KR20220162394A - 기능강화 줄기세포 및 조절 t 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용투여 조성물 - Google Patents
기능강화 줄기세포 및 조절 t 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용투여 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프라이밍된 기능강화 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 키트 및 이를 이용한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리된 기능강화 줄기세포를 조절 T 세포와 병용하여 처리하면, 아토피 피부염 환자의 Th1/Th2 세포의 불균형을 개선할 수 있고, 아토피 피부염 환자의 상태를 Th1으로 쉬프팅할 수 있으므로, 다양한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 프라이밍된 기능강화 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 키트 및 이를 이용한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 미분화 세포로서, 자기 재생을 통해 오랫동안 분열할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 성체줄기세포(Adult stem cell)로 나눌 수 있는데, 배아줄기세포를 이용한 치료 실험이 윤리적인 면과 종양형성 가능성으로 어려운 점이 있는 반면, 성체줄기세포는 다양한 조직에서 손쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있어 다양한 질환치료에 적용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 많은 화합물 면역억제제 또는 항염증제가 개발되어 있고, 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린 (cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드)이 있다. 상기 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포 분열, T세포와 B세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역 억제를 야기한다. 이러한 약물들은 대부분 항종양 활성을 동시에 가지고 있는데, 그 이유는 DNA 장애, DNA 합성 저지 등을 매개로 하여 세포 분열을 저지하기 때문이다. 그러나 이에 따른 대표적인 부작용으로 고혈압과 신독성 (콩팥기능이 저하됨)이 있으며 이 부작용의 발생률이 높기 때문에 사용할 때 충분히 경과를 관찰해야 하는 등의 문제점이 있다. 그 외 부작용으로 드물게 떨림, 발작, 간염, 담액 저류, 혈중 뇨산증가, 근육기력 저하, 조모증 (hypertrichosis), 치은 비대 (gingival hypertrophy)등이 있다. 흔히 쓰이는 억제제 중 아자치오프린은 백혈구수치의 감소, 빈혈, 혈소판 감소 등 골수 기능을 억제하기도 하며 췌장염, 간염, 담즙저류와 함께 드물게 탈모, 발열 등을 보이는 합병증이 있을 수 있다. 스테로이드 제제의 하나인 프레드니솔론은 면역 억제제 중 가장 먼저 사용되기 시작하였으나, 동맥 경화증을 촉진시킬 뿐 아니라 고혈압, 위궤양, 당뇨, 성장 저해, 골다공증, 백내장, 녹내장 등을 일으키므로 주의해야 할 약물이다. 따라서 안전한 면역억제제 또는 항염증제의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근 줄기세포를 이용한 치료법들이 염증 및 면역 질환 치료를 위해 시도되고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 염증을 억제시키거나 조절 T 세포 (regulatory T cells, Tregs)의 생성을 유도하거나 또는 세포사멸에 관여하는 면역세포들의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있어 이를 이용한 다양한 치료제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
그러나, 줄기세포를 이용한 다양한 임상 시험에서 효과의 지속성이나, 장기 추적결과 생체 내 생존 비율이 극히 낮다는 문제점이 보고되고 있어, 줄기세포 치료제를 개선하기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있다. 예컨대 치료 효과를 높이기 위하여 줄기세포에 특정 유전자를 삽입하거나, 줄기세포 기능을 부스팅할 수 있는 다양한 화학물, 펩타이드 등을 전처리하는 방법, 배양 시 저산소, 온도, 빛과 같은 자극 조건을 추가하는 방법들이 시도되거나, 줄기세포의 생존률을 높이기 위해 지지체와 함께 투여하는 방법들이 연구되고 있다. 줄기세포 기능 강화를 위한 다양한 연구들 중 유전자 조작을 이용한 기능 개선 방법은 효과적일 수 있으나, 도입되는 유전자의 안전성 등의 문제점이 지적된다.
따라서 줄기세포 자체에 유전자를 도입하여 기능을 강화하기 보다는 배양 중 다양한 프라이밍 요소 처리를 통해 줄기세포의 내재적 기능을 강화하기 위한 다양한 연구들이 시도되고 있다.
한편 우리 몸의 T세포 중 하나인 조절 T 세포 (regulatory T cells, Tregs)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증성질환이 생기면 오히려 조절 T세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염의 발생 기전에 대해서는 명확히 규명되지 않고 있으나, 개인의 유전적 요인에 따라 환경의 알레르기 항원에 대한 부적절한 Th2 시작 반응이 원인이 되는 것으로 알려져 있다. Th2 타입 세포들은 혈청 내 면역글로불린E(IgE)의 농도를 증가시키고 증가된 IgE에 의해 비만세포가 활성화됨으로써 아토피 피부염을 발생시킨다. 또한 Th1 타입 세포들의 반응 결함 역시 아토피 피부염 악화와 관련되어 있을 것으로 생각된다. 따라서 아토피 피부염 치료를 위한 전략으로 Th1과 Th2 세포 간의 기능적 길항작용을 통하여 Th1/Th2 세포의 불균형을 조절함으로써, 아토피 피부염을 치료하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 최근에는 박테리아 CpG 모티프(motif) 또는 톨 유사 수용체 9 리간드와 같은 병원체 관련 분자를 이용한 T 보조 세포(T helper cell) 분화 조절을 통하여, Th1의 반응을 촉진시키고 Th2 반응을 억제하여 Th1/Th2 세포의 불균형을 조절하는 연구를 통해 아토피 피부염을 치료하고자 하는 시도가 있다.
그러나 아직까지 이러한 불균형을 조절하여 아토피 피부염을 치료하는 방법에 대해서는 많은 연구가 이루어지지 않았으며, 특히, 줄기세포를 이용한 아토피 피부염 치료에 있어서, Th2 질환인 아토피 피부염 환자의 상태를 Th1으로 쉬프팅할 수 있는 치료법에 대해서는 많이 보고되지 않았다.
본 발명자는 줄기세포 기능을 보다 강화하기 위하여 연구하던 중, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;을 처리하면 줄기세포의 아토피 피부염 예방 또는 치료 효과가 현저하게 증진될 수 있음을 확인하였고, 조절 T 세포를 병용하여 처리하는 경우, 더욱 우수한 아토피 피부염 치료 효과가 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으로 프라이밍된 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 키트 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 줄기세포 프라이밍용 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 를 포함하는 1구획; 줄기세포를 포함하는 2 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 3구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 포함하는 1구획; 줄기세포를 포함하는 2 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 3구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는 1 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 2구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포를 포함하는 1 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 2구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 조절 T 세포를 상기 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 조절 T 세포를 상기 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포; 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포; 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리된 기능강화 줄기세포를 조절 T 세포와 병용하여 처리하면, 아토피 피부염 환자의 Th1/Th2 세포의 불균형을 개선할 수 있고, 아토피 피부염 환자의 상태를 Th1으로 쉬프팅할 수 있으므로, 다양한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 TNF-α 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P<0.001, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 2는 IFN-γ 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 3는 IFN-α 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 4는 표 1에 나타낸 조성물에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (****P<0.0001) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α (10ng/ml); 2: IFN-γ (10ng/ml); 3: IFN-α (20ng/ml); 4: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml); 5: TNF-α (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 6: IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 7: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)).
도 5는 표 2에 나타낸 비타민 단독 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (0: 무처리 대조군; 1: 비타민 A(10㎍/ml); 2: 비타민 B1(50㎍/ml); 3: 비타민 B2(5㎍/ml); 4: 비타민 B3(50㎍/ml); 5: 비타민 B5(50㎍/ml); 6: 비타민 B6(50㎍/ml); 7: 비타민 B12(50㎍/ml); 8: 비타민 D2(10㎍/ml); 9: 비타민 D3(10㎍/ml)).
도 6은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 7은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 ICAM1과 VCAM의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 8은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B6 처리된 줄기세포(pcMSC2) 의 면역조절능력을 확인하기 위하여, PHA 자극 PBMC와 pcMSC2 또는 미처리 cMSC를 공배양하고, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 항염증성 사이토카인 IL-10 를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P<0.001, ****P<0.0001, compared to cMSC, P1: PHA로 자극하지 않은, 음성대조군).
도 9는 유세포 분류기를 이용한 조절 T세포(Tregs) 와 비-조절 T세포 분류 전략 및 분류 순도(Purity)를 나타낸 도이다.
도 10은 배양 12일차 조절 T세포(Tregs) 에서 조절 T세포의 특성을 보여주는 전사인자 Foxp3 및 Helios의 발현을 나타낸 도이다.
도 11은 배양 12일차 조절 T세포(Tregs) 로부터 분비되는 IL-2, IL-4, IFN- γ및 IL-17A를 나타낸 도이다.
도 12는 아토피 피부염 동물 모델에서 pcMSC2와 조절 T세포(Tregs) 의 투여 주기 및 시점에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 13은 G1: Naive, G2: Veh.(for pcMSC2), G3: Veh. (for Tregs), G4: pcMSC2, G5: Tregs, G6: pcMSC2+Tregs (D44) 의 각 군에 해당하는 실험물질 투여 후, 피부 병변의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG1 생산량 변화를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. (***P<0.001, ****P<0.0001 compared to Veh.)
도 15는 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 총 IgG1 생산량 변화를 통계분석(T-test)한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG2a 생산량 변화를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. (*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001 compared to Veh.)
도 17은 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG2a 생산량 변화를 통계분석(T-test)한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 IFN-γ 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 3는 IFN-α 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 4는 표 1에 나타낸 조성물에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (****P<0.0001) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α (10ng/ml); 2: IFN-γ (10ng/ml); 3: IFN-α (20ng/ml); 4: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml); 5: TNF-α (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 6: IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 7: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)).
도 5는 표 2에 나타낸 비타민 단독 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (0: 무처리 대조군; 1: 비타민 A(10㎍/ml); 2: 비타민 B1(50㎍/ml); 3: 비타민 B2(5㎍/ml); 4: 비타민 B3(50㎍/ml); 5: 비타민 B5(50㎍/ml); 6: 비타민 B6(50㎍/ml); 7: 비타민 B12(50㎍/ml); 8: 비타민 D2(10㎍/ml); 9: 비타민 D3(10㎍/ml)).
도 6은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 7은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 ICAM1과 VCAM의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 8은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B6 처리된 줄기세포(pcMSC2) 의 면역조절능력을 확인하기 위하여, PHA 자극 PBMC와 pcMSC2 또는 미처리 cMSC를 공배양하고, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 항염증성 사이토카인 IL-10 를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P<0.001, ****P<0.0001, compared to cMSC, P1: PHA로 자극하지 않은, 음성대조군).
도 9는 유세포 분류기를 이용한 조절 T세포(Tregs) 와 비-조절 T세포 분류 전략 및 분류 순도(Purity)를 나타낸 도이다.
도 10은 배양 12일차 조절 T세포(Tregs) 에서 조절 T세포의 특성을 보여주는 전사인자 Foxp3 및 Helios의 발현을 나타낸 도이다.
도 11은 배양 12일차 조절 T세포(Tregs) 로부터 분비되는 IL-2, IL-4, IFN- γ및 IL-17A를 나타낸 도이다.
도 12는 아토피 피부염 동물 모델에서 pcMSC2와 조절 T세포(Tregs) 의 투여 주기 및 시점에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 13은 G1: Naive, G2: Veh.(for pcMSC2), G3: Veh. (for Tregs), G4: pcMSC2, G5: Tregs, G6: pcMSC2+Tregs (D44) 의 각 군에 해당하는 실험물질 투여 후, 피부 병변의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG1 생산량 변화를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. (***P<0.001, ****P<0.0001 compared to Veh.)
도 15는 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 총 IgG1 생산량 변화를 통계분석(T-test)한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG2a 생산량 변화를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. (*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001 compared to Veh.)
도 17은 아토피 피부염 동물 모델에서 PBS(control for pcMSC2), 세포안정화제(control for Tregs), pcMSC2, Tregs, pcMSC2+Tregs (D44) 투여에 따른 혈청 내 총 IgG2a 생산량 변화를 통계분석(T-test)한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;으로 처리된 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;으로 처리되지 않은 줄기세포와 비교하여, 항염증 작용 및 면역조절능이 우수하므로, 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있으며, 특히, 이를 조절 T 세포와 병용하여 처리하면 아토피 피부염 치료 효과가 더욱 현저하게 개선될 수 있다.
본 발명에 있어, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;으로 처리된 줄기세포는 "프라이밍된 줄기세포" 또는 "기능강화된 줄기세포”로 표시할 수 있으며, '프라이밍된 줄기세포'와 '기능강화된 줄기세포'는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 프라이밍된 줄기세포는 본 발명의 프라이밍 인자 처리에 의하여 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능이 현저히 증가되어 우수한 아토피 피부염 치료 효과를 나타내는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어, “프라이밍 인자” 는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합 또는 상기 조합에 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 조합을 의미할 수 있다.
상기 프라이밍 인자의 조합은 이들의 단일 성분을 줄기세포에 처리하는 것과 비교하여 시너지 효과를 나타낼 수 있으며, 낮은 처리 농도로도 목적하는 줄기세포의 기능 강화를 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 있어 “기능 강화” 는 프라이밍 인자 처리에 의하여 줄기세포가 가지고 있는 고유의 성질 및 효과가 증진된 것을 의미하고, 특히, 바람직하게는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 효과가 개선된 것을 의미할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 프라이밍된 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α로 처리된 줄기세포일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α 은 0.1-3: 0.1-3: 0.1-3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 3 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 2.5 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α를 10ng/ml, 10ng/ml 및 20ng/ml 의 농도 조합으로 줄기세포에 처리하고 배양하여 줄기세포의 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다.
또한 본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합에 더하여 비타민으로 더 처리된 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 더 처리된 줄기세포일 수 있다. 비타민을 더 포함하는 프라이밍 인자 조합을 줄기세포에 처리하여 프라이밍하면, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리를 통해 유도되는 줄기세포 기능 강화가 더욱 현저하게 증진될 수 있으며, 아토피 피부염 예방 또는 치료 효과도 현저하게 증진될 수 있다. 상기 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v), 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 줄기세포에 처리될 수 있다. 보다 구체적으로 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B2가 추가되는 경우 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 300 내지 1,000 (w/v), 더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 600 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 400 내지 550 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 2: 500 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있으며, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 가 추가되는 경우, 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 10,000(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 6,000(w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 6,000 (w/v), 더욱 구체적인 예로 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 5,500 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1:1: 2: 5,000 (w/v)의 비율로 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 복합 처리를 위한 농도로 TNF-α 10ng/ml, IFN-γ 10ng/ml, IFN-α 20ng/ml를 선정하고, 비타민 B2 5㎍/ml, 비타민 B3 50㎍/ml, 비타민 B5 50㎍/ml 및 비타민 B6 50㎍/ml 를 선정하여 줄기세포에 처리하고 면역 조절 및 염증 조절 기능의 강화를 확인하였다. 그 결과, 비타민을 첨가한 실험군에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리와 비교하여 IDO 및 TSG6의 발현 증가뿐만 아니라 줄기세포 표면에 발현하는 부착인자인 ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 과 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
특히, 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B6 조합의 프라이밍 인자 처리에 의하여 아토피 피부염 치료 효과가 증대된 줄기세포가 제조될 수 있음을 확인하고, 이를 "pcMSC2 (Primed clonal Mesenchymal Stem Cell 2)"라고 명명하였다.
본 발명에 있어, '프라이밍 처리' 또는 '프라이밍 인자 처리' 는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합 또는 상기 조합에 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 조합을 줄기세포에 12시간 내지 36시간, 바람직하게는 20시간 내지 25시간 동안 처리하고, 줄기세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 상기 배양은 당 분야에 널리 알려진 줄기세포 배양 배지를 제한없이 이용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 처리에 의하여 기능이 강화되는 프라이밍된 줄기세포 및 조절 T 세포는 각각 순차적으로 또는 동시에 병용 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 처리에 의하여 기능이 강화되는 프라이밍된 줄기세포는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 지방, 골수, 태반(또는 태반 조직세포), 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 또한 상기 줄기세포는 클로날 줄기세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 프라이밍된 줄기세포는 상기 프라이밍 인자 조합이 처리되지 않은 줄기세포와 비교하여 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6) 발현, IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현, ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 발현 및 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 발현으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 증진된 줄기세포일 수 있으며, 비만 세포 감소, 총 IgE 감소, IgG2a 의 생산 증가 및 히스타민 감소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아토피 피부염 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어, 조절 T 세포는 혈액, 지방, 골수, 태반 또는 제대혈 유래 조절 T 세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 일 수 있고, 제대혈 단핵세포로부터 CD4+ 세포만을 선별 분리한 후, CD4+ 세포에서 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 조절 T 세포는 CD4+CD25+/ highCD127low 세포일 수 있다. 본 발명의 조절 T 세포는 분리 후 CD3 및 CD28을 통해 활성화될 수 있으며, 배양 5 내지 10일 째에 미토마이신 C (mitomycin C) 가 처리된 동일한 공여자 유래의 CD4- 세포로 자극된 조절 T 세포일 수 있다. 본 발명의 조절 T 세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 분리 후 5 내지 25일, 10 내지 20일 배양된 세포일 수 있다. 이와 같이 배양된 조절 T 세포는 체외배양에서 발생할 수 있는 면역기능 저하없이 조절 T 세포의 특성을 유지할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin)등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA]), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science] 에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 유효량은 환자의 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량을 환자에 적용시 0.00001 내지 10000 μg일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다. 본 발명의 줄기세포 치료제의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 102~1 x 1012세포/kg 일 수 있다.
그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 (a) TNF-α, IFN-γ및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물; 을 포함하며, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장된 형태인 것이고, 상기 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 줄기세포 프라이밍용 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;을 포함하는 1구획; 줄기세포를 포함하는 2 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 3구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트에 관한 것이다.
아토피 피부염 치료를 위하여, 먼저 1구획의 줄기세포 프라이밍용 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;을 2구획의 줄기세포에 처리하여 기능강화된 줄기세포를 제조할 수 있으며, 이를 다시 3구획의 조절 T 세포와 함께 동시에 또는 순차적으로 병용 투여하여 아토피 피부염을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으 로 처리된 줄기세포를 포함하는 1 구획; 및 조절 T 세포를 포함하는 2구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트에 관한 것이다.
상기 제1구획에 포함되어 있는 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;과 같은 본 발명의 프라이밍 인자 처리에 의하여 기능이 강화된 상태의 줄기세포일 수 있다. 아토피 피부염 치료를 위하여 1구획 또는 2구획의 성분을 아토피 피부염 치료가 필요한 개체에 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
상기 키트에 있어서 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민일 수 있다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으 로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 치료제는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있으며, 정맥내 주입, 피하 주입, 피내 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
상기 제1조성물은 바람직하게는 정맥 투여용일 수 있고, 제2조성물은 피내 투여용일 수 있다. 정맥 투여용 조성물이란 액상의 약물이 정맥에 직접 주입되어 작용하도록 하는 무균 조성물을 의미한다. 정맥 투여용 조성물은 통상적인 주사제 제조에 사용될 수 있는 모든 조성물을 포함하며, 조제법에 따라 수성 주사제, 비수성 주사제, 현탁 주사제, 동결 건조 주사제 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제2조성물은 피내 투여용일 수 있고, 피내 투여용 조성물은 액상의 약물을 주사액 형태로 표피 바로 아래 층인 진피에 주사하는 용도의 조성물을 의미한다.
제1 조성물과 제2 조성물의 주사 순서는 이에 제한되는 것은 아니나, 제1 조성물을 주사하고 제2 조성물을 주사할 수도 있고, 제2 조성물을 주사하고 제1 조성물을 주사하거나 동시에 주사할 수 있다. 제1조성물 및 제2 조성물은 개체에 필요한 만큼 반복 투여될 수 있으며, 환자의 상태나 치료 여건 등에 따라 반복 투여 간격을 조절할 수 있다.
본 발명의 키트는 각각의 성분을 포함한 개별 용기를 포함하는 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 용기의 구획 내에 각각의 성분을 포함한 형태로 포장된 형태일 수 있다. 이들 개별 용기 또는 구획 내에 포함되어 있는 성분들은 이를 필요로 하는 환자에게 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으로 처리된 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및 2) 조절 T 세포를 상기 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법.를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 치료 방법의 순서는 1) 단계 이후 2) 단계를 수행할 수 있으나, 2) 단계 이후 1) 단계 또는 1) 및 2) 단계를 동시에 수행할 수도 있다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 아토피 피부염 치료를 필요로 하는 환자로 아토피 피부염 치료 중인 환자, 치료를 받은 적이 있는 환자, 아토피 피부염 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리된 줄기세포는 기존의 아토피 피부염 치료를 위한 약물 또는 치료방법과 병용하여 처리될 수 있으며, 특히, 본 발명과 같이 조절 T 세포와 함께 병용하여 처리되는 경우 더욱 현저한 아토피 피부염 치료 효과를 달성할 수 있다.
상기 치료방법에 있어, 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 함께 처리된 것일 수 있고, 상기 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α 은 0.1-3: 0.1-3: 0.1-3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 3 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 2.5 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있다.
또한 상기 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v), 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 줄기세포에 처리될 수 있다. 보다 구체적으로 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B2가 추가되는 경우 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 300 내지 1,000 (w/v), 더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 600 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 400 내지 550 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 2: 500 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있으며, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 가 추가되는 경우, 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 10,000(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 6,000(w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 6,000 (w/v), 더욱 구체적인 예로 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 5,500 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1:1: 2: 5,000 (w/v)의 비율로 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α로 처리된 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로 상기 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 은 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α 은 0.1-3: 0.1-3: 0.1-3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 3 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 2.5 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α를 10ng/ml, 10ng/ml 및 20ng/ml 의 농도 조합으로 줄기세포에 처리하고 배양하여 줄기세포를 수득하여 이의 아토피 피부염 예방 또는 개선 효과를 확인하였다.
또한 본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합에 더하여 비타민으로 더 처리된 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 더 처리된 줄기세포일 수 있다.
비타민을 더 포함하는 프라이밍 인자 조합을 줄기세포에 처리하여 프라이밍하면, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리를 통해 유도되는 줄기세포 기능 강화가 더욱 현저하게 증진될 수 있으며, 아토피 피부염 예방 또는 개선 효과도 현저하게 증진될 수 있다. 상기 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v), 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 줄기세포에 처리될 수 있다. 보다 구체적으로 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B2가 추가되는 경우 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 300 내지 1,000 (w/v), 더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 600 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 400 내지 550 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 2: 500 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있으며, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 가 추가되는 경우, 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 10,000(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 6,000(w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 6,000 (w/v), 더욱 구체적인 예로 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 5,500 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1:1: 2: 5,000 (w/v)의 비율로 처리될 수 있다.
본 발명의 프라이밍된 줄기세포는 비만 세포 감소, 총 IgE 감소, IgG2a 의 생산 증가 및 히스타민 감소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아토피 피부염 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이밍된 줄기세포 및 조절 T 세포를 병용하여 처리하면, 총 IgG1 감소 효과 및 IgG2a 증가 효과를 달성할 수 있으며, 이를 통해 Th1 으로 시프팅이 이루어지고, 면역 불균형을 해소하여 아토피 피부염 치료 효과를 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 줄기세포 배양 및 후보물질 선정
37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서, 저장상태 (LN2 tank 보관)의 중간엽 줄기세포를 해동하여 배양하고, 이 때 10% FBS 또는 4% hPL을 함유하는 배지 (DMEM, alpha-MEM)에서 세포 컨플루언스가 80%정도로 증식될 때까지 배양하였다. 배양한 중간엽 줄기세포를 100mm dish에 seeding한 후, 중간엽 줄기세포 기능 강화를 위한 후보 물질을 24시간 동안 처리한 후, 기능 강화를 위한 1차 후보 물질의 농도를 설정하였다.
1차 후보물질로는 TNF-α, IFN-γIFN-α를 선정하고, 기능 강화를 확인하기 위해 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6)와 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현을 증가시킬 수 있는 최저 유효 농도를 확인하기 위하여, TNF-α 5, 10, 20ng/ml, IFN-γ 5, 10, 20 ng/ml, IFN-α 10, 20, 40 ng/ml를 각각 줄기세포에 처리하고, TSG6 및 IDO의 발현 변화를 확인하였다.
IDO는 T 세포 증식에 필수적인 트립토판을 카이누렌산(kynurenine)으로 바꿈으로써, T 세포와 같은 면역 세포의 증식을 억제하는 면역조절인자로 알려져 있으며, TSG6는 중간엽 줄기세포가 분비하는 항염증 조절 인자로 알려져 있다. 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다. 각 후보물질의 농도별 처리에 따른 TSG6 및 IDO 결과를 도 1, 도2 및 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, TSG6 및 IDO의 발현을 모두 현저하게 증가 유도할 수 있는 최저 유효농도로 TNF-α 10ng/ml, IFN-γ 10ng/ml 및 IFN-α 20ng/ml를 확인하고, 이후 실험해서 해당 농도를 기준으로 처리하였다.
실시예
2. 줄기세포 기능 강화를 위한 조합 선정
상기 실시예 1을 통해, 줄기세포의 기능강화를 유도하는 것으로 확인된 후보 물질 및 최저 유효농도를 기초로 더욱 강화된 기능강화 조성물을 탐색하기 위해 선정된 후보물질 및 이들의 농도 조합을 표 1 과 같이 설정하였다. 하기 표 1에 기재된 후보 조합을 24시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리하고 실시예 1과 같이 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다.
| 실험군 | |
| 0 | 대조군 (무처리군) |
| 1 | TNF-α (10ng/ml) |
| 2 | IFN-γ (10ng/ml) |
| 3 | IFN-α (20ng/ml) |
| 4 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) |
| 5 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) |
| 6 | IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) |
| 7 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) |
이를 통해 면역 및 항염증 조절의 대표적 인자인 IDO, TSG6의 발현 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군 그룹 0 과 비교하여, 모든 단일 후보물질 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리군 (실험군 1 내지 3)에서 IDO, TSG6의 발현 증가가 확인되었으나, 이들을 각각 조합한 실험군 4 내지 6에서 단일 후보물질 처리군 대비 더욱 현저한 발현 증가가 확인되었다. 특히, TNF-α에 IFN-γ 또는 IFN-α를 처리한 실험군 4, 5는 IFN-γ 및 IFN-α 만을 조합한 실험군 6 과 비교하여 우수한 효과를 나타내었고, 3가지 후보물질을 모두 조합한 처리군에서는 놀랍게도 2개 조합 대비 2배 이상 증가된 기능 강화 효과가 확인되었다.
따라서, 상기 결과를 통해 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) 조합을 줄기세포에 처리하면, 매우 현저한 줄기세포의 면역 및 항염증 기능 강화가 달성될 수 있음을 확인하였다.
실시예
3. 비타민 추가에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
3.1 비타민 단독 첨가에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
비타민은 줄기세포 배양과정 중에 첨가 시, 줄기세포의 증식 능력을 개선시키고, 줄기세포의 stemness를 유지시켜주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 다양한 비타민을 줄기세포 배양과정에 처리하고, 비타민이 줄기세포의 항염증 및 면역 기능 강화 효과를 달성할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로 하기 표 2에 나타낸 다양한 비타민 종류를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 줄기세포에 처리하였으며, 각 후보 물질 처리에 따른 IDO 및 TSG6 발현 변화를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 비타민 처리군은 줄기세포의 항염증 및 면역 조절 기능에 관여하는 IDO 및 TSG6의 발현 변화에는 유의한 효과를 나타내지 않았다.
3.2 비타민과
TNF
-α +
IFN
-γ +
IFN
-α 조합에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
상기와 같이 단일 물질로는 줄기세포 항염증 및 면역조절 기능 강화 효과가 나타나지 않는 비타민을 실시예 2에서 확인한 기능 강화 물질들의 조합에 첨가하는 경우 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기 표 3 과 같이 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)에 각각의 비타민을 첨가하고 각 조합 처리에 따른 IDO 및 TSG6의 발현 변화를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
| 실험군 | |
| 0 | 대조군 (무처치군) |
| 1 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) |
| 2 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin A 10ug/ml |
| 3 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B1 50ug/ml |
| 4 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B2 5ug/ml |
| 5 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B3 50ug/ml |
| 6 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B5 50ug/ml |
| 7 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B6 50ug/ml |
| 8 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B12 50ug/ml |
| 9 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin D2 10ug/ml |
| 10 | TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin D3 10ug/ml |
도 6에 나타낸 바와 같이, 비타민 미처리 실험군 1 과 비교하여 실험군 2, 3, 8, 9에서는 IDO 및 TSG6의 발현이 유의적으로 증가하지 않았고, 실험군 10은 TSG6 발현은 증가하였으나, IDO 에서는 대조군 대비 발현 증가가 확인되지 않았다. 반면 비타민 B2 (실험군 4), 비타민 B3 (실험군 5), 비타민 B5 (실험군 6), 비타민 B6 (실험군 7)의 경우에는 유의적으로 IDO와 TSG6의 발현이 모두 증가되는 것을 확인하였다. TSG6의 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α를 처리한 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5 6, 7에서 각각 49%, 30%, 35%, 45% 증가하였으며, IDO의 경우, 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 25%, 37%, 31%, 18% 증가됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과는, 비타민을 단독으로 줄기세포에 처리하는 경우 줄기세포의 항염증 및 면역조절능을 향상시키지 못하지만, TNF-α + IFN-γ + IFN-α와 비타민B2, 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6를 조합하여 처리하는 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α의 효과를 더욱 높일 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예
4.
ICAM1
및
VCAM
발현 변화 확인
ICAM1 과 VCAM 은 T세포와 결합을 통해, T세포의 증식을 억제하고 사멸을 유도함으로써 과도한 면역과 염증 반응을 감소시켜 다양한 면역 및 염증 관련 질환에 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 실시예 3의 표 3에 기재된 동일한 실험군으로 24시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리하고 실시예 1과 같이 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다.
줄기세포의 면역 질환 및 염증 질환 치료 효과 증진 여부를 확인하기 위하여, 줄기세포 표면에 발현하는 부착인자인 ICAM1((Intercellular Adhesion Molecule 1)과 VCAM(vascular cell adhension molecule)의 발현을 확인하였으며 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, ICAM1의 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α를 처리한 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 45%, 100%, 35%, 45% 증가하였으며, VACM의 경우, 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 52%, 69%, 52%, 69% 증가됨을 확인하였다.
따라서, TNF-α + IFN-γIFN-α 와 비타민B2, 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6의 조합을 줄기세포에 처리하는 경우, ICAM1 및 VCAM의 발현이 현저하게 증가하며, 이를 통해 줄기세포의 면역 조절능 및 항염증 효능이 촉진될 수 있다.
실시예
5. 염증 및 면역조절능력 확인
IDO, TSG6, ICAM-1, VCAM와 같은 면역 및 염증 조절인자를 강화시켰던 상기 실시예 4에서 확인한 프라이밍 처리 조건 조합이 실제 과도한 면역반응을 유발한 조건에서 염증 및 면역반응을 억제하며, 기능 강화되지 않은 cMSC 대비 더욱 우수한 효과를 나타내는지 확인하였다. 이하에서는 표 3 중 실험군 7인 TNF-α + IFN-γIFN-α와 비타민 B6 조합을 cMSC에 처리하였고, 상기 조합으로 프라이밍 처리된 MSC 를 'pcMSC2 (Primed clonal Mesenchymal Stem Cell 2)'로 명명하였다.
PHA (Phytochemagglutinin) 자극 림프구 배양실험은 림프구의 세포분열 촉진을 유도하는 PHA라는 시약을 이용하는 방법으로 과도한 면역활성을 유도하는 방법이다. PBMC (peripheral blood mononuclear cell, PBMC, 말초혈액세포)를 96well plate에 well당 2X105cells 분주하고, PHA 1㎍/ml로 자극하여 5X104cell의 cMSC 또는 pcMSC2와 4일간 공배양하였다. 배양이 완료된 후, 상등액을 모아 염증성 사이토카인인 IFN-gamma와 항염증성 사이토카인인 IL-10을 ELISA를 통해 확인하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 음성 대조군으로는 PHA 로 자극되지 않은 그룹을 이용하였으며, P1으로 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, IFN-gamma는 PHA로 자극한 경우 16013pg/ml 와 같이 현저하게 증가하였나 cMSC와 공배양 한 경우, 5048pg/ml 감소하였고, pcMSC2와 공배양한 경우 1700pg/ml까지 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 cMSC와 pcMSC2를 비교하였을 경우에는 기능 강화된 pcMSC2에서 cMSC보다 약 66%정도 IFN-gamma가 더 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 항염증성 사이토카인인 IL-10의 경우, cMSC와 pcMSC2 모두에서 IL-10의 증가를 확인할 수 있었으며, 특히, cMSC보다 기능강화된 pcMSC2와 공배양한 조건에서, 약 22% 많은 IL-10이 분비되는 것을 확인하였다.
실시예
6. 조절 T 세포 (
Tregs
) 분리 및 배양
StemExpress (CA, USA)로부터 구매한 제대혈 단핵세포를 해동한 후, 인간의 CD4를 인지하는 microbeads (Miltenyi)를 이용하여 CD4+ 세포만을 선별 분리하였다. CD4+ 세포 분리 과정은 제조사 프로토콜에 따라 실시하였다. 간략하게, 전체 제대혈 단핵세포를 CD4 microbead와 섞어준 뒤, 자기장컬럼을 이용하여 CD4+세포만을 순수분리하였다. 분리된 CD4+세포에서 조절 T 세포를 분류하기 위하여 anti-CD4 FITC (Tonbo), anti-CD25 BV785 (Biolegend), anti-CD127 APC (Biolegend) 항체 및 유세포 분류기(BD FACS Melody)를 이용하여 4℃에서 채광을 차단한 조건으로 20분간 염색을 수행하였다. 유세포 분석기를 이용한 조절 T 세포 (CD4+CD25+/ highCD127low, 4-6%) 분리의 분류 전략 및 분류 순도를 도 9에 나타내었다.
유세포 분류기를 통하여 얻어진 제대혈 유래 조절 T세포 (3x105)를 200 μl 배지에 부유하여 96 well flat bottom plate에서 배양을 시작하였다. 조절 T세포의 CD3 및 CD28을 통한 활성화를 위하여 GMP MACS T cell TransAct (Miltenyi)가 첨가되었으며, 배양 배지는 AIM-V media (Gibco), 5% Human Serum AB (GEMCELL), 500 units/mL penicillin (Gibco), 500 mg/mL streptomycin (Gibco), 1.46 mg/mL Glutamine (Gibco), 300 units/mL recombinant human IL-2 (R&D system), 2 μM BHKps25 (Phosphorothioate-backboned oligonucleotide, TriLink), 및 2 ng/mL human TGF-1β(Cell Genix Inc.)를 포함하는 배지를 사용하였다. 배양 시작 후 3일에서 5일 동안 (72시간)은 100 nM rapamycin (Sigma-Aldrich)을 추가하였다.
배양 6일 혹은 7일째에 조절 T세포를 재자극 하기 위하여 mitomycin C (Sigma-Aldrich)가 처리된 동일한 공여자 유래의 CD4- 세포를 조절 T세포 10배의 양으로 추가하였으며 동시에 50 ng/mL의 anti-CD3 antibody (Clone OKT3, Miltenyi)를 처리하였다. 17-19일간 배양된 제대혈 유래의 조절 T세포의 수는 처음 대비 공여자에 따라 270~400배로 증가하였다.
실시예
7. 제대혈 유래 조절 T 세포의 성질 확인
분리된 제대혈 유래 조절 T세포의 특징이 약 2주간의 배양 동안 변형되었는지 확인하고, 다른 세포로의 분화 여부를 확인하기 위해 배양 12일 차에 유세포 분석을 통한 조절 T세포와 분화 T세포의 마커 확인 실험을 수행하였다.
면역관용 기능이 제대로 유지되는 조절 T세포의 경우, 특이적 전사인자인 Foxp3 및 Helios의 발현을 유지한다고 알려져 있으므로, 배양 중 세포의 일부를 얻어 해당 항체를 이용하여 염색한 뒤 발현 변화를 확인하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 12일간 배양된 제대혈 유래 조절 T세포는 90%의 세포들이 해당 전사인자를 모두 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 대조군으로 사용된 비-조절T세포의 경우, 대부분이 Foxp3 및 Helios를 발현하지 않았다.
추가적으로 분류하여 배양된 조절 T세포가 배양기간 동안 다른 세포로 분화되지 않았음을 확인하기 위하여 사이토카인 분비양 측정을 수행하였다. PMA/Ionomycin (Biolegend)를 4시간동안 조절 T 세포에 처리하여 세포들이 사이토카인을 분비하도록 자극하였고, 단백질 이동 저해제 (Brefeldin A)를 함께 처리함으로써 세포 내 분비된 사이토카인 양을 배양액으로의 유출없이 측정하였다. 조절 T세포는 어떠한 사이토카인도 분비하지 않는 것으로 알려져 있으므로, T helper 1 cell (Th1) 및 Natural killer cell (NK cell)로의 분화여부 확인을 위해 IL-2와 IFN-γT helper 2 cell (Th2)로의 분화 여부 확인을 위해 IL-4, 마지막으로 T helper 17 cell (Th17) 로의 분화 확인을 위해 IL-17A의 분비를 확인하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 분리된 후 12일간 배양된 제대혈 유래의 조절 T세포는 IL-2, IL-4, IL-17A, 및 IFN-γ발현이 모두 1% 미만으로 확인되었고, 이는 Th1, Th2, NK cell, Th17으로의 분화가능성이 없음을 나타낸다. 따라서 유세포 분류기를 통해 분류된 후 12일간 배양된 제대혈 유래의 조절 T세포는 다른 세포로의 분화유도 없이 조절 T세포 고유의 기능을 유지하였음을 확인하였고, 이후 분리된 조절 T 세포를 실험에 사용하였다.
실시예
8. 아토피피부염 동물 모델을 이용한 병용투여 효과
실시예 5에서 기능강화 효과가 확인된 pcMSC2와 실시예 6에서 분리된 조절 T 세포를 병용 투여하여 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다.
8.1 아토피 피부염 모델 제조 및 투여 프로토콜
아토피 피부염 시험은 암컷 6주령의 SPF(specific pathogen-free) BALB/c mice (15~20 g)를 SLC, Inc (Shizuoka, Japan)에서 공급받아 사용하였으며, 1주 동안 순화기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 인하대 의과대학 생명과학연구소에서 온도 22~25 ℃, 습도 40~60 %, 주야 12시간 교대로 150~300 Lux의 조명에서 멸균 증류수와 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육환경을 유지하고 실험을 수행하였다. 7주령의 암컷 BALB/c 마우스에 ovalbumin(OVA) 50 μg/50 μl(PBS)과 Alum Adjuvant 4 mg/100 μl을 혼합하여 주 1회 3주간 총 3회에 걸쳐 복강과 피하 투여하여 면역화를 진행하였다. 3회 모두 같은 부위에 투여할 시 해당 질환과 무관한 염증을 유발할 수 있기 때문에 각각 다른 부위에 투여하였다. OVA+alum 투여 3주 후, 1.2x1.2 cm 크기의 멸균 거즈에 OVA 60 μg/60 μl(PBS)을 적신 후 제모한 피부에 주 2~3회, 2주 동안 부착하여 아토피 피부염을 유도하였다. 유도 후 13~14일차에 실험동물을 보정한 후, 26 1/2 gauge needle이 장착된 BD사 1 ml syringe를 이용하여 PBS, 세포안정화제, pcMSC2, 조절 T 세포, pcMSC2+조절 T 세포를 각각 주입하였다.
투여 프로토콜을 도 12에 나타내었고, pcMSC 투여는 파란 화살표로, 조절 T 세포 투여는 붉은 화살표로 도시하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, pcMSC2는 42일차에 최초 투여하여 2일 간격으로 총 3회 정맥 투여하였으며, 회당 1.66ⅹ105/200 ㎕씩 3회, 총 5.0ⅹ105/600 ㎕ 투여하였다. Tregs은 단독 투여군은 44일차에 총 1.0ⅹ106/250 ㎕를 단회 투여하였고, pcMSC2+Tregs 병용 투여군은 pcMSC2의 투여 프로토콜에 더하여 44일차에 총 1.0ⅹ106/250 ㎕ 의 조절 T 세포를 추가 피내 투여 (D44) 하였다. 피내 투여는 한 부위 당 50 ㎕ 이상 투여할 경우 skin trauma를 유도할 수 있기 때문에 250 ㎕에 부유된 세포를 50 ㎕씩 다섯 부위에 걸쳐 주입하였다. Veh.군의 실험동물은 투여 방법에 따라 Veh.(pcMSC2 control), Veh.(Tregs control) 두 가지로 나누었으며, 각각 PBS를 피내 투여, 세포안정화제를 정맥투여하였다.
이틀 후 병변 부위를 다시 제모한 후에 OVA 60 μg/60 μl(PBS)을 적신 1.2x1.2cm 크기의 멸균 거즈를 제모 한 등 피부에 2주 동안 주 3~4회 부착하여 아토피 피부염을 다시 유도하였다(부스팅 단계).
아토피 피부염에 대한 효과를 확인하기 위한 혈액샘플은 다음과 같은 방식으로 수득하였다. 모든 실험동물은 세포안정화제 또는 시험물질 투여 후 약 10일차 (실험 59일차)에 이소플루란을 이용하여 호흡 마취 후 복부를 절개하여 후대정맥을 노출시킨 후에 채혈하였다. 채혈한 혈액은 serum separate tube에 담아 3,000 rpm/15분, 4 ℃에서 원심분리 후, 1.5 ml e-tube에 담아 -70 ℃ deep freezer에 보관하였다.
8.2 병용 투여에 따른 피부 병변 변화 확인
실시예 8.1 의 아토피 피부염을 유발한 실험동물에 pcMSC2, 조절 T 세포를 상기와 같은 프로토콜로 투여하고, 실험 59일차에 피부 병변의 상태를 확인하였으며 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유발한 실험동물에 시험물질을 주입한 후 피부 전반에 걸쳐 질환 유발에 의한 상처, 혈흔, 각질 유무 등을 관찰한 결과 단독투여군 보다 pcMSC2, 조절 T 세포병용 투여군 (D44)에서 피부가 효과적으로 개선되는 것을 확인하였다.
8.3 병용투여에 따른 총
IgG1
억제 효과 및
IgG2
생산 효과 확인
실시예 8.1 의 아토피 피부염 유발 동물 모델에 pcMSC2, 조절 T 세포를 상기와 같은 프로토콜로 투여하고, 총 IgG1과 IgG2a를 비교 하였다. 아토피 피부염 유효성 평가를 위해 혈청 시료는 ELISA kit를 이용하여 혈청 내 total IgG1, IgG2a의 농도를 측정하였고, 측정은 키트 내 프로토콜에 준하여 실시하였다. ELISA plate에 면역글로불린을 인지할 수 있는 캡쳐 항체를 코팅 완충액과 함께 4℃에 하룻밤 동안 보관하고 다음 날 1시간 동안 차단 과정을 거친 후 혈청을 100배 이상 희석하여 50 μl의 양으로 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후 면역글로불린을 인지하는 2차 항체를 넣은 후 substrate buffer인 TMB solution을 넣고 약 15분 정도 반응시킨 후 50 μl의 stop solution을 넣었다. ELISA reader기를 이용하여 450 nm의 필터에서 값을 측정하였다. 확인 결과를 도 14 내지 도 17에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, Total IgG1는 Veh.을 제외한 모든 실험물질 투여군에서 유의적으로 감소되는 것을 확인하였으며, 특히, pcMSC2에 조절 T 세포를 병용 주입하였을 때 가장 큰 폭으로 감소하였다.
도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이 IgG2a의 경우에는 IgG1 결과와 반대되는 패턴이 확인되었는데, Veh. 대비 조절 T 세포 단독 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서 유의미한 수준으로 수치가 증가한 것으로 확인되었다. 또한 pcMSC2, 조절 T 세포 단독 주입군과 비교했을 때 pcMSC2에 조절 T 세포를 병용 주입하였을 때 가장 큰 폭으로 증가하였다. 이는 Th2 질환인 아토피 피부염 모델에 pcMSC2 및 조절 T세포를 주입함으로써 Th1 으로 시프팅이 이루어지고, 이를 통해 면역 불균형을 조절하여 아토피 증상을 완화시킬 수 있는 것을 나타내는 결과이다.
이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (21)
- TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 더 처리된 줄기세포인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 및 조절 T 세포는 병용 투여되는 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 골수, 태반 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 T 세포는 혈액, 지방, 골수, 태반 또는 제대혈 유래 조절 T 세포인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6) 발현, IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현, ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 발현 및 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 발현으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 증진된 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 키트는 (a) TNF-α, IFN-γ및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물; 을 포함하며, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장된 형태인 것이고, 상기 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 키트.
- 줄기세포 프라이밍용 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 를 포함하는 1구획;
줄기세포를 포함하는 2 구획; 및
조절 T 세포를 포함하는 3구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 1구획은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트.
- TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는 1 구획; 및
조절 T 세포를 포함하는 2구획; 을 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 1구획은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 것인 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용 투여 키트.
- TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는 제1조성물; 및 조절 T 세포를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제.
- 제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 더 처리된 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제.
- 제15항에 있어서, 상기 제1조성물은 정맥 투여용이며, 제2조성물은 피내 투여용인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 세포 치료제.
- 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계; 및
2) 조절 T 세포를 상기 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 1) 단계의 줄기세포는 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 함께 처리된 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법.
- TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포; 및 조절 T 세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 줄기세포는 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 더 처리된 줄기세포인, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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| KR1020210070810A KR20220162394A (ko) | 2021-06-01 | 2021-06-01 | 기능강화 줄기세포 및 조절 t 세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 병용투여 조성물 |
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