JP2022045325A - サイトカインストーム抑制剤、サイトカインストーム抑制剤の使用方法およびスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】サイトカインストーム抑制剤の提供。【解決手段】歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含み、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；またはサイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である、サイトカインストーム抑制剤；サイトカインストーム抑制剤の使用方法；スクリーニング方法。【選択図】図３

Description

本発明は、サイトカインストーム抑制剤、サイトカインストーム抑制剤の使用方法およびスクリーニング方法に関する。

＜サイトカインストーム＞
サイトカインは、炎症反応と免疫応答に関与するタンパク質の総称であり、数百種類以上知られている。サイトカインは、それぞれ多彩な活性を有し、それらがバランス良く協調的に相互作用することで生体機能を維持または調節している。通常は感染症などに対する免疫応答によりサイトカインが産生・放出されるが、何らかの原因によりサイトカインの産生・放出が無秩序になって血液中の複数種類のサイトカイン濃度が異常上昇し、結果として生体内の組織を損傷することがある。血液中のサイトカイン濃度が異常上昇した状態を、サイトカインストーム（高サイトカイン血症）と呼ぶ。

サイトカインストームの原因やサイトカインストームを生じる疾患として、感染症、薬剤投与、高度の手術侵襲、敗血症、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全などが知られている。これらの中でも一番の原因は敗血症であり、最近ではウイルス血症、特にＣＯＶＩＤ－１９によりサイトカインストームを生じることが知られている（非特許文献１；Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ （２０２０） ４０：１４）。

動物実験では、リポポリサッカライド（ＬＰＳ。エンドトキシン）の投与により炎症性サイトカインの濃度上昇などの敗血症の症状が惹起され、サイトカインストームを誘導できる（非特許文献２：Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ （２０２０） １４４，１０９８６５）。

＜従来の免疫抑制剤の問題＞
サイトカインストームを抑制する方法として、トシリズマブなどの抗インターロイキン（ＩＬ）－６抗体やステロイドなどの免疫抑制剤によって、炎症性サイトカインなどのサイトカイン量を抑制する方法が広く知られている。例えば、非特許文献３（Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （２０１６） ７：１１４９８）には、ＬＰＳを投与したマウスに抗ＩＬ－６抗体を投与したところ、コントロールの抗体を投与したマウスではＬＰＳ投与から９６時間後にマウスすべてが死亡する条件で、生存率７５％であったことが記載されている。
しかし、抗ＩＬ６抗体やステロイドなどの免疫抑制剤などで炎症性サイトカインを抑える方法は、サイトカインストームを抑制するには不十分であり、サイトカインストームが生じた（近傍の）組織を修復することができない問題があった。そのため近年では、サイトカインストームを免疫抑制剤で治療しても、サイトカインストームに由来する後遺症が残ると考えられている。

特許第６３２７６４７号

Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ （２０２０） ４０：１４ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ （２０２０） １４４，１０９８６５ Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （２０１６） ７：１１４９８ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ （２０２０） ６：５４８－５５９） Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ （２０２０） １０：２２ ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳ ＆ ＲＥＤＯＸ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（２０２０）、 ３３、 ２ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＤＥＶＥＲＯＰＭＥＮＴ （２０２０）， ２９， １２， ７４７－７５４ Ｃｙｔｏｔｈｅａｐｙ ００ （Ｍａｙ ２， ２０００） １－４ Ｃｅｌｌｓ （２０１９） ８， １６０５ Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０２０）、８：５５４ Ｃｅｌｌｓ （２０１９） ８， １２４０ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． （２０１０） １１４、 １５６９－１５８０ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ． （２０１９） ７：ｅ８３１

なお、間葉系幹細胞の培養上清、すなわち単離されていないエクソソーム等の微小粒子を含む組成物が、サイトカイン関連の炎症を抑制することが知られている。例えば、特許文献１には、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物であって、炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、肺線維症、炎症性自己免疫疾患及び虚血性心疾患からなる群から選択される、組成物が記載されている。特許文献１の［００３３］には、炎症性疾患として、前炎症性サイトカインに応答する癌化学療法によって誘発されたショック（例えば前炎症性サイトカイン関連ショック）などの全身性の炎症が記載されている。しかし、特許文献１では、間葉系幹細胞のエクソソームについては検討されていなかった。

本発明が解決しようとする課題は、サイトカインストームに関わる複数のサイトカインを抑制でき、かつサイトカインストームによる組織損傷を抑制できるかサイトカインストームで損傷した組織を修復できるサイトカインストーム抑制剤を提供することである。

＜ＳＯＤ３とサイトカインストームの関係＞
ＩＦＮγとＴＮＦの存在下で、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）は組織の損傷を弱め、炎症を軽減することが知られている（非特許文献４；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ （２０２０） ６：５４８－５５９）。
ＳＯＤ３をＭＳＣが分泌することが知られており、ＭＳＣから分泌されるＳＯＤ３は抗酸化作用および免疫調節によって組織の修復をできることが知られている（非特許文献５；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ （２０２０） １０：２２）が、エクソソームについては記載がない。
高齢者の肺ではＳＯＤ３が少ない状態となっており、このことがサイトカインストームに由来するＣＯＶＩＤ－１９の重症化に関連することが示唆されている（非特許文献６；ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳ ＆ ＲＥＤＯＸ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（２０２０）、 ３３、 ２）。

＜ＭＳＣエクソソームとサイトカインストームの関係（ＳＯＤ３の示唆なし）＞
ＭＳＣエクソソームを用いてサイトカインストームを抑制することが知られているが、ＳＯＤ３がＭＳＣエクソソームのサイトカイン抑制に関与することは知られていない。
例えば、脂肪、骨髄、臍帯から単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはそれらの培養上清から単離されたＭＳＣエクソソームが炎症性サイトカインを抑制することや、サイトカインストームで損傷された組織を修復する効果が、非特許文献２（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ （２０２０） １４４，１０９８６５）のアブストラクトおよび２ページ右カラムに記載されているが、ＳＯＤ３については記載されていない。
ＭＳＣエクソソームによるサイトカインストームの抑制および治療計画が、非特許文献１（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ （２０２０） ４０：１４）の３ページ右カラムから４ページ左カラムに記載されているが、ＳＯＤ３については記載されていない。
骨髄由来ＭＳＣエクソソームによるサイトカインストームの下方制御が非特許文献７（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＤＥＶＥＲＯＰＭＥＮＴ （２０２０）， ２９， １２， ７４７－７５４）に記載されているが、ＳＯＤ３については書かれていない。
ＣＯＶＩＤ－１９肺炎にサイトカインストームが関連することや、ＣＯＶＩＤ－１９感染症の治療に間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）の細胞外小胞（エクソソーム）を用いる方法が有効であることが知られている（非特許文献８；Ｃｙｔｏｔｈｅａｐｙ ００ （Ｍａｙ ２， ２０００） １－４）が、ＳＯＤ３については記載されていない。
非特許文献９（Ｃｅｌｌｓ （２０１９） ８， １６０５）には、ＭＳＣエクソソームがＬＰＳ投与によって誘導された炎症を抑制する作用として、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの送達を通じて、オートファジーを活性化し、損傷した組織のアポトーシス、壊死および酸化ストレスを抑制し、再生を促進することが記載されているが、ＳＯＤ３については記載されていない。
非特許文献１０（Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０２０）、８：５５４．）には、サイトカインストーム状態の細胞や組織は酸化ストレスを受けており、ＭＳＣやエクソソームの投与により、炎症抑制、酸化ストレス抑制に加えて、肺の再生ができることが記載されているが、ＳＯＤ３については記載されていない。

＜ＭＳＣエクソソームによる組織修復（ＳＯＤ３もサイトカインストームも示唆なし）＞
非特許文献１１（Ｃｅｌｌｓ （２０１９） ８， １２４０）には、ＭＳＣエクソソームが損傷した腎臓を再生させることが記載されているが、ＳＯＤ３やサイトカインストームについては記載されていない。

＜ＭＳＣとＳＯＤ３の関係（エクソソームもサイトカインストームも示唆なし）＞
非特許文献１２（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． （２０１０） １１４、 １５６９－１５８０）には、骨髄由来ＭＳＣが分泌するＳＯＤ３が神経細胞を保護することが記載されているが、エクソソームについては記載されていない。
非特許文献１３（Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ． （２０１９） ７：ｅ８３１）には、ＳＯＤ３を高発現するＭＳＣによって虚血性脳卒中を抑制することが記載されているが、エクソソームについては記載されていない。

＜本発明における新たな知見＞
本発明者は、特定の間葉系幹細胞の培養上清に由来するエクソソーム等の微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）を多量に含み、かつ高いＳＯＤ活性を示すことを見出した。
そして、この微小粒子そのものがＬＰＳ投与により誘導されたサイトカインストームにおける炎症性サイトカイン等を直接的に抑えるだけでなく、この微小粒子に含まれるＳＯＤ３がサイトカインの中でもＩＦＮγおよびＴＮＦαの存在下で損傷した組織の修復を進めるか、組織の損傷が生じる前であればサイトカインストームによる組織損傷を抑制するという、相乗効果を奏することを見出した。

＜従来のサイトカインストーム抑制剤との作用機序の違い、高齢者への適用＞
これまで、エクソソーム中にＳＯＤ３タンパク質が存在することは知られていた。しかし、特定の間葉系幹細胞の培養上清に由来するエクソソームのＳＯＤ３活性が非常に高く、サイトカインストームにより損傷した組織を修復できる有効量以上含むことは、本発明者が初めて見出した知見である。この知見がなければ、サイトカインストームに関わるサイトカインを抑制でき、かつサイトカインストームによる組織損傷を抑制できるかサイトカインストームで損傷した組織を修復できるサイトカインストーム抑制剤を想到することはできないため、本発明のサイトカインストーム抑制剤は従来のサイトカインストーム抑制剤とは全く作用機序が異なるものである。
さらにＳＯＤ３が少ない高齢者（非特許文献６；ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳ ＆ ＲＥＤＯＸ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（２０２０）、 ３３、 ２）は、ＳＯＤ３が少ないためにサイトカインを抑制しただけでは組織の修復ができないことが予想されるが、本発明によれば高齢者のサイトカインストームで損傷した組織を顕著に修復できるか、組織の損傷が生じる前であればサイトカインストームによる組織損傷を顕著に抑制できる。

上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、特定の間葉系幹細胞の培養上清に由来するエクソソーム等の微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）を含み、かつ高いＳＯＤ活性を示すことを見出した。そして、本発明者らは、この微小粒子を用いることにより、サイトカインストームに関わる複数のサイトカインを顕著に抑制できることを見出した。
具体的に、本発明および本発明の好ましい構成は、以下のとおりである。

［１］ 歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含むサイトカインストーム抑制剤であって、
サイトカインストーム抑制剤は、培養上清ではなく、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、かつ、シグレック９を含まず、
サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；または
サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である、サイトカインストーム抑制剤。
［１－１］ 歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含み、
微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、
サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する、サイトカインストーム抑制剤。
［２］ 微小粒子がエクソソームである、［１］または［１－１］に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［３］ 微小粒子が培養上清から精製された微小粒子である、［１］、［１－１］または［２］に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［４］ 細胞中または血液中のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαをいずれも抑制する、［１］～［３］のいずれか一項（［１－１］を含む。以下、同様）に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［５］ サイトカインストーム状態のヒトまたはヒト以外の動物にサイトカインストーム抑制剤を投与する場合に、サイトカインストーム抑制剤を投与しない場合よりも生存率を高める、［１］～［４］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［６］ 微小粒子が、ＳＯＤ３を微小粒子１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［７］ ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上である、［１］～［６］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［８］ 微小粒子を０．０１×１０^８個／ｍｌ以上含む、［１］～［７］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［９］ 微小粒子を２．０×１０^９個／ｍｌ以上含む、［１］～［８］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１０］ 歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞または臍帯由来幹細胞が、ヒト歯髄由来幹細胞、ヒト脂肪由来幹細胞、ヒト骨髄由来幹細胞またはヒト臍帯由来幹細胞である、［１］～［９］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１１］ 微小粒子が歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子である、［１］～［１０］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１２］ サイトカインストームで損傷した組織が、肺組織である、［１］～［１１］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１３］ 歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞または臍帯由来幹細胞が、ＳＯＤを微小粒子に高発現するように遺伝子改変された、［１］～［１２］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１４］ 抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方を含む、［１］～［１３］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１５］ サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制してサイトカインストームで損傷する組織を修復する用途である、［１］～［１４］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１６］ サイトカインストーム抑制剤が組織修復剤である、［１］～［１５］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１６－１］ サイトカインストーム抑制剤が、培養上清から微小粒子を除いたものを含まない、［１］～［１６］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
［１７］ ［１］～［１６］および［１６－１］のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤をヒトまたはヒト以外の動物に投与して、
ヒトまたはヒト以外の動物の細胞中または血液中のサイトカイン量を減少させ、かつ、
サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する工程；または
サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する工程を含む、サイトカインストーム抑制剤の使用方法。
［１８］ サイトカインストーム抑制剤を、抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方と併用する、［１７］に記載のサイトカインストーム抑制剤の使用方法。
［１９］ サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する組織修復に有効な因子またはその組合せのスクリーニング方法であって、
歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１または２以上の成分を、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）に関する評価系に供給してＳＯＤ３に関する特性を評価する工程を備える、スクリーニング方法。
［２０］ ［１９］に記載のスクリーニング方法でＳＯＤ３に関する特性を評価されて取得された成分を含むサイトカインストーム抑制剤であって、
当該成分が歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来し、
当該成分が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、
サイトカインストーム抑制剤が、培養上清ではなく、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、かつ、シグレック９を含まず、
当該成分がＳＯＤ３を前記成分１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含むこと、および、ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上であることのうち少なくとも一方を満たし、
サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；または
サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である、サイトカインストーム抑制剤。

本発明によれば、サイトカインストームに関わる複数のサイトカインを抑制でき、かつサイトカインストームによる組織損傷を抑制できるかサイトカインストームで損傷した組織を修復できるサイトカインストーム抑制剤を提供することができる。

図１は、各実施例のサイトカインストーム抑制剤またはコントロールとして用いるＤＭＥＭ培地のＳＯＤ３のタンパク量を示したグラフである。 図２は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）投与されたマウスに対して、各実施例のサイトカインストーム抑制剤またはコントロールとして用いる生理食塩水（ＰＢＳコントロール）を１回投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。 図３は、ＬＰＳ投与されたマウスに対して、各実施例のサイトカインストーム抑制剤またはＰＢＳコントロールを２回投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。 図４は、ＬＰＳ投与されたマウスに対して、実施例１のサイトカインストーム抑制剤、歯髄由来幹細胞の培養上清またはＰＢＳコントロールを２回投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。 図５は、ＬＰＳ投与されたマウスに対して、実施例１のサイトカインストーム抑制剤、歯髄由来幹細胞またはＰＢＳコントロールを投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。 図６は、ＬＰＳ投与されたマウスに対して、実施例１のサイトカインストーム抑制剤、歯髄由来幹細胞の培養上清またはＰＢＳコントロールをＬＰＳ投与から６時間後と１８時間後の２回投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。 図７は、ＬＰＳ投与されたマウスに対して、実施例１のサイトカインストーム抑制剤、歯髄由来幹細胞の培養上清またはＰＢＳコントロールを０時間後と１２時間後の２回投与した場合の、ＬＰＳ投与後の経過時間と生存率との関係を示したグラフである。

以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。

［サイトカインストーム抑制剤］
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含み、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；またはサイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である。
本発明のサイトカインストーム抑制剤によれば、サイトカインストームに関わる複数のサイトカインを抑制でき、かつサイトカインストームによる組織損傷を抑制できるかサイトカインストームで損傷した組織を修復できる。
以下、本発明のサイトカインストーム抑制剤の好ましい態様について説明する。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；またはサイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、組織損傷抑制剤であることが好ましく、組織修復剤であることがより好ましい。
損傷した組織の修復には、組織の再生、一部再生、瘢痕を残した修復、保護などが含まれる。
組織の再生とは、損傷した組織が、形態的および機能的に元の組織と同等程度に復元されることを意味する。この場合、損傷した組織が、元の組織を構成する細胞と同じ細胞によって、組織の欠損が補充されることが好ましい。
組織の一部再生とは、損傷した組織が、形態的および機能的に元の組織と同等までではないが、ある程度は復元されることを意味する。この場合も、損傷した組織が、元の組織を構成する細胞と同じ細胞によって、組織の欠損が補充されることが好ましい。
組織の瘢痕を残した修復とは、損傷した組織が、瘢痕（肉芽細胞やコラーゲン繊維によって置換されたもの）を残して復元されることを意味する。この場合、損傷した組織が、形態的および機能的のうちいずれか一方において元の組織と同等程度に復元されてもよい。
組織の保護とは、損傷した組織の損傷度合いがさらに高まることを抑制することを意味する。
これらの中でも、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、組織の損傷抑制、再生または一部再生をできることが好ましい。

本発明では、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含むため、本発明のサイトカインストーム抑制剤はＳＯＤ３活性を有することが好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＳＯＤ３を１．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことがより好ましく、６．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことが特に好ましく、１０．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことがより特に好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤の好ましい態様は、ＳＯＤ３を好ましくは高濃度で含むことにより、ＳＯＤ３活性をより高めた態様である。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上であることが好ましく、０．４ｕｎｉｔ／μｇ以上であることがさらに好ましく、１．０ｕｎｉｔ／μｇ以上であることがより好ましく、３．０ｕｎｉｔ／μｇ以上であることが特に好ましく、４．０ｕｎｉｔ／μｇ以上であることがより特に好ましい。
微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含まない場合、ＳＯＤ３活性を高めることは困難である。本発明のサイトカインストーム抑制剤の好ましい態様は、ＳＯＤ３を十分に含む特定の微小粒子を、高濃度で含むことにより、このようにＳＯＤ３活性をより高めた態様である。

＜サイトカインストームで損傷した組織＞
サイトカインストームで損傷され、本発明のサイトカインストーム抑制剤で損傷抑制または修復できる組織の種類は特に制限はなく、すべての組織を挙げられる。サイトカインストームで損傷され、本発明のサイトカインストーム抑制剤で損傷抑制または修復できる組織は、すべての臓器、気管、神経および血管であることが好ましく、肺組織、心臓組織、肝臓組織、胆のう組織、脾臓組織、腎臓組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、直腸組織、膀胱組織、気管組織、神経組織、甲状腺組織、血管組織であることがより好ましく、肺組織、気管組織、血管組織であることが特に好ましく、肺組織であることがより特に好ましい。

＜サイトカインストームの抑制＞
（各種類のサイトカインの説明）
本発明の細胞修復剤が、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームによる組織損傷を抑制するかサイトカインストームで損傷した組織を修復する際、サイトカインを抑制する。抑制されるサイトカインとしては特に制限はない。抑制されるサイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαなどを挙げることができる。これら以外にその他の抑制されるサイトカインとして、ＩＬ－１、ＩＬ－１８、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１αなどが挙げられる。

ＩＬ－１は、炎症や感染防御に関与する炎症性サイトカインである。
ＩＬ－２は、細胞の免疫に関与するサイトカインである。ＩＬ－２の過剰発現は、Ｔ細胞のサブセットである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の選択的増加につながる。Ｔｒｅｇは、他の細胞の免疫応答を抑制することにより末梢性寛容を維持する作用を発揮している。末梢性寛容の破綻はヒトにおいて自己免疫疾患を引き起こすと考えられている。したがって、Ｔｒｅｇの免疫抑制能は自己免疫疾患の発症を防いでいると考えられている。また、Ｔｒｅｇはがんにも関与しており、充実性腫瘍および血液悪性腫瘍はＴｒｅｇ数の増加を伴う（特開２０２０－００２１５４号公報の［０００７］参照）。
ＩＬ－４は、ヘルパーＴ細胞からＴｈ２（ヘルパーＴ２型）サブセットへの分化に関与する非重複サイトカインであり、Ｔｈ２は未熟Ｂ細胞からＩｇＥ産生形質細胞への分化を促進する。ＩｇＥレベルはアレルギー性喘息において上昇する。したがって、ＩＬ－４はアレルギー性喘息の発症に関連する（特開２０２０－００２１５４号公報の［０００８］参照）。
ＩＬ－６は、Ｂ細胞分化因子；Ｂ細胞刺激因子－２；肝細胞刺激因子；ハイブリドーマ増殖因子；および形質細胞腫増殖因子である。ＩＬ－６は代表的な炎症性サイトカインであり、また、急性炎症応答の制御、ＢおよびＴ細胞分化を含む特定の免疫応答の調節、骨代謝、血小板産生、上皮増殖、月経、神経細胞分化、神経保護、加齢、癌、アルツハイマー病において起こる炎症反応などに関与する多機能サイトカインである。ＩＬ－６は、疲労、悪液質、自己免疫疾患、骨格系の疾患、癌、心臓疾患、肥満、糖尿病、喘息、アルツハイマー病および多発性硬化症を含む、多数の疾患および障害の発展に役割を果たすと考えられている（特開２０１９－０４７７８７号公報の［０００２］～［０００５］参照）。
ＩＬ－１０は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞で産生される１６０アミノ酸残基のホモ二量体のタンパク質である。ＩＬ－１０は、マクロファージ機能抑制、Ｂ細胞活性化などに関与することが知られている（再表２０１８／２１２２３７号公報の［００５２］参照）。また、抗炎症性サイトカインである。
ＩＬ－１７は、ＣＤ４記憶Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞で産生される１３２アミノ酸残基のタンパク質である。ＩＬ－１７は、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞からの炎症性サイトカイン産生などに関与することが知られている（再表２０１８／２１２２３７号公報の［００５３］参照）。
ＩＬ－１８は、ウイルス感染やがん活性酸素などにより、強いストレスが細胞にかかると放出される。
ＩＦＮ（インターフェロン）は、ウイルス複製の阻害、免疫細胞（例えばナチュラルキラー細胞及びマクロファージなど）を活性化する機能などを有する。ＩＦＮはＩ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、及びＩＩＩ型ＩＦＮに分けられる。その中でもＩＩ型ＩＦＮであるＩＦＮγは、活性化した免疫細胞により産生される多面的サイトカインであり、マクロファージ活性の増加、ＭＨＣ分子の発現の増加、およびＮＫ細胞活性の増加などの細胞応答を誘発することができる（特表２０２０－５２２２５４号公報の［０２０９］参照）。
ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ；腫瘍壊死因子）は、代表的な炎症性サイトカインである。ＴＮＦとして、ＴＮＦα、ＴＮＦβおよびＬＴβが知られている。この中でもＴＮＦαは二次リンパ器官の構造的および機能的組織化、アポトーシスおよび抗腫瘍活性、ウイルス複製の阻害、免疫調節ならびに炎症を含めたいくつもの重要な生活機能を媒介する。ＴＮＦはまた、自己免疫疾患の病理発生、急性期反応、敗血症性ショック、発熱および悪液質においても重要な役割を果たす（特開２０２０－０７９３０６号公報の［０００４］参照）。
ＭＩＧは、１型免疫応答をつかさどるサイトカインである。マクロファージや上皮細胞、血管内皮細胞などから産生され、Ｔｈ１細胞やＣＤ８Ｔ細胞、一部のマクロファージなどを炎症部位に遊走させる。
ＭＩＰ－１αは、マクロファージや線維芽細胞、上皮細胞、血管平滑筋細胞などから炎症に応じて産生されるサイトカインである。

これらのサイトカインの中でもＩＦＮγおよびＴＮＦαが重要である。サイトカインストームの場合に存在するＩＦＮγおよびＴＮＦαがエクソソームのＳＯＤ３と協調して（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ （２０２０） ６：５４８－５５９参照）、サイトカインストームに起因する組織損傷を修復することができる。ＩＦＮγおよびＴＮＦαは完全には抑制されず、ある程度は残存していることが、サイトカインストームに起因する組織損傷を修復しやすくする観点から好ましい。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、細胞中または血液中のＩＬ（インターロイキン）－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαからなる群のうち少なくとも２種類のサイトカインを抑制することが好ましく、これらの群のうち少なくとも４種類のサイトカインを抑制することがより好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαをいずれも抑制することが特に好ましく、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαをいずれも抑制することがより特に好ましい。
また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストーム状態のヒトまたはヒト以外の動物にサイトカインストーム抑制剤を投与する場合に細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）活性を高めることが好ましい。
また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストーム状態のヒトまたはヒト以外の動物にサイトカインストーム抑制剤を投与する場合に、サイトカインストーム抑制剤を投与しない場合よりも生存率を高めることが好ましい。

＜用途＞
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームに関する疾患、例えば感染症、薬剤投与、高度の手術侵襲、敗血症、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全、その他の炎症の治療薬または予防薬、あるいは、サイトカインストームの後遺症の治療薬または予防薬として用いることができる。本発明のサイトカインストーム抑制剤に含まれる微小粒子が含むＳＯＤ３は、サイトカインストームに関わる複数のサイトカインを抑制（下方調整）することができ、かつＩＦＮγおよびＴＮＦαと協調してサイトカインストームに起因する組織損傷を修復できるため、これらのコロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療薬または予防薬として用いることができる。実際、高齢者の肺ではＳＯＤ３が少ない状態となっており、このことがＣＯＶＩＤ－１９の重症化に関連することが示唆されている（ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳ ＆ ＲＥＤＯＸ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（２０２０）、 ３３、 ２）。また、サイトカインストーム状態の細胞は、酸化ストレスを受けていることが示唆されており（Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０２０）、８：５５４）、本発明のサイトカインストーム抑制剤に含まれる微小粒子が含む、高活性のＳＯＤ３が多量に投与されることにより、抗酸化作用を高めて、サイトカインストーム状態の細胞の酸化ストレスを抑制することができる。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、このようにサイトカインストームを抑制し、サイトカインストームに関する疾患を予防または治療し、サイトカインストームに関する疾患からの生存率を高めることができることに加えて、サイトカインストームに起因する組織損傷を修復することでサイトカインストームの後遺症の改善薬として用いられる。

ただし、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、これら以外の用途で用いてもよい。いずれの場合も本発明のサイトカインストーム抑制剤は、医薬組成物であることが好ましい。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、感染症や敗血症の中でも、ＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス症の治療薬または予防薬として用いることができる。ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶや、ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの一部のコロナウイルスなどがヒトやヒト以外の動物に感染すると、サイトカインストーム状態となる。
本出願の出願時では、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬としての薬理試験結果が示されなくても、本発明のサイトカインストーム抑制剤はＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として用いることができる（用いられる可能性がある）と言える。
ＣＯＶＩＤ－１９であること（新型コロナウイルス感染症であること）とは、ヒトまたはヒト以外の動物の生体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞を有することを意味する。感染症は、特に、呼吸器試料から検出またはウイルス滴定を行う方法や、血液循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体を検出する方法などによって確認でき、その際はＰＣＲを用いた公知の方法を用いられる。
ＣＯＶＩＤ－１９の予防とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるヒトまたはヒト以外の動物の生体における感染を阻止する、あるいは少なくともその発生の可能性を減少させることを意味する。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として用いてもよい。ＣＯＶＩＤ－１９の治療とは、ヒトまたはヒト以外の動物の生体においてウイルス感染に関連する症状（呼吸器症候群、発熱等）を減らすこと、弱めること、またはその症状の回復期間を短くすることを意味する。本発明のサイトカインストーム抑制剤の投与によって、ヒトまたは動物の生体のウイルス感染率（感染力価）が減少することが好ましく、ウイルスが生体から完全に消滅することがより好ましい。
さらに、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＣＯＶＩＤ－１９の後遺症の予防薬または治療薬として用いられる。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームに起因する組織損傷を修復することができるため、サイトカインストームの後遺症に起因すると考えられているＣＯＶＩＤ－１９の後遺症の予防薬または治療薬として用いられる。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、従来のサイトカインストーム抑制剤や免疫抑制剤として用いることができる組成物と比較して、大量生産しやすい、従来は産業廃棄物等として廃棄されていた幹細胞の培養液を利活用できる、幹細胞の培養液の廃棄コストを減らせる等の利点がある。特に歯髄由来幹細胞等の培養上清が、ヒト歯髄由来幹細胞、ヒト脂肪由来幹細胞、ヒト骨髄由来幹細胞またはヒト臍帯由来幹細胞の培養上清である場合は、本発明のサイトカインストーム抑制剤をヒトに対して適用する場合に、免疫学上などの観点での安全性が高く、倫理性の問題も少ないという利点もある。歯髄由来幹細胞等の培養上清が、種々の疾患患者（不妊症など）からの歯髄由来幹細胞等の培養上清である場合は、本発明のサイトカインストーム抑制剤をその患者に対して適用する際により安全性が高まり、倫理性の問題も少なくなるであろう。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来するため、修復医療の用途にも用いられる。特に歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物は、修復医療の用途に好ましく用いられる。ここで、幹細胞移植を前提とした再生医療において、幹細胞は再生の主役ではなく、幹細胞の産生する液性成分が自己の幹細胞とともに臓器を修復させる、ということが知られている。従来の幹細胞移植に伴うがん化、規格化、投与方法、保存性、培養方法などの困難な問題が解決され、歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子を用いた組成物により修復医療が可能となる。幹細胞移植と比較すると、本発明のサイトカインストーム抑制剤を用いた修復では細胞を移植しないために腫瘍化などが起こりにくく、より安全と言えるだろう。また、歯髄由来幹細胞等の培養上清や、本発明のサイトカインストーム抑制剤は一定に規格化した品質のものを使用できる利点がある。大量生産や効率的な投与方法を選択することができるので、低コストで利用ができる。

＜微小粒子＞
本発明では、歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子を用い、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含む。微小粒子は、例えば、歯髄由来幹細胞等からの分泌、出芽または分散などにより、歯髄由来幹細胞等から導き出され、細胞培養培地に浸出、放出または脱落する。そのため、微小粒子は、歯髄由来幹細胞等の培養上清に含まれる。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を、培養上清から精製した状態で用いられる。すなわち、微小粒子が培養上清から精製された微小粒子であることが好ましい。
微小粒子の由来は、公知の方法で判別することができる。例えば、微小粒子は、Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ （２０１８） ８：２に記載の方法で、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞のいずれに由来するか判別することができる。具体的には、微小粒子のｍｉＲＮＡパターンに基づいて、それぞれの微小粒子の由来を判別することができる。

本発明では、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）を含む。ここで、ＳＯＤ３はＳＯＤの１種類である。ＳＯＤは、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ_２ ^－）を酸素（Ｏ_２）と過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）に不均化する酵素である。ＳＯＤは、酸素を代謝している細胞中に偏在し、酸素が媒介するフリーラジカル損傷から細胞を保護できる。ＳＯＤは金属コファクターと局在の違いにより４種類に分類されており、ＳＯＤ３は細胞外液または膜に結合したＳＯＤである。

（微小粒子の特性）
微小粒子は、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソーム（Ｅｃｔｏｓｏｍｅ）およびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）、またはマイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択される少なくとも１種類であることが好ましく、エクソソームであることがより好ましい。
微小粒子の直径は、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
微小粒子は、ＳＯＤ３をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含む。微小粒子は、ＳＯＤ３を微小粒子１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことがより好ましく、６．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことが特に好ましく、１０．０ｎｇ／ｍｇ以上含むことがより特に好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤の好ましい態様は、ＳＯＤ３をこのように十分に含む特定の微小粒子を、好ましくは高濃度で含むことにより、ＳＯＤ３活性をより高めた態様である。
微小粒子は、ＳＯＤ３活性が高いことが、サイトカインストームを抑制しやすい観点からより好ましい。
また、微小粒子の表面には、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などのテトラスパニンという分子が存在することが望ましく、それはＣＤ９単独、ＣＤ６３単独、ＣＤ８１単独でもよく、あるいはそれらの２つないしは３つのどの組み合わせでも良い。
以下、微小粒子として、エクソソームを用いる場合の好ましい態様を説明することがあるが、本発明の微小粒子はエクソソームに限定されない。

エクソソームは、原形質膜との多胞体の融合時に細胞から放出される細胞外小胞であることが好ましい。
エクソソームの表面は、歯髄由来幹細胞等の細胞膜由来の脂質およびタンパク質を含むことが好ましい。
エクソソームの内部には、核酸（マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡなど）およびタンパク質など歯髄由来幹細胞等の細胞内の物質を含むことが好ましい。
エクソソームは、ある細胞から別の細胞への遺伝情報の輸送による、細胞と細胞とのコミュニケーションのために使用されることが知られている。エクソソームは、容易に追跡可能であり、特異的な領域に標的化され得る。

（微小粒子の含有量）
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子の含有量は特に制限はない。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子を０．５×１０^８個以上含むことが好ましく、１．０×１０^８個以上含むことがより好ましく、２．０×１０^８個以上含むことが特に好ましく、１．０×１０^９個以上含むことがより特に好ましく、２．０×１０^９個以上含むことがさらにより特に好ましい。
また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子の含有濃度は特に制限はない。本発明のサイトカインストーム抑制剤は微小粒子を０．０１×１０^８個／ｍＬ以上含むことが好ましく、０．０５×１０^８個／ｍＬ以上含むことがより好ましく、０．１×１０^８個／ｍＬ以上含むことが特に好ましく、１．０×１０^９個／ｍＬ以上含むことがより特に好ましく、２．０×１０^９個／ｍＬ以上含むことがさらにより特に好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤の好ましい態様は、ＳＯＤ３を十分に含む特定の微小粒子を、このように高濃度で含むことにより、ＳＯＤ３活性をより高めた態様である。

（歯髄由来幹細胞等の培養上清）
歯髄由来幹細胞等の培養上清は、特に制限はない。
歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清を実質的に含まないことが好ましい。例えば、歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清の含有量が１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。

－歯髄由来幹細胞等－
歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞は、ヒト由来であっても、ヒト以外の動物由来であってもよい。ヒト以外の動物としては、後述する本発明のサイトカインストーム抑制剤を投与する対象の動物（生物種）と同様のものを挙げることができ、哺乳動物が好ましい。

培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞としては、特に制限はない。脱落乳歯歯髄幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ ｔｅｅｔｈ）や、その他の方法で入手される乳歯歯髄幹細胞や、永久歯歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＤＰＳＣ）を用いることができる。ヒト乳歯歯髄幹細胞やヒト永久歯歯髄幹細胞の他、ブタ乳歯歯髄幹細胞などのヒト以外の動物由来の歯髄由来幹細胞を用いることができる。
歯髄由来幹細胞（後述の脂肪由来幹細胞や骨髄由来幹細胞や臍帯由来幹細胞も同様）は、エクソソームに加え、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）－１および－３、ＴＧＦ－α、ＫＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＳＰＡＲＣ、その他の成長因子、ケモカイン等の種々のサイトカインを産生し得る。また、その他の多くの生理活性物質を産生し得る。
本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞が、多くのタンパク質が含まれる歯髄由来幹細胞であることが特に好ましく、乳歯歯髄幹細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明では、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を用いることが好ましい。

培養上清に用いられる脂肪由来幹細胞としては、特に制限はない。脂肪由来幹細胞として、任意の脂肪組織に含まれる体性幹細胞を用いることができる。ヒト脂肪由来幹細胞の他、ブタ脂肪幹細胞などのヒト以外の動物由来の脂肪由来幹細胞を用いることができる。脂肪由来幹細胞としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１８／０３８１８０号の［００２３］～［００４１］に記載の方法で調製された脂肪由来幹細胞を用いることができ、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。また、特開２０１８－５３１９７９号公報の［００２２］および［０１７２］～［０１８７］に記載の方法で調製された脂肪由来幹細胞を用いることができ、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。

培養上清に用いられる骨髄由来幹細胞としては、特に制限はない。ヒト骨髄由来幹細胞の他、ブタ骨髄幹細胞などのヒト以外の動物由来の骨髄由来幹細胞を用いることができる。骨髄由来幹細胞としては、例えば、特開２０１７－１３２７４４号公報の［００２７］～［００２８］および［００４８］に記載の方法で調製された骨髄由来幹細胞を用いることができ、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。

培養上清に用いられる臍帯由来幹細胞としては、特に制限はない。ヒト臍帯由来幹細胞の他、ブタ臍帯幹細胞などのヒト以外の動物由来の臍帯由来幹細胞を用いることができる。臍帯由来幹細胞としては、例えば、特開２０１７－１１９６４６号公報の［００２３］～［００３３］に記載の方法で調製された臍帯由来幹細胞を用いることができ、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。

本発明に用いられる歯髄由来幹細胞等は、目的の処置を達成することができれば、天然のものであってもよく、遺伝子改変したものであってもよい。
特に本発明では、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞の不死化幹細胞を用いることができる。実質的に無限増殖が可能な不死化幹細胞を用いることで、幹細胞の培養上清中に含まれる生体因子の量と組成を、長期間にわたって安定させることができる。歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞の不死化幹細胞としては、特に制限はない。不死化幹細胞は、癌化していない不死化幹細胞であることが好ましい。歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞の不死化幹細胞は、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞に、以下の低分子化合物（阻害剤）を単独または組み合わせて添加して培養することにより、調製することができる。
ＴＧＦβ受容体阻害薬としては、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル）ピリジン－４－イルアミン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（以上、メルク社）、ＳＢ４３１５４２（シグマアルドリッチ社）などが挙げられる。好ましくはＡ－８３－０１が挙げられる。
ＲＯＣＫ阻害薬としては、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害薬としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２（以上、富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。好ましくはＹ－２７６３２が挙げられる。
ＧＳＫ３阻害薬としては、ＧＳＫ－３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３，グリコーゲン合成酵素３）を阻害するものであれば特に限定されることはなく、Ａ １０７０７２２、ＢＩＯ、ＢＩＯ－ａｃｅｔｏｘｉｍｅ（以上、ＴＯＣＲＩＳ社）などが挙げられる。
ＭＥＫ阻害薬としては、ＭＥＫ（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ－ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６－９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ（以上、Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５（以上、コスモ・バイオ株式会社）などが挙げられる。

本発明に用いられる歯髄由来幹細胞等は、ＳＯＤ３を微小粒子に高発現するように遺伝子改変されたものであることが、本発明のサイトカインストーム抑制剤の奏する効果を増強する観点から好ましい。ＳＯＤを微小粒子に高発現する遺伝子改変技術は特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ． （２０１９） ７：ｅ８３１に記載されている方法を用いることができる。

本発明のサイトカインストーム抑制剤を再生医療に用いる場合、再生医療等安全性確保法の要請から、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞（歯髄由来幹細胞等）の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物は、歯髄由来幹細胞等以外のその他の体性幹細胞を含有しない態様とする。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞等以外の間葉系幹細胞やその他の体性幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。
間葉系幹細胞以外のその他の体性幹細胞の例としては、真皮系、消化系、骨髄系、神経系等に由来する幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。真皮系の体性幹細胞の例としては、上皮幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。消化系の体性幹細胞の例としては膵臓（全般の）幹細胞、肝幹細胞等が含まれる。（間葉系幹細胞以外の）骨髄系の体性幹細胞の例としては、造血幹細胞等が含まれる。神経系の体性幹細胞の例としては、神経幹細胞、網膜幹細胞等が含まれる。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、体性幹細胞以外の幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。体性幹細胞以外の幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）が含まれる。
歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清の調製方法としては特に制限はなく、従来の方法を用いることができる。
歯髄由来幹細胞等の培養上清は、歯髄由来幹細胞等を培養して得られる培養液であり、細胞そのものを含まない。例えば歯髄由来幹細胞等の培養後に細胞成分を分離除去することによって、本発明に使用可能な培養上清を得ることができる。各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。

歯髄由来幹細胞等の培養上清を得るための歯髄由来幹細胞等は、常法により選別可能であり、細胞の大きさや形態に基づいて、または接着性細胞として選別可能である。歯髄由来幹細胞の場合には、脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞から、接着性細胞またはその継代細胞として選別することができる。脂肪由来幹細胞の場合には、脂肪組織から採取した脂肪細胞から、接着性細胞またはその継代細胞として選別することができる。臍帯由来幹細胞の場合には、臍帯から採取した細胞から、接着性細胞またはその継代細胞として選別することができる。歯髄由来幹細胞等の培養上清には、選別された幹細胞を培養して得られた培養上清を用いることができる。

なお、「歯髄由来幹細胞等の培養上清」は、歯髄由来幹細胞等を培養して得られる細胞そのものを含まない培養液であることが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞等の培養上清は、その一態様では全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まないことが好ましい。当該態様の組成物はこの特徴によって、歯髄由来幹細胞等自体は当然のこと、歯髄由来幹細胞等を含む各種組成物と明確に区別される。この態様の典型例は、歯髄由来幹細胞等を含まず、歯髄由来幹細胞等の培養上清のみで構成された組成物である。
本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞および大人歯髄由来幹細胞の両方の培養上清を含んでいてもよい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清を有効成分として含むことが好ましく、５０質量％以上含むことがより好ましく、９０質量％以上含むことが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清のみで構成された組成物であることがより特に好ましい。

培養上清を得るための歯髄由来幹細胞等の培養液には基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。なお、基本培地としてはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
但し、血清を含まない「歯髄由来幹細胞等の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後または最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄由来幹細胞等を培養することによって、血清を含まない歯髄由来幹細胞等の培養上清を調製することができる。１回または複数回の継代培養を行うことにし、最後または最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞等の培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞等の培養上清を得ることができる。

培養上清を得るための歯髄由来幹細胞等の培養には、通常用いられる条件をそのまま適用することができる。歯髄由来幹細胞等の培養上清の調製方法については、幹細胞の種類に応じて幹細胞の単離および選抜工程を適宜調整する以外は、後述する細胞培養方法と同様とすればよい。歯髄由来幹細胞等の種類に応じた歯髄由来幹細胞等の単離および選抜は、当業者であれば適宜行うことができる。
また、歯髄由来幹細胞等の培養には、ＳＯＤ３発現および／またはＳＯＤ３活性に寄与する特定のエクソソームを多量に生産させるために、特別な条件を適用してもよい。特別な条件として、例えば、低温条件、低酸素条件、微重力条件など、何らかの刺激物と共培養する条件などを挙げることができる。

－歯髄由来幹細胞等の培養上清に含まれるその他の成分－
本発明でエクソソームの調製に用いる歯髄由来幹細胞等の培養上清は、歯髄由来幹細胞等の培養上清の他にその他の成分を含んでいてもよいが、その他の成分を実質的に含まないことが好ましい。
ただし、エクソソームの調製に使用する各種類の添加剤を、歯髄由来幹細胞等の培養上清に添加してから保存しておいてもよい。

（微小粒子の精製）
歯髄由来幹細胞等の培養上清から、微小粒子を精製することができる。
微小粒子の精製は、歯髄由来幹細胞等の培養上清から微小粒子を含む画分の分離であることが好ましく、微小粒子の単離であることがより好ましい。
微小粒子は、微小粒子の特性に基づいて非会合成分から分離されることにより、単離され得る。例えば、微小粒子は、分子量、サイズ、形態、組成または生物学的活性に基づいて単離され得る。
本発明では、歯髄由来幹細胞等の培養上清を遠心処理して得られた、微小粒子を多く含む特定の画分（例えば沈殿物）を分取することにより、微小粒子を精製することができる。所定の画分以外の画分の不要成分（不溶成分）は除去してもよい。本発明のサイトカインストーム抑制剤からの、溶媒および分散媒、ならびに不要成分の除去は完全な除去でなくてもよい。遠心処理の条件を例示すると、１００～２００００ｇで、１～３０分間である。
本発明では、歯髄由来幹細胞等の培養上清またはその遠心処理物を、ろ過処理することにより、微小粒子を精製することができる。ろ過処理によって不要成分を除去することができる。また、適切な孔径のろ過膜を使用すれば、不要成分の除去と滅菌処理を同時に行うことができる。ろ過処理に使用するろ過膜の材質、孔径などは特に限定されない。公知の方法で、適切な分子量またはサイズカットオフのろ過膜でろ過をすることができる。ろ過膜の孔径はエクソソームを分取しやすい観点から、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
本発明では、歯髄由来幹細胞等の培養上清またはその遠心処理物あるいはそれらのろ過処理物を、ラムクロマトグラフィーなど、さらなる分離手段を用いて分離することができる。例えば様々なカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用できる。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムを使用できる。
各処理段階におけるそれぞれの画分中で、微小粒子（またはその活性）を追跡するために、微小粒子の１つ以上の特性または生物学的活性を使用できる。例えば、微小粒子を追跡するために、光散乱、屈折率、動的光散乱またはＵＶ－可視光検出器を使用できる。または、それぞれの画分中の活性を追跡するために、ＡＣＥ２の発現レベルやＡＣＥ２活性などを使用できる。
微小粒子の精製方法として、特表２０１９－５２４８２４号公報の［００３４］～［００６４］に記載の方法を用いてもよく、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。

＜その他の成分＞
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子の他に、投与する対象の動物の種類や目的に応じて、本発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、栄養成分、抗生物質、サイトカイン、保護剤、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤などを挙げられる。
栄養成分としては、例えば、脂肪酸等、ビタミン等を挙げることができる。
抗生物質としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等が挙げられる。
担体としては、薬学的に許容可能な担体として公知の材料を挙げることができる。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子それ自体であってもよく、薬学的に許容可能な担体や賦形剤などをさらに含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物の目的は、投与対象への微小粒子の投与を促進することである。

薬学的に許容可能な担体は、投与対象に対して顕著な刺激性を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しない担体（希釈剤を含む）であることが好ましい。担体の例は、プロピレングリコール；（生理）食塩水；エマルション；緩衝液；培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど；フリーラジカルを除去する成分を含有する低温保存培地である。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、従来公知のサイトカインストーム抑制剤および／または免疫抑制剤の有効成分を含んでいてもよい。例えば、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、抗ＩＬ－６抗体やステロイドなどの本発明とは機序が異なる有効成分を含むことが、効果が増強、両立および／または相補される観点から好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤は、抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方を含むことがより好ましく、抗ＩＬ－６抗体を含むことが特に好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤が抗ＩＬ－６抗体やステロイドなどの本発明とは機序が異なる有効成分を含む場合、このような有効成分の含有量や含有濃度は公知の方法と同じでもよく異なってもよい。これらは、当業者であれば用途や投与対象などにあわせて適切に変更することができる。

一方、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、所定の物質を含まないことが好ましい。
例えば、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞等を含まないことが好ましい。
また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＭＣＰ－１を含まないことが好ましい。ただし、ＭＣＰ－１以外のサイトカインを含んでいてもよい。その他のサイトカインとしては、特開２０１８－０２３３４３号公報の［００１４］～［００２０］に記載のもの等が挙げられる。
また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、シグレック９を含まないことが好ましい。ただし、シグレック９以外のその他のシアル酸結合免疫グロブリン様レクチンを含んでいてもよい。
なお、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）を実質的に含まないことが好ましい。また、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）などの従来の血清代替物を実質的に含まないことが好ましい。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、上記したその他の成分の含有量（固形分量）がいずれも１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。

＜サイトカインストーム抑制剤の製造方法＞
本発明のサイトカインストーム抑制剤の製造方法は、特に制限はない。
歯髄由来幹細胞等の培養上清を上記した方法で調製し、続けて歯髄由来幹細胞等の培養上清から微小粒子を精製して、本発明のサイトカインストーム抑制剤を調製してもよい。あるいは、商業的に購入して入手した歯髄由来幹細胞等の培養上清から微小粒子を精製して、本発明のサイトカインストーム抑制剤を調製してもよい。さらには、廃棄処理されていた歯髄由来幹細胞等の培養上清を含む組成物を譲り受けて（またはその組成物を適宜精製して）、そこから微小粒子を精製して、本発明のサイトカインストーム抑制剤を調製してもよい。

本発明のサイトカインストーム抑制剤の最終的な形態は、特に制限はない。例えば、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、微小粒子を溶媒または分散媒とともに容器に充填してなる形態；微小粒子をゲルとともにゲル化して容器に充填してなる形態；微小粒子を凍結および／または乾燥して固形化して製剤化または容器に充填してなる形態などが挙げられる。容器としては、例えば凍結保存に適したチューブ、遠沈管、バッグなどが挙げられる。凍結温度は、例えば－２０℃～－１９６℃とすることができる。

［サイトカインストーム抑制剤の使用方法］
本発明のサイトカインストーム抑制剤の使用方法は、本発明のサイトカインストーム抑制剤をヒトまたはヒト以外の動物に投与して、ヒトまたはヒト以外の動物の細胞中または血液中のサイトカイン量を減少させ、かつ、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する。

本発明のサイトカインストーム抑制剤をヒトまたはヒト以外の動物に投与する工程は特に制限はない。
投与方法は、口腔、鼻腔または気道への噴霧または吸引、点滴、局所投与、点鼻薬などを挙げることができ、侵襲が少ないことが好ましい。局所投与の方法としては、注射が好ましい。また、皮膚表面に電圧（電気パルス）をかけることにより細胞膜に一時的に微細な穴をあけ、通常のケアでは届かない真皮層まで有効成分を浸透させられるエレクトロポレーションも好ましい。局所投与する場合、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与などを挙げることができ、動脈内投与または静脈内投与であることがより好ましく、静脈内投与であることがより好ましい。
本発明のサイトカインストーム抑制剤は、肺組織への適用に限られず、全身の組織（全臓器や血管など）への適用が可能である。そのため、投与方法は、口腔、鼻腔または気道への噴霧または吸引よりも、動脈内投与または静脈内投与であることが全身の組織に適用しやすい観点からより好ましく、静脈内投与であることが特に好ましい。動物に投与された本発明のサイトカインストーム抑制剤は動物の体内を循環し、所定の組織に到達してもよい。
投与回数および投与間隔は、特に制限はない。投与回数は１から２回以上とすることができ、１～５回であることが好ましく、１または２回であることがより好ましく、２回であることが特に好ましい。投与間隔は、１～２４時間であることが好ましく、１２時間以内であることがより好ましい。ただし、投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。
投与量は、微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含むため、特に制限はない。マウスモデルでは、マウス１匹（約２５ｇ）当たり１～５０μｇであることが好ましく、３～２５μｇであることがより好ましく、５～１５μｇであることがより特に好ましい。その他の動物に投与する場合、０．０４～２ｍｇ／ｋｇ（重量／体重）であることが好ましく、０．１～１ｍｇ／ｋｇであることがより好ましく、０．２～０．６ｍｇ／ｋｇであることが特に好ましい。ただし、投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。
投与開始時期は、特に制限はない。投与開始時期は、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前であっても、サイトカインストームによる組織の損傷が生じた後であってもよい。本発明では、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前であることが、より生存率を高める観点から好ましい。すなわち、本発明のサイトカインストーム抑制剤およびその使用方法は、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームによる組織の損傷を抑制する用途またはサイトカインストームで損傷する組織を修復する用途であることが好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤およびその使用方法は、サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームによる組織の損傷を抑制する用途であることがより好ましい。
一方、本発明のサイトカインストーム抑制剤およびその使用方法は、サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する用途であることも好ましい。
投与開始時期に関して、図６のＬＰＳ投与から６時間後および１８時間後の投与、すなわちサイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与される場合に生存率が高まることが示されている。図６の場合よりも、図７のＬＰＳ投与から０時間後（サイトカインストームが生じた瞬間）および１２時間後の投与、すなわちサイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対してサイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与する方が、さらに生存率が高まることが示されている。なお、ヒトまたはヒト以外の動物へのウイルスへの感染、ウイルスの増殖、および免疫細胞によるサイトカインストームの発生まで進行し、サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前の状態が、ＬＰＳ投与０時間後の状態である。
生存率を高める観点から、具体的な投与開始時期は、サイトカインストームの発生から６時間以内であることが好ましく、３時間以内であることがより好ましく、１時間以内であることが特に好ましく、サイトカインストームの発生する（と考えられる）時期と同時であることがより特に好ましい。

本発明のサイトカインストーム抑制剤を投与する対象の動物（生物種）は、特に制限はない。本発明のサイトカインストーム抑制剤を投与する対象の動物は、哺乳動物、鳥類（ニワトリ、ウズラ、カモなど）、魚類（サケ、マス、マグロ、カツオなど）であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒトであっても、非ヒト哺乳動物であってもよいが、ヒトであることが特に好ましい。非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターであることがより好ましい。

本発明のサイトカインストーム抑制剤は、従来公知のサイトカインストーム抑制剤および／または免疫抑制剤と併用してもよい。例えば、本発明のサイトカインストーム抑制剤を、抗ＩＬ－６抗体やステロイドなどの本発明とは機序が異なる薬剤と併用することが、効果が増強、両立および／または相補される観点から好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤の使用方法では、本発明のサイトカインストーム抑制剤を、抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方と併用することがより好ましく、抗ＩＬ－６抗体と併用することが特に好ましい。本発明のサイトカインストーム抑制剤と、抗ＩＬ－６抗体やステロイドなどの本発明とは機序が異なる薬剤とを併用する場合、このような薬剤の投与量、投与回数、投与時期は公知の方法と同じでもよく異なってもよい。また、本発明のサイトカインストーム抑制剤と、抗ＩＬ－６抗体やステロイドなどの本発明とは機序が異なる薬剤とを併用する場合、両者の投与回数や投与時期は同じでもよく異なってもよい。これらは、当業者であれば用途や投与対象などにあわせて適切に変更することができる。
抗ＩＬ－６抗体の機序は、敗血症（サイトカインストーム）を増悪させる因子である、辺縁体Ｂ細胞が産生するＩＬ－６の機能を阻害するという機序である（Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （２０１６） ７：１１４９８）。この論文には、ＬＰＳ投与後１時間後では、代表的な炎症性サイトカインであるＩＬ－６やＴＮＦαはマクロファージから多量に産生され、辺縁体Ｂ細胞からわずかしか産生されないが、ＬＰＳ投与後４時間後には辺縁体Ｂ細胞はマクロファージよりＩＬ－６を多く産生することが示されている。
また、ステロイドの機序は、細胞質のグルココルチコイド（ＧＲ）に結合して活性型ＧＲを形成し、核のＤＮＡや転写制御因子に遺伝子発現を調節し、サイトカイン合成（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＦＮγ）を抑制することなどにより抗炎症作用、免疫抑制作用を発揮するものであることが知られている。

［スクリーニング方法］
本発明のスクリーニング方法は、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する組織修復に有効な因子またはその組合せのスクリーニング方法であって、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１または２以上の成分を、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）に関する評価系に供給してＳＯＤ３に関する特性を評価する工程を備える。

本発明のスクリーニング方法によれば、歯髄由来幹細胞等の培養上清に含まれる成分のうち、どの成分がサイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する組織修復に対して有効であるかを、ＳＯＤ３に関する評価系に供給してＳＯＤ３に関する特性を評価することによってスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法では、当該成分のＳＯＤ３に関する特性を評価した結果、例えば精製された後のＳＯＤ３タンパク量が好ましくは１．０ｎｇ／ｍｇ以上である成分を特定して取得することが好ましい。また、例えば、精製された後のＳＯＤ３活性が好ましくは０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上である成分を特定して取得することが好ましい。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、スクリーニングによって特定された成分を有効成分として含有するサイトカインストーム抑制剤、あるいは、予防または治療用組成物を取得できる。スクリーニングによって取得されたサイトカインストーム抑制剤、あるいは、予防または治療用組成物は、歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来しないで、市販および／または精製等された特定成分を組み合わせることで有効なサイトカインストーム抑制剤、あるいは、予防または治療用組成物を得ることができる。すなわち、本発明は、本発明のスクリーニング方法でＳＯＤ３に関する特性を評価されて取得された成分を含むサイトカインストーム抑制剤であって、当該成分が歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来し、当該成分が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、当該成分がＳＯＤ３を前記成分１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含むこと、および、ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上であることのうち少なくとも一方を満たし、サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する、サイトカインストーム抑制剤にも関する。
当該成分のＳＯＤ３タンパク量およびＳＯＤ活性のより好ましい範囲は、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を用いるサイトカインストーム抑制剤の場合のＳＯＤ３タンパク量およびＳＯＤ活性のより好ましい範囲と同様である。

本発明のスクリーニング方法で用いるＳＯＤ３に関する評価系は、公知の評価系を用いることができる。例えば、本明細書に記載のＳＯＤ３の定量方法や、ＳＯＤ３活性の測定方法を各種類のサイトカインストーム関連疾患のモデルマウスに適用できるほか、関連する細胞を用いた評価系を適宜選択して利用できる。こうした各種類の評価系については、当業者であれば適宜選択でき、本明細書の実施例も参照できる。

本発明のスクリーニング方法でＳＯＤ３に関する特性を評価されて取得される成分としては、上述したとおり、歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子（好ましくはエクソソーム）を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法では、その他の歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する成分のＳＯＤ３に関する特性を評価して取得することができる。上述したとおり、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清は、エクソソームなどの微小粒子に加え、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ）、ＴＧＦ－β－１および－３、ＴＧＦ－α、ＫＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＳＰＡＲＣ、その他の成長因子、ケモカイン等の種々のサイトカイン、その他の多くの生理活性物質を含む。

以下に実施例と比較例または参考例とを挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

［実施例１］
＜歯髄由来幹細胞の培養上清の調製＞
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２混合培地の代わりにＤＭＥＭ培地を用い、その他は特許第６２９６６２２号の実施例６に記載の方法に準じて、ヒト乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製した。初代培養ではウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加して培養し、継代培養では初代培養液を用いて培養した継代培養液の上清をＦＢＳが含まれないように分取し、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製した。なお、ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地であり、Ｆ１２はハムＦ１２培地である。

＜歯髄由来幹細胞の培養上清からのエクソソームの調製＞
得られた乳歯歯髄幹細胞の培養上清から、歯髄由来幹細胞のエクソソームを以下の方法で精製した。
乳歯歯髄幹細胞の培養上清（１００ｍＬ）を０．２２マイクロメーターのポアサイズのフィルターで濾過したのち、その溶液を、６０分間、４℃で１０００００×ｇで遠心分離した。上清をデカントし、エクソソーム濃縮ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。再懸濁サンプルを、６０分間１０００００×ｇで遠心分離した。再度ペレットを濃縮サンプルとして遠心チューブの底から回収した（およそ１００μｌ）。タンパク濃度は、マイクロＢＳＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。エクソソームを含む組成物（濃縮溶液）は、－８０℃で保管した。
得られたエクソソーム（歯髄由来幹細胞ＥＶｓ）を含む組成物を、実施例１のサイトカインストーム抑制剤とした。

［実施例２］ 脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（エクソソーム）の調製
脂肪由来幹細胞を用いた以外は実施例１と同様にして、脂肪由来幹細胞の培養上清を調製した。得られた脂肪由来幹細胞の培養上清から、エクソソームを含む組成物を実施例１と同様にして調製した。得られたエクソソーム（脂肪由来幹細胞ＥＶｓ）含む組成物を実施例２のサイトカインストーム抑制剤とした。

［実施例３］ 骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（エクソソーム）の調製
骨髄由来幹細胞を用いた以外は実施例１と同様にして、骨髄由来幹細胞の培養上清を調製した。得られた骨髄由来幹細胞の培養上清から、エクソソームを含む組成物を実施例１と同様にして調製した。得られたエクソソーム（骨髄由来幹細胞ＥＶｓを含む組成物を実施例３のサイトカインストーム抑制剤とした。

［実施例４］ 臍帯由来幹細胞ＥＶｓ（エクソソーム）の調製
臍帯由来幹細胞を用いた以外は実施例１と同様にして、臍帯由来幹細胞の培養上清を調製した。得られた臍帯由来幹細胞の培養上清から、エクソソームを含む組成物を実施例１と同様にして調製した。得られたエクソソーム（臍帯由来幹細胞ＥＶｓを含む組成物を実施例４のサイトカインストーム抑制剤とした。

［評価］
＜エクソソームの特性＞
各実施例のサイトカインストーム抑制剤に含まれる微小粒子の平均粒径は５０～１５０ｎｍであった。
各実施例のサイトカインストーム抑制剤は１．０×１０^９個／ｍｌ以上の高濃度エクソソーム溶液であり、特に実施例１のサイトカインストーム抑制剤は２．０×１０^９個／ｍｌの高濃度エクソソーム溶液であった。
また、得られた各実施例のサイトカインストーム抑制剤の成分を公知の方法で分析した。その結果、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、歯髄由来幹細胞等の幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、シグレック９も含まないことがわかった。そのため、間葉系幹細胞の培養上清の有効成分であるＭＣＰ－１およびシグレック９ならびにこれらの類縁体とは異なる有効成分が、各実施例のサイトカインストーム抑制剤の有効成分であることがわかった。

＜ＳＯＤ３の定量＞
ＳＯＤ３（Ｈｕｍａｎ） ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａ－Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（ＬＳＲ）製、品番ＬＦＥＫ０１０７）を用いて、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１のサイトカインストーム抑制剤）、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２のサイトカインストーム抑制剤）、臍帯由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３のサイトカインストーム抑制剤）、骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例４のサイトカインストーム抑制剤）、コントロールとして用いたＤＭＥＭ培地のＳＯＤ３のタンパク量を、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法により測定した（Ｎ＝２）。得られた結果を図１に示した。

図１より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤に含まれるエクソソームはＳＯＤ３を多量に含むことがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）または臍帯由来幹細胞ＥＶｓ（実施例４）よりもＳＯＤ３のタンパク量が多いことがわかった。これらの結果から、本発明のサイトカインストーム抑制剤は、ＳＯＤ３を高濃度で含むためサイトカインの発現を調整できることがわかった。また、ＳＯＤ３のタンパク量が多いほど、よりサイトカインの発現を調整しやすくなり、サイトカインストーム状態の各種類のサイトカイン量を減らしやすくなる。

＜ＳＯＤ３活性の測定＞
Ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓｘｐｒｅｓｓ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ Ｋｉｔ （ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＮＣ製）を用いて、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１のサイトカインストーム抑制剤）、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２のサイトカインストーム抑制剤）、臍帯由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３のサイトカインストーム抑制剤）、骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例４のサイトカインストーム抑制剤）のＳＯＤ３（Ｈｕｍａｎ）活性を測定した。
測定の際、各実施例のサイトカインストーム抑制剤のエクソソーム濃度および使用量を同じとし、エクソソーム量を同量にした。得られた結果を下記表１に示した。

上記表１より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、ＳＯＤ３活性が高いことがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）または臍帯由来幹細胞ＥＶｓ（実施例４）よりもＳＯＤ３活性が高いことがわかった。ＳＯＤ３活性の確認の方が、ＳＯＤ３タンパク量の確認よりも、サイトカイン量の調整しやすさの確認方法として正確である。ＳＯＤ３活性が高いほど、よりサイトカインの発現を調整しやすくなり、サイトカインストーム状態の各種類のサイトカイン量を減らしやすくなる。

＜ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカインストーム抑制の確認＞
ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ－ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を用いたサイトカインストームの誘導を行い、エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤によるサイトカインストーム抑制効果を、以下の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。
ヒトＰＭＢＣを培養し、サイトカインストーム誘導剤であるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ－Ａ、富士フイルム和光純薬（株）製）にて刺激し、サイトカインストームを誘導した。
この系に、各実施例のサイトカインストーム抑制剤およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を添加する処理をし、ヒトＰＭＢＣの培養上清に含まれるサイトカインの定量をサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製、商品名Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）で行った。定量化したサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαである。
エクソソームを含む実施例１～３のサイトカインストーム抑制剤の添加は、ＰＭＢＣの細胞あたり、１００ｐａｒｔｉｃｌｅｓとなるように処理した。エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤での処理後、４８時間後のサイトカイン量を測定した（Ｎ＝６）。
得られた結果を下記表２に示した。

上記表２より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導されて各サイトカイン量が多くなった細胞に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、サイトカイン量を顕著に抑制できることがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）および骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）よりもサイトカイン量を顕著に抑制できることがわかった。
なお、実施例４の臍帯由来幹細胞ＥＶｓは使用しなかったが、実施例２の脂肪由来幹細胞ＥＶＳと実施例３の骨髄由来幹細胞ＥＶｓの間のＳＯＤ３タンパク量およびＳＯＤ３活性を有することから、実施例２と３の中間程度の傾向のサイトカイン量の調整ができると推測される。

＜ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインストーム抑制の確認＞
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤によるサイトカインストーム抑制効果を、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の８週令のマウスを１群あたり６匹ずつ用いた。
各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。
リポポリサッカライド投与直後に、各マウスの尾静脈から各実施例のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を、それぞれ同量の１０μｇ投与した。
２４時間後に全採血を行い、マウスのサイトカインストームにおける血清を分取した。マウスのサイトカインストームにおける血清に含まれるサイトカインの定量をＩｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ４８－Ｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（登録商標） Ｐａｎｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で行った。あわせて、リポポリサッカライドを投与する前の正常マウスについても、全採血を行い、血清に含まれるサイトカインの定量を同様に行った。定量化したサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαである。
得られた結果を下記表３に示した。

上記表３より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導されて各サイトカイン量が多くなった動物（マウス）に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、サイトカイン量を顕著に抑制できることがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）および骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）よりもサイトカイン量を顕著に抑制できることがわかった。
なお、実施例４の臍帯由来幹細胞ＥＶｓは使用しなかったが、実施例２の脂肪由来幹細胞ＥＶＳと実施例３の骨髄由来幹細胞ＥＶｓの間のＳＯＤ３タンパク量およびＳＯＤ３活性を有することから、実施例２と３の中間程度の傾向のサイトカイン量の調整ができると推測される。

＜ＬＰＳ投与による致死的障害マウスモデルの生存率の評価（１）＞
（１）１回投与の効果の確認
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤による生存率の改善効果を、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｓｌｃ：ＩＣＲ系統のマウスを１群あたり１０匹ずつ用いた。
各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。この条件は、９６時間以内にマウスをすべて死亡する過酷な条件である。
ＬＰＳ投与から６時間後に、各マウスの尾静脈から各実施例のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を、マウス１匹あたりそれぞれ同量の１０μｇ投与した。
ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図２に示した。
図２より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導された動物（マウス）に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、生存率を顕著に改善できることがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）および骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）よりも生存率を顕著に改善できることがわかった。
この生存率の改善は、各実施例のサイトカインストーム抑制剤がサイトカインストームで損傷した組織も修復している可能性を示唆している。

＜ＬＰＳ投与による致死的障害マウスモデルの生存率の評価（２）＞
（２）２回投与の効果の確認
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤による生存率の改善効果を、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｓｌｃ：ＩＣＲ系統のマウスを１群あたり１０匹ずつ用いた。
各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。
ＬＰＳ投与から６時間後に、投与１回目として、各マウスの尾静脈から各実施例のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を、マウス１匹あたりそれぞれ同量の１０μｇ投与した。
ＬＰＳ投与から１８時間後に、投与２回目として、各マウスの尾静脈から各実施例のサイトカインストーム抑制剤およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を、マウス１匹あたりそれぞれ同量の１０μｇ投与した。
ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図３に示した。
図３より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導された動物（マウス）に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、生存率を顕著に改善できることがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）および骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）よりも生存率を顕著に改善できることがわかった。
この生存率の改善は、各実施例のサイトカインストーム抑制剤がサイトカインストームで損傷した組織も修復している可能性を示唆している。
さらに、図２の結果と図３の結果の比較より、各実施例のサイトカインストーム抑制剤の２回目の投与により、１回投与する場合よりも生存率を顕著に改善できることがわかった。
なお、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （２０１６） ７：１１４９８によれば、ＬＰＳを１匹あたり６００μｇ投与したＣ５７ＢＬ／６系統のマウスに、抗ＩＬ－６抗体を投与したところ、コントロールの抗体を投与したマウスではＬＰＳ投与から９６時間後にマウスすべてが死亡する条件で、生存率７５％であったことが記載されている。この論文の記載と、図２および図３の結果の比較から、マウスや実験系の違いはあるものの、各実施例のサイトカインストーム抑制剤（特に実施例１のサイトカインストーム抑制剤）は、生存率の評価において抗ＩＬ－６抗体とほぼ同等の効果を奏することがわかった。

＜ＬＰＳ投与による致死的障害マウスモデルの生存率の評価（３）＞
（３）精製された微小粒子と培養上清の比較
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤による生存率の改善効果を、歯髄由来幹細胞の培養上清を直接用いる場合と比較して、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｓｌｃ：ＩＣＲ系統のマウスを１群あたり５匹ずつ用いた。
各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。
ＬＰＳ投与から６時間後に、投与１回目として、各マウスの尾静脈から実施例１のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）をマウス１匹あたり１０μｇ、歯髄由来幹細胞の培養上清をマウス１匹あたり０．５ｍｌおよびコントロールである生理食塩水をマウス１匹あたり１０μｇずつ、それぞれ投与した。用いた歯髄由来幹細胞の培養上清０．５ｍｌは、実施例１のサイトカインストーム抑制剤１０μｇに相当する量のエクソソームを含む。
ＬＰＳ投与から１８時間後に、投与２回目として、各マウスの尾静脈から実施例１のサイトカインストーム抑制剤、歯髄由来幹細胞の培養上清をおよびコントロールである生理食塩水を投与１回目と同量投与した。
ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図４に示した。
図４より、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導された動物（マウス）に対して投与されることで、歯髄由来幹細胞の培養上清を直接用いる場合および生理食塩水を投与したコントロールと比較して、生存率を顕著に改善できることがわかった。
歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤の生存率の改善は、歯髄由来幹細胞の培養上清を直接用いる場合よりも、サイトカインストームで損傷した組織をより修復している可能性を示唆している。

＜ＬＰＳ投与による致死的障害マウスモデルの生存率の評価（４）＞
（４）精製された微小粒子と幹細胞の比較
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤による生存率の改善効果を、歯髄由来幹細胞を直接用いる場合と比較して、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｓｌｃ：ＩＣＲ系統のマウスを１群あたり５匹ずつ用いた。
各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。
ＬＰＳ投与から６時間後に、各マウスの尾静脈から実施例１のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）をマウス１匹あたり１０μｇ、歯髄由来幹細胞をマウス１匹あたり２×１０^６セルおよびコントロールである生理食塩水をマウス１匹あたり１０μｇずつ、それぞれ投与した。用いた歯髄由来幹細胞の量（マウス１匹あたり２×１０^６セル）は、通常の動物への細胞投与の最大数（致死しない最大数）であり、比較実験としては適切な量である。
ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図５に示した。
図５より、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導された動物（マウス）に対して投与されることで、歯髄由来幹細胞を直接用いる場合および生理食塩水を投与したコントロールと比較して、生存率を顕著に改善できることがわかった。
歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤の生存率の改善は、歯髄由来幹細胞を直接用いる場合よりも、サイトカインストームで損傷した組織をより修復している可能性を示唆している。

＜ＬＰＳ投与による致死的障害マウスモデルの生存率の評価（５）＞
（５）２回投与の時期の比較
マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤による生存率の改善効果を、歯髄由来幹細胞の培養上清を直接用いる場合と比較しつつ、２回投与の時期による影響を生存率の評価（３）の場合と比べる目的で、以下の方法でｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
Ｓｌｃ：ＩＣＲ系統のマウスを１群あたり５匹ずつ用いた。

まず、生存率の評価（３）と同様に、各マウスに対してＬＰＳ投与を行い、ＬＰＳ投与から６時間後および１８時間後に実施例１のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）をマウス１匹あたり１０μｇ、歯髄由来幹細胞の培養上清をマウス１匹あたり０．５ｍｌおよびコントロールである生理食塩水をマウス１匹あたり１０μｇずつ、それぞれ投与した。ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図６に示した。

次に、各マウスに対してＬＰＳ投与を行い、ＬＰＳ投与から０時間後（ＬＰＳ投与と同時）および１２時間後に実施例１のサイトカインストーム抑制剤（超遠心法によって精製）をマウス１匹あたり１０μｇ、歯髄由来幹細胞の培養上清をマウス１匹あたり０．５ｍｌおよびコントロールである生理食塩水をマウス１匹あたり１０μｇずつ、それぞれ投与した。ＬＰＳ投与から１２時間後から１２時間ごとに、各群のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図７に示した。

図６および図７より、歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導された動物（マウス）に対して、図７のようにサイトカインストーム発生（ＬＰＳ投与）と同時（０時間後）および１２時間後に２回投与されることで、図６のようにサイトカインストーム発生（ＬＰＳ投与）から６時間後および１８時間後に２回投与される場合よりも、さらに生存率を顕著に改善できることがわかった。
歯髄由来幹細胞エクソソームを含む実施例１のサイトカインストーム抑制剤の生存率の改善は、歯髄由来幹細胞の培養上清を直接用いる場合よりも、サイトカインストームで損傷した組織をより修復している可能性を示唆している。

＜損傷した組織の修復＞
生存率の評価（１）～（５）に用いたマウスについて、エクソソームを含む各実施例のサイトカインストーム抑制剤が、サイトカインストームで損傷した全身の組織、特にあらゆる臓器を修復する効果を、各マウスの肺、肝臓などの全臓器の組織の写真に基づいて確認した。
その結果、各実施例のサイトカインストーム抑制剤は、サイトカインストームを誘導されて各サイトカイン量が多くなった動物（マウス）に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、サイトカインストームで損傷した各組織を修復できることがわかった。特に、歯髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例１）は、脂肪由来幹細胞ＥＶｓ（実施例２）および骨髄由来幹細胞ＥＶｓ（実施例３）よりも、サイトカインストームで損傷した肺組織や肝臓組織を顕著に修復できることがわかった。
この損傷した組織の修復は、サイトカインストームの後遺症を改善することを示唆している。

Claims (20)

1. 歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含むサイトカインストーム抑制剤であって、
   前記微小粒子が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、
   前記サイトカインストーム抑制剤は、前記培養上清ではなく、前記歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、かつ、シグレック９を含まず、
   サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；または
   サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である、サイトカインストーム抑制剤。
2. 前記微小粒子がエクソソームである、請求項１に記載のサイトカインストーム抑制剤。
3. 前記微小粒子が前記培養上清から精製された微小粒子である、請求項１または２に記載のサイトカインストーム抑制剤。
4. 細胞中または血液中のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαをいずれも抑制する、請求項１～３のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
5. サイトカインストーム状態のヒトまたはヒト以外の動物に前記サイトカインストーム抑制剤を投与する場合に、前記サイトカインストーム抑制剤を投与しない場合よりも生存率を高める、請求項１～４のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
6. 前記微小粒子が、前記ＳＯＤ３を前記微小粒子１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
7. 前記ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
8. 前記微小粒子を０．０１×１０^８個／ｍｌ以上含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
9. 前記微小粒子を２．０×１０^９個／ｍｌ以上含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
10. 前記歯髄由来幹細胞、前記脂肪由来幹細胞、前記骨髄由来幹細胞または前記臍帯由来幹細胞が、ヒト歯髄由来幹細胞、ヒト脂肪由来幹細胞、ヒト骨髄由来幹細胞またはヒト臍帯由来幹細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
11. 前記微小粒子が前記歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
12. 前記サイトカインストームで損傷した前記組織が、肺組織である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
13. 前記歯髄由来幹細胞、前記脂肪由来幹細胞、前記骨髄由来幹細胞または前記臍帯由来幹細胞が、前記ＳＯＤを前記微小粒子に高発現するように遺伝子改変された、請求項１～１２のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
14. 抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
15. サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制してサイトカインストームで損傷する組織を修復する用途である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
16. 前記サイトカインストーム抑制剤が組織修復剤である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のサイトカインストーム抑制剤をヒトまたはヒト以外の動物に投与して、
    前記ヒトまたは前記ヒト以外の動物の細胞中または血液中のサイトカイン量を減少させ、かつ、
    サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する工程；または
    サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームで損傷した組織を修復する工程を含む、サイトカインストーム抑制剤の使用方法。
18. 前記サイトカインストーム抑制剤を、抗ＩＬ－６抗体およびステロイドのうち少なくとも一方と併用する、請求項１７に記載のサイトカインストーム抑制剤の使用方法。
19. サイトカインストームの抑制を通じてサイトカインストームで損傷した組織を修復する組織修復に有効な因子またはその組合せのスクリーニング方法であって、
    歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１または２以上の成分を、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）に関する評価系に供給して前記ＳＯＤ３に関する特性を評価する工程を備える、スクリーニング方法。
20. 請求項１９に記載のスクリーニング方法で前記ＳＯＤ３に関する特性を評価されて取得された成分を含むサイトカインストーム抑制剤であって、
    前記成分が歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清に由来し、
    前記成分が細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）をサイトカインストームにより損傷した組織または細胞を修復できる有効量以上含み、
    前記サイトカインストーム抑制剤が、前記培養上清ではなく、前記歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、かつ、シグレック９を含まず、
    前記成分がＳＯＤ３を前記成分１ｍｇあたり１．０ｎｇ／ｍｇ以上含むこと、および、ＳＯＤ３活性が０．３ｕｎｉｔ／μｇ以上であることのうち少なくとも一方を満たし、
    サイトカインストームが生じているヒトまたはヒト以外の動物に対して前記サイトカインストームによる組織の損傷が生じる前に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームによる組織損傷を抑制する用途；または
    サイトカインストームによる組織の損傷が生じているヒトまたはヒト以外の動物に投与されて、サイトカインストームの抑制を通じて前記サイトカインストームで損傷した組織を修復する用途である、サイトカインストーム抑制剤。

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