CN115747159A - 一种用于杀伤肿瘤的肿瘤相关淋巴结t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于杀伤肿瘤的肿瘤相关淋巴结T细胞及其制备方法和应用，该肿瘤相关淋巴结T细胞经CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)的混合物活化处理后得到。在本发明中，首次发现通过CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)在体外激活和扩增培养后，肿瘤引流淋巴结T细胞显示出了显著增强的肿瘤杀伤效果和肿瘤治疗效果，且经过回输后能够显著抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡，从而实现了肿瘤治疗的新方法、新手段。

Description

一种用于杀伤肿瘤的肿瘤相关淋巴结T细胞及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种用于杀伤肿瘤的肿瘤相关淋巴结T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

研究表明人体免疫系统能够对肿瘤产生特异的免疫反应。但肿瘤也能通过多种抑制机制压制抗肿瘤免疫反应，逃避免疫系统的攻击，从而无法实现基于人体自身免疫系统来自然杀灭肿瘤细胞的效果。

在肿瘤发生发展的过程中，识别肿瘤抗原的T细胞，即肿瘤抗原特异T细胞，会迁移到肿瘤组织中，通过识别肿瘤抗原杀伤肿瘤细胞。这些肿瘤抗原特异T细胞在攻击肿瘤的同时会发生增殖和扩增，因此肿瘤组织中含有更多的抗肿瘤T细胞。但是在肿瘤微环境中各种免疫抑制机制的作用下，这些肿瘤抗原特异T细胞逐渐失去功能，无法有效地攻击肿瘤，从而导致肿瘤的进展。

在相关技术中，有研究人员发现通过体外扩增培养肿瘤组织中的淋巴细胞，即肿瘤浸润淋巴细胞(TIL:Tumor infiltrating lymphocyte)，在达到较高的数量后，再回输给患者进行治疗，能够产生较好的治疗效果。但是由于TIL中大部分为不识别肿瘤抗原的旁观者T细胞，只有小部分为肿瘤抗原特异T细胞。因此TIL细胞只有经过上千倍的体外扩增培养，产生10¹⁰以上的肿瘤抗原特异T细胞后，回输治疗才能产生较好的治疗效果。早期TIL疗法主要集中在黑色素瘤，因为黑色素瘤主要为皮肤型，这个肿瘤亚型中的TIL含量比较高，培养的成功率约为40％。但是在其他肿瘤类型中的TIL含量偏低，培养成功率不到20％。而且在实际操作中大部分肿瘤是无法成功培养TIL的。因此目前TIL治疗存在极大的技术瓶颈和应用范围限制(受制于大部分肿瘤无法成功培养出TIL)。

此外，由于肿瘤组织中含有的淋巴细胞比率非常低，为了达到足够的细胞量，通常需要较多的肿瘤组织才能够保障足够的起始细胞量。而且现有技术中的培养流程也非常复杂，需要添加辅助细胞，经过多轮刺激后，才能够达到治疗所需要的细胞数量，培养时间通常需要近一个月。这些缺陷严重限制了TIL在临床中的应用。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于杀伤肿瘤的肿瘤相关淋巴结T细胞及其制备方法和应用。在本发明中，发明人发现通过使用本发明中的肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂对动物自体肿瘤相关淋巴结T细胞进行激活处理后，能够显著激活其对肿瘤细胞的识别和杀伤作用，使原本不具有或作用效果较弱的肿瘤相关淋巴结T细胞发挥出较好的抗肿瘤效果，从而为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路和治疗手段。

本发明的第一个方面，提供一种对自体肿瘤具有识别和杀伤效果的T细胞，该T细胞经过肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂激活。

在本发明的一些实施方式中，所述T细胞为肿瘤相关淋巴结T细胞。

在本发明中，发明人通过动物实验和人体实验，均验证了使用本发明第一个方面所述的肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂体外激活肿瘤患者自体的肿瘤相关淋巴结T细胞后，回输患者能够显著杀伤肿瘤细胞，从而治疗肿瘤。

在本发明中，所述肿瘤淋巴结T细胞包括肿瘤引流淋巴结(TdLN)T细胞和淋巴结清扫手术切除的淋巴结T细胞。

本发明通过比较不同来源的T细胞识别和攻击肿瘤细胞的能力，发现在小鼠肿瘤模型中除了肿瘤浸润T细胞外，在肿瘤附近的肿瘤引流淋巴结中同样存在一定的肿瘤识别效果，但对于肿瘤细胞的杀伤力较低，直接静脉回输入荷瘤小鼠也没有产生显著的治疗效果，且含量低于肿瘤浸润T细胞。而通过CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)在体外激活和扩增培养后，肿瘤引流淋巴结T细胞表现出了显著的肿瘤杀伤效果和肿瘤治疗效果。同样，在人的肿瘤淋巴结清扫手术所切除的肿瘤相关淋巴结中，同样存在抗肿瘤T细胞，且显著高于血液和肿瘤不相关淋巴结中的含量，但低于肿瘤组织中的含量。经过CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)在体外激活和扩增培养后的人肿瘤相关淋巴结T细胞(TAL-T:Tumor-Associated Lymphnode T cells)对自体PDX肿瘤产生了显著的疗效。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂包括：T淋巴细胞激活抗体和淋巴细胞活化因子。

在本发明的一些实施方式中，所述T淋巴细胞激活抗体包括CD3抗体和CD28抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述T淋巴细胞激活抗体的终浓度为5～20μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述T淋巴细胞激活抗体为CD3抗体和CD28抗体的组合。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述CD3抗体的终浓度为2.5～17.5μg/mL，所述CD28抗体的终浓度为2.5～17.5μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述CD3抗体的终浓度为5μg/mL，所述CD28抗体的终浓度为5μg/mL。

在本发明中，根据实际使用需要，所述CD3抗体和CD28抗体可以包括但不限于任意动物源，所述动物包括但不限于人、鼠、兔、狗、牛和猴子。

在本发明的一些具体实施方式中，所述CD3抗体和CD28抗体为鼠源或人源CD3抗体和CD28抗体。所述鼠源CD3抗体和CD28抗体均购自eBioscience(重组鼠源CD3单抗，16-0037-85；重组鼠源CD28单抗，16-0281-86)。所述人源CD3抗体和CD28抗体均购自近岸蛋白(重组人源化CD3单抗，GMP-A018；重组人源化CD28单抗，GMP-A063)。

需要说明的是，在本发明中，所述CD3抗体和CD28抗体包括但不限于任意以CD3和/或CD28为抗原制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。本领域技术人员可以根据实际条件或情况，合理选择特定类型的CD3抗体和CD28抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述淋巴细胞活化因子包括白细胞介素2。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述淋巴细胞活化因子的终浓度为500～2000U/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，所述淋巴细胞活化因子的终浓度为1000U/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中还包括独立的淋巴细胞活化因子。

在本发明的一些具体实施方式中，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中的各组分可以采用独立包装的方式(即独立包装的白细胞介素2(IL2)、CD3抗体和CD28抗体)或采用预混的包装方式(即预先混合好的白细胞介素2(IL2)、CD3抗体和CD28抗体的混合物)。当采用预混的包装方式时，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中还独立存在单独包装的白细胞介素2(IL2)。

在本发明的一些实施方式中，所述单独包装的白细胞介素2(IL2)与预混后的混合物中的白细胞介素2(IL2)终浓度相同，均为500～2000U/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肺癌、卵巢癌、头颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌和胆管癌。

在本发明中，发明分别通过动物实验和人体实验，验证了原始的肿瘤引流淋巴结(TdLN)T细胞不具有肿瘤杀伤效果，不能实际用于肿瘤的治疗。而在使用本发明第一个方面所述的肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂体外激活后，激活后的肿瘤引流淋巴结(TdLN)T细胞具有较好的肿瘤杀伤效果，能够在回输至动物或人体内后对肿瘤具有较好的治疗效果，显著抑制了肿瘤的生长并加速了肿瘤细胞的凋亡。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的T细胞的制备方法，包括如下步骤：

提取自体抗肿瘤T细胞，使用T淋巴细胞激活抗体和淋巴细胞活化因子的混合物对自体抗肿瘤T细胞培养2～4天后，再使用淋巴细胞活化因子单独培养6～8天，即可。

在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤T细胞为肿瘤淋巴结T细胞。

在本发明中，所述肿瘤淋巴结T细胞包括肿瘤引流淋巴结(TdLN)T细胞和淋巴结清扫手术切除的淋巴结T细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肺癌、卵巢癌、头颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌和胆管癌。

在本发明的一些实施方式中，所述T淋巴细胞激活抗体为CD3抗体和CD28抗体的组合。

在本发明的一些实施方式中，所述淋巴细胞活化因子为白细胞介素2。

在本发明的一些实施方式中，所述制备方法具体为：先将肿瘤淋巴结T细胞在终浓度分别为2.5～17.5μg/mL的CD3抗体和CD28抗体，以及终浓度为500～2000U/mL的IL2的混合液中培养2～4天，然后使用终浓度为500～2000U/mL的IL2单独培养6～8天，即可。

在本发明的一些实施方式中，所述CD3抗体的终浓度为5μg/mL，所述CD28抗体的终浓度为5μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述IL2的终浓度为1000U/mL。

在本发明中，发明人分别将小鼠外周血，肿瘤不相关淋巴结，肿瘤引流淋巴结(肿瘤附近淋巴结)，以及肿瘤组织来源的T细胞与相应的肿瘤细胞共培养，比较这些T细胞在肿瘤细胞刺激过程中表达效应细胞因子IFNg的水平，评估不同组织来源的T细胞识别肿瘤细胞的能力。发现肿瘤浸润T细胞和肿瘤引流淋巴结T细胞都表达了较高的IFNg水平，显著高于血液和肿瘤不相关淋巴结中T细胞的IFNg水平，表明肿瘤组织和肿瘤相关淋巴结中均有较高的抗肿瘤T细胞含量。然而，当将这些T细胞直接用于体外肿瘤杀伤和体内肿瘤治疗时，外周血，肿瘤不相关淋巴结，肿瘤引流淋巴结来源的T细胞都没有产生明显的体外杀伤和体内治疗效果。只有肿瘤浸润T细胞表现出了一定的体外杀伤和体内治疗效果。在通过CD3/CD28抗体+IL2对这些T细胞进行体外激活和扩增培养后，肿瘤浸润T细胞和肿瘤引流淋巴结T细胞都表现出了较好的体外杀伤和体内治疗效果，而外周血和肿瘤不相关淋巴结来源的T细胞则没有产生体外杀伤和体内治疗效果。

此外，进一步发现在人的肿瘤淋巴结清扫手术所切除的肿瘤相关淋巴结中，同样存在较高水平的抗肿瘤T细胞，略低于肿瘤浸润T细胞的含量。通过CD3/CD28抗体+IL2体外激活并扩增培养这些T细胞，回输到自体PDX肿瘤小鼠模型中进行治疗，发现肿瘤相关淋巴结T细胞表现出了与肿瘤浸润T细胞类似的治疗效果。表明通过CD3/CD28抗体+IL2在体外刺激和扩增制备的肿瘤相关淋巴结T细胞，可有效用于肿瘤治疗。从而确定了基于激活后的小鼠肿瘤引流淋巴结和人肿瘤相关淋巴结T细胞的抗肿瘤作用，实现了一种通过CD3/CD28抗体+IL2在体外培养制备肿瘤相关淋巴结T细胞以用于肿瘤治疗的新方法。

本发明的第三个方面，提供一种肿瘤免疫治疗药物或药物组合，该肿瘤免疫治疗药物或药物组合中含有本发明第一个方面所述的T细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物或药物组合中还含有其他药学上可接受的辅剂和/或抗肿瘤药物。

在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物或药物组合为输注剂。

在本发明的一些实施方式中，所述输注剂的给药方式包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、鞘内注射。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物或药物组合的类型包括但不限于溶液型、混悬型、乳剂型和粉针型。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的T细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物的使用方法为：提取患者自体肿瘤淋巴结相关T细胞，使用本发明第一个方面所述的肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂进行激活后，回输至患者体内，即可。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物的给药方式为输注给药。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物的给药频率为为每3-7天使用1次。

在本发明的一些实施方式中，所述给药频率为：每3天、每7天、每14天使用一次。

在本发明的一些实施方式中，所述给药的剂量为5×10⁵～5×10⁷个细胞/20g小鼠体重。当然，本领域技术人员可以根据实验体动物之间的剂量换算关系，合理得到其他动物体，包括但不限于人、大鼠、狗、猪等。

在本发明的一些实施方式中，所述给药的剂量为5×10⁶个细胞/20g小鼠体重。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次发现，通过CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)在体外激活和扩增培养后，相比未经任何处理的肿瘤引流淋巴结T细胞，激活后的肿瘤引流淋巴结T细胞表现出了显著的肿瘤杀伤效果和肿瘤治疗效果。

2.本发明建立了一种通过CD3/CD28抗体+白细胞介素2(IL2)在体外激活和扩增培养肿瘤相关淋巴结T细胞的方法，通过该方法得到的肿瘤相关淋巴结T细胞可用于肿瘤治疗，从而实现了肿瘤治疗的新方法、新手段。

附图说明

图1为小鼠肿瘤模型中不同来源的T细胞与肿瘤细胞共培养后的IFNg表达情况。

图2为小鼠肿瘤模型中不同来源的T细胞直接杀伤肿瘤细胞的效果.

图3为小鼠肿瘤模型中不同来源的T细胞直接回输治疗肿瘤的效果。

图4为小鼠肿瘤模型中不同来源的T细胞经CD3/CD28抗体+IL2激活培养后对肿瘤细胞的杀伤效果。

图5为小鼠肿瘤模型中不同来源的T细胞经CD3/CD28抗体+IL2激活培养后对肿瘤的治疗效果。

图6为人的不同来源T细胞在与自体肿瘤细胞共培养后的IFNg表达水平。

图7为人不同来源的T细胞经CD3/CD28抗体+IL2激活培养后对自身PDX肿瘤的治疗效果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1未刺激的小鼠肿瘤相关淋巴T细胞对肿瘤细胞的识别效果和杀伤效果

在野生型C57BL/6小鼠的皮下分别接种不同的肿瘤细胞，具体为B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)、MC38细胞(小鼠结肠癌细胞)、LLC细胞(小鼠Lewis肺癌细胞)。在接种后第12天，处死小鼠，取外周血、不相关淋巴结(本实施例中肿瘤接种部位为小鼠下肢腹股沟处，不相关淋巴结取自对侧上肢淋巴结，但不相关淋巴结不限于此处，概指肿瘤远端淋巴结)、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织，通过流式分选获得外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞，然后将外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织的CD3+T细胞分别与对应的肿瘤细胞进行共孵育。其中，孵育体系中，CD3+T细胞的加入量分别设置为2万、6万和18万(分别对应效靶比1:1，3:1，9:1)，对应的肿瘤细胞加入量为2万，孵育环境为5％ CO₂，37℃。孵育48小时后，使用BD胞内因子检测试剂盒对孵育体系内的T细胞进行IFNg胞内染色，通过流式分析检测不同样本来源的T淋巴细胞的IFNg表达水平，从而评估不同样本来源的T细胞识别肿瘤细胞的能力。

同时，使用LDH乳酸脱氢酶检测试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况，以评估不同样本来源的T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤效果。

结果如图1和2所示。

可以发现，小鼠肿瘤浸润T细胞(即肿瘤组织来源的CD3+T细胞)和肿瘤引流淋巴结T细胞(即肿瘤引流淋巴结来源的CD3+T细胞)的IFNg水平显著高于血液T细胞(即外周血来源的CD3+T细胞)和肿瘤不相关淋巴结T细胞(即不相关淋巴结来源的CD3+T细胞)，表明肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的T细胞具有更强的识别肿瘤的能力。但是如图2中展示的不同来源的T细胞直接杀伤肿瘤细胞的效果来看，只有肿瘤来源的T细胞对肿瘤细胞表现出了一定的直接杀伤效果，血液，肿瘤不相关淋巴结和肿瘤引流淋巴结来源的T细胞均未表现出明显的直接杀伤效果。

为了进一步验证上述结论，将上述实施例中得到的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞回输给对应的荷瘤7天的小鼠进行治疗，每只小鼠在第7和第10天分别静脉注射5×10⁶个对应的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织的CD3+T细胞进行治疗，每3天测量肿瘤的大小，检测肿瘤的生长情况。

结果如图3所示。

可以发现，只有肿瘤来源的T细胞表现出了一定的治疗效果，血液，肿瘤不相关淋巴结和肿瘤引流淋巴结来源的T细胞均未表现出治疗效果。

上述结果表明，小鼠肿瘤浸润T细胞(即肿瘤组织来源的CD3+T细胞)能够识别肿瘤细胞，直接回输肿瘤浸润T细胞能够起到一定的治疗效果。而小鼠肿瘤引流淋巴结T细胞虽然也具有能够识别肿瘤细胞的作用，但直接杀伤肿瘤细胞的能力较低，直接回输也不能产生对肿瘤的治疗效果。

实施例2CD3/CD28抗体+IL2体外激活和扩增提高小鼠肿瘤引流淋巴结T细胞的肿瘤杀伤能力和肿瘤治疗效果

在本实施例中，采用CD3/CD28抗体+IL2在体外激活并扩增T细胞的方式来提高T细胞的杀伤功能，以使原本不具有杀伤功能或杀伤功能较弱的T细胞同样具有较好的杀伤效果。

取上述实施例中获得的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞，加入至终浓度为5μg/mL的CD3抗体、5μg/mL的CD28抗体和1000U/mL的IL2的细胞培养液(RPMI 1640,10％ FBS,20mM HEPES,1mM sodium pyruvate,0.05mM2-mercaptoethanol,2mM L-glutamine,100μg/mL streptomycin and 100μg/mLpenicillin)中，激活(孵育)3天，孵育环境为5％ CO₂，37℃。然后去除培养液，更换为含有终浓度1000U/mL的IL2的培养液继续体外培养7天，得到激活后的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞。

将激活后的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞与对应的肿瘤细胞共孵育24小时，检测肿瘤细胞的凋亡，评估这些T细胞杀伤肿瘤细胞的效果。孵育方式、检测方法以及评估手段同上述实施例。

结果如图4所示。

可以发现，肿瘤引流淋巴结来源与肿瘤来源的T细胞均表现出了较高的肿瘤杀伤效果，而外周血和不相关淋巴结来源的T细胞则没有观察到杀伤效果。上述结果表明，通过CD3/CD28抗体+IL2在体外激活和扩增能够显著提高肿瘤引流淋巴结T细胞杀伤肿瘤的功能。

为了评估这些体外激活扩增培养的T细胞对肿瘤的实际治疗效果，采用上述实施例中的方法，将激活后的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞过继性回输至对应的肿瘤大小相近的荷瘤小鼠体内进行疗效测试。实验小鼠同样均为荷瘤7天的小鼠，每只小鼠在第7和第10天分别静脉注射5×10⁶个对应激活后的外周血、不相关淋巴结、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织来源的CD3+T细胞进行治疗，从回输当天开始测量皮下肿瘤的大小，观察小鼠的生长情况，以评估激活后的不同来源的T细胞对小鼠肿瘤的治疗作用。

结果如图5所示。

可以发现，激活后的小鼠肿瘤组织和肿瘤引流淋巴来源的T细胞均显著抑制了肿瘤的生长，而激活后的血液和肿瘤不相关淋巴结来源的T细胞则没有表现出治疗效果。上述结果表明，通过CD3/CD28抗体+IL2在体外激活能够显著提高肿瘤引流淋巴结T细胞治疗肿瘤的效果。

实施例3人肿瘤相关淋巴结T细胞对于肿瘤细胞的识别能力

为了评估肿瘤患者(人)的肿瘤相关淋巴结T细胞是否能够有效识别肿瘤细胞，分别从肺癌，卵巢癌，头颈癌，黑色素瘤，乳腺癌，肠癌，肝癌，宫颈癌，肾癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，食管癌，胰腺癌，胆管癌等不同肿瘤类型患者处收集外周血、手术切除的肿瘤组织、淋巴结清扫切除后得到的肿瘤相关淋巴结作为样品。

分别通过流式分选样品中的CD3+T细胞，然后将得到的CD3+T细胞与对应的肿瘤细胞进行共培养48小时，培养方法同实施例1。通过流式分析检测不同来源T淋巴细胞表达IFNg的水平，从而评估不同来源的T细胞对肿瘤细胞的识别能力。

图6展示了其中部分代表性结果。可以发现，在不同肿瘤类型中，均观察到肿瘤组织和肿瘤相关淋巴结来源的T细胞的IFNg水平显著高于外周血T细胞，表明在大部分肿瘤类型中，肿瘤和肿瘤相关淋巴结中的T细胞具有较高识别肿瘤的能力。

实施例4CD3/CD28抗体+IL2体外激活培养的人肿瘤相关淋巴结T细胞在自体PDX肿瘤中的治疗效果

为了评估激活后的患者(人)肿瘤相关淋巴结T细胞的实际治疗效果，按照实施例3中的方法，分别从肺癌，卵巢癌，头颈癌，黑色素瘤，乳腺癌，肠癌，肝癌，宫颈癌，肾癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，食管癌，胰腺癌，胆管癌等不同肿瘤类型患者处收集外周血、手术切除的肿瘤组织、淋巴结清扫切除后得到的肿瘤相关淋巴结作为样品，采用流式分选样品中的CD3+T细胞，冻存备用。

同时利用患者的肿瘤组织在NSG免疫缺陷小鼠中构建人源肿瘤异种移植(Patient-derived tumor xenograft,PDX)模型，构建方法为：选择4-6周龄的NOG免疫缺陷小鼠，将肿瘤组织样本剪成约3mm³大小的小块，手术植入2块肿瘤组织小块直接至小鼠皮下，最后以可吸收线缝合皮肤切口。肿瘤移植后，定期观察小鼠状态及肿瘤生长情况，记录肿瘤体积及小鼠体重变化曲线。移植成功的肿瘤继续在免疫缺陷鼠中传代1-2次，选择成功生长的PDX模型用于后续实验。

小鼠PDX模型构建成功后，复苏冻存的对应患者来源的外周血、肿瘤相关淋巴结和肿瘤浸润T细胞后，按照实施例2中的方法，加入至终浓度为5μg/mL的CD3抗体(近岸蛋白,重组人源化CD3单抗，GMP-A018)、5μg/mL的CD28抗体(近岸蛋白,重组人源化CD28单抗，GMP-A063)和1000U/mL的IL2的细胞培养液(RPMI 1640,10％ FBS,20mM HEPES,1mM sodiumpyruvate,0.05mM 2-mercaptoethanol,2mM L-glutamine,100μg/mL streptomycinand100μg/mL penicillin)中，激活(孵育)3天。去除培养液，更换为含有终浓度1000U/mL的IL2的培养液继续体外培养7天，得到激活后的外周血、肿瘤相关淋巴结和肿瘤浸润T细胞。然后将激活后的外周血、肿瘤相关淋巴结和肿瘤浸润T细胞分别回输到肿瘤体积生长至约40～50mm²的对应的PDX荷瘤小鼠中进行治疗。间隔7天回输一次，每次回输5×10⁶个激活后的T细胞，共回输两次，每次细胞回输后第二天起给予小鼠5万U/200ul IL-2，腹腔给药，每天1次，持续5天。从回输当天开始测量PDX肿瘤的大小，观察小鼠的生存情况，从而评估不同来源的T细胞对自体PDX肿瘤的治疗作用。

结果如图7所示。

可以发现，激活后的肿瘤浸润T细胞和肿瘤相关淋巴结T细胞均显著抑制了肿瘤的生长。结合实施例3中的结果，进一步证实了CD3/CD28抗体+IL2激活培养显著增强了人肿瘤相关淋巴结T细胞对于肿瘤的治疗效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种对自体肿瘤具有识别和杀伤效果的T细胞，其特征在于，所述T细胞经过肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂激活。

2.根据权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞为肿瘤淋巴结T细胞。

3.根据权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂包括：T淋巴细胞激活抗体和淋巴细胞活化因子。

4.根据权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞激活抗体包括CD3抗体和CD28抗体；所述淋巴细胞活化因子包括白细胞介素2。

5.根据权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述肿瘤免疫杀伤T细胞激活剂中，T淋巴细胞激活抗体的终浓度为5～20μg/mL，所述淋巴细胞活化因子的终浓度为500～2000U/mL。

6.根据权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、卵巢癌、头颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌和胆管癌。

7.权利要求1～6任一项所述的T细胞的制备方法，包括如下步骤：

提取自体抗肿瘤T细胞，使用T淋巴细胞激活抗体和淋巴细胞活化因子的混合物对自体抗肿瘤T细胞培养2～4天后，再使用淋巴细胞活化因子单独培养6～8天，即可。

8.一种肿瘤免疫治疗药物或药物组合，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物或药物组合中含有权利要求1～6任一项所述的T细胞。

9.根据权利要求8所述的肿瘤免疫治疗药物或药物组合，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物或药物组合中还含有其他药学上可接受的辅剂和/或抗肿瘤药物。

10.权利要求1～6任一项所述的T细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

Images