CN109576217A

CN109576217A - 调节干细胞的免疫调节作用的方法

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Publication number: CN109576217A
Application number: CN201811227664.6A
Authority: CN
Inventors: 时玉舫; 任光文; 张莉英
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2013-12-14
Publication date: 2019-04-05
Also published as: JP2016504324A; KR20150118100A; EP2931877A4; AU2020201856B2; AU2020201856A1; KR20200138833A; AU2013358904B2; CN105008521B; EP3587562A1; AU2013358904A1; JP6654670B2; JP2020075935A; JP6377632B2; KR102353601B1; EP2931877B1; EP2931877A1; KR102188605B1; WO2014093948A1; ES2756336T3; DK2931877T3

Abstract

本发明提供了在预防和治疗各种疾病例如多发性硬化症、关节炎、狼疮、脓毒症、肝炎、硬化症、帕金森氏病、慢性感染和移植物抗宿主病(GvHD)中使用炎性细胞因子对1‑ISC进行预处理以增大它们的免疫调节作用的方法或试剂盒。本发明涉及用于增强间充质干细胞(JvfSCs)的免疫抑制活性或免疫刺激活性的新颖方法。

Description

调节干细胞的免疫调节作用的方法

本发明是申请号为201380072996.0，申请日为2013年12月14日，申请类型为发明，发明名称为调节干细胞的免疫调节作用的方法的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于增强间充质干细胞(MSC)的免疫抑制活性或免疫刺激活性的新颖方法。

政府利益

本发明是在来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金号为GM866889、DE014913和DE019932以及来自新泽西州科学技术委员会 (New JerseyCommission on Science and 0echnology)的干细胞基金 (NJCST-2042-014-84)的支持下完成的。

背景技术

细胞治疗包括用于任何目的施用活细胞，包括任何病症的诊断或者预防目的，例如再生医学、移植以及甚至是癌症。据信，干细胞在细胞治疗中具有巨大的潜力。但是，其在临床环境中有效的使用由于各种原因一直没有清楚。

干细胞具有两个将它们区别于其他类型的细胞的明显特征。第一，它们是非特化的并且能够长期自我更新而在它们的一般性能上没有显著的改变。第二，在某些生理或者实验条件下，干细胞可以被诱导分化成各种各种特化细胞类型。因此，干细胞对于再生医学大有希望。有两种主要类型的干细胞：胚胎干(ES)细胞和成体干细胞。

成体干细胞存在于很多成熟的组织中，例如存在于骨髓、肌肉、脂肪和大脑中。虽然大多数成体干细胞研究集中于CD34+造血干细胞，但是，CD34- 成纤维细胞样间充质干细胞(MSC)的独特谱系尤其是源自于骨髓的那些一直引起基础和临床研究者明显注意(Chen等.(2006)Immunol.Cell Biol.84： 413-421；Keating(2006)Curr.Opin.Hematol.13：419-425；Pommey&Galipeau (2006)Bull.Cancer 93：901-907)。骨髓衍生的MSC一直显示出分化为若干不同细胞类型的组织，例如软骨、骨、肌肉和脂肪组织(Barry&Murphy(2004)Int.J.Biochem.Cell Biol.36：568-584；Le Blanc&Ringden(2006)Lancet 363： 1439-1441)。

间充质干细胞对于再生医学和自体免疫性疾病具有很大的潜力，并且在临床试验中已经被评价为治疗很多不同类型的疾病，包括肝纤维化、糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和克罗恩病。MSC能够有助于所移植的骨髓、分化自胚胎干细胞的细胞、或者被诱导的多能干(iPS)细胞的移植。因此，MSC 的免疫抑制行为能够在对抗这些病症中提供有益的方法。

从另一个角度看，免疫系统在对抗肿瘤形成和发展中发挥重要的作用。肿瘤总是伴随免疫抑制微环境。MSC具有特异性地转移到肿瘤的固有能力，并且曾有提议作为肿瘤特异性载体用于递送抗肿瘤试剂。实际上，MSC已经被遗传改造为表达各种抗肿瘤因子，包括I型干扰素、TRAIL、IL-12和LIGHT，并且已经显示出在动物模型中具有强效的抗肿瘤作用。因此，通过使用MSC 引导刺激影响来增强抗肿瘤免疫反应对于进一步的癌症治疗来说大有希望。

MSC调节免疫反应、抑制或诱导的基本体内机制远未清楚。更为重要的是，MSC的临床作用随宿主的生理学和病理学状态和MSC本身经历的微环境发生显著的变化。因此，存在在临床环境中进一步理解和开发出成功利用 MSC的免疫调节作用的方案的需要。

发明内容

本发明描述了用于通过驯化MSC群抑制和诱导免疫反应的方法。本发明还提供了使用基因修饰的MSC的免疫佐剂的新来源。

对于治疗应用，本发明的药物组合物能够作为试剂盒提供。本发明的试剂盒含有药学可接受的载体；分离的间充质干细胞群；分离的IFNγ；分离的 IL-lα；I型干扰素(IFN-I例如IFN-α、IFN-β)、转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGF)、分离的白介素-17A(IL17-A)和肿瘤坏死因子(TNF)。在另一个方面，所述试剂盒可以含有在用于减弱免疫反应和/或诱导或者加强免疫反应的方法中使用所述试剂盒的说明书。在又一个实施方式中，所述试剂盒含有药学可接受的载体、免疫抑制分子的抑制剂(例如NO合成酶(iNOS) /吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)抑制剂)、用于加强或者抑制免疫反应的其他细胞因子或者治疗制剂。

在本发明的一个方面，含有分离纯化的MSC、IFNγ和IL-17A的组合物被描述为与药学可接受的载体的混合物。本发明还提供了包含分离的MSC、 IFNγ、TNFα、IL-1和IL-17与药学可接受的载体的混合物的组合物。

在本发明的另一个方面，用于调节免疫反应的方法被描述为通过向需要治疗以抑制或诱导受试者的免疫反应的受试者施用有效量的含有分离的MSC 的组合物来进行，所述MSC已经使用IFNγ以及细胞因子IL-1α；IFN-I、TGFβ、 FGF、TNFα或IL-17中的任何一种以及它们的任意组合处理过。在另一个实施方式中，通过施用有效量的含有分离的MSC的组合物来增强(与没有接受这种治疗或者接受抗炎药物(包括皮质类固醇)或者非甾族抗炎药物以抑制免疫的受试者相比)受试者中的免疫抑制，所述MSC已经使用IFNγ以及细胞因子IL-1α、IL-1β、TNFα或IL-17中的任何一种处理过。

下文以实施例的形式描述优选的方法和材料，所述实施例拟用于展示而非限制本发明。本领域技术人员将认识与在此描述的那些方法和材料类似或者等效并且能够用于实践或者检测本发明的方法和材料。根据所详细描述的说明书以及权利要求书将明了本发明的其他特征和优点。

附图说明

图1是显示由MSC引起的免疫抑制被促炎细胞因子诱导的图。向克隆得到的MSC增补所示的重组细胞因子(各20ng/ml)的组合8小时，然后与CD4+T 细胞母细胞(blast)按1：20的比例(MSC：T细胞)共培养，再过8小时后进行增殖评估。数值表示为采用不同克隆的三个实验的代表的五个孔的平均值+SD。*p<0.001。

图2是显示iNOS-缺陷型MSC加强DTH的图。C57BL/6小鼠使用在完全弗氏佐剂中的OVA通过尾巴基部注射进行免疫。小鼠在第7天使用200μg 聚合(aggregated)OVA在脚掌中进行挑战，所述OVA和或者不和野生型或者iNOS^-/-MSC(2.5x10⁵细胞)一起施用。在24小时后确定脚掌厚度增量作为DTH的度量。数据显示为三个实验的代表的平均值+SD。*p<0.005，相对于单独的OVA。

图3是显示MSC以依赖于炎性细胞因子和NO的方式预防GvHD的图。对受体小鼠(C57BL/6xC3H，F1)进行致死辐射并且使用C57BL/6骨髓细胞加上脾细胞进行静脉内注射。在骨髓移植后第3天和第7天，对受体施用所示的MSC。对于一些野生型MSC组，腹膜内注射L-NMMA、抗IFNγ或抗 TNFα、IL-1α和IL-1β的三抗体混合物(三抗体)。每天对存活进行监测，监测12周。

图4是显示淋巴瘤基质细胞(LSC)以NO依赖型方式促进淋巴瘤形成的图。355个B-细胞淋巴瘤细胞系(C3H-gld/gld背景，0.5x10⁶细胞/小鼠)通过在第0天尾巴静脉与gld/gld小鼠衍生的淋巴瘤基质细胞(C3H背景，P5， 0.25x10⁶细胞/小鼠)共注射。1400W(NOS抑制剂，0.1mg/小鼠)通过在第 0、2、4、8、12、16、20、24和28天进行腹膜内注射。当小鼠频临死亡时记录小鼠存活。

图5是显示NOS抑制剂和IFNγ的组合促进小鼠黑素瘤治疗的图。B16-F0 黑素瘤细胞在第0天通过静脉内注射到C57BL/6小鼠中(0.5x10⁶细胞/小鼠)。在第4、8、12、16、20天通过腹膜内注射施用IFNγ(250ng/小鼠)和1400W (NOS抑制剂，0.1mg/小鼠)。在小鼠频临死亡时记录小鼠存活。

图6：IL-17A在mRNA和蛋白水平两者上大大增强了小鼠BM-MSC中的炎性细胞因子诱导性iNOS表达。BM-MSC使用所示细胞因子处理。iNOS基因表达通过实时PCR进行测量。

图7：IL-17A显著地促进了MSC介导的免疫抑制作用。将MSC细胞和T细胞杂交瘤A1.1细胞系以1：20的比例共培养。向共培养物增补IFNγ+TNFα或IL-17A+IFNγ+TNFα。细胞增殖通过O.D.570nm指示的细胞密度来量度。

图8：IL-17A预防了iNOS mRNA的衰减，(A)iNOS mRNA稳定性在 IFNγ+TNFα和IFNγ+TNFα+IL-17A治疗组中放线菌素D治疗后不同的时间点测量。(B)在IFNγ和TNFα治疗后的不同时间点IL-17A的iNOS表达增强作用。

图9：(A)克隆得到的MSC首先使用重组细胞因子IFNγ、TNFα、IL-17A (各2ng/ml)的所示组合处理12小时，然后与CD4⁺T细胞母细胞按1：20 比例(MSC：T细胞)共培养，并且再过12小时后通过³H-胸腺嘧啶引入法 (incorporation)评价增殖。(B)MSC或者Raw 264.7(巨噬细胞)中的IL-17 受体家族成员的mRNA表达通过RT-PCR.NC：No RT进行检查。(C)IL-17RA 的表面表达通过免疫荧光或者流式细胞法在克隆得到的MSC中进行检查。(D 和E)MSC首先在使用或者不使用IL-17A(10ng/ml)的情况下使用IFNγ和 TNFα处理。IFNγ和TNFα以不同的细胞因子浓度增补12小时，然后与CD4⁺T 细胞母细胞(D)或者T细胞杂交瘤A1.1细胞(E)按1：20的比例共培养 12小时。T细胞增殖通过³H-Tdr引入法进行测量。(F)MSC首先采用和梯度浓度的IL-17A一起的IFNγ和TNFα(2ng/ml)处理12小时，然后与T细胞杂交瘤A1.1细胞按1：10的比例共培养12小时。T细胞增殖通过³H-胸腺嘧啶引入法进行测量。(G)MSC与新鲜的C57BL/6脾细胞加上抗CD3、抗CD28 和抗IL-17A的抗体按1：20或1：40的比例(MSC：脾细胞)共培养48小时，然后通过³H-胸腺嘧啶引入法评价细胞增殖。增殖数值表示为来自三个实验的代表的三个孔的平均值±SEM。

图10：(A和C)MSC与炎性细胞因子IFNγ、TNFα、IL-17A(10ng/ml) 的不同组合共培养12小时，然后收获细胞进行RNA提取。炎性分子iNOS、 IL-6、CXCL1(A)和趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10(C)的mRNA 表达水平通过定量RT-PCR进行检测。(B)MSC与炎性细胞因子IFNγ、TNFα、 IL-17A(10ng/ml)的不同组合共培养24小时，并且通过Western印迹检测iNOS 的蛋白水平。(D)向MSC增补经抗IL-17A的抗体预处理的Sup-CD3或Sup-CD3，并且在12小时之后收集细胞进行RNA提取。iNOS、IL-6、CXCL1、CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达通过定量RT-PCR进行测量。Sup-CD3：来自被抗CD3和抗CD28激活的脾细胞的上清液。(E)MSC使用经抗IL-17A 的抗体预处理的Sup-CD3或Sup-CD3进行处理，并且在24小时之后通过Western印迹评价iNOS的蛋白水平。mRNA表达数值为来自三个独立实验的代表的三个孔的平均值±SEM。Western印迹数据来自三个独立实验的代表。

图11：(A)Act1敲低的MSC或者对照使用IL-17A处理不同的时间，并且通过Western印迹评价IκBα、ERK、p65、JNK的磷酸化水平。(B)Act1 敲低的MSC或者对照在用或者不用IL-17A的情况下使用IFNγ和TNFα处理 (全部细胞因子以5ng/ml增补)。通过Western印迹评价iNOS和Act1的蛋白水平。(C)MSC(Act1敲低或对照)使用不同的细胞因子处理12小时，并且通过定量RT-PCR测量iNOS表达。mRNA表达数值为平均值±SEM。(D) MSC(Act1敲低或者对照)首先在用或者不用IL-17A的情况下使用IFNγ和 TNFα处理(全部细胞因子都以5ng/ml增补)12小时，然后与T细胞杂交瘤 A1.1细胞按1：10的比例共培养12小时。T细胞增殖通过³H-Tdr引入法测量，以单独A1.1的增殖水平作为100％。

图12：(A)WT MSC或者auf1^-/-MSC使用IFNγ和TNFα处理，或者使用IFNγ和TNFα与IL-17A一起进行处理(全部细胞因子都以10ng/ml增补) 12小时，并且iNOS、IL-6和CXCL1表达通过定量RT-PCR测量。mRNA表达数值为三个独立实验的代表的三个孔的平均值±SEM。(B)WT MSC使用 IFNγ和TNFα(10ng/ml)处理，或者使用IFNγ和TNFα(10ng/ml)与不同浓度的IL-17A一起进行处理；auf1^-/-MSC使用IFNγ和TNFα(10ng/ml)处理，或者使用IFNγ和TNFα(10ng/ml)与10ng/ml的IL-17A一起处理。24小时之后，收获细胞用于通过Western印迹进行iNOS检测。Western印迹是三个独立实验的代表。

图13：(A和B)野生型(A)或auf1^-/-MSC(B)在用或者不用IL-17A 的情况下使用IFNγ和TNFα处理(所有细胞因子全部以10ng/ml增补)6小时，然后添加放线菌素D(5μg/ml)以终止转录。在所示的时间点，通过定量RT-PCR分析mRNA水平，以添加放线菌素D时的表达水平作为100％。mRNA 表达数值为来自三个独立实验的代表的三个孔的平均值±SD。

图14：(A)WT MSC或auf1^-/-MSC首先在使用或者不使用IL-17A的情况下使用IFNγ和TNFα处理(所有细胞因子全部以5ng/ml增补)12小时，并且然后与T细胞杂交瘤A1.1细胞按1：10的比例共培养12小时。T细胞增殖通过³H-Tdr引入法测量，以单独的A1.1的增殖水平作为100％。(B) WT MSC或auf1^-/-MSC首先在使用或者不使用IL-17A(10ng/ml)的情况下使用IFNγ和TNFα处理12小时，IFNγ和TNFα以不同的细胞因子浓度增补，并且然后与T细胞杂交瘤A1.1细胞按1：10的比例共培养12小时。T细胞增殖通过³H-Tdr引入法测量，以单独的A1.1的增殖水平作为100％。

图15：(A)测量ALT的血清水平(n＝3-5小鼠/组)。(B)肝组织中的单核细胞(MNC)的绝对数量的计算。(C)CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞的绝对数量通过流式细胞法确定。(D)施用ConA后8小时的肝切片的H&E染色。 a.未处理小鼠；b.ConA+PBS；c.ConA+野生型MSC；d.ConA+IFNγ+TNFα预处理野生型MSC；e.ConA+IFNγ+TNFα+IL-17A预处理野生型MSC；f. ConA+auf1^-/-MSC；g.ConA+IFNγ+TNFα预处理auf1^-/-MSC；h. ConA+IFNγ+TNFα+IL-17A预处理auf1^-/-MSC。

图16：I型干扰素和FGF-2通过减弱NO的生成来下调MSC的免疫抑制作用。(A)在没有影响STAT1和NFκB途径中的有关转录因子的情况下，I 型IFN(IFNα)抑制MSC中的IFNγ+TNFα-诱导的iNOS蛋白表达。(B)增补I型IFN：IFNα或β令人惊讶地抑制了MSC+脾细胞+抗CD3体系中的MSC 介导的免疫抑制。(C)FGF-2(FGFβ)抑制了在MSC中受IFNγ+TNFα或 IFNγ+IL-1β诱导的NO生成，这由培养物上清液中的硝酸盐含量来反映。(D) 增补FGF-2显著地降低了MSC在MSC+脾细胞+抗CD3体系中的免疫抑制作用。

图17：(A)间充质干细胞(MSC)中的可诱导性小鼠一氧化氮合成酶 (iNOS)启动子驱动的人类吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)表达体系的构建。 (A)质粒构建。(B)iNOS^-/-MSC、空载体-转染的和人类IDO-转染的iNOS^-/-MSC使用(+)和不使用(-)重组小鼠炎性细胞因子IFNγ和TNFα刺激。人类IDO表达通过western印迹测量。

图18：(A)为了确定转导效率，转导细胞通过流式细胞法分析GFP表达。 (B)MSC-GFP和MSC-IFNα在5x10⁵/ml培养48小时。收集上清液并且通过IFNα Elisa试剂盒(PBL，NJ)测量IFNα浓度。(C)为了检测转导细胞释放的IFNα是否具有任何生物学功能，在使用APC-H-2Kb(ebiosience,CA)染色后通过流式细胞法测定使用重组IFNα(ebiosience，CA)或者MSC-IFNα和MSC-IFNα的上清液处理的MSC-GFP、MSC-GFP上的H-2Kb的表面表达。

图19：(A)带有或者没带有1×10⁶MSC-GFP或MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞通过肌肉内注射到C57BL/6小鼠中。12天后，切下肿瘤并称重。(B)以如下不同数量的MSC-IFNα肌肉内施用1×10⁶B16细胞：1×10⁶(1：1)、1×10⁵ (1：10)、1×10⁴(1：100)、1×10³(1：1000)、1×10²(1：10000)或者没有 MSC-IFNα。12天后，切下肿瘤并称重。(C)在带有或者不带有MSC-IFNα的 1×10⁶B16肿瘤细胞被通过肌肉内注射到C57BL/6小鼠中。在肿瘤接种后监测小鼠存活，监测100天。(D和E)通过肌肉内注射将1×10⁶B16肿瘤细胞注射到 C57BL/6小鼠中。三天(D)或四天(E)后，通过肌肉内接种1×10⁶MSC-GFP 或MSC-IFNα。肿瘤接种12天后，切下肿瘤并称重。(F)通过肌肉内将1×10⁶B16 肿瘤细胞接种到C57BL/6小鼠中。三天后，通过肌肉内注射PBS、5μg重组IFNα或1×10⁶MSC-IFNα。又过9天后，切下肿瘤并称重。这些实验重复2至3次。误差线、平均值±s.d.适用于所有的图。通过未配对的双尾学生t检验(unpairedtwo-tailed Student's t test)评价统计学显著性。

图20：(A)1×10⁶荧光素酶标记的MSC-IFNα和1×10⁶B16细胞一起被肌肉内注射到C57BL/6小鼠中。在注射后D0、D3、D7、D15和D21，通过现场成像 (live imaging)检测MSC。简而言之，将小鼠麻醉，并且在成像前将150mg/kg 的D-荧光素(Caliper Lifescience，MA)腹膜内提供给小鼠15分钟。BLI数据使用Berthod NC100成像系统采集。(B)计算并呈现荧光素酶信号强度(误差线，平均值±s.d.)。(C)将带有或者不带有1×10⁶MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞通过肌肉内注射到C57BL/6小鼠中。12天后，收集肿瘤。对于HE和Ki-67 (Abcam，MA)染色，将肿瘤样品于10％福尔马林中在室温固定一周并制备石蜡切片。对于TUNEL(原位末端标记)分析，将肿瘤包埋在OCT中，立即冷冻并制备切片以用于采用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche，Basel， Switzerland)根据制造商的程序进行TUNEL分析。

图21：(A)按1000B16细胞/孔将其接种在96孔板的带有0ng/ml、10ng/ml 或100ng/ml重组小鼠IFNα的每个孔中。三天后，使用10μl CCK8(Dojindo， Shanghai，China)将细胞温育2小时，并且测量O.D.(450nm)。(B和C)将有或者没有1×10⁶MSC-GFP或MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞通过肌肉内注射到C57BL/6小鼠(B)或NOD-SCID(C)小鼠中。十二天后，切下肿瘤并称重。 (D和E)将有1×10⁵、1×10⁴MSC-IFNα或者没有MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞通过肌肉内注射到C57BL/6小鼠(D)或NOD-SCID小鼠(E)中。十二天后，切下肿瘤并称重。(F)将有或者没有1×10⁴MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠中。从肿瘤细胞接种前的一天开始每四天静脉内注射抗缺乏唾液酸基的(asialo)GM1的NK细胞特异性耗竭性抗体(depletion antibody) (Wako，Osaka，Japan)或者媒介物对照。十二天后，切下肿瘤并称重。(G) 将有或者没有1×10⁴MSC-IFNα的1×10⁶B16肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠或者β2m缺陷型小鼠中。十二天后，切下肿瘤并称重。这些实验重复2至3次。误差线、平均值适用于所有的图。通过未配对的双尾学生t检验(unpaired two-tailed Student's t test)评价统计学显著性。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同含义，并且将被理解为具有下文描述的含义。本文提及的所有出版物和专利在此通过引证的方式将它们全部引入。在冲突的情况下，将适用于包括定义在内的本说明书。另外，材料、方法和实施例仅为阐述性的而无意是限定性的。

本文使用的术语“约”是指特定术语加上或者减去不超过5％。

本文使用的词语“主要由……组成”是指排除其他活性组分或者能够对组合物、制剂或者结构的基本特性产生实质性影响的任何其他组分，但是一般包括赋形剂。

本文使用的术语“有效量”是指干细胞、细胞因子或者含有两者的治疗性组合物的足以调节、减弱或者诱导受试者中的免疫反应(即T细胞反应的抑制或者免疫反应的促进)由此减轻受治疗的疾病或障碍的至少一种病征或症状的量。

本文使用的术语“治疗”、“处理”或类似术语是指通过向需要这种治疗的患者施用组合物来完成减轻疾病的病征或症状。这种减轻可以在疾病的病征或症状出现之前、以及它们出现之后发生，因此所述术语包括预防性和活性治疗。另外，“治疗”不需要完全减轻病征或症状或者治愈。在细胞水平上，所述术语可以包括发病的细胞群或目标细胞群与未处理的细胞或者使用对照或者比较试剂处理的细胞相比减少至少10％、25％、 50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。

本文使用的处在本发明的范围内的术语“施用”或者“治疗方案”包括本发明的个体组分中的任何组分或者其组合的单次治疗输送或者多次或者重复输送，或者控制输送治疗。这些术语进一步意指包括输送方式例如局部输送、系统输送、血管内输送、肌肉内输送、腹膜内输送、脑血屏障内输送、器官特异性静脉内注射输送或者经由其他不同途径输送。

一般来说，本发明描述了在预防和治疗各种疾病例如多发性硬化症、关节炎、狼疮、脓毒症、肝炎、肝硬化、帕金森氏病、慢性感染和移植物抗宿主病(GvHD)以及甚至癌症和实体瘤中采用炎性细胞因子例如IL-1α、白介素β(IL-1β)、TNFα、IL-17A、IFN-I、TGFβ、FGF预处理MSC以增大它们的免疫调节作用例如免疫抑制或者免疫诱导作用的组合物、方法和试剂盒。

免疫抑制通过在免疫反应过程中产生的炎性细胞因子引发。在没有炎性细胞因子的情况下，MSC没有获得它们的免疫抑制性能。本发明的至少一个方面描述了添加炎性细胞因子从而初免(prime)并驯化(train) MSC以实现针对免疫反应的强效且持久的抑制功能。这种作用特别能够由激活的T细胞的增殖或者其他免疫反应参数包括激活的巨噬细胞和其他免疫细胞、炎性细胞因子如IFNγ或TNFα的血清水平表现。

采用体内研究发现炎性细胞因子对移植物抗宿主病(GvHD)实验性自体免疫性脑脊髓炎、自体免疫性肝炎、慢性感染、肝硬化、肺硬化和类风湿性关节炎具有关键的作用。在本发明的至少一个方面，遗传修饰的MSC被描述为能够逆反地加强免疫反应，这归因于MSC在没有或者减少的NO或IDO的情况下分泌大量趋化因子和生长因子。因此，本发明提供了强大的抑制性和增大性策略来控制免疫反应。

本发明的至少一个方面涉及经初免或驯化的干细胞群，所述干细胞群通过如下方法获得：(i)从细胞来源获得多能祖细胞；(ii)将所述多能细胞培养在适当的培养基中；(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；(iv)使用IFNγ和有效量的至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-17A、TGFα、FGF、IFN-I(IFNα、β)、TNFα以及它们的任意组合。在本发明的一个实施方式中，通过这种方法产生的一个亚组的这些驯化干细胞在施用于需要的受试者中时增强、加强、改善或诱导免疫反应。在至少一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选是人类、或者患有疾病的人类患者。在另一个实施方式中，另一个亚组的驯化干细胞能够抑制、减少、减弱感兴趣部位的免疫反应。

本发明的至少一个方面是按照如下步骤进行的制备经初免或驯化的干细胞的方法：(i)从细胞来源获得多能祖细胞；(ii)将所述多能细胞培养在适当的培养基中；(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；(iv)使用有效量的至少一种细胞因子和IFNγ激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、 IL-17A、TGFα、FGF、IFN-I(IFNα、β)、TNFα以及它们的任意组合。在本发明的一个实施方式中，所述方法采用能够实现最优的MSC性能的特异性培养基。在另一个实施方式中，所述方法包括过滤或提取步骤，其中所有残留的细胞因子基本上与所生成的驯化干细胞分开。本文时用的驯化干细胞是指通过本文所述的方法制得的干细胞，该干细胞可以由无性系的、非无性系的或者这两种类型的干细胞组成。在至少一个实施方式中，所述培养基是低氧的。

在一个实施方式中，驯化干细胞亚组能够抑制、减少或者减弱感兴趣的部位处的免疫反应。在另一个实施方式中，本发明描述了阻断其他治疗或生物学方案例如干扰素或疫苗的免疫抑制性能的药物试剂。在另一个实施方式中，本发明描述了阻断肿瘤相关MSC的免疫抑制性能从而增强抵抗免疫抑制性疾病例如癌症的免疫力的组合物。因此，MSC驯化细胞能够附属于或被用于与其他标准肿瘤免疫治疗程序结合以增加压力下的免疫反应。这种免疫治疗可以包括使用遗传学、生物学和药学修饰MSC、疫苗、蛋白或基因治疗作为免疫佐剂的疫苗和癌症免疫疗法。

在本方面的另一个方面，用于刺激免疫反应的方法被描述为在需要的受试者中根据如下步骤进行：(a)向所述受试者施用有效量的组合物，该组合物含有可诱导性一氧化氮合成酶抑制剂、吲哚胺2,3-加双氧酶抑制剂、可诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)-缺陷型间充质干细胞群、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO) -缺陷型间充质干细胞群或它们的任意组合；和(b)抑制一氧化氮(NO)、吲哚胺2,3-加双氧酶或前列腺素E2(PGE2)中的一种或者多种的生成。在一个实施方式中，

本发明的至少另一个方面涉及组合物，该组合物包含：(a)分离的间充质干细胞群，所述分离的间充质干细胞群通过包括如下步骤的方法生成：(i) 从细胞来源获得多能祖细胞；(ii)将所述多能细胞培养在培养基中以生成间充质干细胞亚群和分化细胞亚群；(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；(iv)使用有效量的至少一种细胞因子和IFNγ激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、TGFβ、FGF、IFN-I(IFNα、β)、TNFα以及它们的任意组合；和可选的(b)药学可接受的载体。在本发明的这个方面，所获得的组合物诱导接受该组合物的受试者的免疫反应。在另一个实施方式中，所述组合物可以基本不含有在扩繁(expand)阶段期间使用的任何细胞因子。本文使用的术语基本上不含有是指以所述组合物的重量计小于5重量％、4重量％、3重量％、2重量％、1重量％、0.5重量％、0.25重量％或0.1重量％。在另一个实施方式中，所述细胞群可以进一步含有克隆的或者非克隆的间充质干细胞、分化细胞或者它们的混合物。

在另一个实施方式中，MSC的激活步骤通过将至少一个亚组的MSC呈递给IFNγ和有效量的至少一种细胞因子足以引发所期望的免疫抑制性能的一段时间来完成，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、 IL-1β、IL-17A、TNFα以及它们的任意组合。在该实施方式中，所获得的组合物含有抑制或者减弱系统地或者局部地接受这种组合物的受试者中的免疫反应的分离MSC。在另一个实施方式中，所述组合物基本不含有任何残留的细胞因子。在这个实施方式中，所述组合物抑制局部免疫T细胞增殖。在另一个实施方式中，所述细胞群可以进一步含有克隆的或者非克隆的间充质干细胞、分化细胞或者甚至是它们的混合物，其中所述细胞群的至少50％、60％、 70％、75％、80％或90％使用克隆的MSC制得。

在本发明的另一个方面，本发明人描述了用于激活、增强、加强或诱导需要的患者中的免疫反应的方法，其中分离MSC群通过暴露于(a)分离的 IFNγ和(b)有效量的至少一种细胞因子足够的一段时间来进行初免或驯化，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、TGFβ、 FGF、IFN-I(IFNα、β)、TNFα以及它们的任意组合。本文使用的处在本发明的范围内的词语“足够的一段时间”包括驯化MSC以表现出期望性能所需要的时间。所述一段时间范围为至少1小时至约4周，包括12小时、24小时、36 小时、48小时、72小时等等。在另一个实施方式中，所述细胞群可以进一步含有克隆的或者非克隆的间充质干细胞、分化细胞或者甚至是它们的混合物，其中所述细胞群的至少50％、60％、70％、75％、80％或90％使用克隆的MSC 制得。

在另一个实施方式中，分离MSC群单独使用或者作为与分离的IFNγ和/ 或其他细胞因子的混合物施用。在至少另一个实施方式中，需要的患者可以是正患有自体免疫性障碍、过敏症、脓毒症、肝硬化、癌症、病毒性感染和器官移植中的任意一种。

在本发明的另一个方面，诱导免疫抑制的方法采用通过如下特殊方法获得的驯化间充质干细胞群：(i)从细胞来源例如骨髓获得多能祖细胞；(ii)将所述细胞包括分化细胞和多能干细胞培养在适当的培养基中；(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；(iv)通过将至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞暴露于IFNγ和至少一种细胞因子足够的一段时间来激活所述至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-17A和TNFα。在至少一个实施方式中，用于激活所述间充质干细胞的所述培养基不含有任何其他细胞因子来源。

在一个优选的实施方式中，治疗需要的所述受试者的方法包括将有效量的含有驯化间充质干细胞的组合物局部施用于患有需要治疗的病症的部位。

本发明的另一个方面涉及诱导NO合成酶(iNOS)、吲哚胺2,3-加双氧酶在至少一个亚组的所述间充质干细胞中的表达的方法。在本发明的该方面，增加NO、IDO代谢物在治疗部位的浓度改善了临床结果。

在本发明的另一个方面，MSC群被成功地转导以释放功能性IFNα。在至少一个实施方式中，使用分泌IFNα的MSC的方法被描述为用于治疗癌症并控制肿瘤生长。

在本发明的又一个方面，驯化干细胞群被描述为在治疗试剂盒中用于临床环境。在至少一个实施方式中，所述治疗试剂盒进一步含有IFNγ和至少一种细胞因子例如IL-1α、IL-1β、IL-17A、IFN-I、TGFβ、FGF、TNFα以及它们的任意组合。在一些具体的实施方式中，治疗试剂盒可以和适当的说明书一起组装成准备用于免疫抑制或者免疫增强从而分别触发这种免疫反应。在一个实施方式中，所述试剂盒主要由驯化MSC、IFNγ和至少一种第二细胞因子组成，但是不含有将实质性地改变所述驯化MSC的行为的任何其他活性组分。

在一个实施方式中，用于免疫抑制的治疗试剂盒含有驯化干细胞群、IFNγ和至少一个细胞因子例如IL-1α、IL-1β、IL-17A、TNFα和它们的任意组合。在另一个实施方式中，用于免疫增强的所述治疗试剂盒含有驯化的克隆干细胞群、IFNγ和至少一个细胞因子例如IL-1α、IL-1β、IFN-I、TGF、TNFα和它们的任意组合。在另一个实施方式中，所述细胞因子为分离型。在另一个实施方式中，用于所述试剂盒的说明书说明用于触发期望的临床结果的步骤。

在又一个实施方式中，描述了用于刺激患有例如癌症或病毒性感染的需要的患者中的免疫反应的方法。在该实施方式中，患者被施用有效量的组合物，所述组合物包含可诱导性一氧化氮合成酶抑制剂、吲哚胺2,3-加双氧酶抑制剂、可诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)-缺陷型间充质干细胞群、吲哚胺2,3- 加双氧酶(IDO)-缺陷型间充质干细胞群或它们的任意组合。在一个优选的实施方式中，所述方法导致抑制一氧化氮(NO)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO) 或前列腺素E2(PGE2)、1-MT、1400W、L-NMMA或其他合适的试剂中的一种或者多种的生成。在该实施方式中，上述提及的iNOS或IDO的抑制剂单独施用或者作为混合物施用。在本发明的这个方面，所述患者的状态是随后接受免疫治疗方案，包括包含本文所述的驯化或者初免的MSC的方案的免疫治疗方案，或者能够包含使用所示干扰素、抗体、细胞治疗剂或调节免疫反应的其他治疗剂的另一种免疫治疗方案。

本发明的另一个方面描述了用于通过构建表达人类IDO的小鼠iNOS缺陷型细胞来筛查用于抑制或者增加哺乳动物MSC包括人类或者小鼠MSC中的IDO活性的试剂或药物的方法，在所述表达人类IDO的小鼠iNOS缺陷型细胞中，IDO蛋白由受人类IDO基因在小鼠iNOS启动子的控制之下编码的氨基酸序列组成，由此改善了MSC的免疫抑制功能。本发明的这个方面描述了筛查试剂或药物以增强或者抑制带有人类IDO表达的小鼠模型中的IDO活性的方法，人类IDO表达受小鼠iNOS启动子的控制，使得所述施用调节了 IDO活性，由此治疗疾病涉及癌症或感染中IDO异常表达，尤其是在与免疫治疗的组合的情况下。

人类间充质干细胞可以衍生自很多细胞来源，例如来自胎盘衍生物、来自骨髓，或者从很多不同的来源获得，包括股骨头松质骨块的栓体(plug)、从患有退行性关节病的患者的臀部或膝盖置换手术过程中获得，以及来自从正常供体和已经收获骨髓以备后期骨髓移植使用的肿瘤患者获得的抽取骨髓。虽然根据所收获的骨髓的来源(即，骨片、外周血等的存在)，所收获的骨髓通常被制备用于通过很多不同的机械分离方法进行的细胞培养分离，但是分离方法中涉及的关键步骤是使用专门制备的培养基，该培养基含有不仅允许间充质干细胞在没有分化的情况下生长而且还允许只有间充质干细胞直接粘附至培养皿的塑料或玻璃表面区域的试剂。

通过制备用于以很少的量存在于骨髓样品中的期望的间充质干细胞选择性粘附和存活的培养基，使存在于骨髓中的间充质干细胞与其他细胞(即，红细胞和白细胞、成纤维细胞、其他分化的间充质细胞等)分开成为可能。人类MSC的其他来源包括脐带、脂肪组织和牙根。MSC是各种细胞类型的间充质细胞系(包括骨、软骨、脂肪、肌腱、神经组织、成纤维细胞和肌肉细胞)的多能祖细胞。间充质干细胞可以从例如骨髓、血液(包括外周血)、骨膜和真皮以及具有中胚层起源的其他组织等组织分离和纯化。在这个方面，已经发现虽然这些祖细胞一般以非常少的量存在于例如骨髓中，并且这些量随着年龄显著下降(即，从相对年轻的患者中的约1/10,000到年老患者的少至1/2,000,000)，但是当培养在特异性的培养基中时，利用人类间充质干细胞对基底的选择性附接(称为“粘附”)，人类间充质干细胞可以从各种组织中分离和纯化。

间充质干细胞通常根据特定标记物的表达或者表达缺失来识别。例如， MSC是CD34-、CD11b、CD11c-、CD45-、MHC类型II、CD44+、Sca-1+、以及MHC类型I低。另外，MSC可以通过它们分化成各种间质细胞类型的能力来识别。体外实验已经表明，培养条件、添加剂、生长因子和细胞因子能够精确地诱导MSC发育为所选择的间质细胞。例如，地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素的组合或者异丁基甲基黄嘌呤、胰岛素和吲哚美辛的混合物已经显示出促使MSC分化为脂肪细胞。类似的，当使用5-氮杂胞苷刺激时，MSC能够分化为骨骼肌肉细胞。已经表明13-VGF导致间充质干细胞分化为心肌细胞。

虽然本发明不限于使用通过任何特定方法获得的MSC，但是MSC可以通过本领域可接受的任何方法从骨髓和脐带分离，纯化和扩大培养。将骨髓细胞的栓体或抽吸物(由优势量的红细胞和白细胞以及非常少量的间充质干细胞组成)通过注射器以将组织分离成单个细胞。在一个优选的实施方式中，多能祖细胞群从适合的来源例如骨髓、脐带或脂肪组织获得，进一步在通常含有谷氨酰胺的适当培养基中培养和扩繁。然后识别间充质干细胞并且与分化细胞区分开，并且进一步在含有IFNγ和选自由IL-1α、IL-1β、IL-17A、IFN-I、 TGF、FGF、TNFα组成的组的至少一种细胞因子或者它们的任意组合的培养基中扩繁。在另一个实施方式中，识别无性系的间充质干细胞并且将其与分化细胞区分开，并且进一步在含有IFNγ和选自由IL-1α、IL-1β、IL-17A、IFN-I、 TGF、FGF、TNFα组成的组的至少一种细胞因子或者它们的任意组合的培养基中扩繁。在任一情况中，在这种培养基中扩繁的所述间充质干细胞被驯化和程序化从而抑制或增强特定临床环境中的免疫反应。

在一个实施方式中，将所述多能祖细胞培养在合适的培养基例如完全培养基(例如含有10％的胎牛血清的MEM培养基)和湿润的气氛(优选低氧) 中。所述培养基保持不变至少一天以允许细胞粘附至培养皿。随后，每3至 4天更换一次培养基。当所述细胞生长至融合时，将所述细胞从培养皿上脱离，优选使用胰蛋白酶进行。在移除或灭活所述胰蛋白酶之后，可以将细胞于不含有血清的培养基中继代培养。用于分离和培养间充质干细胞的另外方法在美国专利申请No.20070160583和No.20070128722中提供，在此通过引证的方式将它们整体引入。MSC还可以使用类似的方法从脐带的渥顿氏胨 (Wharton's jelly)中分离。

在一个实施方式中，本发明分离的间充质干细胞可以是一个亚组的异源性细胞群，包括某些分化细胞。在另一个实施方式中，所述分离的间充质干细胞是仅含有驯化的无性系MSC的同源性组合物。在另一个实施方式中，所述MSC可以是富含MSC的混合细胞群。在这个方面，分离的MSC细胞群由至少约75％的MSC组成，或者由至少约83％、84％、88％、89％、90％、91％、 93％、95％、96％、97％或98％的克隆MSC组成，同时余下的可以包括分化细胞、祖细胞、血细胞、或者将增强临床结果的任何其他合适的细胞。

有效量是指MSC和细胞因子的足以减弱受试者中的免疫反应(即，T细胞反应的抑制)由此减轻疾病或者障碍的至少一个病征或症状的量。

根据本发明使用的所述间充质干细胞按照优先级为自体同源的、同种异体的或异种异体的，并且选择可以主要依赖于治疗需要的紧急程度。

本发明的细胞因子可以通过常规纯化方法、通过重组技术或者从商业来源获得。例如，干扰素γ(IFNγ)的氨基酸序列以GENBANK登录号NP 000610 (人类)和NP 032363(小鼠)提供。IFN蛋白的商业来源包括例如 INTERMUNE(Brisbane，Calif.)和PeproTech，Inc.(Rocky Hill，N.J.)。类似地，肿瘤坏死因子-α(TNFα、恶病质素(cachexin)或恶液质素(cachectin)) 以GENBANK登录号NP 000585(人类)和NP 038721(小鼠)提供，并且可以从诸如ProSpec Bio(rehovot，Israel)和PeproTech，Inc.等来源商购获得。类似地，人类白介素1-α(ILlα)和白介素1-β(IL1β)的登录号已知分别为P01583和P01584，并且可以从诸如ProSpec Bio和PeproTech，Inc.等商业来源获得。白介素17A(IL17A)的登录号已知为BC067505(人类)和 NM 010552(小鼠)。当根据本发明使用时，细胞因子是“分离的”，即同源的 (100％)或接近同源的(90％至99％)。在一个具体的实施方式中，细胞因子是重组蛋白。

白介素17A是关键的炎性细胞因子之一，主要由产生IL-17的CD4⁺T 细胞(Th17)细胞产生，其因为在炎性和自体免疫性反应中的促炎功能而成为众所周知的细胞因子。IL-17A通过异聚体受体复合物IL-17RA和IL-17RC 进行信号转导。一旦IL-17A结合，IL17RA便募集Act 1，IL-17A诱导的信号转导过程的一种关键下游调节子。虽然关于IL-17A诱导的信号转导途径和 IL-17A在炎性和自体免疫性疾病中的作用已经知道不少，但是其细胞靶标和作用方式仍然不懂。

本发明单独采用IL-17A或者采用IL-17A与其他细胞因子组合使用来促进导致免疫抑制的驯化MSC。上述的MSC和细胞因子可以为组合物的形式，例如为适合施用于需要使用它们进行治疗的受试者的药物组合物的形式。本发明的组合物可以通过任何常规的方法施用，包括肠胃外(例如皮下或者肌肉内)或者静脉内注射、静脉内灌注、特异性器官介入或者局部应用。所述治疗可以由在一段时间内的单剂量或者多剂量组成。

药物组合物通常含有至少一种可接受的载体。所述载体必须是在与MSC 和细胞因子具有相容性并且对其受体无害的意义上是“可接受的”。通常，所述载体可以是合适的等渗溶液例如磷酸缓冲盐水、培养基例如DMEM、含有或者不含有白蛋白的生理盐水、5％的右旋葡萄糖水溶液和/或它们的混合物，以及本领域技术人员已知的其他合适的液体。

在用于治疗用途的一个优选的实施方式中，本发明的所述药物组合物还可以作为试剂盒提供。本发明的试剂盒可以仅含有药学可接受的载体；使用分离的IFNγ、分离的IL-1α刺激或驯化的分离间充质干细胞群；和分离的 IL17A和用于在减弱免疫反应的方法中使用所述试剂盒的进一步的说明书。在本发明的这个方面，可以施用以所述试剂盒的细胞因子组分刺激的细胞。所述试剂盒还可以可选地包括例如通过注射施用所述细胞的装置。在一个可选的实施方式中，本发明的适合用于肠胃外施用的组合物可以进一步包含抗氧化剂与一种或者多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、悬浮液或无菌冻干形式的粉末的组合，所述无菌冻干形式的粉末可以仅在使用之前重构成无菌可注射溶液或者分散液，其可以含有抗氧化剂、矿物质和维生素、缓冲剂、使最终制剂成为等渗的溶质的组合。

本发明进一步提供一种组合物，该组合物包含分离的克隆MSC群、分离的IFNγ、分离的IL-1α或β以及分离的IL-17A与药学可接受的载体的混合物。在另一个实施方式中，本发明提供了这样的组合物，该组合物包含分离的MSC群、分离的IFNγ、分离的TNFα和分离的IL-17A与药学可接受的载体的混合物。在一个实施方式中，所述组合物还包含分离的IL-1α或β。所述试剂盒的使用方法提供用于在将有效量的MSC、分离的IFNγ、分离的IL-1α、 TNFα和分离的IL-17A施用于需要治疗的受试者的步骤之后减弱免疫反应，由此减弱受试者的免疫反应。

本发明提供用于减弱免疫反应的方法，所述方法包括将有效量的分离的间充质干细胞、分离的IFNγ、分离的IL-1α和分离的IL-17A施用于需要治疗的受试者由此减弱该受试者的免疫反应。在一个实施方式中，所述方法进一步包括分离的TNF-α。

在另一个实施方式中，所述治疗直接针对多发性硬化症、关节炎、狼疮、脓毒症、肝炎、肝硬化、帕金森氏病、慢性感染和移植物抗宿主疾病。在另一个实施方式中，所述MSC作为药物组合物提供，其中所述MSC在施用前与细胞因子混合物一起配制。在另一个实施方式中，所述MSC和细胞因子作为单独的组分施用。需要治疗的受试者可以是患有与不利的免疫反应相关的特定疾病或障碍的哺乳动物(例如人类、猴子、猫、狗、马等)。在一个具体的实施方式中，所述受试者是人类。

有效性还可以通过监测iNOS、IDO和/或细胞因子表达来确定。受益于减弱不利的免疫反应的受试者包括患有或者易感自体免疫性障碍(例如类风湿性关节炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、GvHD、肝硬化或银屑病)、过敏症(例如枯草热)或脓毒症的受试者。另外，由于炎症协调了肿瘤周围的微环境，有助于增殖、存活和转移，因此某些癌症患者还可以受益于本发明组合物。

在器官移植和骨髓移植中，供体来源的T细胞能够识别受体的MHC 并且导致形成GvHD。这通常致命的疾病往往是对各种免疫抑制治疗没有反应但是靶向免疫调节分子的新方法在治疗GvHD中显示大有希望。最近， MSC已经显示在临床前试验和临床试验中治疗GvHD时高度有效。本文提供的分析进一步证实，MSC活性借助于使用促炎细胞因子刺激后的NO或 IDO生成而被介导。因此，本发明的组合物可以用于器官移植或GvHD治疗。

体内确定合适的剂量可以使用本领域可接受的动物模型例如本文描述的DTH和GvHD模型来完成。然而，由于本发明涉及在医生或兽医的关注下进行治疗，因此可以在治疗过程中根据治疗有效性的评价对治疗的量和时间进行调节，这因受试者不同而异。另外，治疗可以根据医生或兽医的描述在患者中的免疫反应的特定阶段提供。

本发明还提供了用于增强癌症的免疫治疗的效力的方法，所述方法通过向接受免疫疗法治疗的受试者施用有效量的NOS和/或IDO抑制剂。在一些具体的实施方式中，所述抑制剂是IDO和iNOS选择性抑制剂，例如本文所述的抑制剂。所述抑制剂的有效量是这样的量，其在使用免疫疗法后与没有接受所述抑制剂的受试者相比NO生成和/或IDO活性的量降低至少50％、 60％、70％、80％、90％、95％或97％。在一个具体的实施方式中，所述方法提供了使用IDO和/或iNOS选择性抑制剂增强干扰素治疗(例如IFNγ)的治疗有效性。

本发明提供了用于在施用于患者中之前使用炎性细胞因子改变MSC的方法。该方法将显著地增强MSC在临床环境中的效力。在至少一个方面，描述了iNOS和细胞因子在IFNγ和另一种细胞因子作为必要物质(TNFα、IL-1α或IL-1β中的任一种)共存的情况下在MSC免疫抑制作用中的关键作用。在另一个方面，MSC已经显示出在炎性细胞因子IFNγ和TNFα不足以诱导足够的免疫抑制时转变为促进免疫反应。

至少在一个实施方式中，描述了IL-17A改变MSC和细胞因子之间的相互作用的动力学的作用。本发明人已经发现，IL-17A增强了MSC的免疫抑制功能，即使是在低剂量的炎性细胞因子IFNγ和TNFα存在的情况下。不像其促进免疫反应的传统作用那样，如本文所述，IL-17A在MSC存在的情况下在免疫抑制中起到重要的作用。因此，在某些环境下，阻断IL-17A的活性可以诱导或者增强免疫反应。在至少一个实施方式中，描述了IL-17A的病理生理学作用。

IL-17A在促进炎症和自体免疫性中是重要的。本领域技术人员能够理解的是，IL-17A在增强MSC中的免疫抑制中的作用得到首次证实。过去，IL-17A 已经被广泛报道为在IL-17A水平急剧上升的多发性自体免疫性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)和炎性肠病(IBD)中加剧疾病进程。另外，疾病进程在IL-17A被遗传消融或者施用IL-17A阻断抗体时减缓。

然而，IL-17A不是总是促进免疫反应，因为过去报道提出，IL-17A在肠道炎性疾病中具有保护功能。IL-17A的遗传消融或者中和实际上能够在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎模型中加剧疾病进程。在这样的背景下，本领域技术人员能够理解的是，本发明的至少一个方面提出了IL-17A增强了MSC 的免疫抑制性能。在至少一个实施方式中，考虑了MSC在没有IL-17A的情况下可能不会有效抑制免疫反应。

在本发明的又一个方面，本发明人证实了IL-17A通过新的细胞靶标间充质干细胞在增强免疫抑制中的新功能。类似的，已经显示IL-17A通过逆转 mRNA衰减因子AUF1造成的基因表达的抑制作用而发挥这些作用。

在本发明的至少一个实施方式中，小鼠中伴刀豆球蛋白(“ConA”)诱导的肝损伤被用来研究自体免疫性或重症病毒性肝炎的病理生理学过程，其中T 细胞反应在调节肝损伤中发挥关键的作用。由于T细胞反应的抑制能够显著地减弱ConA诱导的肝损伤，并且脂肪组织衍生的基质细胞已经被证明减轻 ConA诱导的肝损伤；本发明人使用骨髓衍生的MSC并且研究IL-17A在调节 MSC介导的肝损伤治疗中的作用。因此，在本发明的至少一个方面提出了 IL-17A能够显著增强MSC的免疫抑制作用。

本发明进一步提出MSC仅能够稍微影响ConA诱导的肝损伤的进程，因为MSC的免疫抑制能力需要炎性细胞因子的刺激。虽然很多细胞因子能够在体内施用ConA后生成，但是这些细胞因子只能保持短时间的高水平，并且在后期施用时不能有效地刺激MSC。因此，内在的MSC在减弱ConA诱导的肝损伤方面是无效的。

因此，本发明的至少一个方面提供了IL-17A通过新颖的细胞靶标间充质干细胞增强免疫抑制的新且新颖的功能。本发明进一步设想IL-17A可以通过逆转由mRNA衰减因子AUF1导致的基因表达的抑制来发挥这些作用。如本文所述，IL-17A是用于增强MSC介导的免疫抑制的因子。

在某些情况中，本发明人已经发现需要体内和体外正向或者反向地控制免疫抑制作用。在一个实施方式中，本发明人筛查了可以利用的生长因子和细胞因子并且发现其中有两个因子令人吃惊地调低MSC介导的免疫抑制：I 型干扰素和成纤维细胞生长因子(FGF-2)。

I型干扰素(IFN)是导致宿主免疫力以根除病毒和其他细胞内感染的细胞因子家族，而FGF-2(FGF-β，碱性成纤维细胞生长因子)属于编码具有生长、抗凋亡和分化活性的肝素结合蛋白的基因家族。然而，没有研究将这两种细胞因子与免疫抑制的调节关联起来。I型干扰素和成纤维生长因子(FGF-2) 起到通过调低iNOS表达的MSC介导的免疫抑制的负调节子的作用。如本文所述，发明人发现，这两种细胞因子能够潜在地抑制MSC转向T细胞增殖的免疫抑制作用(参见图16)。进一步分析揭示，增补这些细胞因子中的任一种能够令人惊讶地减少iNOS蛋白的表达和NO的生成(图17)。

提供如下非限定性实施例来进一步阐述本发明。

实施例

实施例1

材料与方法

小鼠。6-8周龄的雄性C57BL/6、C3H/HeJCr和F1(C57BL/6xC3H)小鼠来自NationalCancer Institute(Frederick，Md.)。IFNγ-R1^-/-小鼠和iNOS^-/-小鼠来自JacksonLaboratory(Bar Harbor，Me.)。小鼠被保持在Robert Wood Johnson Medical SchoolVivarium。在每个实验中，根据年龄和性别将动物匹配，所有实验均得到InstitutionalAnimal Care and Use Committee的批准。

试剂。抗小鼠TNFα、IL-1α、IL-1β和CCR5的重组小鼠IFNγ和TNFα、 IL-1α、IL-1β单克隆抗体、FITC-偶联抗小鼠CD11b和PE-偶联抗小鼠抗体F4/80 来自eBiosciences(LaJolla，Calif.)。抗IL-10和TGF-β的抗体和重组小鼠 M-CSF来自R&D Systems(Minneapolis，Minn.)。抗IFNγ来自Harlan (Indianapolis，Ind.)。抗CXCR3来自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)。吲哚美辛、1-甲基-DL-色氨酸(1-MT)和N G-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)来自 Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)。

细胞。MSC生成于6至10周龄的小鼠的胫骨和股骨的骨髓。将细胞培养在αMEM培养基，该培养基增补有10％的FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml 青霉素和100μg/ml链霉素(全部来自Invitrogen)。在24小时之后移除非粘附细胞，并且保留粘附细胞，每三天重新补充培养基。为了获得MSC克隆，收获融合细胞并且通过限制稀释法将其接种在96孔板。然后挑取单个克隆并扩繁。使用第5世代(passage)至第20世代的细胞。

T细胞母细胞使用CD4^-/-T细胞亚组分离试剂盒(R&D Systems)通过负选择法生成于CD4⁺T细胞。细胞(1x10⁶细胞/ml)采用塑料结合的抗CD3和可溶性抗CD28激活48小时，然后单独使用IL-2(200U/ml)培养48小时。所有T细胞培养物保持在RPMI-1640培养基中，该培养基增补有10％热灭活 FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50mMβ-ME(完全培养基)。

从通过塑料结合的抗CD3激活的脾细胞(2x10⁶/ml)的48小时培养物收获激活的脾细胞上清液，然后使用0.1μm过滤器进行过滤并冷冻。

细胞因子、趋化因子和NO的检测。使用多路珠阵列试剂盒(multiplex bead arraykit)(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)利用液相晶片技术(Luminex Technology) (Bio-Plex System，Bio-Rad，Hercules，Calif.)分析培养物上清液的20个不同的细胞因子和趋化因子。IFNγ采用ELISA(BD Biosciences，San Jose，Calif.) 分析。NO使用改良Griess试剂(Sigma-Aldrich)检测。简而言之，所有NO3 通过硝酸还原酶转化为NO2，并且总NO2通过Griess反应(Miranda等.(2001) Nitric Oxide 5：62-71)检测。

实时PCR。RNA使用RNEASY Mini Kit分离自细胞沉淀。第一链cDNA 合成使用SENSISCRIPT RT Kit用随机六聚体引物进行(所有试剂盒均来自 Qiagen，Valencia，Calif.)。感兴趣的基因的mRNA通过实时PCR(MX-4000 来自Stratagene，La Jolla，Calif.)使用SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)进行定量。mRNA的总量根据内源性β-肌动蛋白mRNA进行归一化。iNOS的引物序列如下：正向：5'-CAG CTGGGC TGT ACA AAC CTT-3'(SEQ ID NO：1)；反向：5'-CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG-3'(SEQ ID NO：2)。其他引物来自RT2 PROFILER.TM.PCR Array Mouse Chemokines&Receptors kit(Superarray，Frederick，Md.)。

趋化性分析。趋化性使用NeuroProbe CHEMOTX Chemotaxis System(NeuroProbe，Gaithersburg，Md.)根据(Shi等.(1993)J.Immunol.Meth.164： 149-154)所述检测。96-孔板的下部分腔室用来自以IFNγ加上TNFα(各 20ng/ml，或Sup.CD3-act(1：2稀释液)刺激的MSC的上清液填充。然后使用带有5μm孔的不含有聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸脂膜覆盖。T细胞母细胞 (1.25x.10⁵)被添加到上部分腔室。温育3小时后，使用MTT分析(Shi等. (1993)supra)对已经通过孔转移并且进入底孔的细胞进行定量。将趋化性指数计算为T细胞母细胞响应于MSC而转移的数量与只是转移到培养基的数量的比率。

采用类似的设置(set-up)检查由T细胞向炎性细胞因子激活MSC转移导致的免疫抑制。在使用或者不使用IFNγ和TNFα(各20ng/ml)刺激24小时的情况下，将MSC(2x10⁴)添加到下部分腔室。然后将激活的T细胞母细胞添加至上部分腔室中，如上所述。将IL-2添加至两个腔室。3小时后，使用³H-胸腺嘧啶对两个腔室进行脉冲，并且在6小时后评估细胞增殖。

MSC对GvHD的诱导和调节。对8周龄的C57BL/6xC3H F1小鼠进行致死辐射(13Gy)并且在24小时后使用成核骨髓细胞(nucleated bone marrow cell) (5x10⁶)和从C57BL/6亲本小鼠分离得到的脾细胞(5x10⁶)通过尾巴静脉注射进行输注。在骨髓移植后第三天和第七天，经由尾巴静脉对受体施用来自 C57BL/6野生型、IFNγR1^-/-或iNOS^-/-小鼠的0.5x10⁶MSC。一些野生型MSC 组还从第一次施用MSC后立即开始每天通过腹膜内注射iNOS抑制剂、NG- 单甲基L-精氨酸(L-NMMA，500μg/小鼠)、抗IFNγ(400μg/小鼠)或抗TNFα、 IL-1α和IL-1β的三种抗体的混合物(各200μg/小鼠)，注射7天。作为阴性对照，对F1小鼠注射F1骨髓细胞。每天观察小鼠的GvHD病征(消瘦、折毛和驼背)并在频临死亡时实施安乐死，于是标记存活时间。在第14天，收集各种组织并制备5μm石蜡切片且用苏木精/署红(H&E)染色。

DTH反应的诱导和组织学分析。通过尾巴基部注射用50μl完全弗氏佐剂乳化的卵清蛋白(OVA，10μg在50μl盐水中)对C57BL/6小鼠(6-8周龄) 进行免疫。5天后，通过使用200μg在30μl盐水中的聚合OVA注射到右后脚掌进行挑战来检测DTH。左脚掌注射30μl盐水作为阴性对照。24小时后，使用游标卡尺测量抗原诱导的脚掌厚度增量并计算如下：(Rimm-Limm)- (R.unimm-L.unimm)，其中R和L是右脚掌和左脚掌的厚度。

统计学分析。通过未配对的双尾学生t检验或方差分析(ANOVA)评价显著性。

实施例2

MSC的免疫抑制功能受到促炎细胞因子的诱导。

为了鉴定潜在的机制，采用了小鼠MSC的克隆。这些克隆的干细胞特性由它们分化成脂肪细胞或者成骨细胞的能力以及它们的表面标记物CD34； CD11b；CD11c；CD45；MHCclass II；CD44⁺；Sca-1⁺；MHC class Il^ow的表达来限定。本文提供的所有结果使用至少三个不同的MSC克隆重复。

由于大部分报道的MSC引起的免疫抑制的研究都基于它们对T细胞增殖和细胞因子生成的作用，因此首先检查MSC对T细胞母细胞的IL-2驱动的增殖的影响。新鲜的CD4⁺T细胞母细胞通过使用抗CD3激活然后使用IL-2 扩繁若干天来由脾细胞生成(Devadas等.(2006)Immunity 25：237-247； Radvanyi等.(1996)Cell Immunol.170：260-273)。T细胞母细胞以1：20的比例(MSC：T细胞)和IL-2(200U/ml)一起添加。细胞增殖通过³H-Tdr 引入法在8小时之后进行评估。令人惊讶的是，发现这些T细胞母细胞的IL-2 驱动的增殖没有受到MSC添加的影响。MSC对T杂交瘤A1.1细胞的增殖也没有影响。但是，这些T细胞母细胞和T杂交瘤细胞没有生成细胞因子，除非通过TCR重激活(Fotedar等.(1985)J.Immunol.135(5)：3028-33)。因此在没有T细胞细胞因子的情况下，MSC不能抑制T细胞增殖。

为了检查细胞因子诱导MSC的免疫抑制能力的可能性，通过在抗CD3 存在的情况下以梯度比例组合MSC和新鲜脾细胞来再现这些培养条件。这些分析的结果表明，当以低至1：60(MSC：脾细胞)添加MSC时，T细胞增殖被完全阻断。重要的是，为了施加它们的免疫抑制作用，MSC不用必须是同系的(syngeneic)。使用第5至20世代之间的MSC，在纯化的由塑料结合抗CD3抗体和抗CD28激活的CD4⁺或CD8⁺T细胞上发现类似的作用。因此，在T细胞激活过程中MSC和T细胞处在共培养物中的条件下，所得的T细胞反应受到MSC的强烈抑制，表明T细胞生成的细胞因子可能具有作用。还检查了从不同小鼠株系生成的MSC克隆的免疫抑制能力。观测到表现出更好的分化潜力的那些克隆具有较强的免疫抑制能力。

为了确定由激活T细胞分泌的细胞因子是否负责诱导由MSC引起的免疫抑制，使用来自抗CD3激活的脾细胞的培养物的上清液增补MSC与T细胞母细胞(如上所述)的混合共培养物。所得的T细胞增殖受到强烈抑制。还观测到与MSC的共培养物中的A1.1细胞的增殖受到以激活脾细胞上清液进行的增补的抑制。这些实验表明，诱导由MSC引起的免疫抑制需要激活T细胞的一些产物。为了鉴定可归责(culpable)的细胞因子，在添加至共培养物之前，使用抗各种细胞因子的中和抗体处理激活脾细胞上清液。这些分析表明，IFNγ的中和完全逆转了与增补有抗CD3激活脾细胞上清液的MSC共培养的T细胞母细胞的增殖的抑制。这些结果暗示在这个过程中IFNγ作为关键的细胞因子，并且揭示在某些条件下，这种主要促炎细胞因子反而能够介导免疫抑制。

然后通过向MSC+T细胞母细胞或MSC+A1.1细胞的混合共培养物添加分离的重组IFNγ(20ng/ml)而不是添加激活脾细胞上清液来直接检测IFNγ的作用。令人惊讶的是，单独的IFNγ没有诱导免疫抑制。然后添加若干种其他促炎细胞因子(各20ng/ml)，并且发现与IFNγ一起同时添加TNFα、IL-1α. 或IL-1β对于获得与MSC的共培养物(MSC：T细胞的1：20的比例)中的 T细胞增殖的抑制是需要的(图1)。因此，抗CD3激活脾细胞上清液引起的 MSC的免疫抑制功能的诱导可能是因为IFNγ与TNFα；IL-1α；或IL-1β协同作用于MSC的缘故。因此，虽然IFNγ是绝对需要的，但是单独的该细胞因子是不足的；在MSC中的适当的免疫抑制信号转导需要IFNγ和其他三种细胞因子中的任意细胞因子的协同作用。

在添加至MSC与T细胞母细胞的混合共培养物中之前，将抗TNFα、IL-1α或IL-1β的中和抗体单独地或者一起添加至激活脾细胞上清液。虽然单独的抗体没有作用，但是所有三种细胞因子的同时阻断完全逆转了T细胞增殖的抑制。其他细胞因子例如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和IL-6(白介素-6)没有作用。本文的数据显示，IFN与其他三种促炎细胞因子TNFα、 IL-1α或IL-1β中的任意细胞因子的组合完全负责诱导MSC抑制T细胞增殖的能力，并且TNFα、IL-Iα和IL-Iβ在与IFNγ一起作用中可以互换。

设想MSC必定碰到源于初始T细胞激活的一定水平的IFNγ。实际上，发现在它们的抗CD3诱导激活的过程中存在时，MSC没有影响初始T细胞反应，如CD69表达中正常增加所展示的那样。作为在初始激活后由脾细胞释放的IFNγ对于诱导由MSC引起的免疫抑制是关键的进一步证据，观测到源自于IFNγ受体1缺陷型小鼠(IFNγR1-/-)的MSC不能够导致免疫抑制。衍生得到这些IFNγR1-/-MSC的若干克隆(所有的克隆都能够分化为脂肪细胞和成骨细胞样细胞)，受检的五个克隆全部不能抑制抗CD3诱导的脾细胞增殖，这支持了这样的理解，即IFNγ在MSC的免疫抑制功能的诱导中是必需的。

这些结果表明紧靠MSC的细胞初始生成的IFNγ和其他细胞因子对于诱导免疫抑制能力是关键的。实际上，抗IFNγ(20μg/ml)在这种情况中也完全阻断了MSC的抑制作用。另外，虽然单独的抗TNFα、IL-1α和IL-1β的抗体 (各20μg/ml)是无效的，但是当将所有三种抗体一起添加时预防了免疫抑制，类似于它们在添加至激活脾细胞上清液时的作用。因此，局部生成的IFNγ和 TNFα、IL-1α和IL-1β的同时作用足以诱导MSC变成具有免疫抑制性。

实施例3

MSC引起的免疫抑制需要一氧化氮

为了鉴定由暴露于细胞因子的MSC引起的免疫抑制受到影响的机制，在各种设计中检查了在TRANSWELL系统中与MSC共培养的抗CD3激活脾细胞(1：20，MSC：脾细胞)的反应。当在孔的两个腔室中采用渗透膜(0.4μm 孔膜)分开时，MSC对T细胞增殖几乎没有作用，表明细胞膜关联蛋白或其他局部作用因子对于由细胞因子初免的MSC引起的T细胞增殖的抑制是关键的。虽然最近报道(Sato等.(2007)supra)显示，PGE-2而不是IDO是需要的，但是发现PGE-2并没与参与。实际上，发现吲哚美辛(10μM，一种PGE-2 阻断剂)、抗IL-10(20μg/ml)、抗TGFβ(20μg/ml)或1-甲基-DL-色氨酸(1-MT， 1mM，一种IDO抑制剂)对由MSC引起的免疫抑制并没有作用，由此排除了这些因子。

已知高浓度的一氧化氮(NO)抑制T细胞反应。NO从其来源快速扩散，但是活性形式的浓度在约100μm内下降。因此，NO只能在紧密靠近生成它的细胞的位置作用，这与介导由MSC引起的免疫抑制的因子的预期特性是吻合的。为了确定NO是否具有这种作用，使用具有iNOS活性的选择性抑制剂 NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)关闭其生成。当在抗CD3存在的情况下添加至MSC与脾细胞的混合共培养物中时，L-NMMA完全恢复了正常的脾细胞增殖。诸如1400W和L-NAME之类的其他iNOS抑制剂显示出同样的作用。而且，源自于iNOS缺陷型小鼠(iNOS^-/-)的MSC对脾细胞增殖几乎没有作用。另外，在所衍生的五个iNOS^-/-MSC克隆(所有克隆都能够分化成脂肪细胞和成骨细胞样细胞)中，没有任何克隆是免疫抑制性的。这些结果表明， MSC响应于细胞因子诱导而生成的NO的活性介导了它们的T细胞反应的抑制。

本文分析表明，由MSC引起的免疫抑制受到IFNγ和促炎细胞因子的诱导并且通过NO来介导。因此，设想到MSC在暴露于这些细胞因子之后能够上调它们的iNOS表达并且生成NO。为了对此进行检查，使用激活脾细胞上清液处理MSC，通过实时PCR分析iNOS mRNA的水平，并与β-肌动蛋白比较。这些分析的结果表明，iNOS在刺激后前4个小时在MSC中得到显著上调，高水平表达保持至少48小时。在刺激后12小时，iNOS mRNA的水平比β-肌动蛋白信息强超过7倍，表现出极高的表达。当将IFNγ和TNFα(各20ng/ml) 一起添加时观测到类似的作用，但是单独任一种都是无效的。

另外，IL-1α和IL-1β在这方面同样可以与TNFα互换。当添加抗体以中和抗CD3激活脾细胞上清液中的细胞因子活性时，观测到单独的抗IFNγ或者抗TNFα、IL-1α和IL-1β的三抗体组合防止了由MSC引起的iNOS上调。当单独使用或双重使用抗TNFα、IL-1α或IL-1β的抗体时，没有作用。因此，诱导免疫抑制的相同细胞因子也是由MSC引起的iNOS表达的强效诱导物。

为了确定细胞因子处理的MSC中的iNOS表达是否确实导致NO生成，测量了来自使用抗CD3激活的脾细胞上清液处理的MSC的条件培养基中的 NO的两个稳定的分解产物硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2)。处理后由MSC 生成的NO2的量是来自经过类似处理的CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞的条件培养基中的NO2的量的至少10倍，这已知是丰富的NO生成物质。这些结果与本文所述的高水平的iNOS mRNA表达相吻合。因此，MSC响应于促炎细胞因子而引起的iNOS表达上调导致NO的生成，其能够作用于紧邻的T细胞。

在本研究中，使用T细胞激活或者当添加外源性炎性细胞因子时，T细胞首先进入细胞循环捕获(cell cycle arrest)并且然后在24小时内死亡。还观察到这种凋亡依赖于NO，因为当使用iNOS抑制剂时没有观测到T细胞凋亡。当使用iNOS^-/-或IFNγR1^-/-MSC时也没有存在凋亡。因此，NO诱导的T细胞的细胞循环捕获和凋亡是由炎性细胞因子激活的MSC介导的免疫抑制机制的一部分。物种之间iNOS的炎性细胞因子诱导表达的差异已经在巨噬细胞中被注意到(Schneemann&Schoedon.2002)Nat.Immunol.3(2)：102)。发现在小鼠、大鼠和牛科动物来源的巨噬细胞中NO受到炎性细胞因子的诱导，但是在山羊、猪、兔和人类巨噬细胞中没有被诱导(Schneemann&Schoedon(2002) supra；Jungi等.(1996)Vet.Immunol.Immunopathol.54：323-330)。因此，IDO 和NO在由来自小鼠和人类的MSC引起的T细胞增殖的抑制中的作用在并排比较中进行分析。发现由L-NMMA引起的NO抑制完全逆转了由小鼠MSC 引起的免疫抑制，而由人类MSC引起的外周血单核细胞增殖的抑制受到1-MT 逆转，表明与利用NO的小鼠MSC相比，来自人类的MSC利用IDO作为免疫抑制主要效应子(Ren G，Su J，Zhang L，Zhao X，Ling W，L'huillie A， Zhang J，Lu Y，Roberts AI，Ji W，Rabson AB，Shi Y.Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression.Stem Cells 2009，27：1954-1962)。

实施例4

MSC的趋化诱导性能受到促炎细胞因子的诱导

在若干研究中，由MSC引起的有效体内免疫抑制已经采用少到1至5个 MSC/10⁶基质细胞来实现，并且经常持续数月，在一些情况中实现免疫障碍的完全治愈。考虑到MSC在安置(settle)在组织中后是固定的，并且免疫抑制受到NO的介导，这仅仅非常局限地作用于来源附近，这种免疫抑制作用是令人震惊的。设想到了细胞因子诱导的MSC可能具有诱惑免疫细胞到其附近的机制，其中局部高浓度NO可能有效地作用于目标T细胞。为了研究这一点，在显微镜下随时间监测MSC和脾细胞的共培养物。

在抗CD3刺激后，观测到脾细胞主动地向纺锤状MSC迁移。相反，在没有抗CD3刺激的情况下没有发生迁移。由于脾细胞具有有限的活力，因此在没有刺激的情况下缺少向MSC的运动可能是因为这些细胞在体外健康欠佳。为了排除这一点，检查了使用激活的脾细胞上清液初免的MSC的诱惑A1.1T 杂交瘤细胞的能力，A1.1T杂交瘤细胞甚至在没有IL-2的情况下也能够很好地存活。在这些条件下，时间流逝显微摄像法(time-lapsemicrovideography) 揭示在共培养物启动的1.5小时内T细胞向MSC活跃地迁移。然而，没有MSC初免的情况下，没有T细胞向MSC的净运动。因此，MSC只有在MSC 暴露于促炎细胞因子之后才会促进T细胞的迁移。

为了检查各种细胞因子在使MSC能够诱惑T细胞中的作用，使用各种重组细胞因子的组合对MSC进行预处理，并且观测共培养物中所引起的被预激活T细胞的迁移。这个分析表明已经诱导MSC的免疫抑制功能的相同T细胞细胞因子对(即，IFNγ和TNFα；IFNγ和IL-1α或IFNγ和IL-1β)也导致它们诱惑T细胞。同样的，使用特异性细胞因子的抗体中和，发现向MSC迁移受到单独的抗INFγ的阻碍，或者被TNFα、IL-1α和IL-1β作为三因子组的阻断阻碍，这与它们对T细胞增殖的激活脾细胞上清液诱导的MSC抑制的作用相同。因此，MSC的细胞因子诱导的免疫抑制功能很可能依赖于淋巴细胞迁移到MSC附近NO水平最高的位置。

实施例5

促炎细胞因子诱导MSC生成对于免疫抑制具有关键作用的趋化因子

激活T细胞向经细胞因子初免的MSC稳健迁移表明MSC分泌强效的化学引诱物例如趋化因子。因此，通过分析上清液来确定在各种条件下培养的由MSC生成的白细胞趋化因子。对于在没有细胞因子的情况下单独培养的 MSC，没有观测到显著的趋化因子生成，证实了固有形式的MSC是不能诱惑 T细胞的。但是，当以1：60的MSC：脾细胞的比例与抗CD3激活脾细胞共培养，MSC大量生成若干种趋化因子，包括1.5ng/ml(在另一个实验中为12ng/ml)的CXCL-9(MIG)和50ng/ml的CXCL-10(IP-10)。这些是强效的 T细胞特异性趋化因子；已经显示浓度仅为1至10ng/ml的单独的任意趋化因子驱动显著的体外趋化性(Loetscher等.(1998)Eur.J.Immunol.28：3696-3705； Meyer等.(2001)Eur.J.Immunol.31：2521-2527)。CXCL-9和CXCL-10的生成受到单独的IFNγ的抗体中和的抑制或者受到所有三种细胞因子TNFα； IL-1α和IL-1β的抗体中和的抑制，这类似于对免疫抑制诱导的作用。趋化因子生成类似地受到了将重组IFNγ和TNFα(各20ng/ml)添加到单独的MSC 的诱导，TNFα同样地可以和IL-1α和IL-1β互换。因此，这些细胞因子足以诱导趋化因子的MSC表达，这很可能负责将T细胞向MSC驱动的趋化性。因此，一旦它们迁移到紧邻MSC的位置，预期激活的T细胞将分泌诱导MSC 生成额外趋化因子的细胞因子，因此形成诱惑更多T细胞到MSC附近的正向反馈环路。

为了系统性地检查MSC的趋化因子表达曲线，检查了使用来自天然的或者抗CD3激活的脾细胞的上清液处理的MSC中的编码趋化因子和它们的受体的84种不同基因的表达。使用小鼠趋化因子和受体RT2PROFILER.TM. PCR Array试剂盒通过实时PCR分析总RNA，并且将趋化因子mRNA水平与β肌动蛋白进行比较(表1)。一些人类细胞因子组合也诱导了人类MSC中的类似的趋化因子生成。

表1.在使用来自激活T细胞的上清液处理的MSC中的趋化因子和相关基因表达的诱导(β-肌动蛋白被定义为1X10⁷单位)

使用来自天然的或激活的T细胞的上清液(50％的终体积)刺激MCS(在5ml的完全培养基中的1X10⁶/T-25培养瓶(flask))12小时。通过实时PCR分析趋化因子和趋化因子受体基因表达。

发现除了低水平的CX3CL-1(曲动蛋白(fractalkine))和CXCL13(趋化因子(C-X-C)配体13，BCA-1)之外，暴露于天然的脾细胞上清液的MSC 中的mRNA水平并不显著。令人吃惊的是，使用激活脾细胞上清液处理MSC 导致一些趋化因子例如CXCL2(趋化因子(C-X-C)配体2，Groβ)、CXCL5 (趋化因子(C-C)配体5，RANTES)、CXCL9(趋化因子(C-X-C)配体9，MIG)、CXCL10(趋化因子(C-X-C)配体10，IP-10)和CCL7(趋化因子 (C-C)配体7，MCP-3)增加了超过100万倍。按绝对值计算，一些趋化因子达到甚至超过了与β-肌动蛋白相同的表达水平。例如，CXCL10显示出两倍于β-肌动蛋白的mRNA拷贝数。受到最高度诱导的趋化因子是白细胞趋化性的极其强效的诱导物，并且很可能在由MSC引起的免疫抑制中发挥重要作用。实际上，观测到CXCR3(T细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11 的受体(Lazzeri&Romagnani，(2005)Curr.Drug Targets Immune Endocr. Metabol.Disord.5：109-118)，它们在MSC中全部受到高度诱导)的抗体的抗体阻断抑制了T细胞母细胞趋向MSC的趋向性并且逆转了它们增殖的抑制。

为了直接检查促炎细胞因子诱导的MSC上清液的趋化性驱动能力，采用了CHEMOTX趋化性系统(NeuroProbe)。该系统由被不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(5μm孔尺寸)分隔开的上腔室和下腔室构成。来自MSC培养物的上清液被放置到下腔室中并且在IL-2存在的情况下将激活的CD4⁺或CD8⁺ T细胞母细胞添加到上腔室中。在3小时之后对趋化性进行定量。发现响应于来自使用IFNγ加上TNFα或者使用IFNγ加上IL-1处理的MSC的培养物上清液，CD4⁺和CD8⁺T细胞两者均发生显著的趋化性。使用来自被激活的脾细胞调理的培养基处理的MSC的上清液也获得类似的结果。

相反，来自未处理的MSC或者激活的单独的脾细胞的阴性对照上清液没有趋化性，如在没有MSC的情况下直接添加IFNγ加上TNFα的那样。重要的是，这种趋化活性可以被抗CXCR3和CCR5(两种最重要的T细胞特异性趋化因子受体)所阻断，特别是在一起添加这两种抗体的情况下。除了募集T 细胞之外，细胞因子激活的MSC还诱惑骨髓来源的树突细胞、巨噬细胞和B 细胞。

CHEMOTX系统还被用来检查趋化性在T细胞增殖的抑制中的作用。在该分析中，在添加或者不添加IFNγ加上TNFα的情况下，将MSC添加至下孔中，并且将T细胞母细胞(和IL-2)添加至上孔中。在该设置中，在下孔中的MSC生成的趋化因子应该诱导T细胞的过膜迁移并且进入到下孔中，在下孔中，由MSC生成的NO因此能够抑制它们的增殖。温育3小时后，使用 3H-胸腺嘧啶对上孔和下孔再脉冲6小时，并且收获两个孔中的细胞以用于确定增殖。CD4⁺和CD8⁺T细胞母细胞的增殖水平在IFNγ和TNFα存在的情况下受到MSC的显著抑制。同样地，抗T细胞趋化因子受体CXCR3和CCR5 的阻断抗体显著地逆转了这种作用。这些数据进一步表明在MSC介导的免疫抑制中T细胞趋化性是关键的。

总而言之，这些结果表明，当MSC在免疫反应过程中被暴露于促炎细胞因子时，它们将生成大量的若干种趋化因子，特别是对T细胞具有特异性的那些趋化因子，因此，这些趋化因子诱惑T细胞进入到紧邻MSC的位置，在该位置处，高浓度的NO起到抑制T细胞功能的作用。

实施例6

MSC对迟发型超敏反应(DTH)和移植物抗宿主病(GvHD)的预防作用依赖于炎性细胞因子和NO的生成

单独使用OVA或者使用OVA和来自iNOS缺陷型小鼠或野生型小鼠的 MSC注射小鼠的脚掌。然后使用OVA对小鼠的脚掌进行挑战，并且根据脚掌肿胀测量所导致的DTH反应。这个分析的结果表明，施用野生型MSC导致 DTH反应中的炎症减轻。明显相反的是，iNOS缺陷型MSC不仅没有减轻炎症，而且实际上还增强了DTH反应(与没有注射MSC的被挑战小鼠相比(图 2))。脚掌的组织学分析显示来自被共注射野生型MSC的动物的皮肤中的炎症指示物减少，但是被共注射iNOS^-/-MSC的那些小鼠在炎症部位具有增加的流体和白细胞侵润。这个实验不仅证明了免疫反应抑制中需要NO，而且还显示在没有生成NO的情况下，MSC介导的趋化性增强了炎症并且可以被用来加强局部免疫反应例如使用iNOS和IDO的抑制剂促进疫苗的效力或者针对癌症引起有效的免疫反应。

由MSC引起的免疫抑制的一种惊人作用是抑制移植物抗宿主病(GvHD) 的能力(LeBlanc等.(2004)supra；Le Blanc&Ringden(2006)supra)。为了研究MSC引起的细胞因子诱导的NO生成是否导致体内的免疫抑制，将来自C57BL/6小鼠的5x10⁶的脾细胞和5x10⁶的有核骨髓细胞注射到经致命辐射的F1(C57BL/6xC3H)小鼠以建立小鼠GvHD模型。所有受体阳性对照小鼠在第15至22天之间都患上广泛的GvHD(消瘦、折毛(ruffled hair)和驼背))，而接受同系F1骨髓的阴性对照没有受到影响。

当F1小鼠在骨髓移植后使用MSC(0.5x10⁶来自于在第3和7天静脉内注射的供体小鼠)处理时，对GvHD具有显著的保护作用；所有MSC处理小鼠存活至少33天并且一些小鼠存活超过75天。相反，使用源自于iNOS^-/-或 IFNγR1^-/-小鼠的MSC处理的F1小鼠没有受到保护，因为它们的存活与没有受到处理的阳性对照没有差异(图3)。IFNγR1或iNOS缺陷型的MSC没有受到保护表明IFNγ和NO生成对于MSC介导的体内免疫抑制是必需的。

由于体外结果显示IFNγ与三个细胞因子TNFα、IL-1α,或IL-1β之一一起作用以诱导MSC的免疫抑制功能，因此检查了这些细胞因子在MSC介导 GvHD保护中的作用。在野生型MSC输注后使用抗这些细胞因子的中和抗体或者L-NMMA注射小鼠7天，并且让GvHD发展。抗IFNγ和L-NMMA都导致MSC介导的GvHD保护的显著逆转(图3)，而阴性对照小鼠没有显示出响应于这些处理的反作用。

抗TNFα、IL-1α和IL-1β的三抗体混合物的作用没有那么显著，没有达到统计学显著性(图4)。该结果进一步暗示IFNγ和NO生成，但是对于其他的细胞因子则是含糊(equivocal)的。但是，重要的是，认识到除了与IFNγ协同诱导由MSC引起的免疫抑制之外，TNFα和IL-1在GvHD的正常致病机制中也是重要的因子。实际上，已经有报道TNFα或IL-1的中和能够降低GvHD的严重性(Hattori等.(1998)Blood 91：4051-4055；McCarthy等.(1991)Blood 78：1915-1918)。因此，多少预期GvHD保护没有被这些抗体逆转到更高的程度。

还在骨髓移植14天后检查了来自这些小鼠的各种器官中的炎症严重性的组织学检查。被观测的白细胞侵润的程度与存活结果具有良好相关性；GvHD 诱导小鼠显示肝、肺和皮肤中的淋巴细胞数量增加，但是几乎没有出现在使用MSC处理的那些小鼠中。另外，MSC保护几乎被抗IFNγ和L-NMMA完全逆转，而抗TNFα、IL-1α和IL-11的三抗体混合物作用较低。总而言之，来自这些GvHD实验的发现以及来自DTH研究的那些发现清楚表明IFNγ和 NO在MSC介导的体内免疫抑制中的作用。

实施例7

源自于肿瘤的MSC样淋巴瘤基质细胞具有免疫抑制性

由于淋巴瘤中的肿瘤细胞没有粘附，因此可以将p53+/-小鼠患有的淋巴瘤与肿瘤基质细胞分离。观测到这些细胞可以进行体外继代并且可以分化为脂肪细胞和成骨样细胞。令人感兴趣的是，像源自于骨髓的MSC一样，这些肿瘤基质细胞也具有免疫抑制性，并且能够有效地抑制抗CD3激活的脾细胞的增殖。这些免疫抑制作用也依赖于IFNγ+TNFα和NO，因为抗IFNγ、IFNγ和iNOS抑制剂能够逆转所述免疫抑制作用。

实施例8

淋巴瘤基质细胞(LSC)以NO依赖方式促进了淋巴瘤的发展

为了检查淋巴瘤基质细胞对肿瘤生长的影响，对355B-细胞淋巴瘤细胞系 (C3H-gld/gld背景，0.5x10⁶细胞/小鼠)共注射源自于gld/gld小鼠的淋巴瘤基质细胞(C3H背景，P5，0.25x10⁶细胞/小鼠)。观测到共注射基质细胞显著地增强了死亡率。令人感兴趣的是，施用1400W(NOS抑制剂，0.1mg/小鼠，在第0、2、4、8、12、16、20、24和28天)显著地逆转了该作用(图4)。因此，肿瘤基质细胞能够显著地促进了肿瘤生长。

实施例9

NOS抑制剂与IFNγ的组合促进了小鼠黑素瘤治疗

为了检验肿瘤基质细胞生成的NO对肿瘤免疫治疗的作用，在第0天将 B16-F0黑素瘤细胞注射到C57BL/6小鼠中(0.5x10⁶细胞/小鼠)。在第4、8、 12、16、20天腹膜内注射施加IFNγ(250ng/小鼠)或1400W(NOS抑制剂， 0.1mg/小鼠)。当小鼠频临死亡时记录小鼠存活。观测到这种组合治疗显著地促进了小鼠存活(图5)。因此，IFNγ在肿瘤发展中具有双重作用；一是通过生成某些血管抑制因子或者阻断某些血管形成因子生成来预防肿瘤发展，另一个是通过生成因子如NO、IDO或PGE2利用肿瘤基质细胞或其他环境细胞诱导免疫抑制。因此，NO、IDO或PGE2中的一种或者多种的抑制能够显著地增强了癌症治疗。因此，当采用例如基于细胞因子、接种疫苗、抗体、树突细胞或T细胞之类的免疫治疗来治疗癌症时，肿瘤基质细胞可能负责大部分案例中使这些治疗不能完全根除肿瘤。iNOS和IDO的抑制剂与免疫治疗的组合使用能够提供了根除肿瘤的有效方法。

实施例10

IL-17A与IFNγ和TNFα协同诱导免疫抑制效应子分子iNOS在小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中的高表达

小鼠MSC介导的免疫抑制依赖于炎性细胞因子。没有这些细胞因子， MSC不会具有免疫抑制作用，除非在炎性细胞因子IFNγ与TNFα或IL-1存在的情况下，MSC才被刺激以表达免疫抑制效应子一氧化氮(NO)(其被可诱导性NO合成酶(iNOS)所催化)以及若干种辅助分子-趋化因子和粘附分子。趋化因子和粘附分子将T细胞和其他免疫细胞保持在MSC的附近，在此大量的NO抑制了免疫细胞的功能。

由于体内炎性环境除了我们前文提到的三种类型的细胞因子之外还含有各种类型的炎性细胞因子和生长因子，因此带有组织损伤的部位中的MSC的原位功能应当受到特定微环境生态位中的各种细胞因子的影响，本发明人检查了其他细胞因子特别是在自体免疫性疾病和组织损伤中高水平表达的那些细胞因子。

在被检验的若干种细胞因子中，发现IL-17A在IFNγ和TNFα存在的情况下大大增强了iNOS表达。IL-17A是见于很多病理学症状中的关键促炎细胞因子，但是很少知道它是如何影响MSC的生理学的。如图6所示，在mRNA 和蛋白水平上，IL-17A大大增强了iNOS的表达。这个发现表明进一步增补 IL-17A可能是增强MSC的免疫抑制活性的有潜力的策略。

实施例11

IL-17A增强了BM-MSC介导的对T细胞增殖的免疫抑制

为了检验IL-17A增强iNOS表达是否具有功能性，进行MSC-T细胞共培养系统以评价MSC的免疫抑制活性。如图7所示，增补IFNγ和TNFα可以以细胞因子浓度依赖形式降低T细胞增殖。令人吃惊的是，添加IL-17A增强了MSC对T细胞增殖的抑制。因此，IL-17A在增强MSC介导的免疫抑制中是功能性的。

实施例12

材料与方法

试剂和小鼠

重组小鼠IFNγ、TNFα、IL-17A和抗IL-17A抗体来自于eBiosciences(La Jolla，CA)。重组小鼠IL-2来自R&D Systems(Minneapolis，MN)。抗β-肌动蛋白、GAPDH、iNOS、p-IκBα、p-P65、p-JNK和p-ERK1/2的抗体来自于 Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。抗Act1的抗体来自于Santa Cruz Biotechnology(Dallas，TX)。PMSF和放线菌素D购自Sigma-Aldrich(St.Louis， MO)。

将C57BL/6小鼠保持在动物园中的特定无病原体的条件下并随意饮水和进食。所有动物程序均得到我们的Institutional Animal Care and Use Committee 批准。

细胞-MSC使用在实施例1中描述的程序生成。简而言之，收获6至8周龄的野生型或auf1-/-小鼠的胫骨和股骨的骨髓。将细胞培养在DMEM培养基中，该培养基增补有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml 链霉素(完全培养基，全部来自于Invitrogen，Carlsbad，CA)。在24小时之后移除所有的非粘附细胞，并且保留粘附细胞。每2至3天更换培养基。为了获得MSC克隆，收获融合细胞并且通过限制稀释法将其接种在96孔板。然后挑取单个克隆并扩繁。MSC能够在相应的分化条件下分化为脂肪细胞和成骨细胞。使用第15世代前的细胞。

T细胞母细胞使用分离自C57BL/6小鼠的天然脾细胞生成，并且培养在 RPMI-1640培养基中，该培养基增补有10％热灭活FBS、2mM谷氨酰胺、 100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50μM的β-ME。使用抗CD3和抗CD28 激活脾细胞(1×10⁶细胞/ml)48小时并收获，将上清液过滤(0.1μm)并冷冻。然后使用的单独IL-2(200U/ml)培养细胞48小时。

增殖分析-为了分析T细胞增殖，将0.5μCi的3H-胸腺嘧啶添加到96孔板的每个孔中，6小时之后通过冷冻终止培养。然后将板冻融，收获细胞并且使用Wallac Microbeta闪烁计数器(Perkin-Elmer,Waltham,MA)评价所引入的3H-Tdr。

信使RNA衰减分析–自然进行了信使RNA衰减分析。将MSC与细胞因子组合一起温育6小时。以5μg/ml的浓度将放线菌素D(Act.D)添加到培养基中以终止转录。在添加Act.D后的不同时间点，收获细胞以用于总RNA提取。

通过定量RT-PCR测量每个时间点的iNOS、CXCL1、CCL2、CXCL10和IL-6 mRNA的水平并针对β-肌动蛋白mRNA的水平进行归一化。将每个时间点保留的mRNA的百分比针对Act.D添加后的时间进行作图。第一阶衰减常数k通过非线性回归法进行确定。相关mRNA半衰期t1/2使用公式t1/2＝ln2/k进行计算。

RNA分离和表达分析-总RNA使用RNAprep Pure Cell/Bacteria试剂盒进行分离。第一链cDNA合成使用cDNA合成试剂盒进行。通过定量RT-PCR(7900 HT；AppliedBiosystems，Foster City，CA)使用SYBR Green Master Mix测量 mRNA的水平，并且针对β-肌动蛋白mRNA进行归一化。正向引物和反向引物对的序列如下：

iNOS：正向5’-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3’和反向 5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3’；

β-肌动蛋白：正向5′-CCACGAGCGGTTCCGATG-3′和反向 5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′；

IL-6：正向5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’和反向 5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’；

CXCL1：正向5’-CTGCACCCAAACCGAAGTC-3’和反向 5’-AGCTTCAGGGTCAAGGCAAG-3’；

CCL2：正向5’-TCTCTCTTCCTCCACCACCATG-3’和反向 5’-GCGTTAACTGCATCTGGCTGA-3’；

CCL5：正向5’-TTTCTACACCAGCAGCAAGTGC-3’和反向 5’-CCTTCGTGTGACAAACACGAC-3’；

CXCL9：正向5’-AGTGTGGAGTTCGAGGAACCCT-3’和反向 5’-TGCAGGAGCATCGTGCATT-3’；

CXCL10：正向5’-TAGCTCAGGCTCGTCAGTTCT-3’和反向 5’-GATGGTGGTTAAGTTCGTGCT-3’。

Western印迹分析-使用冰冷的PBS洗涤细胞两次，收获细胞并且将其于含有蛋白酶抑制剂(Roche，Natley，NJ)和PMSF(Sigma)的混合物的RIPA缓冲液(Millipore，Temecular，CA)中于冰上裂解30分钟。通过在16000g离心 15分钟使裂解物澄清。通过Bradford assay(Bio-Rad，Hercules，CA)确定上清液的蛋白浓度。

将蛋白样品稀释在5xSDS上样缓冲液(250mM Tris-HCl，pH6.8，10％SDS、 0.5％溴酚蓝、50％甘油、5％β-巯基乙醇)并在10％SDS–聚丙烯酰胺凝胶中分级。将蛋白电印迹到硝化纤维素膜(Whatman Inc.，Clifton，NJ)上并在溶解于TBST(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.05％Tween 20)的5％脱脂奶粉中于室温温育1小时。将印迹膜和初次抗体一起在4℃温育过夜，在 TBST中全面洗涤，和HRP-偶联二次抗体(Cell Signaling)一起于室温温育1.5 小时，再用TBST洗涤。印迹膜使用化学发光试剂(Millipore，Billerica，MA) 根据制造商提供的说明书进行显色。

IL-17A受体的免疫荧光检测-培养的MSC首先使用PBS洗涤并且使用冰冷甲醇在-20℃固定10分钟。在与在PBS中的0.3％Triton X-100温育10分钟之后，使用5％BSA于室温将细胞封闭1小时并且和初次抗体抗IL-17RA(Santa Cruz) 于4℃温育过夜。在用PBS洗涤之后，将细胞和Alexa Fluor 594偶联羊抗兔二次抗体和DAPI(Invitrogen)于室温温育1小时。然后使用PBS洗涤细胞后再成像。

小鼠中的ConA-诱导的肝损伤-C57BL/6小鼠(8-10周龄)以15mg/kg静脉注射在PBS中的ConA(Vector Labs，Burlingame，CA)以诱导肝损伤。源自于野生型小鼠或auf1-/-小鼠的MSC(5x10⁵)在IL-17A存在或者不存在的情况下使用或者不使用IFNγ、TNFα处理12小时(每细胞因子各10ng/ml)，然后静脉内施用于已经使用ConA处理30分钟的小鼠中。对小鼠实施安乐死并且在另外的7.5小时后对血清和肝组织进行采样。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性通过ALT检测法进行检测。福尔马林固定的肝组织学切片使用苏木精&署红 (H&E)染色。

肝单核细胞分离和流式细胞法分析-肝单核细胞(MNC)通过40％/70％梯度(gradient)纯化并且使用抗CD3-PE、抗CD4-PerCP/Cy5.5和抗CD8a-APC (eBiosciences)于4℃在染色缓冲液(PBS、3％FCS)中染色30分钟。对于克隆MSC中的IL-17RA的表面表达的检测，细胞使用抗IL-17RA-PE(eBiosciences) 染色并且通过流式细胞法在FACS Calibur流式细胞计(Becton Dickinson，San Jose，CA)上分析。

统计分析-非线性回归法和统计分析使用PRISM v5软件(GraphPad Software，Inc.)进行。使用非配对的t检验进行样品间比较。P<0.05的差异被认为是显著的(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

结果-IL-17A增强了MSC的免疫抑制作用

本实施例提供了MSC的免疫抑制功能不是先天的而是受到促炎细胞因子以浓度依赖方式诱导。IFNγ与三种其他促炎细胞因子–TNFα、IL-1α或IL-1β中的一个的组合对于使MSC能够具有免疫抑制作用是需要的。IL-17A是一种多效性促炎细胞因子，其在各种炎性和自体免疫性疾病的致病机理中的关键作用是已知的。令人感兴趣的是，还已知IL-17A与某些细胞因子协同促进炎症需要的基因表达程序。因此，本发明人检查了IL-17A是否能够与次优浓度的 IFNγ和TNFα协同诱导MSC的免疫抑制性能。

将MSC与低浓度(各2ng/ml)的重组细胞因子IFNγ、TNFα和IL-17A的各种组合培养12小时；将CD4⁺T细胞母细胞以1：20比例(MSC：T细胞)和IL-2 一起添加到培养物中，并且T细胞增殖通过³H-胸腺嘧啶引入法进行评估(注意T细胞母细胞在IL-2存在的情况下增殖，但是它们在没有进一步的TCR激活的情况下没有生成细胞因子)。然后得出结论，即三种细胞因子不能单独诱导 MSC中的免疫抑制。

MSC首先使用重组细胞因子IFNγ、TNFα、IL-17A(各2ng/ml)的所示组合处理12小时，然后与CD4⁺T细胞母细胞以1：20的比例(MSC：T细胞)共培养，并在另外的12小时之后通过³H-胸腺嘧啶引入法评价增殖。因此，T细胞增殖在IFNγ和TNFα存在的情况下受到抑制，并且这种抑制能够受到IL-17A 的显著增强(图9A)，表明IL-17A具有新的免疫调节功能，是一种强效的促炎细胞因子。

MSC或Raw 264.7(巨噬细胞)中的IL-17受体家族成员的mRNA表达然后通过RT-PCRNC：No RT.进行检查。同样地，IL-17A通过IL-17RA和IL-17RC 进行信号转导，两种受体在MSC中的表达通过RT-PCR得到证实(图9B)，其中小鼠巨噬细胞系Raw 264.7被用作阳性对照；IL-17RA的细胞表面表达也通过间接免疫荧光显微法和流式细胞法得到证实(图9C，分别在上图和下图)。

由于炎性细胞因子的浓度在不同的炎性反应阶段发生变化，因此进一步评价IFNγ和TNFα对IL-17A增强的免疫抑制的浓度依赖性。将MSC和具有所示浓度的IFNγ和TNFα一起在没有或者有10ng/ml IL-17A的情况下培养。MSC然后与CD4⁺ T细胞母细胞或A1.1 T细胞杂交瘤共培养以评价对T细胞增殖的作用。IL-17A在低至各1-2ng/ml的IFNγ和TNFα浓度下能够增强MSC对T细胞的免疫抑制作用(图9D、9E)。

即使在较高的IFNγ和TNFα浓度(即10-20ng/ml)，IL-17A仍然提高了免疫抑制，尽管该作用没有那么显著。但是，MSC使用IFNγ和TNFα(2ng/ml)在梯度浓度的IL-17A下处理12小时，并且然后与T细胞杂交瘤A1.1细胞以1：10 的比例共培养12小时。结果，低浓度的IFNγ和TNFα(各2ng/ml)，低至0.5ng/ml 的IL-17A就足以引发T细胞增殖的急剧下降(p<0.05；图9F)。

这个观测结果提供了MSC能够抑制激活原生脾细胞的增殖，这依赖于由T 细胞分泌的炎性细胞因子。T细胞的激活导致很多细胞因子包括IL-17A的生成。为了证实IL-17A有助于MSC的免疫抑制作用，使用抗IL-17A抗体于MSC激活的脾细胞共培养物体系中将其中和。虽然激活的脾细胞的增殖受到MSC的显著抑制，但是这种抑制在添加抗IL-17A的抗体之后受到部分逆转，即，在抗体存在的情况下增殖增加(图9G)。抗体的优化作用在MSC：脾细胞比例为1： 40时出现。采用1：20的MSC：脾细胞比例，逆转没有那么显著，但是仍然具有统计学显著性(p<0.01)。总而言之，这些结果表明IL-17A能够增强MSC的免疫抑制作用，特别是在它们在较低浓度的IFNγ和TNFα中培养的时候。

IL-17A与炎性细胞因子协同诱导MSC中的免疫调节基因的表达

一氧化氮(NO)和协同作用的趋化因子是介导MSC的免疫抑制作用的关键分子。MSC中的趋化因子和iNOS基因受到IFNγ和TNFα的诱导。但是，IL-17A 增强了与IFNγ和TNFα共培养的MSC引起的免疫抑制(图9D、9E)。设计本研究以显示IL-17A与IFNγ和TNFα协同诱导iNOS和趋化因子在MSC中的表达。为了检验这种推测，将MSC群与IFNγ、TNFα和/或IL-17A的各种组合一起培养，并评价对所选的免疫调节基因的表达的作用。

与和单独的细胞因子或细胞因子的两种组合一起培养的MSC相比，添加 IFNγ、TNFα和IL-17A显著地增加了iNOS、IL-6和CXCL1在mRNA水平上的表达(图10A)；Western印迹分析证实iNOS蛋白水平也增加(图10B)。但是，其他趋化因子例如在MSC的免疫抑制作用中发挥枢纽作用的CCL5、CCL2、 CXCL9、CXCL10的表达全都没有受到添加IL-17A的影响(图10C)。

为了证实对基因表达的影响是因为IL-17A，将MSC与来自抗CD3和抗 CD28激活的脾细胞的上清液在抗IL-17A的中和抗体存在或者不存在的情况下培养。向上清液添加抗IL-17A阻断了iNOS、IL-6和CXCL1基因表达的诱导但是没有影响CCL2、CCL5、CXCL9或CXCL10(图10D、10E)。使用Act1敲低 MSC阻断IL-17A的信号转导进一步证实了这个结论。

向IL-17RA募集适配体蛋白Act1与IL-17A依赖性信号转导相关联。由于 IκBα、ERK、p65、JNK的磷酸化在这些Act1敲低MSC中受到损害(图11A)，因此IL-17A不能上调Acl1敲低MSC中的IFNγ+TNFα诱导的iNOS表达(图 11B,11C)。同时，MSC中由IL-17A引起的免疫抑制的增强在缺少Act1的情况下也没有见到(图11D)。因此，对基因表达的影响是因为IL-17A的缘故。总而言之，这些数据表明，IL-17A能够与IFNγ和TNFα协同诱导有助于MSC的免疫抑制功能的基因的表达。

IL-17A逆转由RNA结合蛋白AUF1施加的基因表达抑制

编码iNOS和很多细胞因子/趋化因子的信使RNA迅速降解，这限制了 mRNA和蛋白两者的丰度。信号转导途径的激活特别是在免疫反应过程中的信号转导途径的激活稳定了很多这些mRNA从而增加了它们的表达。实际上， IL-17A诱导很多炎性调节子基因的表达的主要机制是通过稳定它们的mRNA 来实现的。很多蛋白结合至特定的RNA序列(该序列通常位于3’-UTR中)并且靶向mRNA以快速降解。富含AU元件(ARE)包含一个这样mRNA降解序列家族。有很多这样的蛋白，这些蛋白结合至ARE以引发含有它们的mRNA 的受控表达。这些蛋白包括AUF1、HuR、KSRP、TIA-1/TIAR和TTP。这些蛋白的一些标靶包括编码iNOS、IL-6和CXCL1的ARE-mRNA。ARE结合蛋白 AUF1由四个异构体–p37、p40、p42和p45组成–这些异构体结合并且调节iNOS 和IL-6 mRNA的降解。因此推测AUF1可能起到限制iNOS和细胞因子/趋化因子mRNA表达的作用，并且IL-17A可能阻断AUF1的这种活性，由此增加基因的表达。

因此，比较了源自于auf1^-/-小鼠和野生型小鼠的骨髓的MSC之间的细胞因子诱导的基因表达。如前文所述，在用或者不用IL-17A的情况下将细胞与细胞因子的组合一起培养。虽然iNOS、IL-6和CXCL1 mRNA的水平一般来说在野生型MSC中非常低，但是添加IL-17A(和IFNγ和TNFα一起)诱导了这些 mRNA的显著增加(图12A；p<0.001)。相反，这三种mRNA的水平在与 IFNγ+TNFα一起培养的auf1^-/-MSC中高得多，并且添加IL-17A对mRNA水平几乎没有作用(即IL-17A增加了它们的丰度不到两倍)。同样的，IFNγ和TNFα足以最大地诱导auf1^-/-MSC中的iNOS蛋白而不需要IL-17A，这与野生型的 MSC不同(图12B，比较泳道7和8与泳道5)。

考虑到AUF1和IL-17A对基因表达的作用，单独敲除AUF1可能足以提供 mRNA稳定程度以及增高的基因表达，这一般需要IL-17A。野生型和auf1^-/- MSC在用或者不用IL-17A的情况下与IFNγ+TNFα培养。6小时后，添加Act.D 以终止转录。

在不同的时间点，从细胞分离RNA并且确定个体mRNA的水平以评价 mRNA衰减动力学。在野生型MSC中，iNOS、IL-6和CXCL1 mRNA相对不稳定，半衰期分别为4.3±1.4小时，0.7±0.1小时，和0.59±0.08小时；IL-17A导致所有三种mRNA稳定两倍(图13A；每个都是p<0.05)。CCL2和CXCL10 mRNA 对IL-17A没有响应(见图13C)，如所预期的那样，它们不受IL-17A的稳定化 (图13A；对于两种mRNA均为t1/2＝～2小时，在用或者不用IL-17A情况下)。

与野生型MSC不同，敲除AUF1强烈稳定iNOS、IL-6和CXCL1 mRNA(图 13B；对于iNOS和IL-6，t1/2>10小时；对于CXCL1，t1/2＝4.3±0.6小时)。IL-17A 对iNOS和IL-6 mRNA的半衰期没有影响(图13B)，但是其稳定了CXCL1 mRNA至少两倍(图13B；t1/2>10小时与4.3±0.6小时(没有IL-17A)，参见讨论部分)。这些mRNA衰减数据表明，(i)AUF1正常情况下促进了MSC中iNOS、 IL-6和CXCL1 mRNA的降解，而IL-17A导致它们的稳定；(ii)敲除AUF1导致的这些mRNA的稳定与IL-17A对野生型MSC中的mRNA的稳定作用相当；和 (iii)AUF1敲除显示为避免需要IL-17A来诱导iNOS/趋化因子基因表达。因此，AUF1可以用作这样的一种对照点，通过该对照点，IL-17A必然起到引导其对 MSC基因表达的影响，并且可能引起对最终的免疫抑制的影响，这一点将在下文进行检查。

AUF1对由MSC引起的免疫抑制的体外影响

考虑到AUF1敲除诱导趋化因子基因表达而无需IL-17A(见图12和13)，推测单独使用IFNγ+TNFα培养auf1^-/-MSC将足以在表型上复制(phenocopy) 使用所有三种细胞因子培养的野生型MSC的免疫抑制活性。为了证明这种推测，在用或者不用IL-17A的情况下使用IFNγ+TNFα培养野生型和auf1^-/-MSC，并且然后与A1.1T细胞杂交瘤一起培养以分析T细胞增殖。与没有IL-17A的情况下培养的细胞相比，IL-17A增加了野生型MSC的免疫抑制活性；但是， IFNγ+TNFα足以诱导auf1^-/-MSC的最大免疫抑制活性，而IL-17A不能进一步增强免疫抑制作用(图14.A、14B)。经综合考虑，这些结果与AUF1限制iNOS 和细胞因子/趋化因子基因表达的观测结果是吻合的；IL-17A逆转了这种作用从而增强了由MSC引起的免疫抑制。

IL-17A以AUF1依赖型方式增强了MSC在患有ConA诱导的肝损伤的小鼠中的治疗作用

接着本发明人检查了IL-17A对野生型和auf1^-/-MSC引起的体内免疫抑制的影响。小鼠中ConA诱导的肝损伤是主要由T细胞介导的自体免疫性肝炎的被充分描述过的体内模型。由于以前的结果表明IL-17A能够急剧增强MSC在体外系统中的免疫抑制作用，因此预期IL-17A可能能够使MSC在治疗小鼠中 ConA诱导的肝损伤中具有更好的治疗作用。因此，在存在或不存在IL-17A的情况下，首先处理有和没有IFNγ+TNFα的野生型和auf1-/-MSC 12小时，然后将它们静脉内注射到30分钟前接受了ConA注射的小鼠。与没有处理或经 IFNγ+TNFα预处理的野生型MSC相比，IFNγ+TNFα和IL-17A预处理的MSC基本能够减轻肝损坏，血清ALT活性和肝坏死和炎症急剧下降(图15A、15D)。然而，对于auf1^-/-MSC，只有IFNγ+TNFα预处理会引起ConA诱导肝损伤中的最大治疗作用而无需IL-17A(图15A、15D)。与血清ALT活性模式吻合的是，在施用经IFNγ+TNFα和IL-17A一起预处理的野生型MSC或者在用或者不用IL-17A的情况下经IFNγ+TNFα预处理的auf1-/-MSC的小鼠中，肝中的单核细胞以及CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞浸润急剧下降(图15B、15C)。因此，本领域技术人员能够认识到的是，通过利用经IFNγ+TNFα和IL-17A一起预处理的MSC治疗ConA诱导的肝损坏是一种新且新颖的疗法，并且IL-17A的作用以AUF1依赖型方式施加。

实施例13

IL-17A通过增强mRNA的稳定性来促进iNOS表达

为了研究IL-17A如何增强由MSC引起的iNOS表达和免疫抑制的机制，研究了在细胞因子诱导下iNOS的RNA稳定性。如图16A所示，在 IFNγ+TNFα处理组中iNOS mRNA半衰减时间是约2.5小时。有趣的是，增补IL-17A在检验的时间点内完全保护了iNOS mRNA。

在哺乳动物中，很多编码炎性蛋白的mRNAs能够受到存在于它们的3' 非翻译区的富含AU元件(AREs)的去稳定化。快速mRNA降解与带有这些 mRNA的ARE结合蛋白(AUBP)相关地发生。AUFI，即ARE/聚(U)-结合/降解因子1，是一种被表征最充分的AUBP之一，其结合至很多ARE-mRNA 从而介导降解。怀疑AUFI对于在MSC中IL-17A介导的iNOS过表达中注意到的观测结果是关键的。

为了检验这一点，使用siRNA敲低MSC中的AUF1并且使用 IFNγ+TNFα(用或者不用IL-17A)进行处理。令人吃惊的是，在野生型MSC 中，IL-17A诱导了iNOS表达，但是AUF1的缺乏极大地消弭了这种作用，表明AUF1在MSC中的IL-17A介导的iNOS表达的重要性。因此，IL-17A 能够稳定MSC中的iNOS mRNA，这提供了在临床环境中有效增强MSC介导的治疗的一种新颖的方法。

I型干扰素和成纤维细胞生长因子(FGF-2)通过下调iNOS表达对MSC 介导的免疫抑制起到负调节因子的作用

如上所述，IL-17A可能是增强MSC介导的免疫抑制的潜在因子。然而，在很多情况中，体外和体内的这种免疫抑制作用需要予以正向或者负向控制。筛查了可能利用的生长因子和细胞因子，并且令人吃惊的是，两种因子下调MSC介导的免疫抑制：I型干扰素和成纤维细胞生长因子(FGF-2)。

这两种因子可能潜在地抑制了MSC对T细胞增殖的免疫抑制作用(图 16)。进一步分析表明，增补这些因子中的任意一种能够令人惊讶地降低了 iNOS蛋白的表达和NO生成(图17)。

这些发现证实了负向控制MSC介导的免疫抑制的方法。因此，抗I型干扰素和FGF的抗体可以被用来加强MSC的免疫抑制作用。

人类IDO表达小鼠iNOS-/-细胞(人源化IDO MSC)的构建。

MSC介导的免疫抑制存在物种变化性：NO是小鼠MSC的效应子分子，而人类和灵长目动物MSC利用吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)作为抑制性效应子分子。

由于小鼠MSC在炎性细胞因子刺激后不表达吲哚胺2,3-双加氧酶 (IDO)，因此难以研究IDO在小鼠系统中的生物学作用。为了避开这个问题，使用在小鼠iNOS启动子的控制下的人类IDO基因转染小鼠iNOS-/- MSC。这允许IDO在炎性细胞因子刺激后在小鼠MSC中表达。已经成功地生成了表达小鼠iNOS-/-MSC的稳定性人类IDO，证实小鼠炎性细胞因子刺激下IDO的高表达。采用这些人源化的IDO MSC，显示了IDO在小鼠 MSC的体内和体外具有免疫抑制性。人源化的IDO小鼠产生自iNOS-/-小鼠。

还使用人类IDO基因来代替正常小鼠中的小鼠iNOS基因，使得IDO 的表达受到小鼠iNOS基因调节机制的控制，同时使iNOS沉默以进一步研究药物学、癌症治疗并评价免疫反应和免疫相关发病机理。

实施例14

转导MSC群以释放功能性IFNα

在这个实施例中，本发明人使用编码GFP(MSC-GFP)或GFP和小鼠IFNα (MSC-IFNα.)一起的慢病毒转导MSC。超过90％的细胞被成功转导，如通过流式细胞仪上显示的GFP表达所示(图18A)。观测到MSC-GFP和 MSC-IFNα之间没有明显的形态学和增殖速度上的变化。为了检查MSC-IFNα的IFN生成水平，对以5×10⁵细胞/ml培养48小时的MSC的上清液中的IFNα水平进行定量(图18B)。

ELISA分析显示，在MSC-IFNα的上清液中有19ng/ml的IFNα，而在相同条件下培养的MSC-GFP的上清液没有检测到IFNα。为了检验MSC-IFNα释放的IFNα是否具有生物学功能，通过流式细胞法评价了MHC I分子H-2Kb 在MSC表面上的表达。IFNα提高了H-2Kb的表达水平。

图18C详细展示了H-2Kb的表达在MSC-GFP中是低的，这是MSC的本质性能。然而，令人惊讶的是，使用重组IFNα处理后，H-2Kb的表达在 MSC-GFP中急剧上升。H-2b的类似的表达上升在使用MSC-IFNα的上清液处理的细胞上也观测到。相应地，H-2Kb在MSC-IFNα上的表面上的表达也上升到使用IFNα处理的MSC-GFP的类似水平。这些数据证明MSC-IFNα生成了具有生物学功能的IFNα。

MSC-IFNα施加强效的体内抗肿瘤作用。

为了研究MSC-IFN-α对体内肿瘤生长的作用，使用了小鼠B16黑素瘤模型。在该体系中，所有细胞和小鼠都具有C57BL/6背景。通过肌肉内方式单独接种或者和1×10⁶MSC-GFP或MSC-IFN-α一起接种1×10⁶B16黑素瘤细胞，在12天后移除肿瘤并称重。令人预料不到的是，观测到MSC-IFNα使肿瘤生长完全停止，而MSC-GFP稍微增强了肿瘤生长(图19A)。为了检测MSC-IFNα的效力，将1×10⁶B16黑素瘤细胞和不同数量的MSC-IFNα一起注射到动物中。令人惊讶的是，即使是1×10⁴MSC-IFNα(MSC-IFNα：B16的比例＝1：100) 也仍然能够有力地防止肿瘤的体内生长(图19B)。而且，单独使用肿瘤细胞接种的所有小鼠在30天内死亡，而接受肿瘤细胞和MSC-IFNI的小鼠有将近一半存活超过100天(图19C)。

在接种B16黑素瘤细胞后3或4天后注射MSC-IFNα细胞时，肿瘤生长也得到有效地抑制(图19D和19E)。为了比较带有重组IFNα的MSC-IFNα的抗肿瘤能力，在接种B16细胞后3天，使用5μg重组IFNα(50,000U)或 1×10⁶MSC-IFNα处理小鼠。根据我们的体外分析，我们粗略估计1x10⁶注射 MSC-IFNα细胞每天仅生成约19ng的IFNα。这远低于所注射的5μg重组IFNα。这个观测结果是重要的，因为发明人观测到即使使用少量生成的IFNα(低于所注射的重组IFNα的量250倍)，MSC-IFNα也具有比重组IFNα强效得多的抗肿瘤作用(图19F)。重复施用IFNα进一步施加了强效的体内抗肿瘤作用 (补充的图18)。这些数据清楚地证明了分泌IFNα的MSC具有高效的体内抗肿瘤活性。

MSC存在于(persist)肿瘤中，降低肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。

为了进一步研究MSC-IFNα的强效的抗肿瘤作用的机制，追踪了体内施用MSC-IFNα的去向(fate)。因此，使用荧光素酶标记了MSC-IFNα，使用现场成像技术sing BerthodNC100成像系统监测了荧光素酶的体内活性。

当与B16细胞共注射时，MSC-IFNα仅存在于肿瘤中超过两周并逐渐下降(图20A和20B)。考虑到MSC-IFNα的强效抗肿瘤作用(在MSC-IFNα： B16＝1：100的比例仍然有效)，相信SC-IFNα停留在肿瘤内部并且在肿瘤局部持续分泌低但有效的浓度的IFNα至少两周。

本领域技术人员能够认识到这种作用优于需要体内施用半衰期短且剂量高的INFα的优越性。当采用组织学方式检测肿瘤时，发现在B16加上 MSC-IFNα组中有大量的淋巴细胞浸润。

MSC-IFNα抑制了肿瘤细胞增殖，如由Ki-67阳性细胞的下降比例和增加的肿瘤细胞凋亡所显示的，如通过TUNEL分析所示(图20C)。

MSC-IFNα的抗肿瘤活性具有极大的免疫依赖性。

研究了重组INFα对肿瘤生长的直接作用。发现重组IFNα即使在高浓度 (高达100ng/ml，相比于MSC-IFNα生成的19ng/ml)也只是少量地抑制B16 黑素瘤细胞。因此，考虑到体内观测到的由MSC-IFNα引起的完全肿瘤生长抑制，发明人推测除了肿瘤生长的直接抑制之外，应当还涉及其他的机制。

为了检验免疫系统是否在MSC-IFNα的抗肿瘤作用中发挥任何作用，单独地或者和MSC-GFP或MSC-IFNα一起地将B16黑素瘤细胞平行接种到野生型和免疫缺陷型NOD-SCID小鼠中，并比较这些小鼠中的肿瘤生长。在野生型小鼠，MSC-IFNα完全抑制了肿瘤生长(图21B)，但是在免疫缺陷型小鼠中，MSC-IFNα的肿瘤抑制作用被极大地消除(图21C)。为了更加清楚地分析免疫系统在MSC-IFNα的抗肿瘤作用中的作用，我们注射较少的 MSC-IFNα(和B16肿瘤细胞一起)以使直接肿瘤抑制的贡献最小化。当使用少量的MSC-IFNα(1/100的肿瘤细胞)时，在野生型小鼠中的肿瘤生长仍然得到有效地抑制(图21D)；然而，在免疫缺陷型小鼠中，这种作用完全消失 (图21E)。

然后本发明人通过利用带有抗缺乏唾液酸基GM1抗体的耗竭NK细胞来检验NK细胞是否参与MSC-IFNα的抗肿瘤作用。令人惊异的是，在对照小鼠中，肿瘤生长受到有效抑制；然而，在使用NK细胞耗竭抗体处理的小鼠中，这种抑制得到很大逆转(图21F)。CD8+T细胞也有助于MSC-IFNα的抗肿瘤作用，如CD8+T细胞缺陷型小鼠(β2m敲除小鼠)中MSC-IFNα减少肿瘤生长抑制所示(图21G)。这些数据清楚表明除了其对肿瘤细胞的直接影响之外，免疫系统在MSC-IFNα的抗肿瘤作用中也是关键的。

在该研究中，IFNα借助于MSC输送到正常小鼠的肿瘤中。发现在这些具有免疫能力的小鼠中，IFNα通过促进抗肿瘤免疫力来施加其作用。即使少量的分泌IFNα的MSC在正常小鼠中也具有抑制超过100倍的肿瘤细胞生长的能力，但是在免疫缺陷型小鼠中没有如此。而且，NK细胞和CD8+T细胞均显示出在分泌IFNα的MSC的体内抗肿瘤作用中发挥重要作用。

IFNα能够克服MSC的免疫抑制。因此，考虑了IFNα有效地逆转由IFNγ和TNFα诱导的MSC的免疫抑制性能。MSC-IFNα在肿瘤中的长期存在避免了如IFNα所见到的那样的频繁注射。MSC-IFNα释放的低且有效水平的IFNα不太可能导致任何的副作用。本领域技术人员能够认识到经过改造以表达免疫刺激因子的MSC对未来的肿瘤治疗大有希望。

尽管已经参照具体的实施方式描述了本发明，但是本发明的改动和变化应该被解释为没有偏离由所附权利要求书所限定的本发明的范围。

序列表

<110> 罗格斯新泽西州立大学（RUTGERS, THE STATE UNIVERSITY OF NEW JERSEY）

<120> 调节干细胞的免疫调节作用的方法

<130> PP150419US-CN/LGS/WB 分案

<140> PCT/US2013/075208

<141> 2013-12-14

<150> US61/737,616

<151> 2012-12-14

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 合成引物

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cattggaagt gaagcgtttc g 21

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<223> 合成的β-肌动蛋白引物

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Claims

1.一种组合物，所述组合物包含：

(a)分离的间充质干细胞群，所述分离的间充质干细胞群通过包括如下步骤的方法生成：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能细胞培养在培养基中以生成扩繁间充质干细胞亚群和分化细胞亚群；

(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；

(iv)使用干扰素γ(IFNγ)和至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞足够的一段时间，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-17A、肿瘤坏死因子α(TNFα)、I型干扰素(IFN-I)、TGFβ和FGF。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物进一步包含药学可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种另外的细胞因子，所述至少一种另外的细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-17A、IFN-Iα、IFN-Iβ、TNFα、TGFβ和FGF。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述分离的间充质干细胞包含经培养的间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物抑制免疫T细胞群。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物诱导免疫反应。

7.一种用于增强需要的患者中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如下物质：

(a)分离的驯化间充质干细胞群；

(b)分离的IFNγ；和

(c)选自由如下细胞因子组成的组的至少一种细胞因子：IL-1α、IL-1β、IL-17A和TNFα。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述间充质干细胞群、所述分离的IFNγ和所述细胞因子单独施用。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述间充质干细胞群、所述分离的IFNγ和所述细胞因子以混合物的形式施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述需要的患者患有选自由如下病症组成的组的任意一种病症：自体免疫性疾病、过敏症、脓毒症、硬化症、癌症、病毒性感染和器官移植。

11.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括诱导NO合成酶(iNOS)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)在至少一个亚组的所述间充质干细胞中的表达。

12.一种用于诱导需要的患者中的免疫反应的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如下物质：

(a)分离的驯化间充质干细胞群；

(b)分离的IFNγ；和

(c)选自由如下细胞因子组成的组的至少一种细胞因子：IL-1α、IL-1β、IFN-Iα、IFN-Iβ、TNFα、TGFβ和FGF。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述间充质干细胞群、所述分离的IFNγ和所述细胞因子单独施用。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述间充质干细胞群、所述分离的IFNγ和所述细胞因子以混合物的形式施用。

15.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者施用有效量的NOS抑制剂或IDO抑制剂。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述驯化间充质干细胞和NOS或IDO的抑制剂单独施用或者作为混合物的形式施用。

17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述驯化间充质干细胞为疫苗形式。

18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述患者正在患有癌症或病毒性感染。

19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述患者随后接受免疫治疗方案。

20.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括向治疗部位局部施用所述有效量。

21.一种用于诱导或抑制免疫反应的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的分离的驯化间充质干细胞群，所述分离的驯化间充质干细胞群通过包括如下步骤的方法制备：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能干细胞培养在培养基中；

(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；

(iv)通过将至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞暴露于分离的IFNγ和至少一种细胞因子足够的一段时间来激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-17A、IFN-Iα、IFN-Iβ、TNFα、TGFβ和FGF。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述一种细胞因子选自由IL-1α、IL-1β、IL-17A和TNFα组成的组。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述一种细胞因子选自由IL-1α、IL-1β、IFN-Iα、IFN-Iβ、TNFα、TGFβ和FGF组成的组。

24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述方法抑制所述受试者的免疫反应。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述方法诱导所述受试者的免疫反应。

26.一种培养经激活的间充质干细胞群的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能细胞培养在培养基中；

(iii)将所述培养基中的无性系间充质干细胞与分化细胞分开；

(iv)使用IFNγ和至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、IFN-Iα、IFN-Iβ、TNFα、TGFβ和FGF以及它们的任意组合。

27.一种用于诱导或者抑制需要的患者中的免疫反应的方法，所述方法包括向所述患者施用包含有效量的分离的驯化间充质干细胞群的组合物，所述分离的驯化间充质干细胞群通过暴露于IFNγ和至少一种细胞因子足够的时间量来激活，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、TNFα、IFN-Iα、IFN-Iβ、TGFβ和FGF。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述组合物为疫苗形式。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述组合物基本不含任何残留的细胞因子。

30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述组合物主要由至少两个亚组的驯化间充质干细胞组成。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，至少一个所述亚组的驯化间充质干细胞主要由克隆的间充质干细胞组成。

32.一种通过包括如下步骤的方法获得的干细胞：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能细胞培养在培养基中；

(iv)使用IFNγ和至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-17A、TNFα、IFN-Iα、IFN-Iβ、TGFβ和FGF以及它们的任意组合。

33.一种组合物，所述组合物包含：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能细胞培养在培养基中；

(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；

(iv)使用IFNγ和至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、TNFα、IFN-Iα、IFN-Iβ、TGFβ和FGF以及它们的任意组合；和

(v)提取任何残留的细胞因子；和

(b)药学可接受的载体。

34.一种用于改变需要的受试者中的免疫反应的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)选自由生理盐水、5％水性右旋葡萄糖以及它们的混合物组成的组的药学可接受的载体；

(b)间充质干细胞群；

(c)分离的干扰素γ；

(d)选自由IL-1α、IL-1β、IL-17A和TNFα组成的组的至少一种细胞因子。

35.根据权利要求34所述的试剂盒，通过所述试剂盒将(a)、(b)、(c)和(d)的组合施用于需要的受试者来实现免疫抑制。

36.根据权利要求34所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于使用所述试剂盒引起免疫抑制的说明书。

37.一种用于刺激需要的患者中的免疫反应的方法，所述方法包括：

(a)向所述患者施用有效量的组合物，所述组合物包含可诱导性一氧化氮合成酶抑制剂、吲哚胺2,3-加双氧酶抑制剂、可诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)-缺陷型间充质干细胞群、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)-缺陷型间充质干细胞群或它们的任意组合；

(b)抑制一氧化氮(NO)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)或前列腺素E2(PGE2)中的一种或者多种的生成。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，单独施用或者作为混合物施用所述iNOS或IDO的抑制剂。

39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述混合物是疫苗。

40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述患者正患有癌症或病毒性感染。

41.根据权利要求37所述的方法，其中，所述患者随后接受免疫治疗方案。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述免疫治疗包括施用干扰素。

43.根据权利要求37所述的方法，所述方法进一步包括施用驯化干细胞群，所述驯化干细胞群通过包括如下步骤的方法获得：

(i)获得多能祖细胞；

(ii)将所述多能细胞培养在培养基中；

(iii)将所述培养基中的间充质干细胞与分化细胞分开；

(iv)使用IFNγ和至少一种细胞因子激活至少一个亚组的所述经分开的间充质干细胞足够量的时间，所述至少一种细胞因子选自由如下细胞因子组成的组：IL-1α、IL-1β、TNFα、IFN-Iα、IFN-Iβ、TGFβ、FGF以及它们的任意组合。