KR20150118100A - 줄기세포의 면역조절성 효과의 조절 방법 - Google Patents

줄기세포의 면역조절성 효과의 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 질병, 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 루푸스, 패혈증, 간염, 간경변, 파킨슨병, 만성 감염 및 GvHD 의 예방 및 치료에 있어서, 그들의 면역 조절 효과를 증대시키기 위하여 MSC 전처리를 하기 위한 염증성 사이토카인을 갖는 방법 또는 키트를 제공한다. 본 발명은 중간엽 줄기세포의 면역 억제 또는 면역 촉진 활성을 증진하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

줄기세포의 면역조절성 효과의 조절 방법{METHODS MODULATING IMMUNOREGULATORY EFFECT OF STEM CELLS}
본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC) 의 면역억제성 또는 면역촉진성 활성을 증진시키기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 으로부터 부여받은 등록번호 GM866889, DE014913, 및 DE019932 하의 정부지원으로 만들어졌으며, 줄기세포는 New Jersey Commission on Science and Technology 로부터 부여받았다 (NJCST-2042-014-84).
세포성 치료법은 예를 들면 재생 의료, 장기이식 및 심지어 암과 같은 임의의 상태의 진단 또는 예방 목적을 포함하는 임의의 목적을 위해서 살아있는 세포를 투여하는 것을 포함한다. 줄기세포는 세포 치료법에 있어서 매우 훌륭한 잠재성을 갖는 것으로 평가되고 있다. 그러나, 이의 임상 상황에서의 효과적인 사용은 다양한 이유로 기피된다.
줄기세포는 그들을 다른 세포 타입으로 구별하는 두개의 구별되는 특징을 갖는다. 첫째로, 그들은 비특화되어있고 그들의 일반적인 특성에서의 뚜렷한 변화 없이 오랜 기간동안 스스로-재생될 수 있다. 둘째로, 특정 생리학적 또는 실험적 조건 하에서, 줄기세포는 다양한 특화된 세포 타입으로 분화되도록 유도될 수 있다. 그러므로 줄기세포는 재생 의료에 있어서 매우 유망하다. 줄기세포의 두가지 주요 유형이 있다: 배아줄기(ES) 세포 및 성체 줄기세포.
성체줄기세포는 많은 성숙한 조직, 예컨대 골수, 근육, 지방 및 뇌에 존재한다. 성체줄기세포들에 대한 많은 연구가 CD34+ 조혈모세포에 집중되는 동안, 구별되는 계열의 CD34-섬유아세포-유사 중간엽 줄기세포(MSC), 특히 골수에서 유래된 것은 기본적이고 임상적인 연구에서 뚜렷한 흥미를 유발하였다 (Chen, 외. (2006) Immunol. Cell Biol. 84:413-421; Keating (2006) Curr. Opin. Hematol. 13:419-425; Pommey & Galipeau (2006) Bull. Cancer 93:901-907). 골수-유래된 MSC 는 조직의 다양한 세포 유형, 예컨대 연골, 뼈 및 지방 조직으로의 분화를 보여주었다 (Barry & Murphy (2004) Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:568-584; Le Blanc & Ringden (2006) Lancet 363:1439-1441).
중간엽 줄기세포는 재생 의료 및 자가면역질환에 있어서 매우 큰 가능성을 가지고 있고, 임상적인 시도에서 간 섬유화, 당뇨, GvHD 및 크론씨 병을 포함하는 많은 다른 종류의 질환을 치료하기 위해 평가되어 왔다. MSC는 이식된 골수 및 배아 줄기세포 또는 유도된 다분화능 줄기세포(iPS) 로부터 분화된 세포의 성공적인 생착을 돕는다. 따라서, MSC의 면역 억제성 행동은 이러한 상태와 싸우기 위한 유용한 방법을 제공할 수 있다.
다른 각도에서, 면역 시스템은 종양 발달 및 진행에 대항하는데 중요한 역할을 한다. 종양은 언제나 면역억제성 미세환경을 동반한다. MSC는 종양 특이적으로 이동하는 내재적 능력을 가지고 있으며, 항-종양 제제 전달을 위한 종양-특이적 벡터로서 제안되어 왔다. 사실, MSC는 I 형 인터페론, TRAIL, IL-12 및 LIGHT 를 포함하는 다양한 항-종양 인자를 발현하도록 유전적으로 설계되었으며, 동물모델에서 강력한 항-종양 효과를 나타내는 것을 보인바 있다. 그러므로, MSC를 이용한 항-종양 면역 반응의 강화는 추가적인 암 치료법에 대한 큰 가능성을 가진 촉진성 영향을 줄 수 있다는 것을 제안한다.
MSC 조절 면역 반응을 통한 in vivo 메커니즘에 있어서, 억제 또는 유도는 잘 알려져 있지 않다. 더욱 중요하게는, MSC의 임상적인 효과가 숙주의 물리적 및 병리적 상태 및 MSC 자체가 가진 미세환경에 의존적으로 뚜렷하게 다양하다는 것이다. 그러므로 임상적인 셋팅에서 MSC의 면역 조절성 효과를 성공적으로 이용하기 위해서는 치료법에 대한 추가적인 이해와 개발에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 처리된 MSC 집단에 의한 면역 반응 억제 및 유도를 위한 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 유전자 변형된 MSC를 이용한 면역 어쥬번트의 새로운 재료를 제공한다.
치료적으로 사용하기 위하여, 본 발명의 약학적 조성물은 키트로서 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 약학적으로 허용가능한 담체; 단리된 중간엽 줄기세포의 집단; 단리된 IFN 감마 (IFNγ); 단리된 인터루킨-1 알파(IL-1α); 1형 인터페론(IFN-I 예컨대 IFN-Iα(알파), IFN-Iβ(베타)), 형질전환 증식인자 베타(TGFβ), 섬유아세포 성장인자 (FGF), 단리된 인터루킨-17A(IL17-A) 및 종양 괴사성 인자 (TNF)를 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 키트는 면역 반응을 약화시키기 위한 및/또는 면역 반응을 유도 또는 촉진시키기위한 방법에 있어서 키트를 사용하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 면역억제성 분자의 억제제(예컨대 NO 합성효소(iNOS)/ 인돌아민-2,3-다이옥시게나아제(IDO) 억제제), 다른 사이토카인 또는 면역반응의 촉진 또는 억제를 위한 치료적 제형을 포함한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 단리된 정제 MSC, IFNγ 및 IL-17A를 함유하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 것으로 기술된다. 본 발명은 또한 단리된 MSC, IFNγ, TNFα, IL-1 및 IL-17 을 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 면역 반응 조절을 위한 방법은 IFNγ 및 임의의 하나의 사이토카인 IL-1α; IFN-I, TGFβ, FGF, TNFα또는 IL-17 및 이들의 임의의 조합으로 처리된 단리된 MSC를 포함하는 조성물의 유효량을 개체의 면역 반응을 억제 또는 유도하기 위하여 처리를 필요로 하는 개체에 투여하는 것으로 기술된다. 또다른 구현예에서, IFNγ 및 임의의 하나의 사이토카인 IL-1α,β; TNFα 또는 IL-17 로 처리된 단리된 MSC를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것에 의한, 이러한 치료를 받은 적이 없거나 면역을 억제하기 위한 코르티코스테로이드 또는 비-스테로이드성 항염증 약물을 포함하는 항-염증성 약물을 투여받은 개체와 비교하여 개체에서 면역억제를 증진시키는 방법이다.
바람직한 방법 및 재료가 하기 실시예에서 기술되나 이는 예시적인 것으로 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본원에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들을 인식하고 이들을 본 발명의 재현 또는 시험에 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 구체화된다.
도 1은 전염증성 사이토카인에 의하여 MSC의 면역억제가 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 복제된 MSC에 표시된 조합의 재조합 사이토카인을 8시간 동안 보충하였고 (각 20ng/ml) 그 후 CD4+ T 세포 아세포와 1:20 비율 (MSC: T 세포)로 공동-배양하였으며, 추가 8시간 후 증식을 평가하였다. 값은 다른 복제세포를 이용한 세개의 실험의 대표 유래의 5웰의 평균±SD 로 나타내었다. * p <0.001.
도 2는 iNOS-결핍 MSC Boost DTH를 나타내는 그래프이다. C57BL/6 마우스는 완전 프로인트 어쥬번트 내 OVA 에 의해서 꼬리 기반 주입으로 면역화되었다. 야생형 또는 iNOS -/- MSCs (2.5 x10 5 세포)와 함께 또는 이들 없이 투여된 총 200μg OVA로 마우스를 발바닥에서 7일째에 도전(challenge)시켰다. 발바닥의 두께 증가는 DTH 측정에 의하여 24시간 후에 결정하였다. 데이터는 세개 실험 대표의 평균±SD 로 나타내었다. * p <0.005 vs.OVA 단독.
도 3은 MSC 가 염증성 사이토카인 및 NO 의존적 방식으로 GvHD를 예방하는 것을 보여주는 그래프이다. 수용체 마우스 (C57BL/6xC3H, F1)는 치명적인 방사능 조사를 받았으며 C57BL/6 골수 세포와 지라세포를 i.v.로 주입하였다. 골수 이식 3일 및 7일 후, 수용체에 표시된 MSC를 투여하였다. 일부 야생형 MSC 군에 대하여, L-NMMA, 항-IFNγ 또는 TNFα, IL-1α 및 IL-1β 에 대한 3-항체 혼합물(3Abs)을 i.p.로 주입하였다. 생존율은 12 주동안 매일 모니터하였다.
도 4는 림프종 기질세포(LSC)가 림프종 발달을 NO-의존적 방식으로 촉진함을 나타내는 그래프이다. 355B-세포 림프종 세포주(C3H-gld/gld background, 0.5 x 10 6 cells/mouse)를 gld/gld 마우스-유래 림프종 기질세포(C3H background, P5, 0.25x106 cells/mouse)와 함께 꼬리-정맥 i.v.로 0일째에 공동-주입하였다. 1400W (NOS 억제제, 0.1mg/mouse)를 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 및 28일째에 i.p로 주입하였다. 마우스 생존율은 마우스가 빈사 직전일 때 기록하였다.
도 5는 NOS 억제제와 IFNγ 의 조합이 마우스 흑생종 치료를 촉진함을 보여주는 그래프이다. B16-F0 흑생종 세포를 C57BL/6 마우스에 0일째에 i.v.로 주입하였다(0.5x10 6 cells/mouse). IFNγ(250ng/mouse) 및 1400W (NOS 억제제, 0.1mg/마우스)를 i.p 주입으로 4, 8, 12, 16, 20일째에 투여하였다. 마우스 생존률은 마우스가 빈사 직전일 때 기록하였다.
도 6. IL-17A 는 마우스 BM-MSC 에서 염증성 사이토카인-유도된 iNOS 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 모두 현저하게 증가시킨다. BM-MSC는 표시된 사이토카인으로 처리하였다. iNOS 유전자 발현은 실시간 PCR로 측정하였다.
도 7. IL-17A는 MSC-매개된 면역억제 효과를 현저하게 촉진하였다. MSC 세포와 T-세포 하이브리도마 A1.1 세포주는 1:20 비율로 공동-배양하였다. 공동-배양에는 IFNγ + TNFα 또는 IL-17A+ IFNγ + TNFα를 보충하였다. 세포 증식은 O.D. 570nm에서 나타나는 세포 밀도에 의해 측정하였다.
도 8. IL-17A 는 iNOS mRNA의 붕괴를 막아주었으며, (A) iNOS mRNA 안정성을 IFNγ + TNFα 및 IFNγ + TNFα+IL-17A 처리군에서 액티노마이신 D 처리 후 다른 시점에서 측정하였다. (B) IFNγ 및 TNFα 처리 후 다른 시점에서의 IL-17A의 iNOS 발현 증진 효과.
도 9 (A). 복제된 MSC를 표시된 조합의 재조합 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL-17A (각각 2ng/ml)의 조합으로 12시간 동안 일차 처리하였고, 그 후 CD4+ T 세포 아세포와 1:20 비율(MSC:T 세포)로 공동배양하고, 증식을 3H-티미딘 도입에 의하여 추가 12시간 후 측정하였다. (B). MSC 또는 Raw 264.7(대식세포)에서의 IL-17 수용체 패밀리 일원의 mRNA 발현을 RT-PCR에 의하여 시험하였다. NO: no RT. (C). IL-17RA의 표면 발현을 복제된 MSC 에서 면역형광 또는 유세포 분석을 통해 검출하였다. (D 및 E). MSC를 IL-17A(10ng/ml)와 함께 또는 이들이 없는 IFNγ 및 TNFα 로 일차적으로 처리하였고, IFNγ 및 TNFα에는 12시간 동안 다른 농도의 사이토카인을 보충하였으며, 그 후 CD4+ T 세포 아세포 (D) 또는 T 세포 하이브리도마 A1.1 세포(E) 와 함께 12시간 동안 1:20 비율로 공동 배양하였다. T 세포 증식을 3H-티미딘 도입에 의해 측정하였다. (F). MSC를 12시간 동안 농도 구배적 IL-17A 와 함께 IFNγ 및 TNFα 로 일차적으로 처리(2ng/ml)하였고, 그 후 T 세포 하이브리도마 A1.1 세포(E) 와 함께 12시간 동안 1:10 비율로 공동 배양하였다. T 세포 증식을 3H-티미딘 도입에 의해 측정하였다. (G). MSC를 항-CD3, 항-CD28, 및 IL-17A의 대한 항체를 더한 신선한 C57BL/6 지라세포와 함께 48시간 동안 1:20 또는 1:40 비율 (MSCs : 지라세포)로 공동 배양하였고, 그 후 세포 증식을 3H-티미딘 도입에 의해 평가하였다. 증식 값은 세개 실험의 대표 유래의 세개의 웰의 평균±SEM 로 나타내었다.
도 10. (A 및 C). MSC는 12시간 동안 다른 염증성 사이토카인 IFNγ, TNFα , IL-17A (10ng/ml)의 조합과 함께 배양하였으며, 그 후 세포를 RNA 추출을 위해 수확하였다. 염증성 분자 iNOS, IL-6, CXCL1 (A) 및 케모카인 CCL2, CCL5, CXCL9, CXCL10 (C) 의 mRNA 발현 수준을 정량적 RT-PCR로 검출하였다. (B). MSC를 24시간 동안 다른 염증성 사이토카인 IFNγ, TNFα, IL-17A (10ng/ml)의 조합과 함께 배양하였으며, 그 후 iNOS의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 검출하였다. (D). MSC에 Sup-CD3를 보충하거나 IL-17A 에 대한 항체로 전처리된 Sup-CD3를 보충하고, 12시간 후 세포를 RNA 추출을 위해 수집하였다. iNOS, IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5, CXCL9 및 CXCL10 의 발현을 정량적 RT-PCR을 통해 측정하였다. Sup-CD3: 항-CD3 및 항-CD28에 의해 활성화된 지라세포 유래 상청액. (E). MSC에 Sup-CD3를 처리하거나 IL-17A 에 대한 항체로 전처리된 Sup-CD3를 처리하고 iNOS 의 단백질 수준을 24시간 후 웨스턴 블랏을 통해 평가하였다. mRNA 발현 값은 세개 독립 실험의 대표 유래의 세개의 웰의 평균±SEM 로 나타내었다. 웨스턴 블랏 데이터는 세개 독립실험의 대표값이다.
도 11. (A) Act1 넉다운을 갖는 MSC 또는 대조군을 다른 시간에 IL-17A로 처리하고 IκBα, ERK, p65, JNK의 인산화 수준을 웨스턴 블랏으로 평가하였다. (B) Act1 넉다운을 갖는 MSC 또는 대조군을 IL-17A 와 함께 또는 이것 없이 IFNγ 및 TNFα로 처리하였고 (모든 사이토카인 보충은 5ng/ml) iNOS 및 Act1의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 평가하였다. (C) MSC (Act1 넉다운 또는 대조군)을 다른 사이토카인으로 12시간 처리하고, iNOS 발현을 정량적 RT-PCR로 측정하였다. mRNA 발현값은 평균 ±SEM 로 나타내었다. (D) MSC (Act1 넉다운 또는 대조군)을 IL-17A 와 함께 또는 이것 없이 IFNγ 및 TNFα로 12시간 동안 일차 처리하였고 (모든 사이토카인 보충은 5ng/ml), 그 후 T 세포 하이브리도마 A1.1 세포와 1:10 비율로 12시간 동안 공동 배양하였다. T 세포 증식을 3H-Tdr 도입에 의해 측정하였고, Al.1 단독의 증식 수준을 100%로 하였다.
도 12. (A). WT MSCs 또는 auf1 -/- MSCs을 IFNγ 및 TNFα 또는 IL-17A와 함께(모든 사이토카인 보충은 10ng/ml) 12시간 동안 처리하였고, iNOS, IL-6 및 CXCL-1 발현을 정량적 RT-PCR로 측정하였다. mRNA 발현값은 세개 독립 실험의 대표 유래의 세개의 웰의 평균±SEM 로 나타내었다. (B) WT MSC를 IFNγ 및 TNFα(10ng/ml) 또는 다른 농도의 IL-17A와 함께 처리하였다; auf1 -/- MSC를 IFNγ 및 TNFα(10ng/ml) 또는 10ng/ml IL-17A와 함께 처리하였다. 24시간 후, 세포들을 웨스턴 블랏에 의한 iNOS 검출을 위해 수확하였다. 웨스턴 블랏은 세개 독립 실험의 대표값으로 나타내었다.
도 13. (A 및 B). 야생형(A) 또는 auf1 -/- MSCs (B)를 IL-17A와 함께 또는 이들 없이 IFNγ 및 TNFα (모든 사이토카인 보충은 10ng/ml) 로 6시간 동안 처리하고, 전사 종결을 위해 액티노마이신 D(5㎍/ml)를 첨가하였다. 표시된 시점에서, mRNA 수준은 정량적 RT-PCR로 평가하였으며, 액티노마이신 D 첨가 시점을 100% 발현 수준으로 잡았다. mRNA 발현값은 세개 독립 실험의 대표값 유래 세개의 웰의 평균 ±SEM 으로 나타내었다.
도 14. (A). WT MSCs 또는 auf1 -/- MSCs을 IL-17A와 함께 또는 이들 없이 IFNγ 및 TNFα (모든 사이토카인 보충은 5ng/ml)로 12시간 동안 처리하였고, T 세포 하이브리도마 A1.1 세포와 1:10 비율로 12시간동안 공동 배양하였다. T 세포의 증식을 3H-Tdr 도입에 의해 측정하였고, A1.1 단독의 증식 수준을 100%로 잡았다. (B). WT MSCs 또는 auf1 -/- MSCs을 IL-17A 와 함께 또는 이것 없이 IFNγ 및 TNFα로 일차 처리하였고 (10ng/ml), IFNγ 및 TNF α에 다른 농도의 사이토카인을 12시간 동안 보충하였고, 그 후 T 세포 하이브리도마 A1.1 세포와 1:10 비율로 12시간동안 공동 배양하였다. T 세포 증식을 3H-Tdr 도입에 의해 측정하였고, Al.1 단독의 증식 수준을 100%로 하였다.
도 15. (A) ALT의 혈청 수준을 측정하였다. (n=3-5 마우스/군). (B). 간 조직에서 단핵구 세포(MNC)의 완전 수를 계산. (C). 유세포 분석에 의하여 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 완전수를 결정하였다. (D). ConA 투여 8시간 후 간 절편의 H&E 염색. a. 미처리 마우스; b. ConA+PBS; c. CoaA+야생형 MSC; d. ConA+IFNγ+ TNFα 전처리된 야생형 MSC; e. ConA+IFNγ+ TNFα+IL-17A 전처리된 야생형 MSC; f. ConA+auf1 -/- MSCs; g. ConA+IFNγ+ TNFα 전처리된 auf1 -/- MSC; h. ConA+IFNγ+ TNFα+IL-17A 전처리된 auf1 -/- MSCs.
도 16. I 형 인터페론 및 FGF-2 는 NO 생산의 억제를 통해 MSC의 면역 억제 효과를 하향 조절한다. (A) I형 IFN (IFNα) 는 MSC 에서 IFNγ+TNFα-유도된 iNOS 단백질 발현을 STAT1 및 NFκB 경로내 관련 전사인자의 영향 없이 억제한다. (B). I형 IFNs의 보충: IFNα 또는 β 는 MSC+지라세포+항-CD3 시스템에서의 MSC-매개된 면역억제를 현저하게 억제한다. (C) FGF-2 (FGFβ) 는 MSC에서 IFN γ + TNF α 또는 IFN γ + IL-1β에 의해 유도된, 배양 상청액 내 질산염 함량에 의해 반영되는 NO 생산을 억제한다. (D) FGF-2의 보충은 MSC+ 지라세포+ 항-CD3 시스템에서 MSC의 면역억제 효과를 현저하게 감소시킨다.
도 17. (A) 중간엽 줄기세포 (MSCs) 에서 유도가능한 마우스 일산화질소 합성효소(iNOS) 프로모터-유발된 인간 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 (IDO) 발현 시스템의 구조. (A). 플라스미드 구조. (B). iNOS-/- MSCs, 공 벡터-형질감염 및 인간 IDO-형질감염된 iNOS-/- MSC 를 재조합 마우스 염증성 사이토카인 IFNγ 및 TNFα와 함께 (+) 그리고 이들 없이 (-) 자극하였다. 인간 IDO 발현은 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
도 18. (A) 형질도입의 효율성을 결정하기 위하여, 형질도입된 세포들을 유세포분석을 통해 GFP 발현에 대하여 분석하였다. (B) MSC-GFP 및 MSC-IFNα를 48시간 동안 5x105 /ml 로 배양하였다. 상청액을 수집하고 IFNα 농도를 IFNα 엘리사키트(PBL, NJ)에 의해 측정하였다. (C) 형질도입된 세포에 의해 방출되는 IFNα이 어떤 생물학적 기능을 갖는지 여부를 시험하기 위하여, MSC-GFP, 재조합 IFNα으로 처리된 MSC-GFP(ebiosience,CA), 또는 MSC-IFNα의 상청액 및 MSC-IFNα 상에서의 H-2Kb의 표면 발현을 APC-H-2Kb(ebiosience,CA)을 이용한 염색 후 유세포 분석으로 시험하였다.
도 19. (A).1×106 MSC-GFP 또는 MSC-IFNα를 갖거나 갖지 않는 1×106 B16 종양 세포를 근육내로 C57BL/6 마우스에 주입하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. (B) 1×106 B16 세포를 근육내로 다른 수의 MSC-IFNα: 1×106 (1:1), 1×105 (1:10), 1×104 (1:100), 1×103 (1:1000), 1×102 (1:10000)와 함께 또는 MSC-IFNα 없이 접종하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. C. MSC-IFNα 를 갖거나 이들이 없는 1×106 B16 종양세포를 근육 내로 C57BL/6 마우스에 주입하였다. 마우스의 생존을 종양 접종 후 100일 동안 모니터하였다. (D 및 E) 1×106 B16 종양세포를 C57BL/6 마우스에 근육내로 주입하였다. 3일(D) 또는 4일(E) 후, 1×106 MSC-GFP 또는 MSC-IFNα을 근육내로 접종하였다. 종양 접종 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. F. 1×106 B16 종양세포를 근육 내로 C57BL/6 마우스에 주입하였다. 3일 후, PBS, 5μg 재조합 IFNα 또는 1×106 MSC-IFNα을 근육내로 주입하였다. 9일이 지난 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. 3개의 실험을 2 내지 3회 반복하였다. 모든 플롯에 대하여 에러바, 평균±s.d. 통계적 유의도는 unpaired two-tailed Student's t test로 평가하였다.
도 20. (A) 1×106 루시퍼라아제 표지된 MSC-IFNα 를 1×106 B16 세포와 함께 C57BL/6 마우스에 근육내로 주입하였다. 주입 D0, D3, D7, D15 및 D21 후, 실시간 이미징을 통해 MSC를 검출하였다. 간단하게, 마우스를 마취시키고, 150mg/kg의 D-루시페린(Caliper Lifescience, MA) 를 이미징 15분 전 복강내로 주입하였다. BLI 데이타를 Berthod NC100 이미징 시스템을 통해 얻었다. (B). 루시퍼라아제 신호 강도를 계산하여 나타내었다 (에러 바, 평균±s.d.). (C) 1×106 MSC-IFNα을 갖거나 갖지않는 1×106 B16 종양 세포를 C57BL/6 마우스에 근육내로 주입하였다. 12일 후, 종양을 수확하였다. HE 및 Ki-67 (Abcam, MA) 염색을 위하여, 종양 시료를 10% 포르말린으로 실온에서 1주 동안 고정시키고 파라핀 절편을 준비하였다. TUNEL 분석을 위하여, 종양을 OCT 에 담그고, 즉시 동결시켰으며, 제조사의 프로토콜에 따라 in situ 세포 사멸 검출 키트 (Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 TUNEL 에세이를 위한 절편을 준비하였다.
도 21. (A). 96-웰 플레이트 내 웰 당 1 000 B16 세포를 0ng/ml, 10 ng/ml 또는 100 ng/ml의 재조합 마우스 IFNα와 함께 접종하였다. 3일 후, 세포들을 10 ul CCK8 (Dojindo, Shanghai, China) 와 함께 2시간 동안 배양하였고, O.D.(450nm) 로 측정하였다. (B 및 C) 1×106 MSC-GFP 또는 MSC-IFNα를 갖거나 갖지않는 1×106 B16 종양세포를 C57BL/6 마우스 (B) 또는 NOD-SCID 마우스(C) 에 근육내로 주입하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. (D 및 E) 1×105 , 1×104 MSC-IFNα 를 갖는 또는 MSC-IFNα를 갖지 않는 1×106 B16 종양 세포를 C57BL/6 마우스(D) 또는 NOD-SCID 마우스(E)에 근육내로 주입하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다.(F). 1×104 MSC-IFNα를 갖거나 갖지 않는 B16 1×106 종양 세포를 C57BL/6 마우스에 주입하였다. NK 세포-특이적 디플레이션 항체 (depletion antibody) 항-아시알로 GM1 (Wako, Osaka, Japan) 또는 비히클 대조군을 i.v.로 종양 세포 접종일 전 매 4일간 주사하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. (G) 1×104 MSC-IFNα를 갖거나 갖지않는 1×106 B16 종양 세포를 C57BL/6 마우스 또는 β2m-결핍 마우스에 주입하였다. 12일 후, 종양을 절개하고 무게를 측정하였다. 이들 실험을 2 내지 3회 반복하였다. 모든 플롯에 대하여 에러바, 평균±s.d. 통계적 유의도는 unpaired two-tailed Student's t test로 평가하였다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가지며, 하기 기술된 의미를 갖는것으로 이해되어야 한다. 본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 그들 전체로 참조로서 통합된다. 대립되는 경우에 있어서, 본정의를 포함하는 발명의 명세서가 우선된다. 이에 더하여, 물질, 방법 및 실시예들은 설명적인 것이며, 제한하고자 하는 의도가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정 용어의 5%의 상한 또는 하한을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "필수적으로 구성되는"은 기본적인 조성물의 특징, 제형 또는 구조에 실질적으로 영향을 줄 수 있는 다른 유효성분 또는 임의의 다른 성분을 제외하는 것을 말하나 일반적으로 부형제는 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 발명 "유효량"은 개체 내에서 면역 반응의 조절, 약화 또는 유도 (예컨대 T 세포 반응의 억제 또는 면역 반응의 촉진) 에 충분한 것으로, 그 결과 치료 하에서 하나 이상의 질병 또는 장애의 증상 또는 징후의 감소를 나타내게 되는 줄기세포, 사이토카인 또는 이들을 포함하는 치료적 조성물의 양을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는", "치료법" 및 이와 유사한 것은 이와 같은 치료를 필요로 하는 환자에 조성물을 투여함으로써 수반되는 질병의 징후 또는 증상 완화를 말한다. 이러한 완화는 질병이 발생한 후 뿐만 아니라 질병의 징후 또는 증상이 나타나지 전에도 발생할 수 있으며, 따라서 예방 및 활성 치료법을 포함한다. 게다가 "치료", "치료하는", "치료법" 은 징후 또는 증상의 완전한 경감 또는 완치를 요하는 것은 아니다. 세포 수준에서 이것은 미처리 세포 또는 대조군 또는 비교 제제로 처리된 세포와 비교하여 질병을 갖는 또는 표적 세포성 집단의 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 감소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 범위 내의 "투여(administration)", "투여하는" 또는 "치료 처방(treatment regimen)" 용어는 단일 치료물질 전달 또는 다중 또는 반복 전달 또는 본 발명의 개별적 요소 중 하나의 대조 전달 치료 또는 이의 조합을 포함한다. 이와 같은 용어들은 추가적으로 예컨대 국소적, 전신적, 혈관내, 근육내, 복강내, 혈관-뇌 장벽 내부, 장기-특이적 중재 주입 또는 다른 다양한 루트를 통한 전달의 형태를 포함하는 것을 의미한다.
개략적으로, 본 발명은 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 루푸스, 패혈증, 간염, 간경변, 파킨슨병, 만성 감염 및 GvHD 및 심지어 암 및 고형 종양과 같은 다양한 질환의 예방 및 치료에 있어서, MSC를 전처리하기 위한 염증성 사이토카인 예컨대 IL-1α, 인터루킨 베타(IL-1 β), TNFα, IL- 17A, IFN-I, TGFβ, FGF 를 이용하여 이들의 면역 조절 효과, 예컨대 면역 억제 또는 면역 유도 효과를 증대하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 개시한다.
면역억제는 면역 반응 동안에 생산되는 염증성 사이토카인에 의해서 유발된다. 염증성 사이토카인이 부존재하면, MSC는 그들의 면역억제 능력을 얻을 수 없다. 본 발명의 적어도 하나의 양태는 면역 반응에 대한 강력하고 오래 지속되는 억제성 기능을 달성하기 위하여 일차적인 그리고 처리된 MSC 에 염증성 사이토카인을 첨가하는 것을 개시한다. 이러한 효과는 특히 활성화된 T 세포 또는 활성화된 대식 세포 및 다른 면역 세포, 염증성 사이토카인, 예컨대 IFNγ 또는 TNFα의 혈청 수준을 포함하는 다른 면역 반응 파라미터에 의해 분명히 나타날 수 있다.
이식편대숙주병(graft-versus-host disease; GvHD), 실험적 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 만성 감염, 간 경변, 폐경변, 및 류마티스성 관절염에 대한 염증성 사이토카인의 필수적 역할에 대한 in vivo 연구가 수행되었다. 본 발명의 적어도 하나의 양태는, 가역적으로 면역 반응을 촉진할 수 있는, NO 또는 IDO 결핍 또는 감소 하에서, MSC에 의한 많은 양의 케모카인 및 성장 인자의 분비에 책임이 있는 유전적으로-변형된 MSC를 개시한다. 그러므로, 본 발명은 면역 반응을 조절하기 위한 강력한 면역 억제 및 증가 전략을 제공한다.
본 발명의 적어도 하나의 양태는 (i) 세포 원으로부터 다분화능 전구 세포를 얻는 단계; (ⅱ) 상기 다분화능 세포를 적절한 배지에서 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 배지의 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; (ⅳ) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, TGFα, FGF, IFN-I (IFNα,β), TNFα 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유효량의 사이토카인으로 활성화 시키는 단계; 의 공정을 통해 얻어지는 일차적인 또는 처리된 줄기세포의 집단에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에서는 상기 공정에 의해 생산된 이들 처리된 줄기세포의 아집단이 이들을 필요로 하는 개체에 투여되었을 때 면역반응을 증진, 촉진, 개선 또는 유도한다. 하나 이상의 구현예에서 개체는 포유류, 바람직하게는 사람, 또는 질병을 가진 환자이다. 또다른 구현예에서 다른 처리된 줄기세포의 아집단은 관심 부위에서 면역 반응을 억제, 감소 또는 약화시킬 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 양태는 일차적인 또는 처리된 줄기세포의 집단을 만드는 하기 (i) 세포 원으로부터 다분화능 전구 세포를 얻는 단계; (ⅱ) 상기 다분화능 세포를 적절한 배지에서 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 배지의 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; (iv) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, TGFα, FGF, IFN-I (IFNα,β), TNFα 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유효량의 사이토카인으로 활성화 시키는 단계; 에 따른 일차적인 또는 처리된 줄기세포의 집단을 제조하는 공정에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 공정은 최적의 MSC 능력을 달성할 수 있는 특이적 배지를 이용한다. 또다른 구현예에서, 상기 공정은 모든 잔여 사이토카인을 실질적으로 생산된 처리된 줄기세포에서 분리하는 여과 또는 추출 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 처리된 줄기세포는 본원에서 기술된 상기 공정에 의해 생산된 줄기세포를 말하며 줄기세포의 복제성(clonal), 비-복제성(non-clonal) 또는 모든 형태로 구성될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서 상기 배지는 낮은 산소를 갖는다.
하나의 구현예에서, 처리된 줄기세포의 아집단은 대상 부위에서의 면역 반응을 억제, 감소 또는 약화시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 인터페론 또는 백신과 같은 다른 면역 능력 억제의 치료법 또는 생물학적 처방을 차단하는 약학적 시약을 기술한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 암과 같은 면역억제성 질환에 대한 면역성을 증진시키기 위하여 종양 연관 MSC의 면역억제 능력을 차단하는 조성물을 개시한다. 따라서, 처리된 MSC 세포는 다른 표준 종양 면역 치료법 프로토콜의 보조용법이 될 수 있고 또는 이와 조합하여 억압 하의 면역 반응을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 이와 같은 면역 치료법은 백신 및 유전적, 생물학적 및 약학적-변형된 MSC, 백신, 단백질 또는 면역 어쥬번트와 같은 유전자 치료법을 이용하는 암 면역치료법을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 하기 단계에 따라 그들을 필요로 하는 개체에서 면역 반응을 촉진하기 위한 방법이 기술된다 (a) 유도가능한 일산화 질소 합성효소 억제제, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 억제제, 유도가능한 일산화 질소 합성효소(iNOS)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 (IDO)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단 또는 이들의 임의의 조합 및 (b) 하나 이상의 일산화질소(NO), 인돌아민 2,3 디옥시게나아제(IDO) 또는 프로스타글라딘 E2(PGE2)를 함유하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계.
본 발명의 다른 하나 이상의 양태는 (a) 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 단리된 중간엽 줄기세포의 집단: (i) 다분화능 전구 세포(multipotent progenitor cells)를 세포원으로부터 얻는 단계; (ii) 중간엽 줄기세포의 부분 모집단(subpopulation) 및 분화된 세포의 부분 모집단을 생산하기 위하여 배지에서 상기 다분화능 세포를 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 배지내 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계, (iv) 하나이상의 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 아집단(subset)을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, TGFβ, FGF, IFN-I(IFNα, β), TNFα 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 유효량의 하나 이상의 사이토카인으로 활성화 시키는 단계; 및 선택적으로 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 양태에서, 상기 얻어진 조성물은 이러한 조성물을 받는 개체의 면역 반응을 유도한다. 또다른 구현에에서, 이러한 조성물은 발전형 단계(expanding phase) 동안 사용되는 임의의 사이토카인을 대부분 제거한 것이다. 상기 본원에서 사용되는 용어 대부분 제거는 조성물의 무게 당 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25% 또는 0.1% 미만을 갖는 것을 의미할 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 세포 집단은 복제된 또는 비-복제된 중간엽 줄기세포, 분화된 세포, 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, MSC의 활성화 단계는 원하는 면역억제 능력이 나타날 시점까지의 충분한 시간 동안의 IFNγ 및 IL-1 α, IL-1 β, IL-17 A, TNF α 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 사이토카인의 존재에 의해서 달성된다. 본 구현예에서, 상기 얻어진 조성물은 이와 같은 조성물을 전신적 또는 국소적으로 모두 받은 개체에서 면역 반응을 억제 또는 약화시키는 단리된 MSC를 포함한다. 또다른 구현에에서, 상기 조성물은 임의의 잔여 사이토카인을 대부분 제거한 것이다. 또다른 구현예에서 상기 조성물은 국소 면역 T 세포 증식을 억제한다. 또다른 구현예에서, 상기 세포 집단은 추가적으로 복제된 또는 비-복제된 중간엽 줄기세포, 분화된 세포, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 세포의 집단의 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 90%는 복제된 MSC로 만들어진다.
본 발명의 또다른 양태에서, 발명자들은 이들을 필요로 하는 환자에서 면역반응을 활성화, 증진, 촉진 또는 유도하기 위한 방법을 기술하고, 여기에서 단리된 MSC의 집단은 (a) 단리된 IFNγ 및 (b) IL-1α, IL-1β, TGFβ, FGF, IFN-I (IFN α, β), TNFα 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유효량의 하나 이상의 사이토카인으로 충분한 기간 동안 노출된 일차적 또는 처리된 MSC이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 구 "충분한 기간"은 원하는 능력을 나타내기 위해 MSC에 처리에 필요한 시간을 포함한다. 이와 같은 기간 범위는 적어도 1시간 내지 약 4주, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72 시간 등을 포함한다. 또다른 구현예에서, 세포 집단은 복제된 또는 비-복제된 중간엽 줄기세포, 분화된 세포 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있고, 여기에서 상기 세포의 집단의 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 90%는 복제된 MSC로 만들어진다.
또다른 구현예에서, 상기 단리된 MSC의 집단은 개별적으로 또는 단리된 IFNγ 및/또는 다른 사이토카인들과 혼합하여 투여된다. 적어도 하나의 또다른 구현예에서 이를 필요로 하는 환자는 자가면역질환, 알러지, 패혈증, 간경변, 암, 바이러스성 감염 및 장기이식을 겪는 환자일 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 면역억제를 유도하는 방법은 특이적 공정 (i) 골수와 같은 세포원으로부터 다분화능 세포를 얻는 단계; (ii) 분화된 및 다분화성 줄기세포를 포함하는 이러한 세포들을 적절한 배지에서 배양하는 단계; (ⅲ) 상기 배지에서 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; (ⅳ) IFNγ 및 IL-1 α, IL-1 β, IL-17A, 및 TNF α 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인으로 충분한 시간동안 노출시킴으로써 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 활성화시키는 단계에 의해 얻어지는 처리된 중간엽 줄기세포의 집단을 이용한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 중간엽 줄기세포를 활성화시키는데 사용되는 배지는 임의의 다른 사이토카인 원이 없는 것이다.
바람직한 구현예에서, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법은 처리된 중간엽 세포의 유효량을 국소적으로 치료를 위한 상태를 갖는 병을 갖는 부위에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태는 상기 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단에서 NO 합성효소(iNOS), 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제(IDO) 의 발현 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명의 양태에 있어서, 치료 부위에서 NO, IDO 대사 농도의 증가는 임상적인 결과를 개선시킨다.
본 발명의 또다른 양태에서, MSC 집단은 성공적으로 기능적 IFNα를 분비하도록 변환된다. 적어도 하나의 구현예에서, 종양 성장의 조절 및 암 치료를 위해 MSC 분비 IFNα를 이용하는 방법이 기술된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 처리된 줄기세포의 집단은 임상적 셋팅에서 사용하기 위한 치료 키트로 기술된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 치료 키트는 추가적으로 예컨대 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, IFN-I, TGFβ, FGF, TNF α 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료적 키트는 이와 같은 개별적인 면역 반응을 유발하기 위한 적절한 지시서와 함께 면역억제 또는 면역-증진을 위해 사용되도록 조립될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 키트는 처리된 MSC, IFNγ 및 하나이상의 다른 이차적 사이토카인을 필수적인 구성으로 할 수 있으나, 처리된 MSC의 양상을 실질적으로 바꿀 수 있는 임의의 다른 활성 유효성분은 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 상기 면역억제용 치료 키트는 처리된 줄기세포, IFNγ 및 적어도 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IL-1 α, IL-1β, IL-17A, TNFα, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 면역 증진용 치료 키트는 처리된 복제된 줄기세포의 집단, IFNγ 및 적어도 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IL-1α, IL-1β, IFN-I, TGF, TNFα, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 사이토카인은 단리된 형태이다. 또다른 구현예에서, 상기 키트 사용을 위한 지시서는 원하는 임상적 결과를 유발하기 위한 단계를 나누어 설명한다.
또다른 구현예에서, 환자, 예를 들면 암 또는 바이러스성 감염을 겪고 있는 이를 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 촉진하기 위한 방법이 기술된다. 이러한 구현예에서, 환자에 유도가능한 일산화질소 합성효소 억제제, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 억제제, 유도가능한 일산화질소 합성효소(iNOS)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 (IDO)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 유효량의 조성물이 투여된다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 일산화질소(NO), 인돌아민 2,3 다이옥시게나아제 (IDO), 또는 프로스타글라딘 E2 (PGE2), 1-MT, 1400W, L-NMMA 또는 다른 적절한 제제의 생산 억제를 유발한다. 이러한 구현예에서, 상기 언급된 iNOS 또는 IDO의 억제제들은 개별적으로 또는 혼합하여 투여된다. 본 발명의 양태에 있어서, 상기 환자의 상태는 본원에서 기술된 처리된 또는 일차적인 MSC 를 포함하는 면역 치료법 또는 인터페론, 항체, 세포 치료법 또는 다른 면역 반응을 조절하는 치료법을 이용한 치료법을 포함할 수 있는 다른 면역 치료법 처방을 포함하는 처방법을 받은 후일 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 인간 또는 마우스 MSC를 포함하는 포유동물의 MSC에서, 마우스 iNSO 프로모터 조절 하에서 인간 IDO 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열로 구성된 IDO 단백질로 인간 IDO-발현 마우스 iNOS-결핍 세포를 구축 하고 이에 따라 MSC 면역 억제 기능을 개선함으로써 IDO 활성을 억제 또는 증가시키기 위한 시약 또는 약물에 의해 스크리닝하기 위한 방법을 기술한다. 본 발명의 이러한 양태는 마우스 iNOS 프로모터에 의해 조절된 인간 IDO 발현을 갖는 마우스 모델에서의 IDO 활성을 증진 또는 억제하기 위한 시약 또는 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 기술하며, 그 결과 상기 투여가 IDO 활성을 조절하고 이에 따라 암 또는 감염에서 IDO의 비정상적인 발현과 관련된 질병을 특히 면역 치료법과의 조합으로치료하기 위한 방법을 기술한다.
상기 인간 중간엽 줄기세포는 많은 세포 원, 예를 들면 태반 파생물 유래, 또는 골수 유래, 또는 대퇴골두 해면 골부분의 골편(plug)를 포함하는 많은 다른 기원, 엉덩이 또는 무릎 관절 교체 수술 동안 퇴행성 관절염을 갖는 환자로부터 및 정상 수여자 및 미래의 골수 이식을 위하여 골수를 수확하는 종양 환자로부터 얻어지는 것으로부터 유래된 것일 수 있다. 비록 수확된 골수가 일반적으로 많은 수확된 골수 원 (즉, 골세편(bone chips), 말초혈액 등)에 의존적인 다른 기계적인 단리 공정에 의해서 분리된 세포 배양에 대하여 준비되나, 단리 공정에 필수적인 단계는 분화없는 중간엽 줄기세포 성장뿐만 아니라 배양 접시의 플라스틱 또는 유리 표면 영역에 오직 중간엽 줄기세포의 직접적인 부착을 허용하도록 하는 제제를 포함하는 특별히 제조된 배지의 사용이다.
선택적인 부착 및 오랜 시간 동안 골수시료내에 존재하는 원하는 중간엽 줄기세포의 생존을 위한 배지를 생산함으로써, 골수에 존재하는 다른 세포 (즉, 적혈구 및 백혈구, 섬유아세포, 달느 분화된 중간엽 세포 등)으로부터 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있도록 한다. 인간 MSC의 다른 공급원은 탯줄, 지방 조직 및 치주를 포함한다. MSC는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포를 포함하는 중간엽 세포 계대의 다양한 세포 형태를 위한 다분화능 전구세포이다. 중간엽 줄기세포는 예컨대 골수, 혈액(말초 혈액을 포함), 골막, 및 진피 및 중배엽 기원을 갖는 다른 조직과 같은 조직 유래로부터 단리되고 정제된 것일 수 있다. 이와 관련하여, 비록 이들 전구 세포들이 일반적으로 골수에 존재하더라도, 예를 들면, 시간에 따라 양이 다르며 이들의 양을 현저히 나이에 따라 감소(즉, 상대적으로 어린 환자에서 약 1/10,000세포에서 나이든 환자에서 겨우 1/2,000,000 정도로 낮음)하고, 인간 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 단리되고 그들의 선택적인 부착, 기질에 대한 "부착능" 에 의해서 특이적 배지에서 배양된 경우에 정제될 수 있다.
중간엽 줄기세포는 특정 마커의 발현 및 결핍에 따라 일반적으로 동정된다. 예를 들면, MSC는 CD34-, CD11b, CD11c-, CD45-, MHC class II, CD44+, Sca-1+, 및 MHC class I이 낮다. 게다가 MSC는 다양한 중간엽 세포 형태로 분화할 수 있는 그들의 능력에 의해 동정될 수 있다. In vitro 실험은 배양 조건, 첨가물, 성장 인자 및 사이토카인이 MSC가 선택된 중간엽 세포로 발달할 수 있도록 확실하게 유도할 수 있음을 나타낸다. 예를 들면, 덱사메타손과 이소부틸메틸잔틴(isobutilmethylxanthine) 또는 인슐린 또는 이소부틸메틸잔틴, 인슐린 및 인도메타신의 혼합물의 조합은 MSC가 지방세포로 분화되는 것을 촉진한다는 것을 보여주었다. 유사하게 MSC는 5-아자시티딘(azacytidine)으로 자극되었을때 뼈근육세포로 분화될 수 있다. 13-VGF 는 중간엽 줄기세포를 심장 근육세포로 분화되도록 유도할 수 있음을 보여주었다.
본 발명은 임의의 특정 방법에 의해 얻어지는 MSC의 사용으로 제한되지 않으며, MSC는 골수 및 제대혈로부터 단리, 정제 및 당 분야에 허용가능한 임의의 방법에 의하여 증식 배양될 수 있다. 골수의 골편(Plugs) 또는 천자액(aspirates) (적혈구 및 백혈구가 우세하게 구성된, 그리고 중간엽 줄기세포의 양이 시간에 따라 다양한) 들은 조직에서 하나의 단일 세포로 분리시키기 위한 시린지를 통과한다. 바람직한 구현예에서 다분화능 전구 세포의 집단을 적절한 공급원, 예컨대 골수, 제대혈 또는 지방 조직으로부터 얻고 추가적으로 배양하고 이를 일반적으로 글루타민을 포함하는 적절한 배지에서 증식시킨다. 그 뒤 중간엽 줄기세포를 다른 분화된 세포로부터 동정하고 추가적으로 IFNγ 및 IL-1 α, IL-1 β, IL-17A, IFN-I, TGF, FGF, TNF α, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 배지에서 증식시켰다. 또다른 구현예에서, 상기 복제성 중간엽 줄기세포는 분화된 세포들로부터 동정, 및 분리되고 추가적으로 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, IFN-I, TGF, FGF, TNFα, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 배지에서 증식시켰다. 이들 케이스에서, 이러한 배지에서 증식된 상기 중간엽 줄기세포는 특정 임상적 셋팅에서 면역 반응을 억제 또는 강화하기 위해 처리되고 프로그램화된다
하나의 구현예에서, 상기 다분화능 전구 세포는 예컨대 완전 배지 (예를 들어, 10% 소태아혈청을 갖는 MEM 배지)와 같은 적절한 배지 및 가습화된 분위기, 바람직하게는 낮은 산소에서 배양된다. 상기 배지는 세포가 배양 접시에 부착할 수 있도록 하기 위해서 하루 이상 교체하지 않는다. 그 후 상기 배지를 매 3-4일 마다 교체하였다. 세포가 컨플루언스까지 성장하였을 때, 상기 세포를 배양 접시로부터, 바람직하게는 트립신을 이용하여 분리한다. 세포는 무혈청 배지에서 트립신의 제거 또는 불활성화 이후 서브배양될 수 있다. 중간엽 줄기세포를 단리 및 배양하기 위한 추가적인 방법이 미국 특허 출원 Nos. 20070160583 및 20070128722 에서 제공되며 그들 전체로 본원에 통합된다. MSC는 또한 유사한 방법을 이용하여 제대혈의 왓튼 젤리(Wharton's jelly)로부터 단리될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 본 발명의 단리된 중간엽 줄기세포는 특정 분화된 세포를 포함하는 이종 세포 집단의 아집단일 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 단리된 중간엽 줄기세포는 오직 처리된 복제성 MSC만을 함유하는 이종원성 조성물이다. 또다른 구현예에서 상기 MSC는 MSC에서 풍부화된 혼합된 세포 집단일 수 있다. 이와 관련하여, MSC의 단리된 집단은 약 75% 이상의 MSC 또는 약 83%, 84%, 88%, 89%, 90%, 91%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 복제된 MSC로 구성되고, 나머지는 분화된 세포, 전구 세포, 혈구 세포, 또는 임상적 결과를 증진시키는 임의의 다른 적절한 세포를 포함할 수 있다.
유효량은 MSC 및 사이토카인의 양으로, 개체에서 면역 반응을 약화시킴으로써(즉, T 세포 반응의 억제) 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후를 억제하기에 충분한 걸을 말한다.
본 발명에 따라 사용되는 중간엽 줄기세포는 선호도 순으로 자가, 동종 또는 이종이며, 상기 선택은 치료에 필요한 상황에 매우 의존적일 수 있다.
본 발명의 사이토카인은 통상적인 정제 방법, 재조합 기술 또는 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 인터페론-감마(IFNγ)의 아미노산 서열은 GENBANK Accession Nos. NP 000610 (인간) 및 NP 032363 (마우스)에 의해서 제공된다. IFN 단백질의 상업적 공급원은 예를 들어, INTERMUNE (Brisbane, Calif.) 및 PeproTech, Inc. (Rocky Hill, N.J.)을 포함한다. 이와 유사하게, 종양괴사성 인자-알파(TNFα, 카캐신(cachexin) 또는 카켁틴(cachectin))은 GENBANK Accession Nos. NP 000585 (인간) 및 NP 038721 (마우스)로 제공되고 상업적으로 이용가능한 공급원 예컨대 ProSpec Bio (rehovot, Israel) 및 PeproTech, Inc.으로부터 이용가능하다. 유사하게, 인간 인터루킨 1-알파 (IL-1α) 및 인터루킨 1-베타(IL-1β)는 각각 Accession Nos. P01583 및 P01584으로 알려져 있으며, ProSpec Bio and PeproTech, Inc와 같은 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 인터루킨 17A (IL17A) 은 Accession Nos. BC067505 (인간) 및 NM 010552 (마우스) 로 알려져 있다. 본 발명의 따라 사용될 때, 상기 사이토카인은 "단리된" 것이고, 즉 동종 (100%) 또는 거의 동종 (90 내지 99%) 이다. 특정 구현예에서, 상기 사이토카인은 재조합 단백질이다.
인터루킨 17A는 중요 염증성 사이토카인 중 하나이고, 염증성 및 자가면역 반응에서 전염증성 기능하는 것으로 잘 알려진 사이토카인인 CD4+ T 세포(Th17) 를 생산하는 IL-17에 의해 일차적으로 생산된다. IL-17A 는 이형결합 수용체 복합체, IL-17RA 및 IL-17RC를 통해 신호를 전달한다. IL-17A 가 결합하면, IL17RA는 IL-17A-유도된 신호전달 과정의 필수적인 하위 매개체인, Act1 을 이끈다. 비록 IL-17A-유도된 신호전달 경로 및 염증성 및 자가면역질환에서의 IL-17A의 역할에 대해서 잘 알려져 있으나, 이 것의 세포성 타깃과 작용 양식(mode of action)은 여전히 불명확하다.
본 발명은 IL-17A 을 단독으로 또는 다른 사이토카인과 조합하여 면역 억제를 유발하는 처리된 MSC를 촉진하는데 이용한다. 상기-언급된 MSC 및 사이토카인은 조성물, 예를 들면 동일한 치료를 필요로 하는 개체에 투여하기에 적합한 약학적 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구(예를 들어, 피하 또는 근육내) 또는 정맥 주사, 정맥 투여, 특이적 장기 중재(organ intervention) 또는 국소적용을 포함하는 통상적인 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 상기 치료법은 일정 기간 동안 단일 투여 또는 복수 투여로 구성될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함한다. 상기 담체는 MSC 및 사이토카인과 공존할 수 있어야 하고 소위 "허용가능" 해야하며, 이들의 수용자에 대하여 유해하지 않아야 한다. 전형적으로, 상기 담체는 적절한 등장성 용약이며 예컨대 인산완충식염수, 배양 배지, 예컨대 DMEM, 알부민을 포함하거나 포함하지 않는 생리식염수, 5% 수용 덱스트로오스, 및/또는 이들의 혼합물, 및 이들이 속하는 분야에 알려진 적절한 다른 액상일 수 있다.
치료적으로 사용하기 위한 바람직한 구현예에서, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 키트로 또한 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 약학적으로 허용가능한 담체; 단리된 IFNγ, 단리된 IL-1α; 및 단리된 IL17A로 자극되거나 처리된 단리된 중간엽 줄기세포의 집단 및 추가적으로 면역 반응을 약화시키기 위한 방법에서 키트를 사용하기 위한 지시서만을 포함할 수 있다. 본 발명의 양태에 있어서, 상기 키트의 사이토카인 구성요소로 자극된 세포들이 투여될 수 있다.
상기 키트는 또한 선택적으로 세포 투여의 수단, 예를 들면 주입을 위한 것을 포함할 수 있다. 선택적 구현예에서, 본 발명의 상기 조성물은 비경구 투여를 위한 적절하도록
하나 또는 그 이상의 약학적으로-허용가능한 멸균 등장 수용 또는 비수용 요액, 현탁액과 항산화제(들)의 조합 또는 사용하기 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성시킬 수 있는 멸균 동결건조 분말과 항산화제, 미네랄 및 비타민, 완충액, 최종 등장 제형이 되게 하는 용질의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 단리되고 복제된 MSC의 집단, 단리된 IFNγ, 단리된 IL-1α 또는 β, 및 단리된 IL-17A와 약학적으로 허용가능한 담체의 혼합물을 포함하는 조성물을 더 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 단리된 MSCs 집단, 단리된 IFNγ, 단리된 TNFα, 및 단리된 IL-17A 와 약학적으로 허용가능한 담체의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 또한 단리된 IL-1α 또는 β 를 포함한다. 이러한 키트의 사용 방법은 유효량의 MSC, 단리된 IFNγ, 단리된 IL-1α, TNFα, 및 단리된 IL-17A를 이들을 필요로 하는 개체에 투여하고 그 결과 개체에서 면역 반응을 약화시키는 단계에 따른 면역 반응 약화를 위해 제공된다.
본 발명은 유효량의 단리된 중간엽 줄기세포, 단리된 IFNγ, 단리된 IL-1α, 및 단리된 IL-17A 를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하고 이에 따라 개체의 면역 반응을 약화시키는 것을 포함하는 면역 반응 약화를 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 추가적으로 단리된 TNF-α를 포함한다.
또다른 구현예에서, 상기 치료법은 다발성 경화증, 관절염, 루푸스, 패혈증, 간염, 간병변, 파킨슨병, 만성 감염 및 이식편대숙주병에 대한 것이다. 또다른 구현예에서, 상기 MSC는 약학적 조성물로 제공되며, 상기 MSC는 투여 전 사이토카인 혼합물 (cocktail)과 함께 제형화된다. 또다른 구현예에서, 상기 MSC 및 사이토카인은 개별적 구성요소로 투여된다. 치료를 필요로 하는 개체는 면역반응 부작용과 관련된 특정 질병 또는 장애를 갖는 포유류 (예컨대, 인간, 원숭이, 고양이, 개, 말 등)일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 개체는 인간이다.
효과는 또한 iNOS, IDO 및/또는 케모카인 발현을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 면역 반응 부작용의 약화에 의해서 이익을 받는 개체는 자가면역질환 (예컨대, 류마티스성 관절염, 1형 진성당뇨병, 전신성 홍반 루푸스, 피부경화증, GvHD, 간경변, 건선), 알러지 (예컨대 고초열), 또는 패혈증을 갖거나 가질 위험이 있는 개체를 포함한다. 게다가, 염증은 증식, 생존 및 이동에 관여하는 종양 주위의 미세환경을 조정하기 때문에, 특정 암 환자 역시 본 발명의 조성물의 이익을 받을 수 있다.
조직 이식 및 골수 이식에 있어서, 수여자 기원의 T 세포는 수용체의 MHC 를 인식하고 GvHD의 발달을 유도할 수 있다. 이러한 빈번한 치명적인 질병은 다양한 면역억제성 치료법에 대하여 흔히 반응하지 않으나, 새로운 표적 면역 조절 분자 접근법은 GvHD를 치료하는데 큰 가능성을 보여준다. 가장 최근에는, 전-임상 및 임상 시험에서 MSC가 GvHD의 치료에 있어서 매우 효과적이라는 것이 확인되었다. 본원에서 개시하는 분석은 MSC 활성이 전-염증성 사이토카인에 의한 자극 이후의 NO 또는 IDO의 생산을 통해 매개된다는 것을 더 입증한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 GvHD의 치료 또는 조직 이식에 있어서의 효용을 확인한다.
in vivo 에서의 적절한 투여량의 결정은 당 분야에서-수용된 동물 모델, 예컨대 본원에서 기술된 DTH 및 GvHD 모델을 이용하여 수행할 수 있다. 그러나, 본 발명은 외과의사 또는 수의사의 진료 하에서의 치료법 치료를 포함하는 것에 따라, 치료 과정 동안의 치료 시기 양에 대한 조절이 치료법의 효과 평가에 기초하여 이루어질 수 있고, 이 것은 개체간에 다양할 수 있다.
본 발명은 또한 면역 치료법 처리 및 유효량의 NOS 및/또는 IDO 억제제를 수용 개체에 투여함으로써 암 면역 치료의 효율을 증진시키기 위한 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 억제제는 IDO 및 iNOS-선택적 억제제, 예컨대, 본원에서 기술된 것과 같은 것일 수 있다. 이들 억제제의 유효량은 억제제를 받지 않는 개체와 비교하여 면역 치료법의 투여에 의해 NO 생산 및/또는 IDO 활성의 양이 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상 감소하는 것을 제공하는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 IDO 및/또는 iNOS-선택적 억제제를 사용하여 인터페론 치료 (예컨대, IFNγ)의 치료적 효과의 증진을 제공한다.
본 발명은 환자에 투여하기 전 염증성 사이토카인으로 MSC를 변형시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임상적 셋팅에 있어서 MSC의 효과를 현저하게 증진시킨다. 적어도 일 양태에 있어서 IFNγ 및 필요성분으로 다른 사이토카인, TNFα, IL-1α 또는 IL-1β의 공동-존재를 갖는 MSC의 면역 억제 효과에서의 iNOS 및 케모카인의 필수적인 역할이 개시된다. 또다른 양태에 있어서, MSC는 염증성 사이토카인 IFNγ 및 TNFα가 충분한 면역억제를 유도하기 부적절할 때 면역 반응을 촉진하도록 전환되는 것으로 나타났다.
적어도 하나의 구현예에서, MSC 와 염증성 사이토카인 사이의 상호작용의 역학을 변화시키기 위한 상기 IL-17A의 역할이 개시된다. 본 발명자들은 심지어 염증성 사이토카인 IFNγ 및 TNFα가 낮은 투여량으로 존재하여도 IL-17A가 MSC의 면역억제성 기능을 강화시킨다는 것을 발견하였다. 면역 반응을 촉진하는 전통적인 역할과 달리, 본원에서 나타낸 바에 따르면, IL-17A는 MSC의 존재하에서 면역 억제에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 특정 상황에서, IL-17A의 활성 차단은 면역 반응을 유도하거나 증진시킬 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, IL-17A의 병리생리학적인 역할이 개시된다.
IL-17A는 염증 및 자가면역 촉진에 있어서 필수적이다. 당 분야의 통상의 기술자들은 최초로 MSC 내 면역억제 증진에서의 IL-17A의 역할이 입증되었음을 이해할 수 있다. 이전에는, IL-17A가 IL-17A 수준이 현저하게 증가되어 있는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 및 염증성 장 질환(IBD)을 포함하는 복수의 자가면역 질환에서의 질병의 진행을 가속화시키는 것으로 널리 보고되어 왔다. 게다가 질병의 진행은 IL-17A가 유전적으로 제거되거나 IL-17A 차단 항체가 투여되었을 때 저지되었다.
그러나, IL-17A는 언제나 면역 반응을 촉진시키는 것이 아니며, 과거 보고는 IL-17A가 장의 염증성 장애에 있어서 보호 기능을 갖는다는 것을 암시한 바 있다. IL-17A의 유전적 제거 또는 중화는 실제로 덱스트란-설페이트-소듐(dextran-sulphate-sodium; DSS) 유도된 대장염 모델에서 질병 진행을 실제로 악화시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 당 분야의 통상의 기술자들은 본 발명의 적어도 하나의 양태가 IL-17A가 MSC의 면역억제 능력을 증진시킨다는 것을 제공한다는 것을 이해할 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, MSC는 IL-17A 없이는 효과적으로 면역 반응을 억제할 수 없을 수 있다는 것이 고려된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명자들은 신규한 세포 표적, 중간엽 줄기세포를 통한 면역 억제 증진에 있어서 IL-17A의 새로운 기능을 입증하였다. 유사하게 IL-17A는 mRNA 붕괴 인자 AUF1에 의한 유전자 발현의 억제를 역전함으로써 이들의 효과를 나타낸다는 것이 확인되었다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예에서, 마우스에서 간 손상을 유도하는 콘카나발린 A(Concanavalin A)("ConA")가 자가면역 또는 T 세포 반응이 간 손상 매개에 있어서 중추적인 역할을 하는 바이러스성 전격성 간염(fulminant hepatitis)의 병리생리적 진행 연구를 위해 이용된다. T 세포 반응 억제가 ConA 유도된 간 손상을 현저하게 약화시키고 지방 조직 유래된 기질 세포가 ConA 유도된 간 손상을 감소시킨다는 것이 확인됨에 따라; 본 발명자들은 골수 유래된 MSC를 사용하였고, 간 손상의 MSC-매개된 치료법의 조절에 있어서 IL-17A의 역할을 연구하였다. 그러므로 본 발명의 적어도 하나의 양태는 IL-17A가 MSC의 면역억제 효과를 현저하게 증진시킬 수 있다는 것을 제공한다.
본 발명은 MSC의 면역억제 능력은 염증성 사이토카인에 의한 자극을 요구하기 때문에, MSC가 ConA-유도된 간 손상의 진행에 대해 미미한 영향만을 가질 수 있다는 것을 더 제공한다. 비록 많은 사이토카인들이 in vivo에서의 ConA 투여 이후에 생산될 수 있으나, 이러한 사이토카인들은 짧은 기간 동안만 높은 수준으로 남아있으로 투여 이후의 시간에서 MSC를 효과적으로 자극할 수 없다. 그러므로, 나이브 MSC는 ConA 유도된 간 손상 약화에 있어서 효과적이지 않다.
따라서, 본 발명의 적어도 하나의 양태는 신규한 세포 표적, 중간엽 줄기세포를 통한 면역억제 증진에 있어서의 새롭고 신규한 IL-17A의 기능을 제공한다. IL-17A는 mRNA 붕괴 인자 AUF1에 의한 유전자 발현의 억제를 역전함으로써 이들의 효과를 나타낼 수 있다는 것이 추가적으로 확인되었다. 본원에서 기술된 바와 같이, IL-17A는 MSC-매개된 면역억제를 증진시키기 위한 인자이다.
특정 상황에서, 본 발명자들은 양성적 또는 음성적으로, in vitro 및 in vivo에서의 이러한 면역억제 효과를 조절하기 위한 필요성을 확인하였다. 하나의 구현예에서 본 발명자들은 이용가능한 성장 인자 및 사이토카인을 스크리닝하였고 이들 사이에, 강하게 MSC-매개된 면역억제를 하향-조절하는 두개의 인자: I 형 인터페론 및 섬유아세포 성장인자(FGF-2)를 확인하였다.
I 형 인터페론 (IFNs) 들은 바이러스 및 다른 세포내 감염을 제거하기 위한 숙주 면역성을 부여하는 사이토카인 패밀리이고, 반면 FGF-2 (FGF-β, 염기성 섬유아세포 성장인자)는 성장, 항세포자멸사, 및 분화 활성을 갖는 헤파린-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 패밀리에 속한다. 그러나, 어떤 연구도 이들 두개 사이토카인의 면역억제 조절과 관련된 바 없다. I 형 인터페론 및 섬유아세포 성장인자 (FGF-2)는 iNOS 발현의 하향-조절을 통하여 MSC-매개된 면역억제의 음성적 조절자로서 역할을 한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 이들 두개의 인자들이 T-세포 증식에 대한 MSC의 면역억제 효과를 잠재적으로 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 16). 추가적인 분석은 이들 사이토카인의 하나의 보충이 iNOS 단백질의 발현 및 NO 생산을 현저하게 감소시킬 수 있음을 나타내었다 (도 17).
본 발명의 추가적인 기술을 위하여 이하 비-제한적인 실시예들이 제공된다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
마우스. 수컷 C57BL6, C3H/HeJCr 및 F1(C57BL/6xC3H) 마우스, 6-8 주령들을 국립암센터(Frederick, Md) 로부터 얻었다. IFNγ-R1-/- 마우스 및 iNOS-/- 마우스들은 Jackson Laboratory(Bar Harbor, Me) 로부터 얻었다. 마우스들은 Robert Wood Johnson Medical School Vivarium에서 유지시켰다. 동물들을 각 실험에서 나이 및 성별에 관해 매치시키고, Institutional Animal Care and Use Committee 에 의해서 모두 승인받았다.
시약. 재조합 마우스 IFNγ 및 마우스 TNFα, IL-1α, IL-1β에 대한 TNFα, IL-1α, 및 IL-1β 단일 클론 항체, 및 CCR5, FITC-접합된 항-마우스 CD11b, 및 PE-접합된 항-마우스 F4/80들은 eBiosciences (La Jolla, Calif.)로부터 얻었다. 재조합 마우스 M-CSF 및 IL-10 및 TGF-β에 대한 항체들은 R&D Systems (Minneapolis, Minn.)으로부터 얻었다. 항-IFNγ는 Harlan (Indianapolis, Ind.)으로부터 얻었다. 항-CXCR3는 Invitrogen (Carlsbad, Calif.)으로부터 얻었다. 인도메타신(Indomethacin), 1-메틸-DL-트립토판 (1-methyl-DL-tryptophan, 1-MT), 및 N G-모노메틸-L-아르기닌 (N G-monomethyl-L-arginine, L-NMMA)들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)로부터 얻었다.
세포. MSC는 6-10주령의 마우스의 정강뼈 및 대퇴골의 골수로부터 생성하였다. 세포들을 10% FBS, 2mM 글루타민, 100U/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신(모두 인비트로젠)이 보충된 αMEM 배지에서 배양하였다. 비-부착 세포들을 24시간 후에 제거하고, 부착된 세포들은 3일마다 배지 보충물과 함께 유지시켰다. 복제 MSC들을 얻기 위하여, 컨플루언스(confluence)에서 세포들을 수확하고 제한 희석에 의하여 96-웰 플레이트로 분주하였다. 개별적 복제물들을 그 후 수집하고 확장시켰다. 세포들은 5번째 내지 20번째 계대의 것을 이용하였다.
T 세포 아세포(T cell blast)는 CD4-/- T 세포 서브세트 동정 키트(R&D Systems)를 이용한 음성 선택에 의해서 정제된 CD4+ T 세포로부터 생성하였다. 세포들(1x10 6 cells/ml) 은 플라스틱-부착 항-CD3 및 가용성 항-CD28에 의해서 48시간 동안 활성화되었으며, 그 후 오직 IL-2(200U/ml)과 함께 48시간 동안 배양하였다. 모든 T-세포 배양은 10% 가열-불활성화된 FBS, 2mM 글루타민, 100U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 및 50mMβ-ME가 보충된 RPMI-1640 배지(완전 배지)에서 유지하였다.
활성화된 지라세포(splenocyte) 상청액을 플라스틱-결합 항-CD3에 의해서 활성화된 지라세포(2x106/ml) 의 48시간-배양물로부터 수확하고, 그 후 0.1㎛ 필터로 여과하고 동결하였다.
사이토카인, 케모카인 및 NO의 검출. 배양 상청액들을 루미넥스 테크놀로지(Bio-Plex System, Bio-Rad, Hercules, Calif.)를 이용한 멀티플렉스 비드 어레이 키트(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)로 20개의 다른 사이토카인 및 케모카인에 대하여 분석하였다. IFNγ는 ELISA(BD Biosciences, San Jose, Calif.)로 분석하였다. NO는 변형된 그리즈 시약(modified Griess reagent)(Sigma-Aldrich)를 이용하여 검출하였다. 간단하게, 모든 NO3는 질산 환원 효소에 의하여 NO2로 전환되었으며, 총 NO2는 그리즈 반응에 의해 검출하였다(Miranda, 외. (2001) Nitric Oxide 5:62-71).
실시간 PCR. RNA는 세포 펠렛으로부터 RNEASY Mini Kit를 이용하여 단리하였다. 첫째 가닥 cDNA 합성은 랜덤 핵사머 프라이머를 갖는 SENSISCRIPT RT 키트를 이용하여 수행하였다(모든 키트는 Qiagen, Valencia, Calif). 관심 유전자의 mRNA는 SYBR 그린 마스터 믹스(Green Master Mix)(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)를 이용한 실시간 PCR(Stratagene 유래 MX-4000, La Jolla, Calif.)에 의하여 정량화하였다. mRNA의 총량은 내생적 .베타.-엑틴 mRNA에 대하여 표준화하였다. iNOS에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다: 정방향, 5'-CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3' (서열번호 1); 역방향, 5'-CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG-3' (서열번호 2). 다른 프라이머들은 RT2 PROFILER.TM. PCR 어레이 마우스 케모카인 & 리셉터 키트(Superarray, Frederick, Md.)로부터 얻었다.
주화성 분석. 주화성을 기술된 바와 같이(Shi, 외. (1993) J. Immunol. Meth. 164:149-154), NeuroProbe CHEMOTX Chemotaxis System (NeuroProbe, Gaithersburg, Md.)으로 시험하였다. 96-웰 플레이트의 하부 챔버를 IFNγ 및 TNFα(각각 20ng/ml 또는 Sup.CD3-act (1:2 희석) 으로 자극된 MSC 유래 상청액으로 채웠다. 5㎛의 구멍을 갖는 폴리비닐피롤리딘이 없는 폴리카르보네이트 막(polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate membrane)을 그 뒤에 겹쳐주었다. T-세포 아세포(1.25x105)를 상부 챔버에 첨가하였다. 3시간 배양 후, 구멍을 통해서 하부 웰로 이동한 세포들은 MTT 분석을 이용하여 정량화 하였다(Shi, 외. (1993) supra). 주화성 지수는 MSC에 대한 반응으로 이동된 T-세포 아세포의 수와 배지 단독에 대한 이동 수를 비교한 비율로 계산하였다.
염증성 사이토카인-활성화된 MSC를 향한 T 세포 이동의 결과인 면역억제를 유사한 셋-업(set-up) 에서 시험하였다. MSC (2x104)를 IFNγ 및 TNFα(각각 20ng/ml)로 24시간 자극하거나 자극하지 않고 하부 챔버에 첨가하였다. 활성화된 T 세포 아세포들을 그 후 상부 챔버에 상기와 같이 첨가하였다. IL-2를 모든 챔버에 첨가하였다. 3시간 후, 모든 챔버에 3H-티미딘으로 펄스를 가해주고, 6시간 후 세포증식을 평가하였다.
MSC에 의한 GvHD 유도 및 변형. 8주령 C57BL/6 x C3H F1 마우스에 치명적인 방사선을 조사하고 (13Gy) 24시간 이후 꼬리 정맥 주사로 C57BL/6 부모 마우스로부터 단리된 핵화된 골수 세포(nucleated bone marrow cell)(5x106) 및 지라세포(5 x106)를 넣어주었다. 3일 및 7일째 이후 골수를 이식하고, 수용체에 C57BL/6 야생형,IFNγR1-/-, 또는 iNOS-/- 마우스 유래 0.5x106 MSC를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 일부 야생형 MSC 군에는 또한 iNOS 억제제, NG-모노메틸 L-아르기닌 (N-NMMA, 500㎍/마우스), 항-IFNγ(400㎍/마우스), 또는 TNFα, IL-1α 및 IL-1β (각각 200㎍/마우스)에 대한 세개의 항체 혼합물을 첫번째 MSC 투여 직후 초반 7일 동안 매일 i.p 로 투여하였다. 음성 대조군으로써, F1 마우스에는 F1 골수 세포를 주입하였다. 마우스의 GvHD 사인 (소모성, 곱슬머리(ruffled hair) 및 곱사등)에 대해서 매일 관찰하였으며, 빈사 직전에 안락사시키고, 생존시간을 표시하였다. 14일 째에, 다양한 조직들을 수집하고 5μm 파라핀 섹션을 준비하였으며 헤마톡실린/에오신 (H&E)으로 염색하였다.
DTH 반응 유도 및 조직학적 분석. C57BL/6 마우스 (6-8 주령) 을 50㎕ 완전 프로인트 어쥬번트에 유화된 오발부빈(OVA, 50μl 식염수 내 10μg)의 꼬리 기반 주입에 의하여 면역화시켰다. DTH를 오른뒷다리 발바닥에 30μl 식염수 내 총 200μ/g OVA 주입을 하여 도전(challenging)하는 것에 의하여 시험하였다. 왼쪽 발바닥에는 음성 대조군으로 30μl의 식염수를 주입하였다. 24시간 후, 항원-유도된 발바닥 두께 증가를 칼리퍼를 이용하여 측정하고 하기와 같이 계산하였다: (Rimm-Limm)-(R.unimm-L.unimm), 여기서 R 및 L은 왼쪽 및 오른쪽 발바닥의 두께이다.
통계적 분석. 유의도는 unpaired two-tailed Student's t-test 또는 ANOVA(analysis of variance)를 통해 평가하였다.
실시예 2
MSC의 면역 억제 기능은 전염증성 사이토카인에 의해 유도된다.
근본적인 매커니즘을 확인하기 위하여, 마우스 MSC 복제(clone)를 이용하였다. 이들 복제 줄기세포 특징은 지방세포 또는 골세포로 분화되려는 이들의 능력 및 이들의 표면 마커의 발현에 의해서 정의된다: CD34; CD11b; CD11c; CD45; MHC class II; CD44+; Sca-1+; MHC class Ilow. 본원에서 나타내는 모든 결과는 3개 이상의 다른 복제 MSC 를 이용하여 반복한 것이다.
MSC 에 의한 면역억제에 대한 대부분의 연구 보고들이 T 세포 증식 및 사이토카인 생산에 미치는 이들의 영향에 기초하고 있기 때문에, IL-2 유도된 T 세포 아세포의 분화에 대하여 MSC의 효과를 일차적으로 시험하였다. 신선한 CD4+ T 세포 아세포들은 항-CD3 로 활성화된 지라세포로부터 생성되었고 그 후 IL-2와 함RP 며칠동안 확장하였다 (Devadas, 외. (2006) Immunity 25:237-247; Radvanyi, 외. (1996) Cell Immunol. 170:260-273). T 세포 아세포들은 1:20 비율(MSC: T 세포) 로 IL-2(200 U/ml) 와 함께 첨가되었다. 세포 증식은 3H-Tdr 도입에 의하여 8시간 후 평가하였다. 놀랍게도, IL-2 유도된 이들 T 세포 아세포의 분화는 MSC 첨가에 의하여 영향을 받지 않는 것이 확인되었다. MSC는 또한 T 하이브리도마 A1. 1 세포의 증식에도 영향을 미치지 않았다. 이들 T 세포 아세포 및 T 하이드리도마 세포들은, 그러나 TCR을 통한 재활성화((Fotedar, 외. (1985) J. Immunol. 135(5):3028-33)에도 불구하고 사이토카인을 생산하지 않았다. 그러므로 T 세포 사이토카인의 부재시, MSC는 T 세포 증식를 억제할 수 없었다.
사이토카인이 MSC의 면역억제 능력을 유도한다는 가능성을 시험하기 위하여, 이들 배양 조건을 항-CD3의 존재 하의 MSC 및 신선한 지라세포의 비율 구배적인 조합에 의해 재생산하였다. 이러한 분석의 결과는 MSC가 1:60 비율(MSC 대 지라세포)과 같이 낮게 첨가되는 경우 T 세포 증식이 완전히 차단된다는 것을 나타내었다. 중요하게도, 이들 면억억제 효과를 발휘하기 위하여, MSC는 상승 효과를 나타내지 않았다. 유사한 영향이 5번째 내지 20번째 계대 사이 유래의 MSC를 이용한 플라스틱-결합된 항-CD3 항체 및 항-CD28에 의하여 활성화된 정제된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 확인되었다. 그러므로 MSC 및 T 세포들이 T 세포 활성화 동안에 공동 배양되는 조건하에서, 결과물 T 세포 반응은 강하게 MSC에 의해서 억제되었으며, 이는 T 세포 유도된 사이토카인이 역할을 가질 것이라는 것을 나타낸다. 다른 마우스 주 유래의 복제 MSC들의 면역억제 능력 또한 시험하였다. 더 나은 분화 능력을 나타내는 이들 복제들은 더 큰 면역 억제 능력을 갖는 것으로 관찰되었다.
활성화된 T 세포에 의해서 분비되는 사이토카인이 MSC에 의한 면역억제 유도에 원인이 되는지 여부를 확인하기 위하여, MSC와 T 세포 아세포가 혼합된 공동-배양 (상기 기술한 바와 같음) 들에 항-CD3 활성화된 지라세포의 배양물 유래 상청액을 보충하였다. 그 결과 T 세포 증식이 매우 저해되었다. 또한 MSC와의 공동-배양에서의 A1.1 세포의 증식이 활성화된 지라세포 상청액의 보충에 의해서 저해되는 것이 관찰되었다. 이들 실험은 일부 활성화된 T 세포의 산물(들)이 MSC에 의한 면역억제 유도에 요구된다는 것을 나타낸다. 이러한 것의 원인이 되는 사이토카인(들)을 확인하기 위하여, 상기 활성화된 지라세포 상청액을 다양한 사이토카인에 대한 중성화 항체들로 공동 배양물 첨가 전에 처리하였다. 이들 분석은 IFNγ의 중성화가 항-CD3 활성화된 지라세포 상청액이 보충된 MSC와 공동-배양된 T세포 아세포의 증식 억제를 완전하게 뒤집는다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 IFNγ가 이러한 과정에서 핵심 사이토카인이라는 것을 암시하며, 특정 조건하에서 이는 매개 면역을 대신할 수 있는 주요 전염증성 사이토카인임을 나타낸다.
그 후 IFNγ의 효과를 활성화된 지라세포 상청액 대신 MSC+T 세포 아세포 또는 MSC+A1.1 세포의 혼합 공동-배양물에 단리된 재조합 IFNγ (20 ng/ml)를 첨가하는 것을 통해 직접적으로 시험하였다. 놀랍게도, IFNγ는 단독으로는 면역억제를 유도하지 못했다. 여러 다른 전염증성 사이토카인을 그 후 첨가(각각 20ng/ml)하고 IFNγ와 함께 TNFα, IL-1α 또는 IL-1β 중 어느 하나의 동시 첨가가 MSC와의 공동-배양에서 T 세포 증식의 억제를 달성하는데 요구된다는 것을 확인하였다(MSC:T 세포 비율 1:20)(도 1). 그러므로 항-CD3-활성화된 지라세포 상청액에 의한 MSC의 면역억제 기능의 유도는 MSC 상에서 TNFα; IL-1α; 또는 IL-1β 중 하나와 협력하는 IFNγ 활성에 기인할 것이다. 그러므로 IFNγ가 전적으로 요구되는 반면, 이들 사이토카인은 단독으로는 효과가 없으나; MSC에서 적절한 면역 억제 신호전달은 IFNγ와 다른 세가지 사이토카인 중 하나의 협력을 요구한다.
TNFα; IL-1α; 또는 IL-1β에 대한 중화항체를 개별적으로 또는 함께 MSC 및 T 세포 아세포의 혼합 공동-배양물에 첨가하기 전의 활성화된 지라세포 상청액에 첨가하였다. 개별적 항체들은 효과가 없는 반면, 3가지 모든 사이토카인들의 동시 차단은 완전하게 T 세포 증식의 억제를 되돌렸다. 다른 사이토카인들, 예컨대 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 IL-6(인터류킨-6)는 효과가 없었다. 이와 같은 본원의 데이터는 IFN 과 다른 세가지 전염증성 사이토카인, TNFα, IL-1α, 또는 IL-1β 중 임의의 것과의 조합이 T 세포 증식을 억제하기 위한 MSC의 능력 유도에 전적으로 관여하며, TNFα, IL-1α, 및 IL-1β는 IFNγ 와 공동 활성화에 상호교환적임을 나타낸다.
MSC가 초기 T 세포 활성화에서 발생하는 특정 수준의 IFNγ와 접촉해야한다는 점이 고려된다. 특히 MSC는 CD69 발현의 정상적인 증가에 의해 나타나는 것과 같이 그들의 항-CD3-유도된 활성이 나타나는 동안인 경우, 초기 T 세포 반응에 영향을 주지 않는 것이 확인되었다. 초기 활성화 이후의 지라세포로부터 방출되는 IFNγ가 MSC에 의해서 유도된 면역억제에 중요하다는 추가 증거로서, IFNγ 수용체 1이 결실된 마우스(IFNγ R1-/-) 유래 MSC가 면역억제를 할 수 없다는 것이 관찰되었다. 이들 IFNγ R1-/- MSC의 여러 복제 세포들이 유도되었고(모두 지방세포 및 골-유사 세포로 분화될 수 있음), 다섯개 복제세포 중에 어느 것도 항-CD3-유도된 지라세포 증식을 억제할 수 없었으며, 이는 IFNγ가 MSC의 면역억제 기능의 유도에서 필수적이라는 이해를 지지하였다.
이러한 결과는 IFNγ 및 MSC 근처의 세포에 의한 다른 사이토카인의 초기 생산이 면역억제 능력 유도에 필수적이라는 것을 나타낸다. 즉, 항-IFNγ(20㎍/ml)는 또한 이러한 설정에서 MSC의 억제 효과를 완전하게 차단하였다. 게다가 비록 TNFα, IL-1α, 및 IL-1β에 대한 항체 (각각 20㎍/ML)는 개별적으로는 효과가 없으나, 세개의 항체가 함께 첨가되는 경우 활성화된 지라세포 상청액을 첨가했을때의 효과와 유사하게 면역억제를 막았다. 그러므로 TNFα, IL-1α, 및 IL-1β와 함께 국소적으로 생산된 IFNγ의 공동 활성은 면역억제를 나타내기위한 MSC를 유도하기에 충분하다.
실시예 3
MSC에의한 면역억제는 일산화질소를 요구한다
사이토카인-노출된 MSC에 의한 면역억제가 영향을 받는 것을 통해 매커니즘을 확인하기 위하여, TRANSWELL 시스템에서 항-CD3-활성화된 지라세포와 MSC의 공동배양물(1:20, MSC:지라세포)을 다양한 환경에서 시험하였다. 두개 챔버의 웰을 투과성의 막(0.4μm 다공성 막) 에 의해 분리한 경우, MSC는 T 세포 증식에 거의 영향을 주지 않았으며, 이는 사이토카인-primed MSC에 의한 T 세포 증식 억제에 세포 막-연관 단백질 또는 다른 국소 활성화 인자(들)이 필수적이라는 것을 보여준다. 최근 보고 (Sato, 외. (2007) supra)가 IDO가 아닌 PGE-2가 요구된다고 보인 것과 달리, PGE-2는 관여하지 않는다는 것을 확인하였다. 사실 인도메타신(indomethacin)(10μM, PGE-2 차단제), 항-IL-10(20μg/ml), 항-TGFβ(20μg/ml) 또는 1-메틸-DL-트립토판(1-MT, 1mM, IDO 억제제)는 MSC에 의한 면역억제에 영향을 주지 못하는 것이 확인되었으며, 이에 따라 이들 인자들을 판단하였다.
높은 농도의 일산화질소(NO)는 T 세포 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이것은 근원지로부터 빠르게 확산되나, 활성형태의 농도는 약 100μm 내로 감소한다. 그러므로 NO는 이것이 생산된 세포의 근접부위에서만 활성을 나타낼 수 있어 MSC에 의한 면역억제 중재 인자의 예상된 특징과 일치한다. NO가 이와 같은 역할을 갖는지 아닌지를 결정하기 위하여, iNOS 활성의 선택적 억제제, N G-모노메틸-L-아르기닌(L-NMMA)를 이용하여 이의 생산을 저해시켰다. MSC와 항-CD3 존재 하의 지라세포가 혼합된 공동-배양물에 L-NMMA를 첨가하였을 때, 완전하게 정상 지라세포 증식을 회복하였다. 다른 iNOS 억제제, 예컨대 1400W 및 L-NAME은 동일한 효과를 나타내었다. 게다가, iNOS 결핍 마우스(iNOS-/-) 유래 MSC는 지라세포의 증식에 거의 효과가 없었다. 또한 iNOS-/- MSC 유래 5개의 복제(모두 지방세포 및 골-유사세포로의 분화능이 있음)는 어느 것도 면역억제성이 아니였다. 이러한 결과는 사이토카인-유도에 반응하여 MSC에 의해서 생산된 NO의 활성이 이들의 T 세포 반응 억제를 매개한다는 것을 나타낸다.
본원에서의 분석은 MSC에 의한 면역억제가 IFNγ 및 전염증성 사이토카인에 의해 유도되고 NO를 통해 매개된다는 것을 나타낸다. 따라서, MSC가 이들 사이토카인에 노출된 후 이들의 iNOS 발현과 NO 생산을 상향 조절할 수 있음이 고려된다. 이를 시험하기 위하여, MSC를 활성화된 지라세포 상청액으로 처리하고 iNOS mRNA 수준을 실시간 PCR로 분석하였으며 β-액틴과 비교하였다. 상기 분석의 결과는 iNOS가 자극 4시간 후 MSC에서 뚜렷하게 상향 조절되고 48시간 이상 동안 높은 수준 발현을 유지한다는 것을 나타내었다. 자극 12시간 후에, iNOS mRNA 수준은 β 액틴 메세지의 7배 이상이였고, 매우 높은 발현을 나타내었다. 유사한 효과가 IFNγ 및 TNFα(각각 20ng/ml)를 함께 첨가하였을 때 관찰되었으나 이들을 단독으로첨가한 경우 효과가 없었다.
게다가, 이러한 관점에서 IL-α 및 IL-1β이 TNFα와 다시 상호교환적이다. 항체들을 항-CD3-활성화된 지라세포 상청액 내 사이토카인 활성의 중화를 위해 첨가하였을때, 항-INFγ 단독, 또는 TNFα, IL-1α 또는 IL-1β에 대한 3-항체 조합이 MSC에 의한 iNOS의 상향 조절을 막는다는 것이 관찰되었다. TNFα, IL-1α 또는 IL-1β에 대한 항체들을 단독으로 또는 2개씩 사용하였을 때 이들은 효과가 없었다. 그러므로, 면역억제를 유도하는 일부 사이토카인들은 MSC에 의한 iNOS 발현의 강력한 유도제이다.
사이토카인-처리된 MSC에서의 iNOS 발현이 NO 생산을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 두개의 안정한 NO 절단 산물, 질산염(NO3) 및 아질산염(NO2)들을 항-CD3-활성화된 지라세포 상청액으로 처리된 MSC 유래 조건화된 배지에서 측정하였다. 처리 후 MSC에 의해서 생산된 NO2의 양은 풍부한 NO 생산자로 알려진 CD11b+F4/80+ 마이크로파지로 유사하게 처리된 것 유래보다 10배 이상 높았다. 이러한 결과는 본원에서 기술된 iNOS mRNA 발현의 높은 수준과 일치하는 결과이다. 따라서 전염증성 사이토카인에 대한 반응으로 MSC에 의한 iNOS 발현의 상향 조절은 NO의 생산을 유도하며, 이는 근접 T 세포에서 활성을 나타낼 수 있다.
본 연구에서, T 세포 활성화와 함께 또는 외인성 염증성 사이토카인을 첨가하였을 때, T 세포는 첫번째 들어간 세포주기에 멈춰있게되고 24시간 이내에 사멸한다. 이러한 세포자멸사는, T 세포 세포자멸사가 iNOS 억제제가 사용되었을 때는 관찰되지 않았기 때문에 NO 의존적인 것으로 관찰되었다. 세포자멸사는 또한 iNOS-/- 또는 IFNγ R1-/- MSC가 사용되었을 때에도 나타나지 않았다. 그러므로, NO-유도된 T 세포 세포 주기 중단 및 세포자멸사는 염증성 사이토카인-활성화된 MSC에 의해 매개되는 면역억제반응 매커니즘의 일부이다. iNOS의 염증성 사이토카인-유도된 발현에서의 종간 차이는 macrophages (Schneemann & Schoedon. 2002) Nat. Immunol. 3(2):102)에 기술되어 있다. NO는 마우스, 랫트 및 소 기원의 대식세포 내 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 것으로 확인되었으나, 염소, 토끼, 돼지 및 인간의 대식세포에서는 그렇지 않았다(Schneemann & Schoedon (2002) supra; Jungi, et al. (1996) Vet. Immunol. Immunopathol. 54:323-330). 그러므로, 마우스 및 인간 유래의 MSC에 의한 T 세포 증식의 억제에서의 IDO 및 NO의 역할을 side-by-side comparison로 분석하였다. L-NMMA에 의한 NO의 억제는 완전하게 마우스 MSC에 의한 면역억제를 회복시키는 것으로 나타난 반면, 인간 MSC에 의한 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear) 증식의 억제는 1-MT 에 의해 회복되었으며, 이는 인간 유래 MSC는 NO를 활용하는 마우스 MSC와 비교하여 면역억제의 주요 작용제로서 IDO를 활용한다는 것을 보여준다(Ren G, Su J, Zhang L, Zhao X, Ling W, L'huillie A, Zhang J, Lu Y, Roberts AI, Ji W, Rabson AB, Shi Y. Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression. Stem Cells 2009, 27:1954-1962).
실시예 4
MSC의 화학적유도(Chemoattractive) 능력은 전염증성 사이토카인에 의해 유도된다.
다양한 연구에서, in vivo 에서의 MSC에 의한 효과적인 면역억제는 백만개의 체세포 당 1 내지 5개의 MSC 정도로 달성되고 종종 한달동안 유지되며, 완전한 면역 장애의 치료는 일부 예에서만 나타난다. MSC가 조직에 위치한 이후에는 움직이지 않고, 이의 면역억제가 NO에 의해 매개되며 이것이 근원으로부터 매우 국소적으로 가까운 곳에서만 활성을 나타내는 것을 고려하면, 이와같은 면역억제 효과는 놀라운 것이다. 이는 사이토카인-유도된 MSC가 국소적으로 높은 농도를 갖는 NO가 표적 T 세포에 효과적으로 작용하도록 면역세포를 그들의 부근으로 유도하는 매커니즘을 갖는 것으로 고려된다. 이와 같은 내용을 시험하기 위하여, MSC와 지라세포의 공동배양을 현미경하에서 시간에 따라 모니터링하였다.
항-CD3 자극 동안, 지라세포는 방추형태의 MSC를 향해 활동적으로 이동하는 것이 관찰되었다. 반대로 항-CD3 자극이 없는 경우 이동이 일어나지 않았다. 지라세포는 한정적인 생존능을 갖기 때문에 자극 부재시 MSC를 향한 운동능의 결핍은 in vitro에서의 이들 세포의 열악한 상태에 기인한 것으로 보인다. 이러한 것을 제외하기 위하여, IL-2 부존재하에서도 심지어 잘 생존할 수 있는 활성화된-지라세포-상청액-프라임화된 MSC(activated-splenocyte-supernatant-primed MSC)들의 A1.1 T 하이브리도마 세포를 이끄는 능력에 대하여 시험하였다. 이와 같은 조건에서 시간-지속촬영 마이크로비디오그래피는 공동-배양 시작 후 1.5 시간 이내에 MSC를 향한 T 세포의 빠른 이동을 보여주었다. 그러나 MSC의 프라이밍없이는, MSC를 향한 T 세포의 전체적인 이동이 관찰되지 않았다. 그러므로 MSC는 오직 MSC가 전염증성 사이토카인에 노출된 후에만 T 세포의 이동을 촉진한다.
MSC가 T 세포를 이끄는 능력에서의 다양한 사이토카인의 역할을 시험하기 위하여, MSC를 다양한 재조합 사이토카인의 조합으로 전처리하였으며, 공동-배양에서 전-활성화된 T 세포의 결과적인 이동을 관찰하였다. 이러한 분석은 MSC의 면역억제기능을 유도하는 동일한 T 세포 사이토카인 쌍 (즉, IFNγ 및 TNFα; IFNγ 및 IL-1α, 또는 IFNγ 및 IL-1β) 가 또한 그들이 T 세포를 이끌 수 있도록 한다는 것을 나타내었다. 유사하게 특이적 사이토카인의 중화항체를 이용하면, MSC를 향한 이동이 활성화된-지라세포-상청액 유도된 MSC의 T 세포 증식 억제와 동일하게 항-IFNγ 단독 또는 세가지 모든 TNFα, IL-1α 및 IL-1β 의 차단에 의해서 차단된다는 것이 확인되었다. 그러므로 상기 사이토카인-유도된 MSC의 면역억제 효과는 NO 수준이 높은 MSC 인접부위로의 림프구의 이동에 의존적인 것으로 생각되었다.
실시예 5
전염증성 사이토카인은 면역 억제에 필수적인 케모카인을 생산하기 위하여 MSC를 유도한다
사이토카인-프라임된 MSC를 향한 활성화된 T 세포의 강한 이동은 MSC가 강력한 화학적주성인자(chemoattractant), 예컨대 케모카인을 분비한다는 것을 나타낸다. 이에 따라 다양한 조건하에서 배양된 MSC에 의한 백혈구 케모카인의 생산을 상청액 분석에 의하여 결정하였다. 사이토카인이 없는 MSC 단독 배양에서는 뚜렷한 케모카인 생산이 관찰되지 않았고, 내생적 형태의 MSC는 T 세포를 이끌 수 없다는 사실이 관찰되었다. 그러나 항-CD3-활성화된 지라세포와 공동배양하였을때, 50ng/ml MSC: 지라세포 1:60에서 MSC는 1.5 ng/ml의 CXCL-9 (MIG) (다른 실험에서 12 ng/ml) 및 50 ng/ml의 CXCL-10 (IP-10) 을 포함하는 많은 양의 다양한 케모카인을 생산하였다: 지라세포 비율 1:60. 이들은 강력한 T 세포 특이적 케모카인이다; 이들 케모카인은 오직 1 내지 10ng/ml의 농도에서도 단독으로 in vitro에서 주화성을 뚜렷하게 유도하는 것으로 나타났다 (Loetscher, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:3696-3705; Meyer, et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:2521-2527). CXCL-9 및 CXCL-10 의 생산은 IFNγ 단독, 또는 면역억제에서의 효과와 유사하게 세가지 사이토카인들 TNFα; IL-1α, 및 IL-1β의 항체 중화에 의해서 억제된다. 케모카인 생산은 MSC 단독에 재조합 IFNγ 및 TNFα(20ng/ml 각각) 을 추가함으로써 유사하게 유도될 수 있으며, 동시에 TNFα는 IL-1α, 및 IL-1β와 다시 상호교환가능하다. 그러므로 이들 사이토카인들은 T 세포를 MSC를 향해 주화성으로 이동하도록 할 수 있는 케모카인의 MSC 발현을 충분하게 유도한다. 그러므로, 이들이 MSC에 매우 근접하게 이동하면, 활성화된 T 세포는 MSC에의한 추가적인 케모카인의 생산을 유도하는 사이토카인을 분비할 것으로 기대되며, 따라서 MSC의 주변으로 더 많은 T 세포를 유도하기 위한 양성 피드백 순환이 만들어진다.
MSC의 케모카인 발현 프로파일을 시스템적으로 확인하기 위하여, 케모카인 및 그들의 수용체를 암호화하는 84개의 다른 유전자의 발현을 항-CD3 활성화된 지라세포 또는 나이브(naive) 세포 유래 상청액으로 처리된 MSC에서 시험하였다. 총 RNA 를 Mouse Chemokines and Receptors RT2 PROFILER.TM. PCR Array kit를 이용하여 실시간 PCR로 분석하였고, 케모카인 mRNA 수준을 β엑틴과 비교하였다 (표 1). 일부 인간 사이토카인 조합은 인간 MSC에서 유사한 정도로 케모카인 생산을 유도하였다.
표 1. 활성화된 T 세포 상청액으로 처리된 MSC 에서의 케모카인 및 관련 유전자의 발현 유도 (β-엑틴은 1x107 유닛으로 정의)
Figure pct00001
MSC (1x106 /5ml 완전 배지 내 T-25 플라스크) 는 나이브 또는 활성화된 T 세포 (최종 부피의 50%) 유래의 상청액으로 12시간 동안 자극하였다. 케모카인 및 케모카인 수용체 유전자 발현은 실시간 PCR로 분석하였다.
낮은 수준의 CX3CL-1(프렉탈카인) 및 CXCL13 (케모카인 (C-X-C) 리간드 13, BCA-1)을 제외하고, 나이브 지라세포 상청액에 노출된 MSC에서의 mRNA 수준은 뚜렷하지 않았다. 뚜렷하게, 활성화된 지라세포 상청액을 MSC에 처리하면 일부 케모카인, 예컨대 CXCL2(케모카인 (C-X-C) 리간드 2, Groβ), CXCL5 (케모카인 (C-C) 리간드 5, RANTES), CXCL9 (케모카인 (C-X-C) 리간드 9, MIG), CXCL10 (케모카인 (C-X-C) 리간드 10, IP-10) 및 CCL7 (케모카인 (C-C) 리간드 7, MCP-3)에서 백만배 이상의 증가를 나타내었다. 절대치로 나타내면, 일부 케모카인들은 β엑틴과 동일한 수준 또는 심지어 그 이상에 도달하였다. 예를 들면, CXCL10은 β엑틴의 mRNA 복제수의 두배로 나타났다. 가장 높게 유도된 케모카인은 매우 강력한 백혈구 주화성 유도제이며, 이들은 MSC에 의한 면역억제에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 사실, MSC에서 모두 높게 유도되는 T 세포 케모카인 CXCL9, CXCL10 및 CXCL11(Lazzeri & Romagnani, (2005) Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 5:109-118)에 대한 수용체인 CXCR3의 항체 차단은 T 세포 아세포의 MSC로의 주화성을 억제하고 이들의 증식 억제를 전환시켰다.
주화성-유도 전염증성 사이토카인-유도된 MSC 상청액의 능력을 직접 시험하기 위하여, CHEMOTX Chemotaxis System (NeuroProbe) 을 이용하였다. 상기 시스템은 폴리비닐피롤리딘이 없는 폴리카르보네이트 막(polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate membrane)(5㎛의 구멍)으로 분리된 상부 및 하부 챔버로 구성되어 있다. MSC 배양물 유래 상청액을 하부 챔버에 위치시키고 활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 아세포를 IL-2 존재하의 상부 챔버에 첨가하였다. 주화성은 3시간 후에 정량화하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 드라마틱한 주화성이 IFNγ 및 TNFα 또는 IFNγ 및 IL-1 처리된 MSC 유래 배양 상청액에 대한 반응에서 일어나는 것을 확인하였다. 유사한 결과가 활성화된 지라세포에 의해 조절된 배지로 처리된 MSC 유래 상청액으로 처리한 경우에서도 확인되었다.
반면, 음성 대조군인 미처리 MSC 유래 상청액 또는 활성화된 지라세포 단독은 MSC 없이 IFNγ 및 TNFα를 직접 첨가한 것과 같이 비-주화성이였다. 중요하게도; 이들 주화성 활성은 가장 중요한 T 세포-특이적 케모카인 수용체 중 2개인 CXCR3 및 CCR5 에 대한 항체에 의해서, 특히 두가지 항체가 동시에 첨가되었을때 차단될 수 있었다. T 세포를 불러들이는 것 뿐만 아니라, 사이토카인-활성화된 MSC는 또한 골수-유래 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포를 끌어들였다.
CHEMOTX 시스템을 또한 T 세포 증식 억제에서 주화성의 역할을 시험하기 위해 사용하였다. 이와 같은 분석에서, MSC는 IFNγ 및 TNFα의 첨가와 함께 또는 이 것의 첨가 없이 하부 웰에 첨가하였고 T 세포 아세포(IL-2와 함께)는 상부 웰에 첨가하였다. 이와 같은 설정에서, 하부 웰에서 MSC에 의해 생산된 케모카인은 막을 통해 MSC에 의해서 생산된 NO가 있는 하부 웰로의 T 세포 이동을 유도하였고 따라서 이들의 증식을 억제하였다. 3시간 배양 후, 상부 및 하부 웰 모두에 추가적으로 6시간 동안 3H-티미딘을 조사해주었고, 두개 웰에 위치한 세포들을 증식 결정을 위해 수확하였다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포 아세포 모두의 증식 수준이 IFNγ 및 TNFα의 존재하의 MSC에 의해서 뚜렷하게 억제되었다. 다시, T 세포 케모카인 수용체 CXCR3 및 CCR5에 대한 차단 항체는 뚜렷하게 이들의 효과를 되돌렸다. 이러한 데이터들은 추가적으로 T 세포 주화성이 MSC-매개된 면역억제에서 필수적이라는 것을 나타낸다.
이들을 종합하면, 이와 같은 결과는 MSC가 면역반응 동안 전-염증성 사이토카인에 노출되었을 때, 이들이 많은 양의 여러 케모카인을 생산하고, 특히 이들은 T 세포에 특이적이라 T 세포를 MSC 인접부위로 이끌 수 있으며, 이 부위는 T 세포 기능을 억제하는 작용을 하기 위한 높은 농도의 NO가 있는 부위라는 것을 나타낸다.
실시예 6
MSC에 의한 지연형 과민증(DTH) 및 이식편대숙주 질환(GvHD)의 예방은 염증성 사이토카인 및 NO 생산에 의존적이다.
OVA 단독 또는 OVA 와 iNOS-결핍 또는 야생형 마우스 유래의 MSC를 마우스의 발바닥에 주입하였다. 그 후 상기 마우스에 OVA를 발바닥에 도전(challenged)시키고 발바닥 붓기를 통해 결과적인 DTH 반응을 측정하였다. 이러한 분석의 결과는 야생형 MSC의 투여가 DTH 반응에서의 염증을 감소시키는 결과를 나타낸다는 것을 보여주었다. 현저하게 대조적으로, iNOS-결핍 MSC는 염증을 감소시키지 못했을 뿐만 아니라, MSC가 주입되지 않은 도전 마우스와 비교하여 실제로 DTH 반응을 강화시켰다 (도 2). 발바닥의 조직학적 분석은 야생형 MSC 공동-주입 동물유래 피부에서의 염증 지시자들의 감소를 보여준 반면, iNOS-/- MSC 공동-주입에서는 염증 부위에서 유체가 증가하고 백혈구 침윤이 증가되었다는 것을 보여주었다. 이러한 실험은 면역 반응의 억제에 NO 가 요구된다는 것을 입증할 뿐만 아니라, NO 가 생산되지 않을 경우 MSC-매개된 주화성이 염증을 강화시킨다는 것을 보여주었고, 이것은 국소 면역 반응 강화, 예컨대 iNOS 및 IDO에 대한 억제제를 사용하는 종양에 대한 백신의 효과 촉진 또는 효과적인 면역 반응의 촉발에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.
MSC에 의한 현저한 면역억제 효과의 하나는 이식편대숙주질환(GvHD) (Le Blanc, et al. (2004) supra; Le Blanc & Ringden (2006) supra)을 억제하는 능력이다. MSC에 의한 사이토카인-유도된 NO 생산이 in vivo 면역억제 결과를 나타내는지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스 유래의 5x106 핵 골수 세포 및 5x106 지라 세포를 마우스 GvHD 모델을 만들기 위하여 치사 방사능이 조사된 F1 (C57BL/6 x C3H) 마우스에 주입하였다. 모든 수용체 양성-대조군 마우스는 광범위한 GvHD (소모성, 곱슬머리(ruffled hair) 및 곱사등)이 15일 내지 22일 사이에 발달하였고, 반면 선천성 F1 골수를 받은 음성 대조군은 영향을 받지 않았다.
골수 이식 후 F1 마우스를 MSC로 처리 (공여 마우스 유래 0.5x106 세포를 3일째 및 7일째 i.v로 주입)하였을 때, GvHD에 대한 뚜렷한 보호가 나타났다; 모든 MSC 처리된 마우스들은 33일 이상 생존하였으며, 일부는 75일 이상 생존하였다. 반대로, iNOS-/- 또는 IFNγ R1-/- 마우스 유래의 MSC로 처리된 F1 마우스는 예방 효과가 없었으며, 그들의 생존율은 미처리 양성 대조군과 다르지 않았다(도 3). iNOS-/- 또는 IFNγ R1-/- 결핍 MSC에 의한 예방 효과의 부재는 IFNγ 및 NO 생산이 MSC-매개된 in vivo 에서의 면역 억제에 필수적이라는 것을 나타낸다.
in vitro 결과가 IFNγ가 세가지 사이토카인, TNFα, IL-1α 또는 IL-1β 중 어느 하나와 함께 MSC의 면역억제 기능 유도를 위해 작용한다는 것을 보여주기 때문에, 이들 사이토카인의 MSC-매개된 GvHD 예방 역할을 시험하였다. 마우스에 이들 사이토카인에 대한 중화항체 또는 L-NMMA를 야생형 MSC 투입 후 7일 동안 주사하고 GvHD가 발달할 수 있도록 하였다. 항-IFNγ 및 L-NMMA가 MSC 매개된 GvHD 예방의 뚜렷한 전환을 유발하였고 (도 3), 반면 음성 대조군 마우스는 이들 처리에 대하여 반대 효과를 보이지 않았다.
TNFα, IL-1α 및 IL-1β에 대한 3-항체 혼합물의 효과는 현저하지 않았고, 통계적으로 유의하지 않았다(도 4). 이러한 결과는 추가적으로 IFNγ 및 NO 생산이 원인임을 보여주나, 이들은 다른 사이토카인에 대해서는 불분명하였다. 그러나 MSC에 의한 면역억제 유도를 위한 IFNγ 와의 시너지 효과 외에, TNFα, 및 IL-1은 GvHD의 정상적인 발병에서 또한 중요한 인자라는 것을 인식하는 것이 중요하다. 사실 TNFα 또는 IL-1의 중화는 GvHD 의 중증도를 감소시킬 수 있다는 것이 보고되었다(Hattori 외. (1998) Blood 91:4051-4055; McCarthy 외. (1991) Blood 78:1915-1918). 그러므로 GvHD의 예방은 이들 항체들에 의해서 큰 정도로 전환되지 않는다는 것이 어느정도 예측된다.
이들 마우스 유래의 다양한 기관들에서의 염증 심각도의 조직학적 시험을 골수 이식 14일 후에 시험하였다. 관찰된 백혈구 침윤의 정도는 생존 결과와 상당한 연관관계가 있었다; GvHD-유도된 마우스는 간, 폐 및 피부에서 증가된 백혈구 수가 관찰되었으나, MSC 로 처리된 마우스에서는 거의 존재하지 않았다. 또한 MSC에 의한 보호는 거의 완벽하게 항-IFNγ 및 L-NMMA에 의해서 전환되었고, 반면 TNFα, IL-1α 및 IL-11 에 대한 3-항체 혼합물은 적은 효과를 나타내었다. DTH 연구 유래의 결과 뿐만 아니라, 상기 GvHD 실험으로부터 확인된 결과를 종합하면, MSC-매개된 in vivo에서의 면역 억제에서 IFNγ 및 NO 의 역할이 분명하게 확인되었다.
실시예 7
종양-유래 MSC 유사 림프종 기질 세포는 면역억제성이다.
림프종의 종양세포는 비부착성이기 때문에, p53+/- 마우스에서 발달된 림프종으로부터 종양 기질 세포를 단리할 수 있다. 이들 세포들은 in vitro에서 계대되고 지방세포 및 골-유사세포로 분화될 수 있다는 것이 관찰되었다. 흥미롭게도, MSC 유래 골수와 같이, 이들 종양 기질 세포도 면역억제성이며 효과적으로 항-CD3-활성화된 지라세포의 증식을 억제할 수 있었다. 이러한 면역억제 효과는 항-IFNγIFNγ 및 iNOS 억제제가 면역억제 효과를 전환할 수 있기 때문에 IFNγ+TNFα 및 NO에 또한 의존적이였다.
실시예 8.
림프종 기질 세포(LSCs)는 NO-의존적 방식으로 림프종 발달을 촉진한다.
종양 성장에 있어서 림프종 기질 세포의 효과를 확인하기 위하여, 355 B 세포 림프종 세포주(C3H-gld/gld background, 0.5x10 6 cells/mouse)를 gld/gld 마우스-유래 림프종 기질 세포(C3H background, P5, 0.25x10 6 cells/mouse)와 함께 공동-주입하였다. 기질 세포의 공동-주입은 뚜렷하게 사망율을 증진시켰다. 흥미롭게도, 1400W 투여(NOS 억제제, 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 및 28일째 0.1 mg/mouse로 투여)는 이러한 효과를 뚜렷하게 전환시켰다(도 4). 그러므로, 종양기질세포는 뚜렷하게 종양 성장을 촉진할 수 잇다.
실시예 9.
NOS 억제제와 IFNγ의 조합은 마우스 흑생종 치료를 촉진한다.
종양 면역치료법에서 종양 기질 세포-생산된 NO의 역할을 시험하기 위하여, B16-F0 흑생종 세포를 C57BL/6 마우스에 0일째에 주입하였다 (0.5x106 cells/mouse). IFNγ (250 ng/mouse) 또는 1400W (NOS 억제제, 0.1 mg/mouse)를 i.p. 주입 에의해 4, 8, 12, 16, 20 일째에 투여하였다. 마우스가 빈사상태일 때 마우스의 생존율을 기록하였다. 상기 조합 치료법은 마우스 생존율을 현저하게 증가시킨다는 것이 관찰되었다 (도 5). 그러므로, IFNγ는 종양 발달에 있어서 두가지 역할을 갖는다; 하나는 일부 혈관신생억제 인자의 생산 또는 일부 혈관신생 인자 생산의 차단에 의한 종양 발달을 막는 것이고, 다른 하나는 NO, IDO 또는 PGE2 와 같은 인자의 생산을 통해 종양 기질 또는 다른 환경적 세포에 의한 면역억제를 유도하는 것이다. 그러므로, NO, IDO 또는 PGE2를 하나 또는 그 이상 억제하는 것은 암 치료를 현저하게 강화할 수 있다. 따라서, 예컨대 사이토카인, 백신, 항체, 수지상 세포 또는 T 세포와 같은 면역치료법을 암 치료를 위해 사용할 때, 종양 기질 세포는 대부분의 케이스에서 완전하게 종양을 치료하기 위한 이들 치료법을 불능상태로 하는 원인이 될 수 있다. 면역치료법과 iNOS 및 IDO에 대한 억제제의 조합 사용은 종양을 근절하기 위한 효과적인 방법을 제공할 수 있다.
실시예 10
IL-17A 는 IFNγ 및 TNFα와 마우스 골수 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)에서 면역억제 작용제 분자 iNOS 의 높은 발현을 유도하는 시너지 효과를 나타낸다.
마우스 MSC-매개된 면역억제는 염증성 사이토카인에 의존적이다. 이들 사이토카인이 없으면, 면역억제 사이토카인인 IFNγ 및 TNFα 또는 IL-1이 존재하더라도 MSC는 면역억제 효과를 나타내지 못하고, MSC는 유도가능한 NO 합성효소(iNOS)에 의해 촉매되는 면역억제 작용제 일산화질소(NO) 및 다양한 헬퍼 분자-케모카인 및 부착 분자 발현을 위해 자극된다. 케모카인 및 부착 분자는 높은 양의 NO가 면역세포의 기능을 억제하는 MSC 부근에서 T-세포 및 다른 면역 세포를 유지한다.
in vivo에서 염증성 환경이 상기에서 언급한 세가지 유형의 사이토카인 외에도 다양한 종류의 염증성 사이토카인 및 성장 인자를 포함하기 때문에, 조직 손상을 갖는 부위에서의 MSC의 in situ 기능은 특정 미세환경 틈새에서 다양한 사이토카인에 의해서 영향을 받게되고, 본 발명의 발명자는 자가 면역 질환 및 조직 손상에서 특히 높은 수준으로 발현되는 다른 사이토카인을 시험하였다.
시험한 다양한 사이토카인 중, IL-17A는 IFNγ 및 TNFα의 존재 하에서 iNOS 의 발현을 매우 증진시키는 것으로 확인되었다. IL-17A는 많은 병리적 상태에서 발견되는 중요한 전염증성 사이토카인이나, 이들이 어떻게 MSC의 생리에 영향을 주는지에 관해서는 잘 알려져 있지 않았다. 도 6에 나타낸 바와 같이, mRNA 및 단백질 수준에서 IL-17A는 iNOS의 발현을 매우 증진시킨다. 이러한 결과는 추가적으로 IL-17 A의 보충이 MSC의 면역억제 활성을 증진시키기 위한 가능한 전략이 될 수 있음을 보여준다.
실시예 11
IL-17A 는 T세포 증식에서의 BM-MSC-매개된 면역억제를 강화한다.
iNOS 발현을 증진시키는 IL-17A 가 기능적인지 아닌지 여부를 시험하기 위하여, MSC-T 세포 공동 배양 시스템을 MSC 면억억제 활성을 평가하기 위하여 수행하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IFNγ 및 TNFα 의 보충은 사이토카인 농도 의존적으로 T-세포 증식을 감소시켰다. 인상적이게도, IL-17A의 추가는 T 세포 증식에서 MSC의 억제를 증진시켰다. 그러므로 IL-17A는 MSC-매개된 면역억제의 증진에 있어서 기능적이다.
실시예 12
재료 및 방법
시약 및 마우스
재조합 마우스 IFNγ, TNFα, IL-17A 및 IL-17A에 대한 항체는 eBiosciences (La Jolla, CA)로부터 얻었다. 재조합 마우스 IL-2 는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 얻었다. β-엑틴, GAPDH, iNOS, p-IkBα, p-P65, p-JNK, 및 p-ERK1/2 들에 대한 항체들은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 얻었다. Act1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 얻었다. PMSF 및 액티노마이신 D( actinomycin D)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구매하였다.
C57BL/6 마우스는 특이적 무균 조건 하에서 물과 식이를 자유롭게 제공하는 동물 사육장에서 유지시켰다. 모든 동물 프로토콜은 우리의 동물실험 윤리위원회에 의해 승인받았다.
세포들- MSC는 실시예 1에 기술된 프로토콜을 이용하여 생성하였다. 간단하게, 6-8 주령의 야생형 또는 auf1-/- 마우스의 경골 및 대퇴골수를 수확하였다. 세포는 10% FBS, 2mM 글루타민, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 (완전 배지, 모두 인트로젠, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 모든 미부착 세포들은 24시간(hr) 후에 제거하였고, 부착 세포들을 유지시켰다. 배지는 2-3일 마다 교환해주었다. 복제 MSC를 얻기위해서, 컨플루언스의 세포들을 수확하고 한계 희석을 통해 96-웰 플레이트에 분주하였다. 그 후 개별적인 복제세포들을 획득하고 증식시켰다. MSC는 각각 분화 조건 하에서 지방세포 및 골세포로 분화될 수 있다. 세포들은 15번째 계대 전 사용하였다.
T 세포 아세포는 C57BL/6 마우스로부터 단리된 나이브 지라세포 (naive splenocytes)로부터 생성하였고, 10% 열-불활성화된 FBS, 2mM 글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 및 50μM β-ME가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 지라세포 (1x106 cells/ml)은 항-CD3 및 항-CD28 로 48시간동안 활성화시키고 수확하였으며, 상청액 여과(0.1μm) 및 동결하였다. 그 뒤 세포들을 IL-2(200U/ml) 과 함께 단독으로 48시간 동안 배양하였다.
증식 분석- T 세포 증식을 분석하기 위하여, 0.5μCi의 3H-티미딘을 동결에 의한 배양 종결 6시간 전에 96 웰 플레이트에 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 그 후 해동시키고, 세포들을 수확하였고, 도입된 3H-Tdr을 Wallac Microbeta scintillation counter (Perkin-Elmer, Waltham, MA)를 이용하여 평가하였다.
메신저 RNA 붕괴 분석(RNA decay assay)- 메신저 RNA 붕괴 분석을 필수적으로 수행하였다. MSC 는 6시간 동안 사이토카인 조합물과 함께 배양하였다. 엑티노마이신 D (Act.D)를 전사 종결을 위한 최종 농도인 5 ㎍/ml에서 배지에 첨가하였다. Act.D 첨가 후 다양한 시점에서 총 RNA 추출을 위하여 세포를 수확하였다.
iNOS, CXCL1, CCl2, CXCL10 및 IL-6 mRNA 수준을 정량적 RT-PCR 에 의하여 각 시점에서 분석하였고, β-엑틴 수준에 대하여 정규화하였다. 각 시점에 남아있는 mRNA의 비율을 Act.D 첨가 후 시간에 대하여 플롯화하였다. 1차 붕괴 상수(First order decay constants), K는 비선형 회귀분석으로 결정하였다. 연관된 mRNA 반감기, t1/2는 하기 식 t1/2=ln2/k에 의해서 계산하였다.
RNA 단리 및 유전자 발현 분석- 총 RNA를 RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit를 이용하여 단리하였다. 일차-가닥 cDNA 합성을 cDNA 합성 키트를 이용하여 수행하였다. mRNA 의 수준은 SYBR Green Master Mix 와 함께 정량적 RT-PCR (7900 HT; Applied Biosystems, Foster City, CA) 에 의해서 측정하였고, β-엑틴 mRNA 의 수준에 대하여 정규화하였다. 정방향 및 역방향 프라이머 쌍의 서열은 하기와 같다:
iNOS, 정방향 5'-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3' 및
역방향 5'-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3';
β-엑틴: 정방향 5'-CCACGAGCGGTTCCGATG-3' 및
역방향 5'-GCCACAGGATTCCATACCCA-3';
IL-6: 정방향 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3' 및
역방향 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3';
CXCL1: 정방향 5'-CTGCACCCAAACCGAAGTC-3' 및
역방향 5'-AGCTTCAGGGTCAAGGCAAG-3';
CCL2: 정방향 5'-TCTCTCTTCCTCCACCACCATG-3' 및
역방향 5'-GCGTTAACTGCATCTGGCTGA-3';
CCL5: 정방향 5'-TTTCTACACCAGCAGCAAGTGC-3' 및
역방향 5'-CCTTCGTGTGACAAACACGAC-3';
CXCL9: 정방향 5'-AGTGTGGAGTTCGAGGAACCCT-3' 및
역방향 5'-TGCAGGAGCATCGTGCATT-3';
CXCL10: 정방향 5'-TAGCTCAGGCTCGTCAGTTCT-3' 및
역방향 5'-GATGGTGGTTAAGTTCGTGCT-3'.
웨스턴 블랏 분석- 세포들을 아이스-콜드 PBS로 2회 세척하고, 수확하였으며 프로테아제 억제제(Roche, Natley, NJ) 및 PMSF (Sigma)의 혼합물을 함유하는 RIPA 완충액(Millipore, Temecular, CA) 내에서 30분 동안 아이스 상에서 용해시켰다. 용해물을 16,000g 으로 15분 동안 원심분리하여 정제하였다. 상청액의 단백질 농도는 브래드포드 분석법(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 결정하였다.
단백질 시료를 5x SDS 로딩 완충액(250 mM　Tris-HCl, pH6.8, 10%　SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 5% β머캅토에탄올) 로 희석시키고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분획화하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Whatman Inc., Clifton, NJ) 상에서 전기블랏팅하고 TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20) 에 용해된 5% 탈지분유에서 1시간 동안 실온 배양하였다. 블랏팅 막은 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였고, TBST에서 광범위하게 세척하였고, HRP-접합 이차 항체 (Cell Signaling)와 함께 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였으며, TBST로 다시 세척하였다. 블랏팅 막은 제조자의 지시에 따라 화학발광시약(Millipore, Billerica, MA)과 함께 전개되었다.
IL-17A 수용체의 면역형광 검출- 배양된 MSC를 PBS로 일차 세척하고 10분동안 -20℃에서 아이스-콜드 메탄올로 고정하였다. PBS 내 0.3% 트리톤 X-100과 함께 10분 배양 후, 세포들을 1시간 동안 실온에서 5% BSA로 차단하였으며, 일차 항체 항-IL-17RA (Santa Cruz)와 함께 4℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포들을 Alexa Fluor 594 접합 염소 항-토끼 이차 항체 및 DAPI (Invitrogen) 과 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세포들을 그 뒤 사진 촬영 전 PBS로 세척하였다.
마우스에서의 ConA-유도된 간 손상- C57BL/6 마우스(8 내지 10 주령)에 PBS 내 ConA (Vector Labs, Burlingame, CA)를 정맥적으로 15mg/kg으로 주입하여 간 손상을 유도하였다. 야생형 마우스 또는 auf1-/- 마우스 유래 MSC (5x105)는 IL-17A의 존재 또는 부재하에서 IFNγ, TNFα(각 사이토카인에 대하여 10 ng/ml)으로 12시간 동안 처리되거나 처리되지 않았고, 그 후 처리된 마우스에 정맥적으로 ConA를 30분 동안 투여하였다. 마우스를 안락사시키고 혈청 및 간 조직을 7.5 시간 후 시료화하였다. 혈청 알라닌아미노기전달효소(ALT) 활성은 ALT 검출법에 의해 확인하였다. 포르말린-고정 간 조직학적 절편은 헤마톡실린&에오신(H&E)으로 염색하였다.
간 단핵구 세포의 단리 및 유세포 분석- 간 단핵구 세포 (Liver mononuclear cells, MNCs)는 40%/70% 구배에 의해 정제되었고, 항-CD3-PE, 항-CD4-PerCP/Cy5.5, 및 항-CD8a-APC (eBiosciences)로 30분동안 염색 완충액 (PBS, 3% FCS) 4℃에서 염색하였다. 복제된 MSC에서 IL-17RA의 표면 발현을 검출하기 위하여 세포들은 항-IL-17RA-PE (eBiosciences)로 염색하고 FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) 상의 유세포 분석기로 분석하였다.
통계적 분석- 비선형적 회귀 및 통계적 분석은 PRISM v5 software (GraphPad Software, Inc.)로 수행하였다. 시료들 사이의 비교는 unpaired t 테스트를 이용하여 수행하였다. P < 0.05 의 차이를 유의한 것으로 고려하였다 (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
결과- IL-17A는 MSC의 면역억제 효과를 증진시킨다.
본 실시예에서는 MSC의 면역억제 기능이 내생적인 것이 아니며, 농도 의존적인 형태로 전염증성 사이토카인에 의해 유도된다는 것을 제공한다. IFNγ 및 세개의 다른 염증성 사이토카인-TNFα, IL-1α, 또는 IL-1β- 중 하나의 조합은 MSC가 면역억제 효과를 나타내는데 요구된다. IL-17A는 다양한 염증성 및 자가면역성 질환의 발병에 있어서 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있는 다면발현성 전염증성 사이토카인이다. 흥미롭게도, IL-17A는 염증에 요구되는 유전자 발현 프로그램을 촉진하기위해 특정 사이토카인과 시너지를 나타내는 것으로도 알려져 있다. 그러므로 본 발명자들은 MSC의 면역억제 능력을 유도하기 위하여 IL-17A가 IFNγ 및 TNFα의 차선적 농도(suboptimal concentration)에서 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 시험하였다.
MSC는 12시간 동안 다양한 조합의 재조합 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL-17A의 낮은 농도(2ng/ml 각각)에서 배양되었고; CD4+ T 세포 아세포를 1:20 비율(MSC:T 세포)로 IL-2와 함께 배양물에 첨가하였고, T 세포의 증식을 3H-티미딘 도입에 의해서 평가하였다(IL-2 존재 하에서 T 세포 아세포가 증식되나, 이들은 추가적인 TCR 활성화 없이는 사이토카인을 생산하지 않는다). 그 뒤 세개의 사이토카인 중 어느 것도 단독으로는 MSC에서 면역억제를 유도할 수 없다고 결론지었다.
MSC는 앞서 말한 재조합 사이토카인 IFNγ, TNFα 및 IL-17A (각각 2ng/ml)의 조합으로 12시간 동안 일차 처리되었으며, 그 뒤 CD4+ T 세포 아세포와 1:20 비율(MSC:T 세포)로 공동배양되었고, 증식은 추가적인 12시간 후 3H-티미딘 도입에 의해 평가하였다. 이에 따라서, T 세포 증식은 IFNγ 및 TNFα의 존재하에서 억제되었으며, 이와 같은 억제는 IL-17A에 의해서 뚜렷하게 증진되었으며 (도 9A), IL-17A의 신규한 면역조절 기능, 강력한 전염증성 사이토카인임을 입증하였다.
MSC 또는 Raw 264.7(대식세포)에서의 IL-17 수용체 패밀리 일원의 mRNA 발현은 RT-PCR로 시험하였다. NC:No RT. 일반적으로 IL-17A는 IL-17RA 및 IL-17RC 통해 신호전달을 하고, MSC에서 이들 수용체들의 발현은 RT-PCR로 확인하였으며(도 9B), 여기에서 마우스 대식세포 세포주 Raw 264.7는 양성 대조군으로 사용하였다; 세포 표면의 IL-17RA의 발현은 또한 간접적 면역형광 미세현미경 및 유세포 분석기를 통해 확인하였다(도 9C, 상부 및 하부 패널, 각각)
염증성 사이토카인의 농도는 염증성 반응의 다른 단계에서 차이를 나타내기 때문에, IL-17A- 향상된 면억억제에서의 IFNγ 및 TNFα 의 농도 의존성을 추가적으로 평가하였다. MSC는 10ng/ml IL-17A 가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 IFNγ 및 TNFα 의 지정된 농도와 함께 배양하였다. 그 뒤 MSC를 CD4+ T 세포 아세포 또는 A1.1 T 세포 하이브리도마와 함께 T 세포 증식에 대한 효과를 평가하기 위하여 공동-배양하였다. IL-17A는 각각 1-2ng/ml 와 같은 낮은 농도의 IFNγ 및 TNFα에서 T 세포에대한 MSC의 면역억제 효과를 증진시킬 수 있었다 (도 9D, 9E).
비록 높은 농도의 IFNγ 및 TNFα(즉, 10-20ng/ml)에서도 IL-17A가 여전히 면역억제를 증진시키지만, 이러한 효과는 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, MSC는 IFNγ 및 TNFα (2ng/ml)로 IL-17A의 단계별 농도와 함께 12시간 동안 처리되었고, 그 뒤 T 세포 하이드리도마 A1.1 세포와 1:10의 비율로 12시간 동안 공동배양되었다. 따라서 0.5 ng/ml IL-17A 만큼 낮은 농도의 IFNγ 및 TNFα (2ng/ml, 각각)은 T 세포 증식의 급격한 감소를 유발하는데 충분하였다 (p < 0.05; 도 9 F).
이러한 관찰은 MSC가 T 세포에 의해 분비되는 염증성 사이토카인 의존적으로 활성화된 1차 지라세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 활성화 T 세포는 IL-17A를 포함하는 많은 사이토카인의 생산을 이끈다. IL-17A 가 MSC의 면역억제 효과에 관여한다는 것을 확인하기 위하여, IL-17A 에 대한 항체를 MSC-활성화된 지라세포 공동 배양 시스템에서 이것을 중화시키기 위해 사용하였다. 활성화된 지라세포의 증식이 뚜렷하게 MSC에 의해서 억제되는 반면, 이와 같은 억제는 부분적으로 IL-17A에 대한 항체의 첨가에 따라 다시 회복되었고, 즉, 항체 존재하에서 증식이 증가하였다 (도 9G). 항체의 최적 효과는 MSC: 지라세포 비율이 1:40일때 나타났다. MSC: 지라세포비율이 1:20인 경우, 회복은 뚜렷하지 않았으나, 여전히 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다(p<0.001). 이러한 결과를 종합하면, 이들 결과는특히 이들이 낮은 농도의 IFNγ 및 TNFα과 배양되었을 때 IL-17A가 MSC의 면역억제 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
IL-17A 는 MSC에서 면역조절 유전자의 발현을 유도하기 위하여 염증성 사이토카인과 함께 시너지 효과를 나타낸다.
함께 활성을 나타내는 일산화질소 (NO) 및 케모카인들은 MSC의 면역억제 효과를 매개하는 핵심분자이다. MSC에서 케모카인과 iNOS 유전자는 IFNγ 및 TNFα에 의해서 유도된다. 그러나, IL-17A는 IFNγ 및 TNFα과 함께 배양된 MSC에 의한 면역억제를 증진시킨다 (도 9D, 9E). 본 연구는 그 후 MSC에서 iNOS와 케모카인의 발현 유도를 위한 IFNγ 및 TNFα와 IL-17A의 시너지 효과를 보이기 위하여 설계되었다. 이와 같은 가설을 시험하기 위하여, MSC 집단을 다양한 IFNγ, TNFα, 및/또는 IL-17A와의 조합과 함께 배양하고, 선택된 면역조절 유전자의 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
단독 또는 이중 조합 사이토카인과 배양된 MSC와 비교하여, IFNγ, TNFα 및 IL-17A의 첨가는 극적으로 iNOS, IL-6 및 CXCL1의 발현을 mRNA 수준에서 증가시켰다 (도 10 A); 웨스턴 블랏 분석은 iNOS 단백질 수준의 증가를 매우 잘 확인시켜주었다 (도 10B). 그러나 MSC의 면역억제에서 중심적인 역할을 하는 다른 케모카인, 예컨대 CCL5, CCL2, CXCL9, CXCL10들의 발현은 IL-17A의 첨가에 의하여 모두 영향을 받지 않았다 (도 10C).
상기 유전자 발현에 대한 영향이 IL-17A에 기인한 것이라는 것을 확인하기 위하여, MSC를 IL-17A에 대한 중성화 항체가 존재하거나 존재하지 않는 항-CD3 및 항-CD28-활성화된 지라세포 유래의 상청액과 함께 배양하였다. 항-IL-17A의 상청액에 대한 첨가는 CCL2, CCL5, CXCL9, 또는 CXCL10에 대한 영향없이 iNOS, IL-6 및 CXC1 유전자 발현의 유도를 차단하였다 (도 10D, 10E). Act1 넉다운 MSC를 이용한 IL-17A 의 신호전달의 차단은 추가적으로 이와 같은 결론을 확인하였다.
IL-17RA에 대한 어댑터 단백질(adaptor protein)인 Act1의 모집은 IL-17A 의존적 신호전달과 관련되어 있다. IκＢα, ERK, p65, JNK 들의 인산화가 이들 Act1 넉다운 MSC에서 손상되기 때문에 (도 11A), IL-17A는 Act1 넉다운 MSC에서 IFNγ+ TNFα 유도된 iNOS의 발현을 상향조절할 수 없다 (도 11B, 11C). 이와 같이, MSC에서 IL-17A에 의한 면역억제의 증진은 또한 Act1의 부존재 하에서 나타나지 않는다(도 11D). 그러므로, 상기 유전자 발현에 있어서의 효과는 IL-17A에 기인한다. 이와 함께, 이들 데이터들은 IL-17A가 MSC의 면역억제 기능에 관여하는 유전자의 발현을 유도하기 위하여 IFNγ 및 TNFα와 함께 시너지 효과를 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다.
IL-17A 는 RNA-결합 단백질 AUF1에 의해 정해지는 유전자 발현의 억제를 역전시킨다.
iNOS 및 많은 사이토카인/케모카인들을 암호화하는 메신저 RNA 는 빠르게 분해되고, 이는 mRNA 및 단백질들이 풍부해지는 것을 제한한다. 신호전달 경로의 활성화, 특히 면역 반응 동안에는 이들의 발현을 증가시키기위해서 많은 이들 mRNA들이 안정화된다. 사실 IL-17A에 의한 주요 기전은 이들의 mRNA 안정화에 의해 많은 염증성 매개 유전자들의 발현을 유도하는 것이다. 수많은 단백질들이 특이적 RNA 서열, 보통 3'-UTR 내부 및 표적 mRNA에 급격한 분해를 위하여 결합한다. AU-풍부 영역 (AREs)은 mRNA 분해 서열의 하나의 패밀리를 포함한다. 이들을 갖는 mRNA의 조절된 발현을 유발하기 위하여 ARE에 결합하는 수많은 단백질이 있다. 이들 단백질들은 AUF1, HuR, KSRP, TIA-1/TIAR, 및 TTP을 포함한다. 이들 단백질들 타깃 중 일부는 iNOS, IL-6 및 CXCL1을 암호화하는 ARE-mRNA를 포함한다. ARE-결합 단백질 AUF1은 4개의 아형-p37, p40, p42, 및 p45 - 으로 구성되고 이들은 iNOS 및 IL-6 mRNA에 결합하고 분해를 조절한다. 그러므로 AUF1이 iNOS 및 사이토카인/케모카인 mRNA의 발현을 제한하기 위해 활성을 나타내고 IL-17A가 AUF1의 이러한 활성을 차단함으로써 유전자의 발현을 증가시킨다는 가설이 수립된다.
이와 같이, 사이토카인-유도된 유전자 발현을 auf1-/- 마우스 및 야생형 마우스의 골수 유래 MSC 사이에서 비교하였다. 세포들은 전과 같이, IL-17A이 있거나 없이, 사이토카인들의 조합물과 함께 배양하였다. iNOS, IL-6 및 CXCL1 mRNA의 수준이 야생형 MSC에서는 일반적으로 매우 낮은 것과 비교하여, IL-17A 첨가 (IFNγ 및 TNFα와 함께)는 이들 mRNA의 유의적인 증가를 유도하였다 (도 12A; p< 0.001). 반대로, 이들 세가지 mRNA의 수준은 IFNγ+TNFα와 함께 배양된 auf1-/- MSC에서 매우 높았으며, IL-17A의 첨가가 mRNA 수준에 적은 영향을 미쳤다 (즉, IL-17A는 그들의 풍부도를 2배 미만 증가시켰다). 이와 같이 IFNγ 및 TNFα는 야생형 MSC 와 반대로 auf1-/- MSC에서 IL-17A에 대한 필요없이 iNOS 단백질을 최대한으로 유도하는데 충분하였다 (도 12B, 레인 7 및 8과 레인 5의 비교).
유전자 발현에 대한 AUF1 및 IL-17A의 영향이 주어지면, AUF1 넉아웃이 일반적으로 IL-17A가 요구되는 mRNA 안정화 정도, 유전자 발현의 증가를 제공하는데 단독으로 충분하다는 것이 가능하다. 야생형 및 auf1-/- MSC를 IL-17A가 있거나 없는 조건에서 IFNγ+TNFα과 함께 배양하였다. 6시간 후, Act.D를 전사 종결을 위해 첨가하였다.
다양한 시점에서, RNA를 세포로부터 분리하였고 개별적인 mRNA 수준을 mRNA 분해 역학을 평가하기 위하여 결정하였다. 야생형 MSC에서, iNOS, IL-6 및 CXCL1 mRNA는 각각 4.3±1.4 시간, 0.7±0.1 시간, 및 0.59 ±0.08 시간의 반감기를 가져 상대적으로 불안정하였고; IL-17A는 세개의 모든 mRNA에서 두배의 안정화를 유도하였다 (도 13A; 각각에 대하여 p < 0.05). IL-17A에 대해 반응하지 않는 CCL2 및 CXCL10 mRNA (도 13C 참조)는 기대했던 바와 같이 IL-17A에 의해 안정화되지 않았다 (도 13A; IL-17A 유무, mRNA들에 대하여 t1/2=~2시간).
야생형 MSC와 반대로, AUF1 넉아웃은 iNOS, IL-6, 및 CXCL1 mRNAs 를 강하게 안정화시켰다 (도 13B; iNOS 및 IL-6에 대하여 t1/2 >10 시간; CXCL1에 대하여 t1/2= 4.3 ±0.6 시간). IL-17A는 iNOS 및 IL-6 mRNA의 반감기에 대하여 영향을 주지 않았지만 (도 13B), CXCL1 mRNA는 2배 이상 안정화시켰다 (도 13B; IL-17A가 없는 4.3±0.6 시간과 비교하여 t1/2 >10 시간; 토론 참조). 이들 mRNA 분해 데이터는 다음을 나타낸다, (i) AUF1 은 일반적으로 MSC에서 iNOS, IL-6 및 CXCL1 mRNA의 분해를 촉진하고 IL-17A는 이들의 안정화를 유발한다; (ⅱ) AUF1의 넉아웃에 의한 이들 mRNA의 안정화는 야생형 MSC에서의 mRNA에 대한 IL-17A의 안정화 효과의 증폭과 비교할만하며; 그리고 (ⅲ) AUF1 넉아웃은 iNOS/케모카인 유전자 발현ㅇmI을 유도하기 위한 IL-17A에 대한 요구를 제거하는 것으로 나타난다. 그러므로 AUF1은 IL-17A가 MSC 유전자 발현에 대해 영향을 미치는 것을 유발하기 위해 활성을 나타내야 하는 것을 통해 대조점으로서 제공될 수 있고, 이후 시험될 궁극적인 면역억제일 수 있다.
MSC에 의한 면역억제에 대한 AUF1 의 in vitro에서의 효과
AUF1 넉아웃이 케모카인 유전자 발현을 IL-17A에 대한 요구없이 유도하는 것이 주어졌으며 (도 12 및 13 참조), IFNγ + TNFα를 갖는 auf1-/- MSC를 단독으로 배양하는 것이 모든 세개의 사이토카인과 야생형 MSC의 면역억제 활성의 표현형 모사에 충분할 것이라고 가정하였다. 이와 같은 가정을 평가하기 위하여, 야생형 및 auf1-/- MSC를 IL-17A의 유무와 함께 IFNγ + TNFα와 함께 배양하였으며, 그 뒤 T 세포 증식을 평가하기 위하여 A1.1 T 세포 하이브리도마와 함께 공동-배양하였다. IL-17A는 이것 없이 배양된 세포와 비교하여 야생형 MSC의 면역억제 활성을 증가시켰다; 그러나, IFNγ + TNFα은 auf1-/- MSC 의 최대 면역억제 활성을 유도하는데 충분하였으며, IL-17A 은 추가적인 면역억제 효과 향상을 가져오지 않았다 (도 14A, 14B). 이들을 함께 고려하면 이러한 결과는 AUF1가 iNOS 및 사이토카인/케모카인 유전자 발현을 제한한다는 관찰; IL-17A가 MSC에 의한 면역억제를 증진하기 위하여 이들 효과를 역전시키다는 것과 일치한다.
IL-17A 은 AUF1 의존적 방식으로 ConA-유도된 간 손상을 겪은 마우스에서 MSC의 치료효과를 증진시킨다.
본 발명자들은 다음으로 in vivo 에서의 면역억제에 대한 IL-17A 의 효과를 야생형 및 auf1-/- MSC 에의해 시험하였다. ConA-유도된 마우스의 간 손상은 주로 T 세포에 의해서 매개되는 자가면역 간염의 in vivo 모델에서 잘 기술되어 있다. 이전의 결과가 IL-17A가 in vitro 시스템에서 MSC의 면역억제 효과를 현저하게 증진시킬 수 있다는 것을 보여주었기 때문에, IL-17A가 ConA-유도된 간 손상 마우스를 치료하는 치료적 효과를 더욱 증가시킬 수 있다는 것이 기대된다. 이에 따라, IL-17A의 존재 또는 부존재 하에서, IFNγ+ TNFα와 함께 또는 이들 없이 야생형 및 auf1-/- MSC를 12시간 동안 일차적으로 처리하였으며, 그 뒤 30분 전에 ConA 주입을 받은 마우스에 정맥적으로 주사하였다. 미처리 또는 IFNγ + TNFα 전처리된 야생형 MSC와 비교하여, IFNγ+ TNFα 및 IL-17A 전처리된 야생형 MSC는 혈청 ALT 활성 및 간 괴사 및 염증을 급격하게 감소시킴으로써 간 손상을 상당히 개선시켰다 (도 15A, 15D). 그러나 auf1-/- MSC 에 대해서는, IL-17A 에 대한 요구없이 오직 IFNγ + TNFα 전처리에서도 ConA 유도된 간 손상에서 최대의 치료적 효과를 이끌어 냈다 (도 15A, 15D). 혈청 ALT 활성의 패턴과 일치하게, 단핵 세포 뿐만 아니라 간에서 CD3+ CD4+ 및 CD3+ CD8+ T 세포들의 침투도 IFNγ + TNFα와 IL-17A로 전처리된 야생형 MSC, 또는 IL-17A와 유무와 함께 IFNγ + TNFα로 전처리된 auf1-/- MSC 로 투여된 마우스에서 급격하게 감소하였다 (도 15B, 15C). 그러므로 당업자는 IL-17A 와 함께 IFNγ + TNFα로 전처리된 MSC 활용이 ConA-유도된 간 손상의 치료에 대하여 새롭고 신규한 치료법이라는 것을 인식할 수 있고 IL-17A의 효과를 AUF1 의존적 방법에 가할 수 있다.
실시예 13.
IL-17A는 mRNA 안정성 증진를 통해 iNOS 발현을 촉진시킨다.
IL-17A가 어떻게 iNOS 발현 및 MSC에 의한 면역억제를 증진시키는지에 대한 매커니즘을 분석하기 위해서, 사이토카인 유도하에서 iNOS 의 RNA 안정성을 연구하였다. 도 16A에 나타낸 바와 같이, iNOS mRNA 붕괴 반감기 (half decay time)는 IFNγ + TNFα 처리군에서 약 2.5 시간이였다. 흥미롭게도, IL-17A를 보충하면 상기 시험된 시점내에서 iNOS mRNA는 완전히 보호되었다.
포유류에서, 염증성 단백질을 암호화하는 많은 mRNA는 이들의 3'-비번역 영역에 존재하는 AU-풍부 인자(AREs) 에 의해 불안정화해진다. 급격한 mRNA 분해는 ARE-결합 단백질(ARE-binding proteins; AUBPs)과 이들의 mRNA 와 연관되어 일어난다. AUFI, ARE/poly(U)-결합/분해인자 1은 많은 ARE-mRNA에 분해 매개를 위해 결합하는 가장 잘 알려진 AUBP 중에 하나이다. AUF1은 MSC에서의 IL-17A 매개된 iNOS 과다발현에서 나타나는 관찰에 필수적일 것으로 예상된다.
이러한 내용을 시험하기 위하여, MSC에서 AUF1을 siRNA로 넉다운시켰으며, IL-17A와 함께 또는 이들 없이 IFNγ + TNFα 로 처리하였다. 야생형 MSC에서 IL-17A는 iNOS의 발현을 강하게 유도한 반면, AUF1의 부재는 이러한 효과를 대부분 차폐시켰고, MSC에서 IL-17A 매개된 iNOS 발현에서의 AUF1의 중요성을 나타내었다. 그러므로 IL-17A는 임상적 셋팅에서 MSC에서의 iNSO mRNA 안정화를 가능하게 하고이는 MSC-매개된 치료법을 효과적으로 증진시키기위한 신규한 방법을 제공한다.
I 형 인터페론 및 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor; FGF-2)는 iNOS 발현의 하향조절을 통해 MSC-매개된 면역억제의 음성조절자 역할을 한다.
상기에서 기술한 바와 같이, IL-17A는 MSC-매개된 면역억제를 증진시키는 잠재적 인자가 될 수 있다. 그러나 많은 케이스에서, 이러한 in vitro 및 in vivo에서의 면역억제 효과는 양성적 또는 음성적으로 조절되는 것이 필요하다. 이용가능한 성장 인자 및 사이토카인을 스크리닝하였으며, 두개의 인자가 MSC-매개된 면역억제를 강하게 하향-조절하는 것을 발견하였다: I형 인터페론 및 섬유아세포 성장인자(FGF-2).
이들 두가지 인자들은 잠재적으로 T-세포 분화에 대한 MSC의 면역억제효과를 억제할 수 있다 (도 16). 추가적인 분석은 이들 사이토카인 중 하나의 보충이 iNOS 단백질의 발현 및 NO 생산을 강하게 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다 (도 17).
이러한 발견은 MSC-매개된 면역억제의 음성적 조절을 위한 방법을 증명한다. 따라서 I 형 인터페론 및 FGF 에 대한 항체들이 MSC의 면역억제 효과를 신장시키기 위해 사용될 수 있다.
인간 IDO-발현 마우스 iNOS-/- 세포의 구축 (인간화된-IDO MSC).
MSC-매개된 면역억제에 대한 종 다양성이 있다: NO는 마우스 MSC 에 대한 작용 분자인 반면, 인간 및 영장류 MSC는 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase; IDO)를 억제성 작용 분자로 활용한다.
마우스 MSC가 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO)를 염증성 사이토카인 자극 이후 발현하지 않으므로, 마우스 시스템에서 IDO의 생물학적 역할에 대해 연구하기 쉽지 않다. 이러한 문제를 피하기 위하여, 마우스 iNOS-/- MSC들을 마우스 iNOS 프로모터의 조절하에서 인간 IDO 유전자로 형질감염시켰다. 이는 염증성 사이토카인 자극이 있을 때 마우스 MSC에서 IDO의 발현을 가능하게 하였다. 안정한 인간 IDO 발현 마우스 iNOS-/- MSC는 마우스 염증성 사이토카인에 의한 자극 하에서 높은 IDO 발현의 확인과 함께 성공적으로 발생하였다. 이들 인간화된 IDO MSC와 함께, IDO는 in vitro 및 in vivo의 마우스 MSC에서 면역억제성인 것으로 나타났다. 인간화된-IDO는 iNOS-/- 마우스로부터 발생된다.
인간 IDO 유전자는 또한 정상 마우스에서 마우스 iNOS 유전자와 교체하기 위하여 사용되고 그 결과 IDO의 발현은 마우스 iNOS 유전자 조절 기전에 의해서 조절되며, 그 동안 iNOS 유전자는 추가적인 약물학, 암 치료법 연구, 및 면역 반응 및 면역 연관 발병을 평가하기 위해 침묵화되었다.
실시예 14
기능적 IFNα 방출을 위한 MSC의 집단 형질도입
본 실시예에서, 발명자들은 GFP를 암호화하는 렌티바이러스를 갖는 MSC(MSC-GFP) 또는 GFP와 함께 마우스 IFNα를 갖는 MSC(MSC-IFNα)로 MSC에 형질도입하였다. 90% 이상의 세포들이 성공적으로 형질도입되었으며, 유세포 분석 상에서 GFP 발현으로 나타났다 (도 18A). MSC-GFP와 MSC-IFNα 사이에 형태 및 증식 속도상에서 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다.
MSC-IFNα의 IFN 생산 수준을 시험하기 위하여, IFNα 수준을 48시간동안 5x105 세포수로 배양된 MSC 상청액에서 정량화하였다(도 18B).
ELISA 분석법은 MSC-IFNα의 상청액에서 IFNα 19ng/ml 가 존재하는 반면, 동일한 조건하에서 배양된 MSC-GFP 상청액에서는 IFNα가 검출되지 않는다는 것을 보여주었다. MSC-IFNα에 의해서 방출된 IFNα가 생물학적인 기능을 나타내는지 여부를 시험하기 위하여, MHC I 분자 H-2Kb 의 발현을 MSC 표면상에서 유세포 분석을 통해 평가하였다. IFNα 는 H-2Kb의 발현수준을 증가시켰다.
도 18C는 H-2Kb의 발현이 MSC의 본질적 속성인 MSC-GFP에서 낮다는 것을 나타낸다. 그러나 재조합 IFNα 로 처리한 후에는 놀랍게도, H-2Kb의 발현이 MSC-GFP에서 현저하게 증가하였다. H-2b 의 유사한 증가된 발현이 MSC-IFNα의 상청액으로 처리된 세포에서도 또한 관찰되었다. 유사하게, MSC-IFNα상의 H-2Kb 표면 발현 또한 IFNα로 처리된 MSC-GFP의 발현과 유사한 수준으로 증가하였다. 이러한 데이터는 MSC-IFNα가 생물학적으로 기능하는 IFNα를 생산한다는 것을 입증한다.
MSC-IFNα는 in vivo에서 강한 항-종양 효과를 나타낸다.
in vivo에서의 종양성장에 대한 MSC-IFNα 의 효과를 확인하기 위하여, 마우스 B16 흑색종 모델을 이용하였다. 이와 같은 시스템에서, 모든 세포들 및 마우스들은 C57BL/6 배경에 위치시켰다. 1x106 B16 흑색종 세포들은 단독으로 또는 1x106 MSC-GFP 또는 MSC-IFNα 중 어느 것과 함께 근육내로 접종되었으며, 12일 후 종양을 제거하고 무게를 측정하였다. MSC-IFNα가 완전하게 종양의 성장을 멈추게 한 반면, MSC-GFP는 종양의 성장을 약하게 증진시키는 예측하지 못한 결과가 관찰되었다 (도 19A). MSC-IFNα의 능력을 시험하기 위하여, 1x106 B16 흑색종 세포와 다른 수의 MSC-IFNα를 동물에 주입하였다. 놀랍게도, 1x104 MSC-IFNα 에서도 (MSC-IFNα:B16=1:100 비율) in vivo에서 여전히 종양 성장을 강하게 억제할 수 있었다 (도 19B). 게다가 종양 세포를 단독으로 접종한 모든 마우스들이 30일 내 죽은 반면 종양세포와 함께 MSC-IFNI를 받은 마우스의 거의 절반은 100일 이상 생존하였다 (도 19C).
MSC-IFNα 세포가 B16 흑색종 세포 접종 3일 또는 4일째 접종되었을때, 종양 성장 역시 효과적으로 억제되었다 (도 19D 및 19E). MSC-IFNα의 항-종양 능력과 재조합 IFNα를 비교하기 위하여, 5㎍의 재조합 IFNα (50,000U) 또는 1x106 MSC-IFNα를 B16 세포 접종 3일 후 마우스가 갖도록 하였다. 우리의 in vitro 분석에 기초하여, 우리는 1x106 으로 주입된 MSC-IFNα가 일일 약 19ng의 IFNα만을 생산할 수 있을 것으로 대략적으로 예상하였다. 이것은 5㎍의 재조합 IFNα 주입보다 훨씬 낮은 양이다. 발명자들이 심지어 적은양의 IFNα 생산에서도(재조합 IFNα 주입 양보다 250배 낮음), MSC-IFNα이 재조합 IFNα 보다 더욱 더 강력한 항-종양 효과를 갖는다는 것(도 19F)을 관찰함에 따라 이러한 관찰은 유의적이다. 반복적인 IFNα 투여는 추가적으로 강력한 항-종양 효과를 in vivo에서 유발한다 (보충 도 18). 이들 데이터는 분명하게 IFNα-분비 MSC가 in vivo에서 매우 강력한 항-종양 활성을 가지고 있다는 것을 입증한다.
종양에서 지속되는 MSCs 는, 종양 세포 증식을 감소시키고, 종양 세포의 세포자멸사를 유도한다.
MSC-IFNα의 강력한 항-종양 효과 매커니즘을 추가적으로 연구하기 위하여, in vivo 에서 MSC-IFNα 투여의 경과를 추적하였다. 이에 따라, MSC-IFNα를 루시퍼라아제로 표지하였고, 이들의 활성은 in vivo에서 살아있는 이미지 관찰 기술인 sing Berthod NC100 imaging system으로 모니터하였다.
B16 세포와 공동-주입하였을 때, MSC-IFNα은 점차적인 감소를 동반하며 2주 이상 동안 종양에서 지속된다 (도 20A 및 20B). MSC-IFNα의 강한 항-종양 효과를 고려하면(MSC-IFNα:B16 = 1: 100의 비율에서도 여전히 효과적임), SC-IFNα 가 종양 내부에 머물러 있고, 지속적으로 낮은 그러나 효과적인 농도의 IFNα를 2주 이상동안 종양 내에 국소적으로 방출될 것이라고 생각된다.
당업자들은 in vivo에서 재조합 IFNα의 투여를 위해 요구되는 짧은 반감기와 고용량에 대한 이들 영향의 우월성에 대하여 인식할 수 있다. 종양을 조직학적으로 시험하였을 때, B16 내에서의 거대한 림프구의 침투가 MSC-IFNα을 더한 군에서 발견된다.
MSC-IFNα는 Ki-67-양성 세포의 비율의 감소로 보여지는 바와 같이 종양 세포 증식을 억제하고, TUNEL 분석법에 의해 보여진 바와 같이, 종양 세포의 세포자멸사를 증가시킨다 (도 20C).
MSC-IFNα의 항-종양 활성은 매우 면역-의존적이다.
재조합 IFNα이 in vitro 종양 성장에 미치는 직접적인 영향을 연구하였다. 재조합 IFNα는 높은 농도 (MSC-IFNα에 의해 생산되는 19ng/ml 과 비교하여, 최대 100ng/ml) 에서조차 미미한 정도로만 B16 흑색종 세포를 억제하는 것으로 확인되었다 (도 21A). 그러므로, MSC-IFNα에 의한 in vivo 에서 관찰되는 완전한 종양 성장 억제를 고려하면, 발명자들은 종양 성장의 억제에 직접적으로 관여하는 것 외에 다른 매커니즘이 있을 것으로 결론내렸다.
MSC-IFNα의 항-종양 효과에 있어서 면역 시스템이 역할을 하는지 여부를 시험하기 위하여, B16 흑색종세포를 단독으로 또는 MSC-GFP 또는 MSC-IFNα 와 함께 야생형 또는 면역결핍 NOD-SCID 마우스에 병렬적으로 접종하였으며 이들 마우스에서 종양 성장을 비교하였다. 야생형 마우스에서, MSC-IFNα는 완전하게 종양 성장을 억제(도 21B)한 반면, 면역결핍마우스에서는 MSC-IFNα의 종양 억제 효과가 현저하게 감소하였다 (도 21C). MSC-IFNα의 항-종양 효과에 있어서 면역 시스템의 역할을 더욱 분명하게 분석하기 위하여, 우리는 B16 종양 세포와 함께 적은 MSC-IFNα을 접종하였고, 그 결과 직접적인 종양 억제 기여가 최소화되었다. 적은 수의 MSC-IFNα가 사용(1/100 종양세포)되었을 때, 종양 성장은 여전히 야생형 마우스에서 효과적으로 억제되었다 (도 21D); 그러나 이러한 효과는 면역결핍 마우스에서 완전하게 사라졌다 (도 21E).
발명자들은 그 후 NK 세포들이 MSC-IFNα의 항-종양 효과에 관여하는지 여부를 항-아시알로 GM1 항체(anti-asialo GM1 항체)를 이용하여 NK 세포를 사멸시킴으로써 시험하였다. 놀랍게도, 대조군 마우스에서 종양 성장은 효과적으로 억제되었다; 그러나 이와 같은 억제는 NK 세포사멸 항체로 처리된 마우스에서 현저하게 역전되었다(도 21F). CD8+ T 세포는 또한 CD8+ T 세포 결핍 마우스, β2m 넉아웃 마우스에서 MSC-IFNα에 의한 종양 성장의 억제가 사라지는 것에 의해서 나타나는 바와 같이 MSC-IFNα의 항-종양 효과에 관여한다 (도 21G). 이러한 데이터들은 면역 시스템이 MSC-IFNα의 항-종양 효과에 있어서 이 것의 종양 세포에 대한 직접적인 효과 외에도 필수적이라는 것을 분명하게 보여준다.
본 연구에서, IFNα은 정상 마우스에서 MSC 를 통해 종양세포로 전달된다. 면역 적합 마우스(immune competent mice) 에서, IFNα은 항-종양 면역성을 촉진함으로써 이 것의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 심지어 적은 수의 IFNα-분비 MSC는 정상 마우스보다 백 배 이상의 종양 세포 성장 억제 능력을 가지나, 면역결핍 마우스에서는 그렇지 않았다. 게다가, NK 세포 및 CD8+ 세포는 모두 in vivo에서 IFNα-분비 MSC의 항종양 효과에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
IFNα은 MSC의 면역억제를 극복할 수 있다. 따라서, IFNγ 및 TNFα에 의해 유도된 MSC의 면역억제 능력에 대한 IFNα의 효과적인 역전을 관찰하였다. 종양에서 장기간의 MSC-IFNα의 존재는 IFNα에서 나타나는 빈번한 주입을 피할 수 있게 한다. MSC-IFNα 에서 방출되는 낮은, 그러나 효과적인 수준의 IFNα는 어떠한 부작용도 유발하지 않는 것으로 보였다. 당업자는 면역 자극인자를 발현하도록 설계된 MSC가 앞으로 종양 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
본 발명은 특이적 실시예를 참고적으로 기술하였으나, 본 발명의 변형 및 이의 수정은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한 하기 청구항의 정의된 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (43)

  1. (i) 다분화능 전구 세포(multipotent progenitor cells)를 얻는 단계;
    (ii) 상기 다분화능 세포를 배지에서 증식된 중간엽 줄기세포의 부분모집단(subpopulation) 및 분화된 세포의 부분모집단 생산하기 위해 배양하는 단계;
    (ⅲ) 중간엽 줄기세포를 상기 배지의 분화된 세포로부터 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 하나 이상의 분리된 중간엽 줄기세포의 아집단(subset)과 인터페론 감마(IFNγ) 및 인터루킨-1 알파(IL-1α), 인터루킨-1 베타(IL-1β), IL-17A, 종양괴사 인자 알파(TNFα), 1형 인터페론(IFN-I), TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인을 함께 충분한 기간동안 활성화 시키는 단계;
    (a) 상기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 단리된 중간엽 줄기세포 집단을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 추가적으로 IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-17A, IFN-Iα, IFN-Iβ, TNFα, TGFβ 및 FFG 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 추가적인 사이토카인을 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단리된 중간엽 줄기세포는 배양된 중간엽 줄기세포를 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역 T-세포 집단을 억제하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역 반응을 유도하는 조성물.
  7. (a) 단리되고 처리된(trained) 중간엽 줄기세포의 집단;
    (b) 단리된 IFNγ; 및
    (c) IL-1α, IL-1β, IL-17A, 및 TNFα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인; 의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이들을 필요로 하는 환자에서 면역억제를 증진시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 집단, 단리된 IFNγ 및 상기 사이토카인은 개별적으로 투여되는 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 집단, 단리된 IFNγ 및 상기 사이토카인은 혼합하여 투여되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 필요로하는 환자는 자가면역 질환, 알러지, 패혈증, 간경변, 암, 바이러스성 감염 및 장기 이식으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 상태를 겪는 환자인, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 하나 이상의 상기 중간엽 줄기세포의 아집단에서 일산화질소 합성효소(NO synthases; iNOS) , 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase; IDO)의 발현 유도를 추가적으로 더 포함하는 방법.
  12. (a) 단리되고 처리된 중간엽 줄기세포;
    (b) 단리된 IFNγ; 및
    (c) IL-1α, IL-1β,IFN-Iα, IFN-Iβ, TNFα, TGFα 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인: 의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이들을 필요로 하는 환자에서 면역반응 유도를 위한 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 집단, 단리된 IFNγ 및 상기 사이토카인은 개별적으로 투여되는 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 집단, 단리된 IFNγ 및 상기 사이토카인은 혼합하여 투여되는 것인, 방법.
  15. 제12항에 있어서, NOS 억제제 또는 IDO 억제제의 유효량을 상기 환자에 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 처리된 중간엽 줄기세포 및 NOS 또는 IDO의 억제제는 개별적으로, 또는 혼합하여 투여되는 것인, 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 처리된 중간엽 줄기세포는 백신 형태인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 환자는 암 또는 바이러스성 감염을 겪는 환자인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 환자는 면역 치료법 처방을 받은 후인 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 유효량은 치료 부위에 국소적으로 투여되는 것인 방법.
  21. (i) 다분화능 전구 세포(multipotent progenitor cells)를 얻는 단계;
    (ii) 상기 다분화능 줄기세포를 배지에서 배양하는 단계;
    (ⅲ) 중간엽 줄기세포를 상기 배지의 분화된 세포로부터 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 하나 이상의 분리된 중간엽 줄기세포의 아집단을 단리된 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, IFN-Iα IFN-Iβ, TNFα, TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인에 노출시켜 충분한 기간동안 활성화 시키는 단계;
    상기 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된 단리되고 처리된 중간엽 줄기세포 집단의 유효량을 그들을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 면역반응 유도 또는 억제 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나의 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-17A 및 TNFα로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 하나의 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IFN-Iα IFN-Iβ, TNFα, TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 방법은 개체의 면역 반응을 억제하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 방법은 개체의 면역 반응을 유도하는 것인, 방법.
  26. (i) 다분화능 전구 세포를 얻는 단계;
    (ⅱ) 배지에서 상기 다분화능 세포를 배양하는 단계;
    (ⅲ) 상기 배지 내 분화된 세포로부터 복제성(clonal) 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 하나 이상의 분리된 중간엽 줄기세포의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IFN-Iα IFN-Iβ, TNFα, TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인 또는 이들의 조합으로 활성화시키는 단계; 를 포함하는 활성화된 중간엽 줄기세포 집단의 배양 방법.
  27. IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, TNFα, IFN-Iα IFN-Iβ, TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인에 충분한 시간동안 노출시켜 활성화된 단리되고 처리된 중간엽 줄기세포 집단의 유효량을 포함하는 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하는 그들을 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 유도 또는 억제하기 위한 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 백신 형태인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 임의의 잔여 사이토카인을 실질적으로 포함하지 않는, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 필수적으로 두개 이상의 처리된 중간엽 줄기세포의 아집단으로 구성되는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 처리된 중간엽 줄기세포의 아집단은 필수적으로 복제된 중간엽 줄기세포로 구성되는 것인, 방법.
  32. (i) 다분화능 전구 세포를 얻는 단계;
    (ⅱ) 배지에서 상기 다분화능 세포를 배양하는 단계;
    (ⅲ) 상기 배지 내 분화된 세포로부터 복제성 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 단리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, IL-17A, TNFα, IFN-Iα IFN-Iβ, TGFβ 및 FGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인 또는 이들의 조합으로 활성화시키는 단계; 를 포함하는 과정에 의해 얻어지는 줄기세포.
  33. (a) 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 단리된 중간엽 줄기세포의 집단;
    (i) 다분화능 전구 세포를 얻는 단계;
    (ii) 상기 다분화능 세포를 배지에서 배양하는 단계;
    (ⅲ) 상기 배지 내 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 단리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, TNFα, IFN-Iα IFN-Iβ, TGFβ, FGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인으로 활성화시키는 단계; 및
    (v) 임의의 잔여 사이토카인을 추출하는 단계; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체; 를 포함하는 조성물.
  34. (a) 생리 식염수, 5% 수용성 덱스트로오스, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 약학적으로 허용가능한 담체;
    (b) 중간엽 줄기세포 집단;
    (c) 단리된 인터페론 γ;
    (d) IL-1α, IL-1β, IL-17A, 및 TNFα로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인; 을 포함하는 이들을 필요로 하는 개체에서 면역 반응을 수정하기 위한 키트.
  35. 제32항에 있어서, (a), (b), (c) 및 (d) 의 조합물을 그들을 필요로 하는 개체로 투여하면 면역 억제를 달성하는 것인, 키트.
  36. 제32항에 있어서, 이상 면역(illicit immune) 억제를 위하여 키트를 사용하기 위한 지시서를 추가적으로 포함하는 키트.
  37. (a) 유도가능한 일산화질소 합성효소 억제제, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 억제제, 유도가능한 일산화질소 합성효소(iNOS)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단, 인돌아민 2,3-다이옥시게나아제 (IDO)-결핍 중간엽 줄기세포의 집단 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 환자에 투여하는 단계;
    (b) 하나 또는 그 이상의 일산화질소(NO), 인돌아민 2,3 다이옥시게나아제(IDO) 또는 프로스타글라딘 E2 (prostaglandin E 2; PGE2)의 생산을 억제하는 단계; 를 포함하는 그들을 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 촉진하기 위한 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 iNOS 또는 IDO의 억제제는 개별적으로 또는 혼합물로 투여되는 것인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 혼합물은 백신인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 환자는 암 또는 바이러스성 감염 환자인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 상기 환자는 면역 치료법 처방을 받은 후인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 면역치료법은 인터페론의 투여를 포함하는 것인, 방법.
  43. 제35항에 있어서,
    (i) 다분화능 전구 세포를 얻는 단계;
    (ⅱ) 상기 다분화능 세포를 배지에서 배양하는 단계;
    (ⅲ) 상기 배지에서 분화된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; 및
    (ⅳ) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 아집단을 IFNγ 및 IL-1α, IL-1β, TNFα, IFN-Iα IFN-Iβ, TGFβ, FGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인으로 충분한 시간 동안 활성화시키는 단계; 를 포함하는 공정을 통해 얻어지는 처리된 줄기세포 집단을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
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