KR20220153768A - Il-10 과발현 인간 지방유래 중간엽줄기세포 및 그 용도 - Google Patents
Il-10 과발현 인간 지방유래 중간엽줄기세포 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 IL-10(interleukin 10)을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포는 TNF-α, IL-1β, IL-6, p-p38 및 p-IκBα의 발현을 억제하는 항염증 효과와 관절염 발생률 및 중등도를 감소시키는 효과가 있으며, 이러한 항염증 및 관절염 억제능이 IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포 대비 현저하게 향상되는 효과가 있다.
Description
본 발명은 IL-10(interleukin 10) 과발현 인간 지방유래 중간엽줄기세포 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
류마티스 질환(rheumatoid disease)은 면역이상으로 관절을 싸고 있는 활막에 염증유발을 시작으로 점차 연골 및 뼈로 염증이 파급되어 관절의 파괴 및 변형을 유발하거나 빈혈, 건조증후군, 패섬유화증 등 전신을 침범하는 자가면역 질환으로 현재까지 정확한 원인은 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 현재까지 모든 류마티스 질환 환자에 적용할 수 있는 단일치료법이 존재하지 않고, 완치가 불가능한 질환이다.
류마티스 관절염 환자는 인구 100명 당 1명의 비율로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 질병 발생 10년 정도 경과 후에는 환자의 50% 에서 일상생활에 장애를 갖게 되며, 이로 인해 발생되는 통증, 피로감, 우울증상으로 인해 삶의 질이 저하되어 사회적 및 경제적인 손실을 일으킨다. 류마티스 관절염 치료제 시장은 2015년 $49bn 시장을 형성하였고, 2022년까지 연간 평균 2%씩 성장해 $55bn 시장을 형성할 것으로 전망되고 있다.
류마티스 관절염을 치료하기 위한 치료제로는 부작용이 많은 스테로이드 계열보다는 비스테로이드성 소염진통제를 사용하고 있으며, 최근에는 염증을 유발하는 사이토카인을 차단하는 약제(예, Etanercept, Infliximab, Adalimumab등)를 사용하여 염증을 줄이고 있으나, 치료효능은 50-60%의 환자에서만 나타내고 있다.
현재 많은 약물들이 연구/개발되고 있음에도 불구하고 장기간 투여 시 많은 부작용을 초래하고 있으며, 이미 염증으로 인해 한번 파괴된 조직과 세포 및 변형된 관절은 복구가 되지 않는 반면, 통증완화 및 염증반응의 개선 효능만 있다는 한계가 있다. 따라서 지속적인 조직파괴에 관여하는 자가항체 형성을 억제하고, 변형된 관절의 복원을 유도하는 새로운 치료제의 개발이 절실한 상황이다.
한편, 지방유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)는 비교적 쉽게 분리하여 대량 배양이 가능하며, 환자지방조직으로부터 쉽게 확보가 가능한 실용적인 장점을 가지고 있다. 지방유래 중간엽줄기세포는 indolamine 2,3-dioxygenase (IDO), transforming growth factor (TGF)-β1, hepatocyte growth factor (HGF), prostaglandin E2 (PGE2), TNF-α stimulated gene/protein -6 (TSG-6) 등과 같은 다양한 물질들을 분비하여 면역반응을 강력하게 억제하는 것으로 알려져 있다.
IL-10(인터루킨 10; interleukin 10)은 사이토카인 합성 억제제 인자(Cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)로 조혈세포, 특히 면역 세포의 강력한 면역조절인자이다. IL-10은 활성화된 helper T cell 2(Th2) 세포, B세포, 각질세포, 단핵구(monocyte) 및 대식세포(macrophage)와 같은 세포에서 생산되며, T 세포, 단핵세포 및 대식세포를 포함하는 다수의 세포의 활성화를 억제하고 helper T cell 1(Th1) 세포, 천연 킬러 세포, 단핵구 및 대식세포와 같은 세포의 IL-1, Interferon-γ(IFN-γ), 및 Tumor necrosis factor(TNF)등의 합성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
류마티스 관절염에서 줄기세포 치료제 개발은 성체줄기세포 단독투여방법으로 2018년 기준 총 8건의 임상시험이 전 세계적으로 진행되고 있다. 그러나 아직까지 정식으로 출시된 류마티스 질환을 위한 줄기세포 치료제는 없는 상태로, 분명한 효과 규명 및 장기적인 안전성 규명을 위한 추가적인 연구가 여전히 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 부작용은 현저히 낮으면서 류마티스 관절염의 예방 및 치료에 적합한 줄기세포를 포함하는 치료제에 대하여 연구하던 중, 중간엽줄기세포에 IL-10 유전자를 과발현하여 중간엽줄기세포의 줄기세포성이 증가되었으며, 관절염 발생률과 중증도를 억제 및 염증을 억제하는 효과가 현저하게 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, IL-10(Interleukin 10)을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 질환(rheumatoid disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 IL-10(Interleukin 10)을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 질환(rheumatoid disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽줄기세포인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 류마티스 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)인 것일 수 있다.
본 발명의 IL-10(Interleukin 10)을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포는 LPS에 의해 염증이 유발된 대식세포 및 관절염이 유발된 마우스 모델에서, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 억제하고, 인산화된 p38 단백질 및 인산화된 IκBα 단백질의 발현을 억제하는 항염증 효과와 관절염 발생률 및 중등도를 감소시키는 효과가 있으며, 이러한 항염증 및 관절염 억제능이 IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포 대비 현저하게 향상되는 효과가 있다.
도 1은 사람 지방유래 중간엽줄기세포에 IL-10 유전자를 도입하기 위한 렌티바이러스 발현벡터 맵(map)을 나타낸 것이다.
도 2는 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 IL-10 과발현 여부 및 줄기세포성을 분석한 결과를 나타낸 것이다; A: RT-PCR을 통한 IL-10 mRNA 발현확인 결과, B: ELISA를 통한 IL-10 단백질 발현 확인 결과 및 C: 면역표현형(Immunophenotyping)을 통해 줄기세포 표지마커를 확인한 결과.
도 3은 유체 분석기(Flow cytometry)를 통한 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 생산효율성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 염증매개 인자(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 발현분석을 통해 염증유발 대식세포주에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 항염증 효능 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 염증유발 대식세포주에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)에 의한 인산화된 p38 및 IκBα 단백질 발현변화 확인을 위한 웨스턴 블랏 분석 결과(A) 및 이를 정량화한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 6은 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여로 인한 관절염 발생률 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여로 인한 관절염 중등도 감소효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 IL-10 과발현 여부 및 줄기세포성을 분석한 결과를 나타낸 것이다; A: RT-PCR을 통한 IL-10 mRNA 발현확인 결과, B: ELISA를 통한 IL-10 단백질 발현 확인 결과 및 C: 면역표현형(Immunophenotyping)을 통해 줄기세포 표지마커를 확인한 결과.
도 3은 유체 분석기(Flow cytometry)를 통한 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 생산효율성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 염증매개 인자(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 발현분석을 통해 염증유발 대식세포주에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 항염증 효능 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 염증유발 대식세포주에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)에 의한 인산화된 p38 및 IκBα 단백질 발현변화 확인을 위한 웨스턴 블랏 분석 결과(A) 및 이를 정량화한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 6은 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여로 인한 관절염 발생률 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여로 인한 관절염 중등도 감소효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 IL-10(Interleukin 10)을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 질환(rheumatoid disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “~을 포함하는(comprising)”이란 “함유하는(including)” 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 “~로 구성되는(consisting of)”이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 “필수적으로 구성되는(essentially consisting of)”이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "발현(expression)"은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하며, “과발현(overexpression)"은 정상적인 상태 또는 일반적인 상태보다 특정 유전자의 발현의 수준이 과도하게 증가한 것을 의미한다. 본 발명에서 IL-10을 과발현하는 줄기세포는 구체적으로는 IL-10 유전자(mRNA) 또는 단백질의 발현 수준이 증가되어 있는 줄기세포이다.
본 발명에서 상기 IL-10은 인간 및 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 IL-10 유전자를 의미하며, 가장 바람직하게는 인간 IL-10 유전자일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)"는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방조직(fat tissue), 힘줄(건), 신경조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육세포(muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포(multipotent progenitor)를 말한다. 본 발명에서 중간엽줄기세포는 분화되지 않은 상태, 즉 줄기세포 상태로 조성물 중에 포함된다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며 바람직하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 중간엽줄기세포는 제대, 제대혈, 태반, 골수, 지방조직, 근육, 양수 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 유래한 것일 수 있으나, 지방 조직 유래 중간엽줄기세포인 것이 가장 바람직하다. 지방조직 유래의 중간엽줄기세포는 골수, 양수, 제대혈 줄기 세포와 달리 다량을 제공받을 수 있는 실용적인 장점을 가지고 있고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기 세포로 추정되고 있으며, 최근 선진국에서 광범위하게 이루어지고 있는 성형수술이 지방흡입술(liposuction)임을 고려하다면 사실상 지방유래 줄기세포는 무한적인 그 유용성이 높다. 또한, 지방 조직 유래 중간엽줄기세포는 다른 조직에서 유래된 줄기세포보다 IL-10 과발현시 항염증 및 관절염 억제능이 더 뛰어난 효과를 가질 수 있다.
일 구현예에서 중간엽줄기세포를 얻는 과정을 설명하면 다음과 같다: 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽줄기세포 소스, 예컨대, 지방조직, 혈액 또는 골수로부터 중간엽줄기세포를 분리한 다음, 이어 상기 세포를 적합한 배지에서 배양하고, 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 중간엽줄기세포를 수득하는 것일 수 있다. 지방 조직으로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 중간엽줄기세포를 분리할 수 있다. 상기 중간엽줄기세포의 분리는 종래 알려진 어떤 분리방법에 의해서도 분리될 수 있다. 예를 들면, 밀도차를 이용한 분리법(density gradient fractionation), 면역선택(immunoselection) 및 감별 부착 분리법(differential adhesion separation) 등이 있다. 지방 조직으로부터 중간엽줄기세포를 분리, 배양하는 방법은 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다.
상기에서 분리된 중간엽줄기세포의 배양은 당업계에 공지된 세포 배양용 배지에서 수행할 수 있으며, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, DMEM 배지, McCoys 5A 배지, Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 KSB-3 basal media등이 있다. 또한, 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있는데, 우태아혈청, 말 또는 인간 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용할 수 있다.
분리 또는 배양된 줄기세포는 사용 전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호(cyoprotection) 처리한 후 냉동 보관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨 , D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스 또는 콜린 클로라이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 줄기세포에서 IL-10을 과발현시키는 가장 일반적인 방법은 IL-10 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 줄기세포에 인위적으로 또는 실험적으로 도입하여 IL-10 유전자의 복제개수(copy number)를 증가시키는 것이다. 원래의 세포가 가지고 있던 것이 아닌 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내부로 주입하는 것을 형질감염(transfection), 그리고 이로 인하여 세포의 유전적 형질이 변화되는 현상을 형질전환(transformation)이라고 한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터를 통하여 세포 내부로 주입되는 과정을 형질도입(transduction)이라고 부른다. 본 명세서에서는 용어 ‘형질전환’, ‘형질감염’ 그리고 ‘형질도입’이 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입되어 정상형과 다른 유전적 형질을 갖게 된 것 또는 그러한 과정을 일컫는 것으로서 유사한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 핵산은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는것을 말한다. 즉, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 따른 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 IL-10 유전자가 삽입된 렌티바이러스 발현벡터(IL-10 Lentiviral Vector)를 중간엽줄기세포에 형질감염시켜 수득한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IL-10 유전자는 NCBI GenBank database의 BC104252.1에 공지된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IL-10 유전자가 삽입된 렌티바이러스 발현벡터는 pLenti-GIII-CMV(ABM INC. Lentiviral Vector Cat. No. LV188793)을 사용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 방법으로 제작된 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)에서 IL-10 유전자를 도입하지 않은 사람 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs) 대비 IL-10의 mRNA 및 단백질이 과발현되면서도, 줄기세포성이 유지되며, 안정적인 생산이 가능함을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명에서 류마티스 질환이란, ‘류마티즘(rheumatism)’이라는 단어에서 유래된 것으로서, 전신 결합조직 특히 관절 및 근육, 인대, 활액낭, 건(腱), 섬유조직 등을 침투하여 여러 질환을 일으키며 그곳에 염증, 변성, 대사장애를 특징적으로 하는 질환을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 골관절염(퇴행성관절염), 류마티스 관절염, 근막동통증후군, 섬유조직염, 점액낭염, 건염, 결정 유발성 질환(통풍, 가성통풍), 척추병증(강직성 척추염, 건선성관절염, 반응성관절염, 장병성관절염), 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발성 근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 베체트병을 포함한 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 상기 류마티스 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 하기 특성 중 적어도 한 가지 특성을 가지는 것을 특징으로 한다.
(a) TNF-α, IL-1β 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염증 유발 인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
(b) 인산화된 p38 단백질 및 인산화된 IκBα 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
(c) 류마티스 관절염의 발생률 및 중등도를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)가 LPS에 의해 염증이 유발된 대식세포에서 염증 유발 인자인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현을 감소시키며, 특히, IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs)에 비교하여 현저하게 감소시키는 항염증 효과가 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한 다른 일실시예에서는 본 발명의 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)가 LPS에 의해 염증이 유발된 대식세포에서 MAPKs 신호전달과정에서 인산화된 p38 단백질(p-p38)과 NF-κB 신호전달과정에서 인산화된 IκBα 단백질(p-IκBα)의 발현을 억제하여, NF-κB 활성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타냄을 확인하였으며, IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs)에 비해 향상된 항염증 효과를 가짐을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 콜라겐 타입 II(collagen type II) 단백질에 의해 류마티스 관절염을 유발시킨 마우스 모델에서, 본 발명의 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)가 관절염 발생률 및 중등도를 감소시키는 효과가 있으며, IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs)에 비교하여 관절염 발생률 및 중등도를 현저하게 감소시켜 관절염 억제효능이 매우 우수함을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 콜라겐 타입 II(collagen type II) 단백질에 의해 류마티스 관절염을 유발시킨 마우스 모델에서, 본 발명의 IL-10을 과발현하는 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)가 대조군 및 IL-10 유전자를 도입하지 않은 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs) 대비 무릎연골조직 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 현저하게 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
따라서 이상의 세포 실험과 동물 실험 결과는, IL-10 과발현으로 인하여 hATMSCs의 항염증 효과 및 류마티스 관절염 발생 억제능이 현저하게 향상됨을 보여주며, IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 류마티스 질환, 특히 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에서, 기존의 아무것도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포보다 더욱 효과적인 줄기세포 치료제로서 사용될 수 있음을 시사한다.
본 명세서에서 "치료"란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 시술을 의미하며, 임상적 병리의 예방을 위해서도 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
일 구현예에서, IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 줄기세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 조성물은 정맥 투여 또는 본 발명에 따른 세포 또는 조성물의 투여가 필요한 장기 예를 들면 관절, 골수강, 골조직 및/또는 병리학적으로 손상된 부위에 직접 주사되는 방식으로 투여될 수 있고, 정맥 주사되는 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 상기 조성물은 줄기세포 치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다.
본원에서 “세포치료제” 란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유효성분인 중간엽줄기세포는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 유효성분의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. IL-10 과발현 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)의 제작
IL-10 과발현 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 overexpressing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, IL-10 hATMSCs)를 제작하기 위하여, ABM Inc.으로부터 인간 IL-10 렌티바이러스 발현벡터[제품명: IL-10 Lentiviral Vector(Human)(CMV)(pLenti-GIII-CMV) Lentiviral Vector Cat. No. LV188793]를 제작 구매하였다. IL-10 렌티바이러스 발현벡터(IL-10 Lentiviral Vector)의 맵(map)은 도 1에 나타난 바와 같다.
K-STMECELL IRB(Institutional review board)의 동의 및 양해하에 얻은 사람 지방유래 중간엽줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, hATMSCs)는 항생제가 첨가된 RKCM 배양배지(10% FBS 첨가, K-STEMCELL에서 제공)에 배양되었다.
IL-10 Lentiviral Vector를 293FT cell에 형질주입(transfection) 및 조립(packaging)하여 얻은 바이러스 입자(virus particles)를 리포좀 형질감염(liposomal transfection)을 통해 사람 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSC)에 형질도입을 실시하여, IL-10 유전자 도입 사람 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs)를 수득하였다.
실시예 2. IL-10-hATMSCs의 줄기세포성 및 IL-10 과발현 분석
형질전환된 IL-10-hATMSCs의 줄기세포성 및 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs) 표지마커를 분석하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 IL-10-hATMSCs에서 RT-PCR 및 ELISA 분석을 통해 IL-10의 과발현을 확인하였으며, 유세포 분석(Flow cytometry)을 통해 stem cell 표지인자(양성마커: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, 음성마커:CD34, CD45, HLA-DR)의 발현분석을 실시하였다. 이때, 대조군으로 hATMSCs를 이용하였다.
RT-PCR 및 ELISA 분석 결과, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포에서 IL-10의 mRNA 및 단백질의 과발현을 확인하였으며(도 2A 및 도 2B), 유세포 분석기를 이용한 면역 표현형(immunophenotyping) 분석을 통해 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs) 양성표지 마커(CD73, CD90, CD105) 및 음성표지 마커(CD34, CD45, HLA-DR)가 IL-10 유전자 도입에 의해 변화하지 않았음을 확인함으로써, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 줄기세포성을 검증하였다(도 2C).
또한, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 생산효율성은 지방유래 중간엽줄기세포의 음성표지인자인 human CD34 항체와 human IL-10 항체를 이용한 유체 분석기(flow cytometry)를 통해 분석되었다. 그 결과 human CD34 negative/human IL-10 positive cell population이 88.28%였음을 확인하였다. 결과적으로, IL-10 유전자가 삽입된 렌티바이러스 입자(lentiviral particles)의 최적농도(MOI 100)로 지방유래 중간엽줄기세포에 처리하여 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 생산효율성(88%이상)을 증진시킴으로서 안정적인 생산시스템을 확보하였다(도 3).
실시예 3. LPS에 의해 염증반응이 유발된 대식세포에서 IL-10 hATMSCs의 세포의 항염증 효과 분석
IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 항염증 효과를 확인하기 위해, LPS에 의해 염증이 유발된 대식세포에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포(IL-10 hATMSCs) 또는 지방유래 중간엽줄기세포(hATMSCs)에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 발현을 qRT-PCR 분석 방법으로 평가하였다.
구체적으로, LPS (1μg/mL)로 염증유발시킨 대식세포주(RAW264.7 macrophage) 및 IL-10 hATMSCs 또는 hATMSCs를 트렌스웰(transwell)을 이용한 공동 배양 시스템(co-culture sytsem)에서 6h, 12h 및 24h 동안 배양한 후 대식세포로부터 total RNA 분리 킷드를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 분리하였고, cDNA 합성킷드를 이용하여 cDNA 합성을 실시하였다. 대식세포주에서 하기 표 1의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대한 시발체를 이용하여 qRT-PCR 분석을 통해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 발현을 정량적으로 분석하여, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 항염증 효과를 확인하였다.
| Gene | Forward(5'-3') | Reverse(5'-3') |
| TNF-α | AGCAAACCACCAAGTGGAGGA | GCTGGCACCACTAGTTGGTTGT |
| IL-1β | AGTTGACGGACCCCAAAAG | AGCTGGATGCTCTCATCAGG |
| IL-6 | CTACCAAACTGGATATAATCAGGA | CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA |
| GAPDH | AGGTCATCCCAGAGCTGAACG | CACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT |
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포는 염증 유발 대식세포주에 대해 염증 유발 인자인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 현저하게 감소시킴을 확인함으로써 항염증 효과가 뛰어나다는 사실을 확인하였다.
실시예 4. LPS에 의해 염증반응이 촉진된 대식세포에서 IL-10 hATMSCs의 세포의 항염증 작용기전 분석
LPS는 MAPKs 신호전달과정에서 인산화된 p38 단백질과 NF-κB 신호전달과정에서 인산화된 IκBα 단백질을 증가시키면서 염증반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. LPS에 의해 염증반응이 촉진된 대식세포에서 IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 세포의 항염증 작용기전을 검증하기 위해서 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 통해 항염증이 유발된 대식세포주에서 인산화된 p38 단백질과 인산화된 IκBα 단백질 발현을 분석하였다.
구체적으로, LPS (1μg/mL)로 염증을 유발시킨 대식세포주(RAW264.7 macrophage)와 IL-10 hATMSCs 또는 hATMSCs를 transwell를 이용한 공배양(co-culture)하여 24 h 후 대식세포로부터 총 단백질(total protein) 분리 킷드를 이용하여 total protein을 분리하였다. 인산화된 p38(p-p38) 및 인산화된 IκBα(p-IκBα) 항체를 이용하여 Western blot 분석을 실시하여 인산화된 p38 단백질과 인산화된 IκBα 단백질의 발현분석을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포는 염증유발 대식세포주에서 인산화된 p38 단백질과 인산화된 IκBα 단백질 발현을 현저하게 감소시켰다.
이러한 결과로부터, IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포는 항염증이 유발된 대식세포주에서 MAPKs 신호전달과정에서 인산화된 p38 단백질 발현과 NF-κB 활성을 억제함으로써 항염증 효능을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5. Collagen type II 단백질 투여로 인한 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여에 의한 관절염 발생률 및 관절염 중등도 분석
IL-10 유전자 도입 지방유래 중간엽줄기세포의 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 류마티스 관절염 유발 마우스 모델을 대상으로, 관절염 발생률 및 관절염 지수(중등도)를 평가하였다.
실험에 사용한 마우스는 7주령의 DBA/1 마우스(mouse)로, 특정 병원균이 없는 상태에서 표준 마우스 사료와 물로 사육하였으며, 보건복지부의 지침에 따른 윤리위원회의 규정에 따라 다루었다.
7주령 마우스(DBA/1) 암컷의 꼬리에 콜라겐 타입 II(Collagen type II) 단백질(2 μg)을 1차 주사하고 2주 후에 2차 주사하여 관절염 유발하였다. Collagen type II 단백질로 2차 주사 후 꼬리에 1 x 106 개의 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs를 정맥 주사하고 대조군에는 동량의 saline을 투여하였다.
주 2회 육안으로 발의 발적, 부종 및 기형의 발생유무를 관찰하여 각 시기별 관절염 발생률(% of arthritis)을 조사하였다.
관절염의 중등도를 평가하기 위하여, Collagen type II 단백질 주사 후 21일 후에 육안으로 발관절염을 확인하고 28일 후에 Isoflurane을 이용하여 호흡 마취한 후 피부를 절개하여 무릎 관절염을 확인하였다. 이때, 발적이나 부종 등 관절염의 증거가 없을 때는 0점, 1점은 한 두 개의 발가락에 종창을 동반한 홍조를 띄거나, 최소한의 종창이 유발된 상태, 2점은 확실한 홍조를 띄거나 국부적 상지종창, 그리고 이러한 것이 여러 발가락에서 관찰되는 경우이며, 3점은 무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되며 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태로 하는 기준에 따라 점수를 매기어 무릎 관절염의 지수(arthritis index)를 평가하였다. 각각의 발에서 나타나는 점수(score)는 네 발을 각각 평가한 후 합산하여 최대 12점이 되도록 하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 관절염의 발생은 모든 실험 동물군에서 collagen type II 단백질을 투여한 후 4주째부터 발생하기 시작하였다. 대조군에서는 시간이 경과하면서 관절염이 증가하여 type II collagen을 투여한 후 7주째에는 모든 군에서 관절염이 발생하였는데, 실험 시작 후 4주에 30%, 5주에 60%, 7주에 들어서는 100%의 마우스에서 관절염의 발생이 관찰되었다. hATMSCs 투여군에서는 관절염 발생률이 4주째부터 발생(20%)하였고, 6주째에 50%로 가장 많이 발생하였으며, 7 및 8주째에서는 40%로 감소하였다. IL-10 hATMSCs 투여군에서는 관절염 발생률이 4주째부터 발생(20%)하였고, 5 및 6주째에 40%으로 가장 많이 발생하였으며, 7 및 8주째에서는 20%로 감소함에 따라, haTMSCs 투여군 보다 관절염 발생률을 억제 하는 효과가 훨씬 우수함을 확인하였다.
관절염의 중등도를 관절염 지수(mean of arthritis index)로 평가한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 관절염의 중증도가 8주째까지 계속해서 증가하는 추세(4주: 2±0.31, 5주: 3.8±0.35, 6주: 5±0.56, 7주: 8.5±0.56, 8주: 8.8±0.55)를 보였다. hATMSCs 투여군에서는 대조군에 비해 관절염의 중등도의 감소를 관찰할 수 있었으며(4주: 1.5±0.32, 5주: 2.4±0.45, 6주: 3.8±0.28, 7주: 3.4±0.35, 8주: 3.2±0.44), 특히 IL-10 hATMSCs 투여군에서는 대조군에 비해 가장 현저한 관절염의 중등도의 감소를 보여주었다(4주: 1.4±0.23, 5주: 2.01±0.21, 6주: 3.2±0.24, 7주: 2.4±0.22, 8주: 2.2±0.25).
이러한 결과들로부터, collagen type II 단백질로 유발한 류마티스 관절염 유발 마우스모델에서 IL-10 hATMSCs 투여군 및 hATMSCs 투여군에서 관절염에 대한 억제효능이 있음을 확인하였으며, 특히 IL-10 hATMSCs는 관절염의 억제효능이 hATMSCs 대비 현저히 증가하여, 매우 뛰어난 관절염 억제 효능을 가짐을 확인하였다.
실시예 6. 류마티스 관절염 유발 동물모델에 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여 후 연골 조직 내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 유전자 발현분석
실시예 5의 관절염 발생률 및 관절염 중등도 분석 후, 류마티스 관절염 유발 동물모델로부터 무릎 연골 조직을 수득하여 염증 관련 인자들의 유전자 발현을 분석하였다.
무릎 연골 조직 내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 유전자의 발현을 분석하기 위해서 연골조직으로부터 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리하여 RNA 0.5 μg과 AccuPower RT PreMix (Bioneer)을 사용하여 cDNA 합성하였다. 합성된 cDNA 2 μl와 target primer, AccuPower GreenStar™ qPCR PreMix (Bioneer)와 Realtime-PCR machine (Exicycler96, Bioneer)를 사용하여 실시한 후 Ct값을 기준으로 fold change로 상대정량하여 비교하였다.
류마티스 관절염 유발 마우스모델의 무릎 연골조직에서 qRT-PCR에 의한 IL-1β, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| Normal | Control | hATMSCs | IL-10 hATMSCs | |
| IL-1β/GAPDH | 1 | 24.7±0.55 | 16.2±0.61 | 13.5±0.21 |
| IL-6/GAPDH | 1 | 65.1±0.77 | 47.0±1.5 | 31.5±1.8 |
| TNF-α/GAPDH | 1 | 3.2±0.33 | 1.8±0.15 | 1.5±0.29 |
Collagen type II 단백질을 투여한 후 7주째 마우스모델의 무릎 연골조직으로부터 qRT-PCR를 통해 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α mRNA 분석한 결과 정상군(Normal)에 비해 대조군(Control)에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현이 현저하게 증가하였음을 확인하였다(표 2). 이러한 결과는 collagen type II 단백질 투여로 인해 관절염이 현저하게 발생하였음을 보여준다. IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs 투여군은 대조군에 비해 IL-1β, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현이 감소하였으며, 특히 IL-10 hATMSCs 투여군에서 현저한 감소를 확인하였다(표 2). 이러한 결과는 IL-10 hATMSCs 및 hATMSCs의 투여는 관절염의 발생을 억제한다는 것을 보여주며, 특히 IL-10 hATMSCs의 투여는 관절염 발생에 대한 강한 억제효과가 있음을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- IL-10(Interleukin 10)을 과발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 질환(rheumatoid disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽줄기세포인 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 IL-10 유전자가 삽입된 렌티바이러스 발현벡터(IL-10 Lentiviral Vector)를 중간엽줄기세포에 형질감염시켜 수득한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 류마티스 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)인 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염증 유발 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 인산화된 p38 단백질 및 인산화된 IκBα 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 IL-10을 과발현하는 중간엽줄기세포는 류마티스 관절염의 발생률 및 중등도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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