WO2024049158A1 - 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 - Google Patents
말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2024049158A1 WO2024049158A1 PCT/KR2023/012770 KR2023012770W WO2024049158A1 WO 2024049158 A1 WO2024049158 A1 WO 2024049158A1 KR 2023012770 W KR2023012770 W KR 2023012770W WO 2024049158 A1 WO2024049158 A1 WO 2024049158A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- stem cells
- peripheral blood
- derived stem
- cells
- medium
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 102
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 26
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 9
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 9
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 8
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 claims description 8
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 7
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 5
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 14
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 14
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 12
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 10
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 10
- MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N iron;sulfuric acid Chemical compound [Fe].OS(O)(=O)=O MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 7
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 7
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 6
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 6
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 5
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 5
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 description 4
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010061619 Deformity Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010031149 Osteitis Diseases 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 208000018339 bone inflammation disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 208000017568 chondrodysplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention establishes conditions for effectively separating and culturing stem cells existing in peripheral blood, and provides a composition for differentiation and treatment into progenitor cells that can differentiate into somatic cells of various target tissues by utilizing the stem cells. .
- Stem cells can be obtained by separating them from various tissues, such as fat, bone marrow, and umbilical cord blood, through a surgical method with the patient's consent.
- the present invention provides a method for effectively isolating and culturing stem cells from peripheral blood.
- compositions for differentiation and treatment into progenitor cells that can differentiate into somatic cells of various target tissues such as cartilage, myocardium, and nerves using peripheral blood-derived stem cells.
- the purpose of the present invention is to provide a method for effectively separating and proliferating stem cells from peripheral blood.
- Another object of the present invention includes interferon-gamma (Interferon- ⁇ , INF- ⁇ ) and growth factors, wherein the growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF) and transforming growth factor.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- derived from peripheral blood containing one or more growth factors selected from the group consisting of growth factor- ⁇ , TGF- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF).
- VEGF vascular endothelial growth factor
- bFGF basic fibroblast growth factor
- Another object of the present invention is to provide a method for cultivating peripheral blood-derived stem cells, comprising the step of isolating and culturing the stem cells attached to the peripheral blood-derived cells in a cell culture medium containing the medium composition for attachment of peripheral blood-derived stem cells. It is provided.
- the present invention includes interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and growth factors, and the growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF), conversion Containing one or more growth factors selected from the group consisting of transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF).
- VEGF vascular endothelial growth factor
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- EGF epidermal growth factor
- bFGF basic fibroblast growth factor
- the present invention provides one or more substances selected from the group consisting of interferon-gamma (INF- ⁇ ), interferon-alpha (IFN- ⁇ ), and TNF-alpha (TNF- ⁇ ); and a medium composition for attachment of peripheral blood derived stem cells containing growth factors.
- INF- ⁇ interferon-gamma
- IFN- ⁇ interferon-alpha
- TNF- ⁇ TNF-alpha
- the composition of the medium used for attachment of peripheral blood-derived stem cells of the present invention is not limited, but the basic medium includes 1 to 20% fetal bovine serum (FBS) and auto serum (Auto serum). It may include one or more materials selected from the group consisting of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimum Essential Media Eagle), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12), and ⁇ - It may be a medium selected from the group consisting of MEM, but is not limited thereto.
- FBS fetal bovine serum
- Auto serum Auto serum
- DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
- MEM Minimum Essential Media Eagle
- DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
- ⁇ - It may be a medium selected from the group consisting of MEM, but is not limited thereto.
- the growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), and fibroblast growth factor (basic). It may contain one or more growth factors selected from the group consisting of fibroblast growth factor (bFGF), and preferably may include EGF and FGF, but is not limited thereto.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- EGF epidermal growth factor
- fibroblast growth factor basic
- It may contain one or more growth factors selected from the group consisting of fibroblast growth factor (bFGF), and preferably may include EGF and FGF, but is not limited thereto.
- interferon-gamma When interferon-gamma (IFN- ⁇ ) is included in a medium composition that can induce attachment of stem cells isolated from peripheral blood, the content of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) is 1 based on the total weight of the medium composition. It may contain from 200 ng/mL, preferably from 1 to 50 ng/mL, but is not limited thereto.
- interferon-alpha When interferon-alpha (IFN- ⁇ ) is included in a medium composition that can induce attachment of stem cells isolated from peripheral blood, the content of interferon-alpha (IFN- ⁇ ) is 1 based on the total weight of the medium composition. It may contain from 200 ng/mL, preferably from 1 to 50 ng/mL, but is not limited thereto.
- TNF- ⁇ When TNF- ⁇ is included in a medium composition that can induce attachment of stem cells isolated from peripheral blood, the content of TNF- ⁇ is based on the total weight of the medium composition. It may be included at 1 to 50 ng/mL, preferably 1 to 10 ng/mL, but is not limited thereto.
- the medium containing interferon-gamma (IFN- ⁇ ) for attaching stem cells isolated from peripheral blood may not contain other factors such as growth factors other than interferon-gamma (IFN- ⁇ ). .
- peripheral blood-derived stem cells may include, but are not limited to, mesenchymal stem cells.
- the present invention relates to one or more substances selected from the group consisting of Apo transferrin, Iron-dextran, and TNF- ⁇ ; and a medium composition for proliferation of peripheral blood-derived stem cells containing growth factors.
- the composition of the medium used for proliferation of peripheral blood-derived stem cells of the present invention is not limited, but the basic medium includes at least one selected from the group consisting of 1 to 20% fetal bovine serum and autologous plasma. It may contain a material and may be a medium selected from the group consisting of DMEM, MEM, DMEM/F-12, and ⁇ -MEM, but is not limited thereto.
- the growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), and fibroblast growth factor (basic). It may contain one or more growth factors selected from the group consisting of fibroblast growth factor (bFGF), and preferably may include EGF and FGF, but is not limited thereto.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
- EGF epidermal growth factor
- fibroblast growth factor basic
- It may contain one or more growth factors selected from the group consisting of fibroblast growth factor (bFGF), and preferably may include EGF and FGF, but is not limited thereto.
- the apo transferrin content is preferably 0.1 to 10 mg/mL based on the total weight of the medium composition. Typically, it may be included at 1 to 5 mg/mL, but is not limited thereto.
- the content of the iron-dextran is 1 to 10 ug/mL, preferably based on the total weight of the medium composition. May be included at 1 to 5 ug/mL, but is not limited thereto.
- the content of TNF- ⁇ is preferably 1 to 10 ug/mL based on the total weight of the medium composition. It may be included at 1 to 5 ug/mL, but is not limited thereto.
- the medium containing Apo transferrin and/or Iron-dextran for proliferating stem cells isolated from peripheral blood includes Apo transferrin and/or Iron-dextran.
- Apo transferrin and/or Iron-dextran include Apo transferrin and/or Iron-dextran.
- peripheral blood-derived stem cells may include, but are not limited to, mesenchymal stem cells.
- the present invention provides one or more substances selected from the group consisting of interferon-gamma (IFN- ⁇ ), interferon-alpha (IFN- ⁇ ), and TNF-alpha (TNF- ⁇ ); and a method for culturing stem cells isolated from peripheral blood containing growth factors and a composition for inducing differentiation of the cells into progenitor cells.
- IFN- ⁇ interferon-gamma
- IFN- ⁇ interferon-alpha
- TNF-alpha TNF-alpha
- a method of culturing peripheral blood-derived stem cells comprising the step of isolating and culturing the attached stem cells in a cell culture medium containing a medium composition for peripheral blood-derived stem cell attachment.
- peripheral blood was separated and attached with medium containing interferon-gamma (IFN- ⁇ ), and the cells were observed.
- IFN- ⁇ interferon-gamma
- useful biomarkers may be LIN28, OCT4, NANOG, SOX2, CD29, CD90, and CD105, but are not limited thereto.
- LIN28, OCT4, NANOG, SOX2, CD90, or CD105 are marker genes or cell surface antigen markers indicating stem cells.
- OCT4, NANOG, and SOX2 are essential transcription factors for maintaining the stem cell phenotype.
- LIN28 is a transcription factor that regulates self-renewal of stem cells.
- CD29 also called integrin beta-1 (ITG ⁇ 1)
- CD90 also called Thy-1
- GPI glycosylphosphatidylinositol
- CD105 also called Endoglin, is a type I membrane glycoprotein located on the cell surface, is part of the TGF- ⁇ receptor complex, and is used as a marker for hematopoietic cells.
- Chondrocytes differentiated from a composition for inducing differentiation into cells can be used for the prevention or treatment of diseases requiring cartilage regeneration, such as cartilage-related diseases.
- the cartilage-related disease is not limited thereto, but may be one or more selected from the group consisting of osteoarthritis, arthrosis deformity, chondrodysplasia, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, osteomalacia, osteitis fibrous, and aplastic bone disease.
- the present invention also provides a method for preventing or treating a disease comprising administering a pharmaceutical composition to an individual in need thereof.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be applied in any formulation, and more specifically, it may be a parenteral formulation.
- Parenteral formulations may be in the form of injections, applications, aerosols, and patches.
- Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
- Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
- the composition of the present invention can be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and the composition can be formulated for unit administration in ampoules or vials.
- stem cell refers to an undifferentiated state that has unlimited proliferation capacity (self-renewal capacity) and the ability to differentiate into cells of various tissues by a specific differentiation-inducing stimulus (multi-differentiation potency).
- stem cell preferably a mesenchymal stem cell.
- the term “mesenchymal stem cell (MSC)” used in the present invention refers to cells that have unlimited proliferation capacity in an undifferentiated state and the ability to differentiate into cells of various tissues by specific differentiation-inducing stimuli. .
- the mesenchymal stem cells of the present invention may be any cell with differentiation and proliferation ability, including humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, and dogs. It can be derived from any animal, such as dogs, cats, mice, and rabbits, and is preferably derived from humans, more preferably human adipose tissue, bone marrow, peripheral blood, or umbilical cord blood. It may be isolated from the back, and most preferably may be derived from peripheral blood.
- the term "for attachment” refers to providing a composition for separating peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from peripheral blood and then selecting only the stem cells contained in the PBMCs that are attached to a culture dish. .
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- the term “for proliferation” refers to providing a composition that can induce proliferation of attached stem cells.
- progenitor cell refers to a cell that is superior to stem cells in its ability to differentiate into specific somatic cells.
- Progenitor cells may be chondrogenic progenitor cells, cardiac progenitor cells, and neural progenitor cells, but are limited thereto. That is not the case.
- the term "differentiation" used in the present invention refers to the phenomenon in which cells become specialized in structure or function while dividing and growing, that is, the form or function of biological cells, tissues, etc. to perform a given task. This means that this is changing.
- the differentiation of the present invention may be, but is not limited to, differentiation of peripheral blood-derived stem cells into somatic cells including chondrocytes, cardiomyocytes, and nerve cells.
- subject of the present invention includes animals or humans whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, preferably companion animals and humans, but is not limited thereto.
- diseases can be effectively prevented or treated.
- administration means introducing a predetermined substance into a human or animal by any suitable method, and the route of administration of the composition for prevention or treatment according to the present invention is any general route as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally or parenterally.
- the composition for preventing or treating cartilage-related diseases according to the present invention can be administered by any device that allows the active ingredient to move to target cells.
- the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
- composition according to the present invention is isolated from peripheral blood by containing one or more substances selected from the group consisting of interferon-gamma (IFN- ⁇ ), interferon-alpha (IFN- ⁇ ), and TNF-alpha (TNF- ⁇ ).
- IFN- ⁇ interferon-gamma
- IFN- ⁇ interferon-alpha
- TNF- ⁇ TNF-alpha
- composition according to the present invention contains one or more substances selected from the group consisting of Apo trasnferrin, Iron-dextran, and TNF- ⁇ , thereby promoting peripheral blood-derived stem cells.
- Apo trasnferrin a substance selected from the group consisting of Apo trasnferrin, Iron-dextran, and TNF- ⁇ , thereby promoting peripheral blood-derived stem cells.
- the proliferation of can be induced more quickly than existing culture methods.
- composition according to the present invention a method for separating and culturing peripheral blood-derived stem cells, is established and utilized to induce differentiation into progenitor cells capable of differentiating into somatic cells of various target tissues and to be used for the prevention or treatment of diseases. You can.
- Figure 1a shows differences in adhesion and proliferation depending on the presence or absence of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) added to the medium of stem cells isolated from peripheral blood.
- IFN- ⁇ interferon-gamma
- Figure 1b shows the results of inducing cell proliferation of isolated stem cells in a medium containing TNF- ⁇ and apotransferrin or iron dextran.
- Figure 2 shows the basic characteristics of stem cells, showing a positive reaction for CD29 and CD105 and a negative reaction for CD34 in the immunophenotype expressed by stem cells.
- Figure 3 shows the basic characteristics of stem cells and the levels of OCT4, LIN28, NANOG, and SOX2 markers expressed in mesenchymal stem cells.
- Figure 4a shows the results confirmed by Alcian blue staining after inducing differentiation of peripheral blood-derived stem cells into chondrocytes and chondrogenic progenitor cells using ciprofloxacin.
- Figure 4b shows Col2a (Type II Collagen), Aggrecan (ACAN), and DAPI (4', 6-diamidino-2) by immunofluorescence staining after inducing differentiation of peripheral blood-derived stem cells into chondrogenic progenitor cells using ciprofloxacin. -phenylindone) and Merge expression results are shown.
- Figure 4c shows the results of confirming the expression of Col2a, aggrecan, DAPI, and Merge by immunofluorescence staining after inducing differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes (somatic cells).
- DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
- Peripheral blood-derived stem cells were cultured in DMEM/F-12 medium containing 1 to 20% Auto serum or FBS containing 5 ug/mL of TNF- ⁇ , 5 mg/mL of Apo-transferrin or Iron Dextran. (Iron-dextran) was added at a concentration of 5 ug/mL to induce cell proliferation (Figure 1b).
- Peripheral blood-derived stem cells whose cell density reached 80% were washed with DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), recovered and counted with TrypLE (Gibco, 12604-021), and then washed with flow cytometry staining buffer (FACS buffer). Suspension was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube at a concentration of 1 Then react at 4°C for 1 hour.
- DPBS Dynabecco's phosphate buffered saline
- TrypLE TrypLE
- FACS buffer flow cytometry staining buffer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
Abstract
본 발명은 말초혈액으로부터 줄기세포를 효과적으로 분리하고 증식하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 인터페론-감마(IFN-γ)를 포함함으로써 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포의 부착력을 높여 줄기세포가 획득되는 수율을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물, 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 확립하고 이를 활용하여 다양한 타겟 조직의 체세포로 분화할 수 있는 전구세포로의 분화를 유도하고 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 말초혈액 내에 존재하는 줄기세포를 효과적으로 분리 및 배양하는 조건을 확립하고, 해당 줄기세포를 활용하여 다양한 타겟 조직의 체세포로 분화할 수 있는 전구세포로의 분화 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
줄기세포는 환자 동의에 의한 수술적 방법을 통해 지방, 골수, 제대혈 등 다양한 조직으로부터 분리하여 얻을 수 있다.
지방조직 채취 수술의 경우 주사 관이 지방층까지 삽입되기 때문에 신경 또는 혈관 파괴 등과 같은 심각한 부작용의 가능성이 있다. 이러한 부작용으로 인해 환자 및 공여자는 수술 과정에 대한 심리적 부담감을 가질 수 있다.
반면, 말초혈액의 경우 수술 과정 없이 단순 채혈만으로 쉽게 혈액을 얻을 수 있다.
따라서, 말초혈액으로부터 줄기세포를 분리할 경우 별도의 수술 과정이 필요 없어 환자 및 공여자의 편의성이 좋고, 수술 과정에서 발생할 수 있는 오염 문제에서도 자유로울 수 있으므로 줄기세포를 이용한 연구 및 치료제 개발에 획기적인 접근법을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 말초혈액으로부터 줄기세포를 효과적으로 분리, 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 말초혈액유래 줄기세포를 활용하여 연골, 심근, 신경 등 다양한 타겟 조직의 체세포로 분화할 수 있는 전구세포로의 분화 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적은 말초혈액에서부터 줄기세포를 효과적으로 분리하고 증식하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인터페론-감마(Interferon-γ, INF-γ) 및 성장인자를 포함하고, 상기 성장인자는, 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 전환 성장인자(Transforming growth factor-β, TGF-β), 표피 성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 포함하는, 말초혈액유래 줄기세포(Peripheral blood derived stem cell) 부착용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 말초혈액유래 세포를 상기 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물을 포함하는 세포배양 배지에서 부착된 줄기세포를 분리 및 배양하는 단계를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포의 배양방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ) 및 성장인자를 포함하고, 상기 성장인자는, 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 전환 성장인자(Transforming growth factor-β, TGF-β), 표피 성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 포함하는, 말초혈액유래 줄기세포(Peripheral blood derived stem cell) 부착용 배지 조성물을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 인터페론-감마(INF-γ), 인터페론-알파(IFN-α) 및 티엔에프-알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질; 및 성장인자를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포(Peripheral blood derived stem cell) 부착용 배지 조성물을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 말초혈액유래 줄기세포 부착에 사용된 배지 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본 배지는 1 내지 20%의 소 태아 혈청(FBS) 및 자가 혈장(Auto serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있고, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimum Essential Media Eagle), DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 및 α-MEM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 전환 성장인자(Transforming growth factor-β, TGF-β), 표피 성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 EGF 및 FGF 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인터페론-감마(IFN-γ)가 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포의 부착을 유도할 수 있는 배지 조성물에 포함될 경우, 상기 인터페론-감마(IFN-γ)의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 200 ng/mL, 바람직하게는 1 내지 50 ng/mL으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인터페론-알파(IFN-α)가 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포의 부착을 유도할 수 있는 배지 조성물에 포함될 경우, 상기 인터페론-알파(IFN-α)의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 200 ng/mL, 바람직하게는 1 내지 50 ng/mL으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 티엔에프-알파(TNF-α)가 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포의 부착을 유도할 수 있는 배지 조성물에 포함될 경우, 상기 티엔에프-알파(TNF-α)의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 1 내지 10 ng/mL으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포를 부착하기 위한 인터페론-감마(IFN-γ)가 포함된 배지에는 인터페론-감마(IFN-γ) 외에 성장인자와 같은 다른 인자는 포함하지 않을 수 있다.
또한, 상기 말초혈액유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 아포 트랜스페린(Apo transferrin), 아이론 덱스트란(Iron-dextran), 티엔에프-알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질; 및 성장인자를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포 증식용 배지 조성물을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 말초혈액유래 줄기세포 증식에 사용된 배지 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본 배지는 1 내지 20%의 소 태아 혈청 및 자가 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있고, DMEM, MEM, DMEM/F-12 및 α-MEM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 전환 성장인자(Transforming growth factor-β, TGF-β), 표피 성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 EGF 및 FGF 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 분리된 줄기세포의 증식을 유도할 수 있는 배지 조성물에 상기 아포 트랜스페린(Apo transferrin)이 포함될 경우, 상기 아포 트랜스페린 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 10 mg/mL, 바람직하게는 1 내지 5 mg/mL로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
분리된 줄기세포의 증식을 유도할 수 있는 배지 조성물에 상기 아이론 덱스트란(Iron-dextran)이 포함될 경우, 상기 아이론 덱스트란의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 ug/mL, 바람직하게는 1 내지 5 ug/mL으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
분리된 줄기세포의 증식을 유도할 수 있는 배지 조성물에 티엔에프-알파(TNF-α)가 포함될 경우, 상기 티엔에프-알파의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 ug/mL, 바람직하게는 1 내지 5 ug/mL으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포를 증식하기 위한 아포 트랜스페린(Apo transferrin) 및/또는 아이론 덱스트란(Iron-dextran)이 포함된 배지에는 아포 트랜스페린(Apo transferrin) 및/또는 아이론 덱스트란(Iron-dextran) 외에 성장인자와 같은 다른 인자는 포함하지 않을 수 있다.
또한, 상기 말초혈액유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터페론-알파(IFN-α) 및 티엔에프-알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질; 및 성장인자를 포함하는 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포를 배양하는 방법 및 해당 세포의 전구세포로의 분화 유도용 조성물로부터 유도된 전구세포를 제공한다.
구체적으로, a) 말초혈액유래 줄기세포의 부착용 배지 조성물을 포함하는 세포배양 배지에서 부착된 줄기세포를 분리 및 배양하는 단계; 및 b) 말초혈액유래 줄기세포의 증식용 배지 조성물을 포함하는 세포배양 배지에서 a)의 부착된 줄기세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 말초혈액유래 세포를 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물을 포함하는 세포배양 배지에서 부착된 줄기세포를 분리 및 배양하는 단계를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 말초혈액을 분리하여 인터페론-감마(IFN-γ)가 함유된 배지로 부착한 후 세포를 관찰한 결과, 세포 부착 정도는 대조군(Control) 대비 유의한 차이가 나타났으며, 사이토카인이 말초혈액유래 줄기세포의 부착에 적합성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 유용성 바이오마커는 LIN28, OCT4, NANOG, SOX2, CD29, CD90 및 CD105일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, LIN28, OCT4, NANOG, SOX2 또는 CD90, CD105는 줄기세포임을 나타내는 표지유전자 또는 세포 표면항원 마커이다. OCT4, NANOG, SOX2는 줄기세포의 표현형을 유지하는 데 필수적인 전사인자이다. LIN28은 줄기세포의 자가 재생(Self-renewal)을 조절하는 전사인자이다. CD29는 인테그린 베타-1(ITGβ1)이라고도 하며, 줄기세포를 비롯한 다양한 세포 유형, 혈액, 피부와 같은 조직에서 발현되는 마커이다. CD90은 Thy-1이라고도 불리며, 글리코실포스파티딜이노시톨(Glycosylphosphatidylinositol, GPI)고정 당단백질로 흉선 세포, T 세포, 뉴런, 조혈 줄기 세포, 내피 세포에서 발현된다. CD105는 엔도글린(Endoglin)이라고도 하며, 세포 표면에 위치한 유형 I 막 당단백질로 TGF-β 수용체 복합체의 일부이고 조혈 세포의 표지 마커로 사용된다.
일 실시예에서, 말초혈액유래 줄기세포로부터 시프로플록사신(Ciprofloxacin) 또는 성장인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상 포함하는 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포 또는 시프로플록사신을 포함하는 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포는 연골 재생이 필요한 질환, 예컨대, 연골 관련 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
상기 연골 관련 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 투여 단계를 포함하는 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용 가능하며, 보다 구체적으로 비경구용 제형일 수 있다, 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 및 패치 등의 형태 일 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
주사형 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(Self-renewal Capacity)과 더불어 특정한 분화 유도 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(Multi-differentiation Potency)을 가진 세포를 말하며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)"는 미분화 상태에서 무한 증식능력과 더불어 특정한 분화 유도 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 인간(Human), 원숭이(Monkeys), 돼지(Pigs), 말(Horses), 소(Cows), 양(Sheep), 개(Dogs), 고양이(Cats), 생쥐(Mice) 및 토끼(Rabbits) 등 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이며, 더 바람직하게는 인간의 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 말초혈액 유래일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "부착용"이란 말초혈액에서부터 말초 혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 후 배양 접시에 부착되는 PBMC에 포함되어 있는 줄기세포만을 선별하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "증식용"이란 부착된 줄기세포의 증식을 유도할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "전구세포"란 특정 체세포로 분화할 수 있는 능력이 줄기세포보다 뛰어난 세포를 말하며, 전구세포는 연골전구세포, 심근전구세포 및 신경전구세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "분화(Differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해 가는 것을 말한다. 본 발명의 분화는 말초혈액유래 줄기세포에서 연골세포, 심근세포 및 신경세포 등을 포함한 체세포로의 분화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 동물 또는 인간을 포함하며, 바람직하게는 반려동물과 사람일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터페론-알파(IFN-α) 및 티엔에프-알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함함으로써 말초혈액으로부터 분리된 줄기세포의 부착력을 높여 줄기세포가 획득되는 수율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 아포 트랜스페린(Apo trasnferrin), 아이론 덱스트란(Iron-dextran), 티엔에프-알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함함으로써 말초혈액유래 줄기세포의 증식을 기존 배양 방법 대비 더 빠르게 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물, 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 확립하고 이를 활용하여 다양한 타겟 조직의 체세포로 분화할 수 있는 전구세포로의 분화를 유도하고 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
도 1a는 말초혈액으로부터 분리한 줄기세포의 배지에 인터페론-감마(IFN-γ)의 첨가 유무에 따른 부착과 증식의 차이를 보여준다.
도 1b는 분리된 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배지에, 아포 트랜스페린 또는 아이론 덱스트란을 포함하는 배지로 세포의 증식을 유도한 결과를 보여준다.
도 2는 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 줄기세포가 발현하는 면역표현형에 있어서 CD29 및 CD105에 대하여는 양성반응, CD34에 대하여는 음성반응을 보여준다.
도 3은 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 중간엽 줄기세포에서 발현하는 OCT4, LIN28, NANOG 및 SOX2 표지 유전자 레벨을 보여준다.
도 4a은 시프로플록사신을 이용한 말초혈액 유래 줄기세포의 연골세포 및 연골전구세포로의 분화 유도 후 알시안블루(Alcian blue) 염색으로 확인한 결과를 보여준다.
도 4b는 시프로플록사신을 이용한 말초혈액유래 줄기세포의 연골전구세포로의 분화 유도 후 면역형광염색으로 Col2a(Type II Collagen), 아그레칸(Aggrecan, ACAN), DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindone) 및 Merge의 발현을 확인한 결과를 보여준다.
도 4c는 중간엽줄기세포를 연골세포(체세포)로의 분화 유도 후 면역형광염색으로 Col2a, 아그레칸, DAPI 및 Merge의 발현을 확인한 결과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예 및 제조예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양
말초혈액(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 혈액)을 Ficoll과 1:1의 비율로 밀도구배를 이용하여 말초혈액 내 세포를 분리한다. 그 후 1 내지 20% Auto serum 또는 FBS가 함유된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지에 IFN-γ 200 ng/mL를 첨가하여 줄기세포의 부착을 유도한다.
이후 부착된 줄기세포를 확인하여 부착되지 않은 세포는 제거한 뒤 1 내지 20% Auto serum 또는 FBS가 함유된 DMEM/F-12 배지로 교체하고 줄기세포 밀도가 80%에 도달할 때까지 배양한다 (도 1a).
실시예 2. 말초혈액유래 줄기세포 증식 유도
말초혈액유래 줄기세포를 TNF-α 5 ug/mL가 포함된 1 내지 20% Auto serum 또는 FBS가 함유된 DMEM/F-12 배지에, 아포 트랜스페린(Apo-transferrin) 5 mg/mL 또는 아이론 덱스트란(Iron-dextran) 5 ug/mL의 농도로 첨가하여 세포의 증식을 유도하였다 (도 1b).
실시예 3. 말초혈액유래 줄기세포의 표면항원 확인
세포 밀도가 80%에 도달한 말초혈액유래 줄기세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 이용하여 수세하고 TrypLE(Gibco, 12604-021)로 세포 회수 후 개수한 뒤 Flow cytometry staining buffer(FACS buffer)로 현탁(Suspension) 하여 1 X 105 cells/10 uL의 농도로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브(Microcentrifuge tube)에 담은 다음 형광표지인자가 붙어있는 CD29, CD105, CD34 1차 항체를 이용하여 빛을 차광한 뒤 4℃에서 1시간 반응시킨다.
1차 항체 반응을 끝낸 후 FACS buffer로 세포를 3회 수세한 후 유세포 분석(Flow Cytometry) 장비를 이용하여 항체 발현율을 확인한다. 그 결과, CD29와 CD105의 양성반응, CD34의 음성반응이 확인되었다 (도 2).
실시예 4. 말초혈액유래 줄기세포의 유전자 레벨 확인
세포 밀도가 80%에 도달한 말초혈액유래 줄기세포를 Trizol을 이용하여 RNA를 추출한 뒤 OCT4, NANOG, LIN28 및 SOX2 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과 줄기세포 특이적 유전자의 발현이 확인되었다 (도 3).
실시예 5. 말초혈액유래 줄기세포의 연골세포로의 분화 확인
말초혈액유래 줄기세포를 시프로플록사신(Ciprofloxacin)이 포함된 배지를 이용하여 연골세포로의 분화를 16일 동안 유도하였다 (도 4a). 16일 동안 분화 유도된 세포를 DPBS를 이용하여 수세하고 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 상온에서 30분 고정한다. 고정이 완료된 세포를 0.05% Triton X-100으로 상온에서 10분 동안 투과화(Permeabilization)한다.
이후 1차 항체(Col2a, Aggrecan)을 이용하여 1시간 내지 1일간 부착한다. 이후 DPBS를 이용하여 세포를 3회 수세한 후 2차 형광 항체를 부착한다. 그 후 DPBS를 이용하여 세포를 3회 수세하고, DAPI로 핵을 5분간 염색하고, DPBS로 3회 수세한다. Vectashield Mounting solution으로 염색을 완료한 세포 위에 흩뿌려 mounting한다. 최종적으로 샘플을 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과, 말초혈액유래 줄기세포의 시프로플록사신을 이용한 연골전구세포, 연골 분화배지를 이용한 연골세포로의 분화가 확인되었다 (도 4b 및 도 4c).
Claims (6)
- 인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ) 및 성장인자를 포함하고,상기 성장인자는, 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 전환 성장인자(Transforming growth factor-β, TGF-β), 표피 성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자를 포함하는,말초혈액유래 줄기세포(Peripheral blood derived stem cell) 부착용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimum Essential Media Eagle), DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 및 α-MEM으로 이루어진 군으로부터 선택되고,소 태아 혈청(FBS) 및 자가 혈장(Auto serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는, 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 인터페론-감마는 1 내지 200 ng/mL의 농도로 포함되는 것인, 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 말초혈액유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함하는, 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 중간엽 줄기세포는 CD29 및 CD105를 발현하는 것인, 말초혈액유래 줄기세포 부착용 배지 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 말초혈액유래 줄기세포의 배양방법:a) 말초혈액유래 세포를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 포함하는 세포배양 배지에서 배양하여 말초혈액유래 줄기세포를 부착시키는 단계;b) 부착된 말초혈액유래 줄기세포를 분리 및 배양하는 단계.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2022-0108916 | 2022-08-30 | ||
| KR1020220108916A KR102522295B1 (ko) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024049158A1 true WO2024049158A1 (ko) | 2024-03-07 |
Family
ID=86100731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/012770 WO2024049158A1 (ko) | 2022-08-30 | 2023-08-29 | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102522295B1 (ko) |
| WO (1) | WO2024049158A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102522295B1 (ko) * | 2022-08-30 | 2023-04-18 | 주식회사 스마트셀랩 | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010107285A2 (ko) * | 2009-03-20 | 2010-09-23 | 주식회사 스템메디언스 | 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 |
| KR20150118100A (ko) * | 2012-12-14 | 2015-10-21 | 럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴저지 | 줄기세포의 면역조절성 효과의 조절 방법 |
| KR20160024147A (ko) * | 2014-08-25 | 2016-03-04 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 강화된 인터류킨―１ 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법 |
| KR20180008015A (ko) * | 2016-07-15 | 2018-01-24 | 주식회사 엔바이오텍 | 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법 |
| KR20210012867A (ko) * | 2019-07-26 | 2021-02-03 | 브렉소젠 주식회사 | 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법 |
| KR102522295B1 (ko) * | 2022-08-30 | 2023-04-18 | 주식회사 스마트셀랩 | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102307115B1 (ko) | 2021-05-12 | 2021-10-01 | 주식회사 스마트셀랩 | 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 |
-
2022
- 2022-08-30 KR KR1020220108916A patent/KR102522295B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-08-29 WO PCT/KR2023/012770 patent/WO2024049158A1/ko unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010107285A2 (ko) * | 2009-03-20 | 2010-09-23 | 주식회사 스템메디언스 | 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 |
| KR20150118100A (ko) * | 2012-12-14 | 2015-10-21 | 럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴저지 | 줄기세포의 면역조절성 효과의 조절 방법 |
| KR20160024147A (ko) * | 2014-08-25 | 2016-03-04 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 강화된 인터류킨―１ 수용체 길항제 생성능을 보유한 중간엽 줄기세포의 제조방법 |
| KR20180008015A (ko) * | 2016-07-15 | 2018-01-24 | 주식회사 엔바이오텍 | 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법 |
| KR20210012867A (ko) * | 2019-07-26 | 2021-02-03 | 브렉소젠 주식회사 | 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법 |
| KR102522295B1 (ko) * | 2022-08-30 | 2023-04-18 | 주식회사 스마트셀랩 | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102522295B1 (ko) | 2023-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| WO2018226051A2 (ko) | 인간줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포 배양용 무혈청 배지 조성물 | |
| WO2024049158A1 (ko) | 말초혈액유래 줄기세포의 분리 및 배양조건과 이를 활용한 전구세포로의 분화유도 | |
| CN104212760B (zh) | 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 | |
| WO2015105357A1 (ko) | 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 | |
| KR102664092B1 (ko) | 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물 | |
| WO2018030448A1 (ja) | 細胞培養用培地、及び細胞培養方法 | |
| WO2012033352A2 (ko) | 말과동물 양수 유래 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법 | |
| WO2013165120A1 (ko) | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 | |
| WO2010107285A2 (ko) | 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 | |
| WO2013077639A1 (ko) | 말과동물 양막-유래 중간엽 줄기세포 | |
| WO2018155952A2 (ko) | 인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법 | |
| WO2012053718A9 (ko) | 전자기장을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 방법 | |
| WO2019221477A1 (ko) | 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도 | |
| WO2023163559A1 (ko) | 무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법 | |
| KR102669135B1 (ko) | 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물 | |
| KR102637401B1 (ko) | 레노그라스팀에 의한 줄기세포의 운동신경전구세포로의 유도 및 운동신경세포로의 분화 | |
| WO2016190704A1 (ko) | 향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법 | |
| WO2022215980A1 (ko) | 클로렐라 추출물을 포함하는 세포 배양용 조성물 | |
| WO2016088932A1 (ko) | 지방-유래 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하여 지방세포로 분화시키는 방법 | |
| WO2023136691A1 (ko) | 엑소좀 생산성을 증가시키는 방법 및 그에 의하여 생산된 엑소좀을 포함하는 조성물 | |
| WO2022019403A1 (ko) | 고효능 줄기세포를 제조하기 위한 s-i-s 배양방법 | |
| KR20230152192A (ko) | 커큐민에 의한 줄기세포의 심근전구세포로의 유도 및 심근세포로의 분화 | |
| EP1636341A2 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| CN111218423A (zh) | 脂肪干细胞来源的神经元前体细胞及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23860834 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |