置の第７日に、マウスを分析のために殺した。白血病細胞の有意な部分（２７％）はこの時点においてＣＤ１５について陽性であった（表２）。二次細胞をもつ２つの他の５ＣＩＤ−ｈｕマウスから、同様な結果が得られた。ＣＤ１５’細胞の集団は、処置の第７および９日後に、それぞれ、１４％および５４％に増加した。顆粒球の分化の誘発は細胞学により確証された。オール−ｔｒａｎｓ　Ｒ＾を使用する処置の７日後、小葉化核および好中球の顆粒をもつ骨髄細胞のいっそう分化した形態が前骨髄細胞を観察することができた。こうして、５ＣＩＤ− ｈｕマウス中で増殖する前骨髄性白血病細胞はオール−ｔｒａｎｓ　ＲＡに対して応答しそして成熟好中球細胞に分化することができることが証明された。

表２前骨髄性白血病細胞へのオール−ｔｒａｎｓ　レチノイン酸の効果継代　処置　ＣＤ３３＋　ＣＤ１５−　ＣＤ３３＋　ＣＤ１５−２　９日　８６％　１４％２　４４％　５６％略号：ＮＡ、適用不可能＊試料を第３日および第７日に生検した同一の腫瘍から誘導した。

ＡＭＬ　の内皿　」を士１」記載したように、Ｐｔ、２からのＡＭＬ細胞を骨髄マーカーＣＤ３３およびＣＤ１５により定められた２つの集団を含有した。われわれは低い成熟の（ＣＤ３３ ’　ＣＤｌ５−　）およびより分化した（ＣＤ３３’　ＣＤ１５”　）集団における白血病子孫細胞の活性を、変化する数の選別した細胞を二次５ＣＩＤ−ｈｕマウスの中に移すことによって比較した。５人のドナーからつくった合計４５匹の５ＣＩＤ−ｈｕマウスを使用して、２つの独立の実験を実施した。３または２匹の動物の１ｌＩＩ細胞を収穫し、プールし、ＰＥ−ＣＤ３３およびＰＥ　−ＣＤ１５で染色し、次いでＣＤ３３”　ＣＤ１５−およびＣＤ３３　’ＣＤ１５’ 集団に選別した。１０ｂ〜１０５細胞の注射後８〜１１週およびより少ない投与量の細胞を使用した後９〜１４遇に、白血病の増殖をフローサイトメトリーにより分析した。ＭｏＡｂ、　Ｗ６／３２およびＣＤ４５を使用する組み合わせた染色により検出された合計のヒト造血素細胞の中のＨＬＡ−８７’　（Ｍ８４０．２”　、ＢＢ７．１”）の百分率として、ＡＭＬ細胞の増殖を示した。

表３に要約した結果が明瞭に証明するように、ＣＤ３３”　ＣＤ１５−集団は白血病を二次宿主の中に移すときいっそう効率的である。１０４のＣＤ３３”　ＣＤ１５−細胞を注射した５匹の動物のうちの５匹および１０３のＣＤ３３”　（：Ｄ１５−細胞を注射した５匹の動物のうちの３匹は検出可能なレベルの白血病細胞の増殖を有したが、同一数のＣＤ３３’　ＣＤ１５”細胞を注射した１０匹の動物のいずれも白血病細胞の増殖の証拠を示さなかった。また、二次宿主において発生した白血病は、注射した集団に無関係に、もとの白血病細胞と同様に、ＣＤ３３’　ＣＤ１５−およびＣＤ３３“ＣＤ１５”の両者の集団を絶えず含有することが観察された。

表３ＣＤ３３−　ＣＤ１５−およびＣＤ３３＋ＣＤ１５＋細胞中の白血病子孫細胞の活性の比較これらのデータは２つの独立の実験の結果を表す。

白血病細胞の百分率は、Ｗ６／３２’　／ＣＤ４５’　として定めた合計のヒト細胞の中の一６／３２”　／ＭＢ４０．２’細胞の百分率として表されている。

ニーｌ　モデルにお４るヒト　の　および以下のデータは、ヒト充実腫瘍の転移の広がりの研究のためのモデルとして５ＣＩＤ−ｈｕマウスの使用を例示する。

５ＣＩＤ　−ｈｕモデルの新規性、および主要な利点は、それが特定のヒト組織へのヒト腫瘍細胞の生体内の転移の広がりの分析を可能とするという事実である。

ヒト胎児肺断片の接種前に、移植した免疫欠損５ＣＩＤマウスの中にヒト肺癌細胞系の細胞を静脈内に導入した。ヒト肺組織中の腫瘍細胞の特異的ホーミングおよび増殖を観察する。あるいは、腫瘍細胞を５ＣＩＤ−ｈｕ中のいくつかのヒト肺移植片の１つの中への直接注射を経て導入し、そして肺移植片の間の腫瘍細胞の転移的動きを観察する。

種特異的および器官特異的転移のこのモデルは、転移の分子のメカニズムの研究および新しい治療的理学療法の開発のために使用することができる。

仕打麦末勅立汰二車ス亘よグ■貴。ホモ接合ＣＢ−１７ｓｃｉｄ　／　５ｃｉｄマウスを６〜８週齢で使用した。ヒト胎児肺をほぼ１ｍ１１１３の断片に切断し、そしてマウスの乳脂肪パッドの中にそして腎臓包の下に外科的に移植した。

同一妊娠年令のヒト胎児大腿骨および脛骨を長さ方向に切断し、そして５ＣＩＤマウスの中に皮下的に移植した。生ずる５ＣＩＤ−ｈｕ動物を移植４〜８ａｌに実験のために使用した。

旦裕糸。変異型サブタイプの小細胞肺癌（ＳＣＩＤ）細胞系Ｎ４１７および）１８２を、ナショナル・キャンサー・インスチチュート（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｔｌｅａｌｔｈ）から入手した。肺腺癌細胞系Ａ４２７はＡＴＣＣから入手した。細胞系は１０％胎児子ウシ血清を補充した増殖培地ＲＰＭＩ−１６４０（Ｎ４１７およびＨ８２）またはＤＭＥＭ　（Ａ４２７）中で維持した。

裏駿王ｌ。腫瘍細胞を５ＣＩＤ　−ｈｕマウスの中に横の尾静脈を経て静脈内に注射した。あるいは、細胞はマウスの中に皮下的に移植したヒト胎児＆１１礒の中に直接注射した。マウスを週２回増殖について検査し、そしてＩ１ｍ体積が５ｃｍ’に到達したときまたはその前に殺した。ヒト肺移植片、マウス肺および他の内部の器官および腫瘍を組織学的に検査した。ジスパーゼおよびＤＮアーゼの存在下に３７℃において１時間インキュベーションすることによって無菌的に取り出しそして細かく切った腫瘍から、単細胞懸濁液を調製した。細胞を洗浄しそして静脈内注射のために使用するか、あるいは再確立した細胞系に対して生体外に外植した。

精−来ヒト　のハ　・　二■８２の　・ホーミングおよび■。５ＣＬＣ系８８２のＩＩｌ胞を収穫し、そして３つの胎児ヒト肺断片を移植した５ＣＩＤ−ｈｕマウスの中に静脈内に注射し、それらの断片のうちの２つは乳脂肪パッドの中でありそして１つは腎臓包の下であった。ヒト肺組織における速く増殖する腫瘍の外観のために、マウスを注射４〜５週後に殺した。大部分のマウスにおいて、腫瘍の増殖はすべての３つの肺移植片を含んだ。いずれの場合においても、マウス肺を包含する、いずれのマウス器官においても腫瘍は発見されなかった。これは組織の組織学的分析により確証された。

細胞Ｈ８２Ｔｌをヒト肺腫瘍の１つから生体外で再確立し、そして５ＣＩＤ−ｈｕ　（肺）マウスの静脈内注射のために使用した。再び、これはもっばらヒト胎児肺断片内で腫瘍を発生させた。結果を表４に要約する。こうして、Ｈ８２細胞の血液が支持する広がりは、マウス器官を含まないで、ヒト肺組織内の腫瘍の特異的増殖を生ずる。

ヒト　のハ　−　二Ｎ４１７のホーミングよ　。

８８２細胞について前述の実験に類似する実験において、Ｎ４１７細胞を使用した。Ｎ４１７細胞は５ＣＩＤ−ｈｕマウス内のヒト肺Ａｌｌ織の特異的にホーミングすることができること、そしてこの能力は生体内の１継代後に持続されることが観察された。ヒト肺組織の中の腫瘍形成の潜伏期間は４〜６週であった。結果を表５に要約する。

Ｎ４１７細胞は、Ｈ８２細胞と同様に、ヒト胎児肺組織において特異的に移動および増殖することが明らかである。しかしながら、５ＣＩＤマウス中の８４１７細胞の静脈内注射はマウス組織中の腫瘍の増殖を生じた。有意には、これらの腫瘍はＳＣ［Ｄ−ｈｕ　（肺）マウス中のヒト肺腫瘍より長い潜伏期間後に発生した。後者は注射４〜６週後に感知し得る大きさに到達するが、マウス器官（優先的に脂肪組織）中の腫瘍は注射後より長い期間、８〜１２週にわたって発生する。こうして、Ｎ４１７細胞を受容した５ＣＩＤ−ｈｕ　（肺）マウスはヒト腫瘍を発生し、そしてそれらがマウス器官中で腫瘍を発生することができる前に、殺さなくてはならなかった。

５ＣＬＣＮ４１７４７（７）”　−（７）　゛　の゛　。骨髄の包含は５ＣＬＣ患者における頻繁な臨床的特徴である。骨髄転移の変異型を選択するために、Ｎ４１７細胞を５ＣＩＩＩ−ｈｕ　（骨）マウスの中に静脈内注射した。これらの動物の大部分は、注射後８〜１２週以内に種々の褐色脂肪組織の部位の中に１１瘍を発生した。動物の終末のとき、ヒト骨髄を回収し、組織学的に検査し、そして生体外に外植した。注射した１０匹のうちの１匹は、組織学および生体外腫瘍細胞の外植の両者により、ヒト骨移植片内のＮ４１７細胞の存在を示した。これらの細胞を５ＣＩＤ−ｈｕママウス中注射の第２ラウンドのために使用し、そしてヒト骨髄へ移動しそしてその中で腫瘍の増殖を引き起こす能力の増加を示した。ヒト骨髄の転移性のＮ４１７の安定な変異型の選択は、転移の広がりにおける骨髄の関与に導く、腫瘍細胞の表現型の変化を分解することができる。

葱豚済員囚糸Ａ４２７．　Ａ４２７細胞を５ＣＩＤ−ｈｕ　（肺）マウスの中に静脈内注射して、ヒト胎児肺組織に移動しそしてその中で増殖するそれらの能力を検査した。細胞を注射した合計５４匹のマウスのうちで、６匹の動物（１１％）は５〜６力月の範囲の期間にわたってヒト肺ｍ織中で腫瘍を発生した。注射した動物のいずれも、ヒト肺組織以外の組織の中で腫瘍を発生しなかった。

細胞を肺腫瘍（Ａ４２７ＴＩＶ）の１つから回収し、そして静脈内注射により生体内継代の第２ラウンドのために使用した。　Ａ４２７Ｔ１ｖ細胞を、また、生体外に外植して永久的細胞系を確立した。生体外に外植した細胞の約８０％は、培養の最初の５日の過程にわたって死亡した。

生ずる細胞系Ａ４２７Ｔｌを、数回の生体外継代後、５ＣｒＤ−ｈｕマウスの中に注射した。これらの結果の結果を表７に示す。

上に表す結果から明らかなように、親細胞系Ａ４２７は５ＣＩＤ−ｈｕママウス中ヒト肺組織中で移動および／または増殖する非常に制限さた能力を有する。しかしながら、＾４２７の最初の生体内継代はヒト；組織を侵入する劇的に増加した能力をもつ変異型（Ａ４２７ＴＩＶ）の選、を生した。Ａ４２７Ｔ１シ細胞は、親細胞系のそれに比較して、非常に；い潜伏期間後に、すべての注射した動物において腫瘍を誘発した。

しかしながら、このホーミング能力は生体内でのみ維持するようｒ思われる。なぜなら、それは生体外の腫瘍細胞の数回の継代後に二われるからである。

ヒト肺＆Ｉｌ織における＾４２７細胞の腫瘍発生性のこの特定の特徴は、腺癌細胞の肺組織にホーミングし、そしてその中で生存するためＣ必要な細胞のフローサイトメトリーを定めるための独特の機会で噌る。

゛５ＣＬＣサブ　イブの　９：より攻撃性がっ不応性ｖ　−３ＣＬＣサブタイプ（Ａ４１７．　Ｈ８２、およびＨ４４６，（Ｄ、　Ｎ、　Ｃａｒｎｅｙ　ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　４５．２９１３　［ａ９８５］）またはｃ−５ＣＬＣサブタイプ（１１１４６，Ｈ６９゜８３４５　（前掲〕およびＡＣＣ−ＬＣ−５２，ＡＣＣ−ＬＣ−５１，ＡＣＣ−ＬＣ−６０（Ｔ、　Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９．２６８３　［１９８９］）から誘導された細胞系を比較した。細胞をヒト胎児肺（）！ＦＬ）の断片を移植した５ＣＴＤ−ｈｕ−Ｌマウスまたはヒト胎児骨髄の断片を移植した５ＣＩＤ　−ｈｕ　−８Ｍマウスの尾静脈の中に静脈内注射した（Ｓ、　Ｋｙｏｉｚｕｍｉ　ら、Ｂｌｏｏｄ　７９＋１７０４　（１９９２）。

５ＣＩＤ−ｈｕ−Ｌマウスの接種後の変化する時間において、ＩＩＦＬ移植片および宿主ネズミ器官を巨視的および組織学的分析にかけた。４〜５週以内に、ｖ −５ＣＬＣ系Ｎ４１７および１１８２は注射したマウスの８０〜１００％の移植したＮＦＬ組織内に腫瘍を誘発した（データは表８に示されている）、ｉｒＬも影響を受けたマウスにおいて、２または３つのヒト肺移植片の２以上は腫瘍の増殖を支持した。しばしば２以上の腫の瘍小節が同−ＨＰＬ移植片内に発生した。

ｖ　−３ＣＬＣ１１４４６は、頻度が多少低くかつ潜伏期間がより長いにもかかわらず、ＨＦＬへの転移の同様に高い特異性を示した。こうして、ＨＦＬへのｖ　−３ＣＬＣ系の転移は高い効率で起こることができる。

！ｌ１ｍの形態学はｖ−５ＣＬＣの典型であった：比較的高い核／細胞質の比をもつ多角細胞が非常に薄い間質により支持されたシートに配置されていることが観察された。有糸分裂像は頻繁であり、同様に広範な区域の壊死が存在した。腫瘍の切片の免疫組織化学的染色は、１１ＦＬ移植片中のＮ４１７起源の腫瘍がＮ −ＣＡＭおよびシナブトフィシンを発現し、そして二１−ロン特異的エノラーゼについて弱く陽性であり、もとの細胞系の表現型のプロフィルを保持することを明らかにした。

腫瘍細胞を８４１７および１１８２により誘発されたＨＦＬ　Ｉｌ！瘍（それぞれ、Ｎ４１７Ｔ１および１１８２ＴＩ）を回収し、そして生体外で細胞系として再確立した。これらの細胞を５ＣＩＤ−ｈｕ−Ｌマウスの中に注射すると、マウスの８０＝ｉ００％のＩＩＦＬ移植片移植肺内の特異的増殖を生じた。

５つの古典的Ｓ　Ｃ＋、、Ｃ細胞系は５ＣＩＤ−ｈｕ　−Ｌにおいて異なる転移の可能性を示した。細胞系ＡＣＣ−１、Ｃ−５１および６０は５ＣＩＤ−ｈｕ− １−において転移性ではなかった。２匹の注射した動物のうちの１匹において、Ａ　ＣＣ−−Ｌ　Ｃ−−５２細胞は）ＩＦＬ移植片において単一の腫瘍を誘発した。この腫瘍から回収された細胞は、もとの細胞系よりも５ＣＩＤ−ｈｕ−Ｌにおいて感知し得る程度に転移性ではなかった。ｃ　−５ＣＬＣ系Ｈ３４５゜＋＋１４６およびＨ６９は、異なる頻度であるが、ｖ　−５ＣＬＣ系Ｎ４１７および１１８２より長い潜伏期間でＩＩＦＬ中で腫瘍を誘発した。５ＣＬＣの転移はヒト肺組織に対して非常に特異的であった。転移の病巣は実験動物のいずれにおけるマウス肺においても発見されなかった。９つの５ＣＬＣ系のうちの６つはいかなるマウス組織に対しても転移ではなかった。

しかしながら、Ｎ４１７または８６９細胞を与えた５ＣＩＤマウスは、移植したＩＩＦＬと区別される解剖学的部位において追加の腫瘍を発生した。

すべての腫瘍はネズミ褐色脂肪組織の中に局在化した。さらに、■−３ＣＬＣＮ４１７およびＨ８２は実験の雌の５ＣＩＩＩマウスの約半分において卵巣腫瘍を生成した。ＨＦＬへのｖ　−５ＣＬＣの転移の組織特異性のための対照として、Ｎ４１７細胞をヒト胎児腸の断片を移植した５ＣＩＤマウスの中に注射した。注射細胞の大きい数（３Ｘ１０’）にかかわらず、８匹のマウスのいずれも移植した腸組織において腫瘍を発生しなかった。ＩＩＦＬへの５ＣＬＣ細胞の転移は種および組織の両者に対して特異的であると、われわれは結論する。

ｖ−５ＣＬＣ細胞が５ＩｊＤ−ｈｕ−ＬにおいてＩ（ＰＬに対して自発的に転移することができるかどうかを試験するために、Ｎ４１７Ｔ１細胞を５匹のマウスの２つのＨＦＬ移植片の１つの中に直接注射して、局在化した腫瘍の増殖を発生させた。注射５〜７週後に、５匹のマウスのうちの２匹は第２の、注射しなかったＩＩＦＬ移植片への転移を発生した。

Ｎ４１７の骨髄−転移の変異型を使用して、同様な実験を反復した；第２の、注射しなかった旺りへの自発的転移の頻度は２０％から６０％に変化した。注射した半分における一次腫瘍の外科的除去は５匹のマウスのうちの５匹において残留する第２　ＨＦＬ移植片において転移の増殖を生じたが、切除の部位は＋ｔＷ瘍の再発の徴候を示さなかった。

Ｈ８２細胞は自発的転移のアンセイにおいて弱くのみ転移性であり、第２半分への転移の頻度は２０％を越えなかった。これらの実験は、自発的転移の研究のための５ＣＩＤ−ｈｕ−Ｌモデルの適用可能性を証明する。

骨髄への転移は５ＣＬＣ腫瘍の頻繁な臨床的特徴である。われわれは、ＳＣＩＤ −ｈｕ−８Ｍマウスを使用する実験的転移のモデルにおいて５ＣＬＣのこの特性を再現しようと試みた。初期の（すなわち、移植後６週より短い）　ＨＦＢ？Ｉ移植片は、１１　Ｆ　Ｂ　Ｍの髄質内で主要な細胞のタイプとして間質および血管の要素を含有する。８週より大きいの移植後の適齢（「後期」）のＨＦＢＭ移植片は多糸のヒト造血を証明する。これらの変化を包含するために、ｖ　−５ＣＬＣ系ｈ８およびＮ４１７の細胞をＨＰＢＭの移植後異なる時間にＳＣＩＤ−ｈｕ−ＢＭの中に静脈内注射した。注射後５〜７週において、ＨＦＢＭ移植片移植膣内細胞の存在を組織学的分析および骨髄細胞の生体外培養により分析した。

ＨＦＢ？Ｉへのｖ−３ＣＬＣの実験的転移は、移植片の移植後の適齢の臨界的に依存することが発見された。こうして、移植後８〜１０週において注射したマウスにおけるＨＦＢＭへの１１８２細胞の転移は稀であった。

しかしながら、移植後３〜６週３〜６におけるＨＦＢＭへの転移はマウスの半分より多くにおいて起こった。Ｈ８２細胞の注射後に後期のＨＦＢ？ｌ移植片の中で発生した唯一の腫瘍から、細胞系ＨＢＩを誘導した。

この系統は、親の系統Ｈ８２に似て、表９に示す。初期の移植後の時間においてＩＩ　Ｆ　Ｂ　Ｍへの同一の強い優先的に転移を示した。

ｖ　−５ＣＬＣＮ４１７は移植後の任意の適齢においてＨＦＢＭへの非常に低い転移の可能性を有した。しかしながら、１つの細胞系（Ｎ４Ｂ旧）が、後期のＩＩＦＢＭ移植片中のＮ４１７により誘発された腫瘍から再確立された。

この系統は初期のＩＩ　Ｐ　Ｂ　Ｍに対して高度に転移性であるが、後期のＨＦＢＭに対してそうではないことが発見された。腫瘍は移植後４週においてＮ１Ｍ１を注射した５匹のＳＣ１０−ｈｕ　−ＢＭのうちの４匹において発生したが、移植後８〜１０週に注射した１９匹の５ＣＩＤ　−ｈｕ　−ＢＭにおいて発生しなかった。ＨＦ８Ｍ腫瘍としてＮ４１７　（Ｎ、［Ｍ）の腫瘍形成性変異型の系統的継代を、静脈内注射の４ラウンドを通して続けた。個々の１８Ｍ腫瘍から確立された合計１０の腫瘍形成性変異型は初期のｌ（ＦＢＭに対して高度Ｇこ転移性であった；後期ＨＦＢＭへの転移は散在性であり、親の系統のそれを頻度で越えなかった。　ｖ　−５ＣＬＣ１１８２およびＮ４１７の選択した変Ｗ型は移植後の初期の時間においてＩＩ　Ｆ　Ｂ　門に対して転移性であると、われわれは結論する。

表９移植後の異なる適齢のＨＰＢＭへの５ＣＬＣの転移ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＢＭに２〜３×１０６細胞（＋１８２またはＮ４１？）または１０６細胞（ＨＢＩおよびＮ１３Ｍ４）　／マウスを注射した。すべてのマウスを移植後５〜７週において殺した。ＮＤ、決定しなかった。

移植したヒト骨髄中の転移性ｓｅｔ、ｃｌＩ瘍は、端部、すなわち、骨断片の多数の骨幹端部分内で最も頻繁に発生した。腫瘍は攻撃性であり、そして正常骨髄細胞要素の変位および骨溶解性分解に必ず導いた。

５ＣＬＣ系およびそれらのＨＦ　Ｂ　Ｍ転移性変異型の両者は、マウス骨髄へまれに転移することができた。しかしながら、ＨＦＢＭへ転移性のＮ４１７の変異型の選択はマウス骨髄への転移の頻度の有意な増加に関連しなかった。マウス椎骨髄における転移性病巣は１つの椎骨に限定され、ぞして髄質空間に拘束されるままであるために十分に小さかった；非常にわずかのケースは骨溶解性病巣を示した。これが示唆するように、マウス骨髄中のヒトＳＣＩ、Ｃへの転移および／またはその増殖は起ごろことかできるが、１１　Ｆ　Ｂ　Ｍにおけるほど効率的ではない。

ＨＦＲＭへの５ＣＬＣへの転移が移植の人工物という可能性を排除するために、債髄転移性変巽ＪＪＮ４８Ｍ４を、５ＣＩＤマウスの新生児からの骨髄を移植しノｊＳＣＩＤマウスの中に注射した。９匹のマウスのいずれも、り（因性Ｓ　ＣＬ　Ｃ骨髄移植片へ、の転移を発生し、なかった。

移植後初期におけるＨＦＢ１１へのｖ−！；Ｃｌ、Ｃの転移の観察された特異性だめのｉｉｌ能な理由をわれわれは取り扱った。多分、初期のＩＩＦＢＭにおける豊富な骨間質は活性的にサイトカ、インを産生：９．および／′またはト、ｌ・造血を支持するために必要な特異的付着性分子を発現することができ、こうして転移性細胞のホーミングおよび／または増殖のために好適な条件をつくる。致死的量より少ない線量のＴ照射に５ＣＩＤ−ｈｕ−ＢＭマ・リスを暴露することによって、後期のＩＩＦＢ門移植片の中に同様な条件を同定する試みをした。ＳＣＩＤ　−ｈｕ　−ＢＭの致死的量の照射は、移植後にＩＩＰＢＭ移植片において観、察される事象に類似する、回収後のＩＩ　Ｆ　Ｂ　Ｍ中の造血累細胞の大量の死亡を生じた。

移植後７および８週において各５匹の５ＣＩＤ　−ｈｕ　−ＢＭの２つの群を２または３Ｇｙの線量で照射し１、そして２４時間後にＮ１３Ｍ４を注射した。

同一トナーからの旧＋ＢＩ’ｌを移植し、た、各５匹の照射しないマウスの対照群に、同一時間にＮ４８Ｍ４細胞を注射した。表１０中の結果が示すように、照射は後期ＨＦＢＭへのＮ１３Ｍ４細胞の転移を増強する。同一マウスにおいて、照射はマウス骨髄またはマウス褐色脂肪への転移に対する効果をもたなかった。

親Ｎ４１７細胞の注射前の５ＣＩＤ　ｈｕ−８Ｍマウスの照射は、）ＩＦＢｌ’ ｌへの転移の頻度を増加しなかった。

次に、後！ｌＩＩ　ＨＦ　Ｂ　Ｍへの転移の効率に対する照射の効果の持続性を検査した。５ＣＩＤ−ｈｕ−聞に、照射後３および７日に、Ｎ１３Ｍ４細胞を注射した。照射の増強効果は照射後第３日においてなお明らかであったが、第７日にそうではなかった。これらの結果が示すように、致死的量より少ない量の照射は後期肝聞における応答を活性化し、これはＳＣ１，Ｃ変異型の種特異的転移を増強する。

ＨＦ　Ｂ　Ｍへの転移への照射の効果は細胞障害性および内皮バリヤーの一体性の潜在的損失のためではないことを値認するために、実験のマウスをン、シクロホスファアミド、すなわち、照射により誘発されるものに類似する骨髄の内皮における形態学的変化を誘発することが知られている物質で処置した。これらのマウスのいずれも、Ｎ１３Ｍ４細胞または親糸Ｎ４１７を引き続いて注射したとき、）ＩＦＢＭ移植片中で転移を発生しなかった。こうして、ＩＩＦＲＭ移植片への転移の増強は、一般的な毒性それ自体のためではなく、照射により活性化された特定の、メカニズムのためであるように思われる。

活性化することができる１つの可能なメカニズムを取り扱うために、５ＣＩＤ− Ｉｌｌｊ−Ｂ１１マウスを、Ｎ１３Ｍ４またはＮ　４１　’／細胞の注射前に、ヒる。ＩＬＩαにより誘発される付着分子および／または成長因子がＨＦＢＭ移植片への５ＣＬＣ細胞の転移に関係する場合、ＳＣＩＤ−ｈｕ−８Ｍ中の後期肝Ｂ！１−１の実験的転移の増強が起こる。事実、表１０に示すように、５ＣＬＣ細胞の注射前に１１．１αを注射した５ＣＩＤ−ｈｕ　−８Ｍマウスにおいて、後期ＨＦＢＭへの種特異的転移の劇的な増加が観察された。放射線の処置を使用するときのように、この効果は選択した転移性変異型Ｎ４ＢＭ４に制限され、そして親Ｎ４１７細胞では観察されなかった。ｖ　−５ＣＬＣＨ８２は、初期！＋　Ｆ　Ｂ　Ｍへ転移性であり、また、放射線に暴露しないが、■１，１αに暴露したマウスにおいて後期旺ＢＭへの転移の頻度の増加を示した。こうして、照射は＋１８２ではな（−２Ｎ４ＢＭ４の後期ＨＦＢＭへの転写を増強した。異なる転移の挙動は、これらの細胞系上の血管の付着分子の発現の異なるパターンに関連させることができた。

表１０１０５ＣＩＤ−ｈｕ−Ｂウスニおける後期ＨＦＢＭへの５ＣＬＣの転移ヘノ照射、シクロホスファミドおよびＩＬＩαの処置の効果すべてのマウスに示した１０６細胞を静脈内注射し、そしてこれらのマウスを注射後５〜６週に殺した。　ＣＴＰ　、シクロホスファミド、静脈内注射した。ＩＰ、腹腔内注射、　ＩＶ、静脈内注射。

＊　選択の４ラウンドにおいて分離したＮ４１７の２つの独立の骨髄の転移性変異型を使用した。

＋　１３’ｌ（ｓ源からの体全体の照射。

これらの結果が示唆するように、後期ＨＦＢＭ移植片の微小環境を転移性病巣の発生のためにいっそう好適とする、ある種の条件をＴ−照射またはＩＬＩαにより誘発することができる。生体外の内皮への腫瘍細胞の付着への、および内皮の付着分子の発現の増加を介して仲介される、生体内の転移へのＩＬＩαの増強効果を、前の実験は証明した。われわれのデータはこれらの内皮の付着分子を拡張する。

われわれのデータは、これらの観察を、生体内で移植されたヒト組織へのヒト膿瘍細胞の特異的転移に拡張する。

前述の５ＣＩＤ−ｈｕマウスにおけるヒト肺癌系についての転移の挙動の実施例は、ヒト充実腫瘍の転移のプロセスを研究するためのモデルとして、５ＣＩＤ　 −ｈｕマウスの使用を例示する。　５ＣＩＤ−ｈｕ幼動物おいて、種特異的および器官特異的の両者の転移を研究することができる。

結果から明らかなように、ヒト肺癌細胞の転移特性は種特異的である。マウス肺に比較して、ヒト肺移植片の小さい大きさおよびより低い血管新生を考察するとき、とくに印象的である。５ＣＩＤ−ｈｕマウスにおける種特異的転移は、また、５ＣＬＣ以外のヒト癌細胞系を使用して観察することができる。転移の器官特異性を、異なるヒト器官の断片を移植した５ＣＩＤ−ｈｕマウスにおいて研究することができる。

このモデルは、問題のヒト組織に転移する増強した能力をもつ腫瘍細胞変異型の選択を可能とする。

この系は、細胞のタイプに無間係に、５ＣＬＣマウスの中に移植した任意のヒト組織へ転移する任意の種類のヒト腫瘍細胞の能力を評価するための道具を提供する。

この明細書の中に述べたすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物および特許出願を特定しかつ個々に引用によって加えると示すように、ここに引用によって加える。

本発明を完全に記載したが、当業者にとって明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱しないで多数の変化および変更が可フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３／４８　Ｚ　７０５５−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲＩ（７２）発明者　シュティベルマン、エミリアアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４００２゜ベルモント、モント　クレスタ　ドライブ（７２）発明者　マクセン、ジョセフ　エム。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２３゜サンフランシスコ、ユニオン　ストリート

Claims

【特許請求の範囲】

１．霊長類の腫瘍に対して向けられた治療をキメラ非霊長類哺乳動物宿主に適用し、前記哺乳動物宿主は機能的同系リンパ球を欠如する免疫欠損の非霊長類哺乳動物、霊長類の腫瘍細胞の増殖および／または転移のための環境を提供できる非新生物細胞からなる少なくとも１つの充実の正常の機能的な血管新生の霊長類胎児の器官組織、および移植された霊長類の腫瘍からなり；そして前記腫瘍の転移への前記処置の効果を決定する；ことからなる、前記治療の効能を評価する方法。
２．前記免疫欠損の非霊長類哺乳動物がマウスであり、そして前記霊長類がヒトである、請求の範囲１の方法。
３．前記マウスがｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ表現型である、請求の範囲２の方法。
４．前記少なくとも１つの充実の正常の機能的な血管新生の霊長類胎児の器官組織が少なくとも２つの明確な器官のタイプからなる、請求の範囲１の方法。
５．前記器官のタイプがヒト胎児肺およびヒト胎児骨である、請求の範囲４の方法。
６．前記抗転移処置が、二次転移部位への腫瘍細胞の付着を妨害する化合物の投与からなる、請求の範囲１の方法。
７．（ａ）機能的同系リンパ球を欠如する免疫欠損マウス；（ｂ）ヒト腫瘍の細胞の増殖のための環境を提供できる充実の正常の機能的な血管新生のヒト胎児の器官組織からなる第１移植片；および（ｃ）転移する前記ヒト腫瘍の前記細胞の増殖を受容しかつ支持できる、充実の正常の機能的な血管新生のヒト胎児の器官組織からなる第２移植片；からなるキメラマウス宿主を使用するヒト腫瘍の転移の可能性を評価する方法であって、前記腫瘍の細胞を前記第１移植片の中に導入し；転移を可能とするために十分な時間の間前記宿主を成長させ；そして前記第２移植片の中の前記ヒト腫瘍の前記細胞の存在を決定する；ことからなる前記方法。
８．前記第１移植片が骨でありそして前記第２移植片が肺である、請求の範囲７の方法。
９．機能的同系リンパ球を欠如する免疫欠損の非ヒト哺乳動物；ヒトの腫瘍細胞の増殖および／または転移のための環境を提供できる非新生物細胞からなる少なくとも１つの充実の正常の機能的な血管新生の霊長類胎児の器官組織；および移植されたヒトの腫瘍細胞；からなるキメラ非ヒト哺乳動物宿主。
１０．前記免疫欠損の非ヒト哺乳動物がマウスである、請求の範囲９のキメラ非ヒト哺乳動物宿主。
１１．前記マウスがｓｃｉｄ／ｓｏｉｄ表現型を有する、請求の範囲１０のキメラ非ヒト哺乳動物宿主。
１２．前記充実の正常の機能的な血管新生のヒト胎児の器官組織が少なくとも２つの明確な器官のタイプからなる、請求の範囲１のキメラ非ヒト哺乳動物宿主。
１３．前記器官のタイプがヒト胎児肺およびヒト胎児骨である、請求の範囲１２のキメラ非ヒト哺乳動物宿主。
１４．免疫グロブリンおよび丁細胞レセプター遺伝子の再配置における遺伝的欠陥の結果として、機能的同系ＢおよびＴリンパ球を欠如する免疫欠損マウス；ヒト腫瘍細胞の増殖のための環境を提供できる充実の正常の機能的な血管新生のヒト胎児の骨移植片；前記骨の中に移植された前記骨の中で増殖できるヒト腫瘍細胞；および転移する前記ヒト腫瘍細胞の増殖を受容しかつ支持できる、充実の正常の機能的な血管新生のヒト胎児の器官移植片；からなるキメラマウス宿主。