KR20210012867A - 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법 - Google Patents

유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포는 일반적인 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 보다 기능성이 강화되고 증식력이 우수하다.

Description

유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법{Precursor cell of iPSC-derived mesenchymal stem cell and method for preparing the same}
본 특허출원은 2019년 7월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2019-0091269호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 다분화능을 가진 기질세포로서 골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 연골이나 골조직, 인대, 골수 기질 등 다양한 결합조직으로 분화할 수 있으므로 관절염이나, 외상, 화상등에 의해 생긴 연부조직 결손을 치료하는 등 다양한 질환에 대한 치료 용도로 연구되고 있다. 또한 중간엽 줄기세포는 이러한 구조적 지지 기능 외에도 항염증성 사이토카인을 발현하고 대식세포를 M2형 대식세포로 변환하는 등 면역조절 기능 또는 면역 억제기능을 가지고 있어 염증반응을 억제하고, 관절염, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 자가면역질환 등 면역계의 과도한 활성화로 인해 발생하는 면역질환의 치료제로 사용되고자 많은 연구가 이루어지고 있다.
최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이다. 이러한 엑소좀을 상업적으로 이용하기 위해서는 다량의, 그리고 양질의 엑소좀이 필요하다. 그러나 중간엽 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 양은 매우 소량에 불과하고, 중간엽 줄기세포의 기능과 증식능력 또한 계대가 반복될수록 감소하기 때문에, 중간엽 줄기세포와 동등하거나 그보다 우수한 기능성을 가지면서도 증식능력이 우수한 세포를 확립하는 기술 개발의 필요성이 대두되었다.
대한민국 공개특허공보 제10-2019-0063453호(2019.01.15. 공개)
본 발명자들은 종래의 중간엽 줄기세포와 동등하거나 그보다 우수한 기능성을 가지면서도 증식능력이 우수한 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포보다 미분화 단계에 있는 중간엽 전구세포를 확립하고, 그 기능성 및 증식능력에서의 우수성을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(precursor cell of iPSC-derived mesenchymal stem cell)와 이로 이루어진 세포집단(cell population) 및 이들의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유도만능줄기세포-유래 중간엽줄기세포의 전구세포로부터 엑소좀을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 전구세포를 포함하는 세포집단(cell population)을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 다분화능을 가진 세포로서 골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 가장 흔히 사용되나, 골수 외에도 제대 또는 제대혈, 지방조직, 양수, 어금니의 치아 돌기(tooth bud)로부터 유래할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 기질세포(stromal cell)이라는 용어로도 불리운다.
본 명세서에서 본 발명자들이 개발한 중간엽 줄기세포의 전구세포는 일반적인 중간엽 줄기세포가 아닌, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포이다.
상기 "유도만능줄기세포"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화 줄기세포 라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주고, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마 (teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.
본 발명의 유도만능줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼 등의 모든 종 유래의 유도만능줄기 세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.
또한, 본 발명의 상기 유도만능줄기세포가 역분화 되기 전의 체세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 양수 또는 태반 등으로부터 유래된 체세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 지방세포(adipose cell), 상피세포(epithelial cell), 표피세포(epidermal cell), 연골세포(chondrocyte), 근세포(muscle cell), 심근세포(cardiac muscle cell), 멜라노사이트(melaonocyte), 신경세포(neural cell), 교세포(glial cell), 성상교세포(astroglial cell), 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포집단은 적어도 80% 이상의 세포의 세포 표면에 발현되는 마커 단백질이 CD73+, CD90+, CD105+, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포집단은 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 세포의 세포 표면에 발현되는 마커 단백질이 CD73+, CD90+, CD105+, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세포집단은 많아도 5% 이하의 세포에서 세포 표면 발현에 발현되는 마커 단백질이 CD34+, 및/또는 CD45+인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포집단은 많아도 5%, 4%, 또는 3% 이하의 세포에서 세포 표면 발현에 발현되는 마커 단백질이 CD34+, 및/또는 CD45+인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 CD는 세포표면 항원 무리(cluster of differentiation)을 의미하고, "+" 또는 "(+)"는 세포 표면에 해당 세포 표면 마커가 존재함(양성)을 의미하며, "-"또는 "(-)"는 세포 표면에 해당 세포 표면 마커가 존재하지 않음(음성)을 의미한다. 상기 마커의 존재(양성) 또는 부존재(음성)는 물리적으로 절대적인 존재 여부를 의미하는 것이 아니라, 당업계의 기술 수준에서 실험적으로 검출가능한 수치 이상이면 존재(양성)하고, 그 수치 이하이면 부존재(음성)하는 것으로 판단하는 상대적인 기준에 따른 존재 또는 부존재를 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 중간엽 줄기세포의 전구세포는 동등한 수의 중간엽 줄기세포에 비하여 ANKRD1, CPE, NKAIN4, LCP1, CCDC3, MAMDC2, CLSTN2, SFTA1P, EPB41L3, PDE1C, EMILIN2, SULT1C4, TRIM58, DENND2A, CADM4, AIF1L, NTM, SHISA2, RASSF4, 및 ACKR3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 높은 수준으로 발현한다.
상기 본 발명의 중간엽 줄기세포의 전구세포가 높은 수준으로 발현하는 유전자의 발현량은, 동등한 수의 중간엽 줄기세포가 발현하는 유전자 발현량과 비교하여 적어도 3배, 5배, 7배, 또는 10배 이상 높게 발현되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 중간엽 줄기세포의 전구세포는 동등한 수의 중간엽 줄기세포에 비하여 DHRS3, BMPER, IFI6, PRSS12, RDH10, 및 KCNE4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 낮은 수준으로 발현한다.
상기 본 발명의 중간엽 줄기세포의 전구세포가 낮은 수준으로 발현하는 유전자의 발현량은, 동등한 수의 중간엽 줄기세포가 발현하는 유전자 발현량과 비교하여 적어도 3배, 5배, 7배, 또는 10배 이상 낮게 발현되는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포 및 동등한 수의 중간엽 줄기세포는 동종조직 유래이다. 보다 구체적으로는 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 동종조직에서 유래한 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포이다.
본 발명의 일 실시예에서 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 제대 조직 유래의 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포이고, 이와 비교되는 동등한 수의 중간엽 줄기세포는 제대 조직 유래의 중간엽 줄기세포이다.
본 발명자들은 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 BxC(brexogen stem cell)로 명명하였다.
본 명세서에서 상기 "유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)"는 "유도만능줄기세포 유래 중간엽 전구세포", 또는 "유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포"로도 표현된다.
본 명세서에서, 상기 "유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)"는 “한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)"에 수탁번호 "KCTC14019BP"로 기탁된 것이다.
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 동일한 조직 유래(e.g. 제대 조직)의 유도만능줄기세포의 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)는 동일한 조직 유래(e.g. 제대 조직)의 중간엽 줄기세포(MSC)와 비교하여 염색체 핵형에 있어서 이상이 없었고, 증식능력이 우수하였다. 구체적으로 본 발명의 BxC는 계대를 9번 이상 거듭할 경우 동일 조직 유래의 중간엽 줄기세포(MSC)와 비교하여 10배 이상 증식능의 차이가 나타났으며, 12 번 이상의 횟수로 계대를 하여도 증식능의 감소가 관찰되지 않았다. 또한, BxC는 MSC에 비하여 세포 증식능과 관련된 마커인 Ki67의 발현량도 2배 이상 높게 나타났다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)는 Endostatin, Endothelin-1, VEGF-A, Thrombospondin-2, PlGF, PDGF-AA, beta-NGF, 및 HB-EGF 등의 기능성 단백질을 동등한 수의 중간엽 줄기세포와 비교하여 다량 분비한다.
본 명세서에서 상기 Endostatin은 자연적으로 생성되는 type XVIII 콜라겐에서 유래한 20 kDa C-터미널 단편으로, 항-신생혈관제제로 보고되어 있다.
본 명세서에서 상기 endothelin-1은 preproendothelin-1 (PPET1)으로도 알려져 있으며, EDN1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 혈관 내피세포에서 생산된다. endothelin-1은 강력한 혈관수축제로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)는 VEGFA 유전자가 인코딩하는 단백질로서 혈관 내피세포의 VEGFR1 및 VEGFR2와 상호작용을 통해 혈관의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 Thrombospondin-2는 THBS2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서, 세포-세포 상호작용 또는 세포-기질 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. Thrombospondin-2의 암에 대한 역할은 논란의 여지가 있으나, 중간엽 줄기세포의 세포 표면 특성을 조절하는 것으로 보고되어 있으며 세포 부착 및 세포 이동에 관여한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 PlGF (placental growth factor)는 PGF 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 VEGF sub-family의 멤버로서 배아발생기에서 혈관신생에 주된 역할을 하는 단백질로 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 PDGF-AA(platelet-derived growth factor)는 세포의 성장 및 분열을 조절하는 성장인자로서 혈관의 생성 및 성장, 및 중간엽줄기세포의 증식, 화학주성, 및 이동에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 NGF (Nerve growth factor)는 신경친화성 인자 및 뉴로펩타이드로서, 신경의 성장, 유지, 증식 및 생존에 주로 관여한다. NGF는 alpha-, beta-, 및 gamma-NGF가 약 2:1:2의 비율로 발현되는 세 가지 단백질의 복합체로서, 여기에서 gamma-NGF는 세린 프로테아제로 작용하고, beta-NGF의 N-터미널을 절단하여 NGF를 활성화시킨다고 알려져 있다.
본 명세서에서 상기 HB-EGF(heparin-binding EGF-like growth factor)는 HBEGF 유전자에 의해 인코딩되는 EGF family 단백질의 멤버이다. HB-EGF는 심장의 발달 및 혈관분포에 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 표피 창상의 치유에서 상피화 과정에 필수적인 단백질로 알려져 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 전구세포의 제조방법을 제공한다:
유도만능줄기세포를 FBS 및 bFGF를 포함하는 배지에서 1-10일간 배양하는 단계; 및
SSEA-4 (-) 세포를 분리하여 FBS 및 bFGF 를 포함하는 배지에서 1-10일간 배양하는 단계.
본 발명의 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 상술한 중간엽 줄기세포의 전구세포와 동일한 세포이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포는 인간의 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 양수 또는 태반 등으로부터 유래된 체세포를 역분화용 배지에서 배양하여 제조된 것이다.
구체적으로 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 지방세포(adipose cell), 상피세포(epithelial cell), 표피세포(epidermal cell), 연골세포(chondrocyte), 근세포(muscle cell), 심근세포(cardiac muscle cell), 멜라노사이트(melaonocyte), 신경세포(neural cell), 교세포(glial cell), 성상교세포(astroglial cell), 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage), 또는 골수, 제대, 제대혈, 지방조직, 양수, 어금니의 치아 돌기(tooth bud)로부터 유래한 중간엽줄기세포 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen-4)는 인간의 유도만능 줄기세포 및 배아줄기세포의 특징적 세포표면 마커 중 하나이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 SSEA-4는 본 발명의 중간엽줄기세포 전구세포(BxC)로의 분화 과정에서 유도만능줄기세포의 특성이 남아 있는 세포와 유도만능줄기세포의 특성이 사라진 세포들을 구분하기 위한 스크리닝 인자로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자는 유도만능줄기세포를 배양하여 SSEA-4를 발현하는지 여부를 기준으로 스크리닝하여 SSEA-4 (-) 세포를 분리한 후 추가 배양을 실시하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포, 및 SSEA-4 (-) 세포의 배양은 구체적으로는 1-10일, 3-10일, 5-10일간 배양될 수 있고, 보다 구체적으로는 5-7일 또는 7-10일간 배양될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포를 1-10일간 배양한 후의 SSEA-4 (-) 세포의 분리는 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 또는 MACS(magnetic-activated cell sorting) 방법이 사용될 수 있고, 바람직하는 FACS 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 당업계에 알려진 세포의 분리방법을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세포를 배양하는 배지는 5~20%, 5~15%, 5~10%, 10~15% 또는 10~20%의 FBS를 포함하고, 가장 구체적으로는 10%의 FBS를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 세포를 배양하는 배지는 1~20 ng/ml, 2~20 ng/ml, 3~20 ng/ml, 5~20 ng/ml, 7~20 ng/ml, 10~20 ng/ml, 1~15 ng/ml, 2~15 ng/ml, 3~15 ng/ml, 5~15 ng/ml, 7~15 ng/ml, 10~15 ng/ml, 1~10 ng/ml, 2~10 ng/ml, 3~10 ng/ml, 5~10 ng/ml, 7~10 ng/ml의 bFGF를 포함하고, 가장 구체적으로는 10 ng/ml의 bFGF를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 엑소좀의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포를 포함하는 세포집단을 세포배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포배양 배지는 엑소좀이 제거된 우태아혈청이 함유된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포배양 배지에 엑소좀을 제거한 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 줄기세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS에서 유래된 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀(Exosome)"은 나노 크기의 막 소포(vesicle)로 세포내 이입 경로(endocytic pathway)의 세포소기관인 다포성 소체(multivesicular body)와 원형질막(plasma membrane)의 융합에 의해 방출되며, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-150 nm 정도이며, 이는 LDL 보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작다. 엑소좀은 다중 소포체(multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출된다. 엑소좀이 세포성 면역의 중재, 세포간 신호전달 등과 같은 중요하면서도 특화된 기능을 수행한다는 점은 잘 알려져 있다. 엑소좀의 마커 단백질로는 CD9, CD63, CD81 등이 잘 알려져 있다. 본 발명의 상기 엑소좀은 30-150 nm 크기로 엄격하게 한정되지 않으며, 상기 크기 범위 내에 속하는 다포성 소체(multivesicular body), 상기 크기 이상의 지질 이중층으로 구성된 미세소포체(microvesicle), 및 이들의 혼합물을 포함하는 개념이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양은 12시간 내지 120 시간, 24시간 내지 96시간, 48시간 내지 96시간, 또는 60시간 내지 84시간, 가장 구체적으로는 72시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 엑소좀을 분리하기 전 다양한 물질로 전처리 될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 엑소좀을 분리하기 전 인터페론 감마(interferon-gamma), 피오글리타존(pioglitazone), 메트포민(metformin), AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide), 트롬빈(thrombin), 레스베라트롤(resveratrol), substance P, 히알루론산, 테트란드린(tetrandrine), PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate), 엑센딘-4(exendine-4), 덱사메타손(dexamethasone), 인슐린(insulin), 아스코르브산(ascorbate), 연골형성 성장인자 IGF(Insulin-like Growth Factor) 및 TGF-beta 1(Transforming Growth Factor beta 1) 등을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질로 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 용어 "전처리"는 본 발명의 중간엽 줄기세포의 전구세포를 상술한 물질 중 1 이상의 물질이 첨가된 세포배양 배지에 일정 시간 동안 접촉시키는 과정을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 "전처리"는 상기 (a) 단계와 동시에 또는 별도의 단계로서 순차적으로 수행될 수 있고, 전처리 시간은 6 내지 42시간, 6 내지 36시간, 6 내지 30시간, 6 내지 27시간, 12 내지 48시간, 12 내지 42시간, 12 내지 36시간, 12 내지 30시간, 12 내지 27시간, 18 내지 48시간, 18 내지 42시간, 18 내지 36시간, 18 내지 30시간, 18 내지 27시간, 21 내지 48시간, 21 내지 42시간, 21 내지 36시간, 21 내지 30시간 또는 21 내지 27시간 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (b) 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양된 중간엽 줄기세포의 전구세포에서 세포배양 배지로 분비한 엑소좀을 분리하는 과정이다.
상기 배양 배지는 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포를 세포배양하여 수득한 배양액, 또는 상기 배양액의 희석, 여과 및/또는 농축물을 의미한다. 상기 배양액은 상술한 유도만능 줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포를 포함하거나 또는 불포함 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀의 분리방법은 다음과 같다. 상기 배양 배지를 200-400 x g에서 5 내지 20분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포 잔여물을 제거한 뒤, 상층액을 취하여 9,000-12,000 x g로 60-80분간 고속원심분리한다. 이때 다시 상층액을 취하여 90,000-120,000 x g로 80-100분간 원심분리하고 상층액을 제거함으로써 하층에 남아 있는 엑소좀을 얻을 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 중간엽 줄기세포 배양 배지를 수거하여 300 x g에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하고, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000 x g, 4 ℃에서 70분간 원심분리한다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 x g, 4 ℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 하층에 남아있는 엑소좀을 분리하였다.
상술한 엑소좀의 제조방법은 상술한 중간엽 줄기세포의 전구세포를 배양하여 엑소좀을 생산한다는 점에서 상술한 중간엽 줄기세포의 전구세포와 공통된다. 본 명세서에서 상술한 엑소좀의 분리방법은 예시적인 것이며 당업계에서 사용되는 엑소좀의 분리방법 또한 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 엑소좀은 치료제를 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 치료 단백질, 항체 (예를 들면, 전장 항체, 단클론성 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 미니바디(minibody), 억제 RNA, 또는 소분자 약물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 치료 단백질은 손실 또는 불활성화가 치료되는 질환과 관련되는 것으로 공지된 단백질, 예컨대, 예를 들면, 종양 억제인자, 키나아제, 포스파타아제, 또는 전사 인자이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 항체는 세포내 항원에 결합한다. 그와 같은 세포내 항원은 활성이 세포 증식 및/또는 생존을 위해 요구되는 단백질, 예컨대 종양유전자일 수 있다. 일부 경우에서, 항체는 항원의 기능을 차단한다. 일부 경우에서, 항체는 단백질-단백질 상호작용을 방해한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 억제 RNA는 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 pre-miRNA이다. 다양한 양태에서, 억제 RNA는 활성이 특정 질환 상태의 유지를 위해 필요한 단백질, 예컨대, 예를 들면, 종양유전자의 발현을 차단한다. 종양유전자가 돌연변이 된 형태의 유전자인 경우에, 이후 억제 RNA는 우선적으로 야생형 단백질이 아닌 돌연변이체 종양유전자의 발현을 차단한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소분자 약물은 조영제이다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 소분자 약물은 화학치료제이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 조성물은 경구투여를 위해 제형화되거나, 비경구 투여, 예컨대, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 복강내 주사를 위해 제형화된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 치료제는 항미생물제를 포함한다. 항미생물제는 벤즈알코늄 염화물, 벤즈에토늄 염화물, 벤질 알코올, 브로노폴, 센트리미드, 세틸피리디늄 염화물, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로자일레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 엑세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 페닐 수은 니트레이트, 프로필렌 글리콜, 또는 티메로살일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간의 제대에서 유래한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 전구세포는 수탁번호 KCTC14019BP로 기탁된 것이다.
본 발명은 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포의 전구세포는 일반적인 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 보다 기능성이 강화되고 증식력이 우수하다.
도 1a-1b은 유도만능 줄기세포(iPSC)의 0일차, 7일차 배양 후의 세포표면 발현 마커 SSEA-4의 발현 비율 및 현미경 사진을 나타낸 도이다. 도 1c는 유도만능 줄기세포를 7일간 배양하고 SSEA-4 (-)에 해당하는 세포를 분리한 다음, 7일간 배양한 후의 세포(BxC)의 표면 발현 마커 SSEA-4의 발현비율 및 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 유도만능 줄기세포의 배양 0일차(iPSC), 배양 7일차(pre-BxC), SSEA-4 (-) 분리 후 배양 7일차(BxC), 및 중간엽 줄기세포(MSC)의 세포 표면 마커의 종류를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)와 동종 조직 유래 중간엽 줄기세포(MSC)의 핵형을 분석한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)와 동종 조직 유래 중간엽 줄기세포(MSC)의 계대 배양을 통한 세포수를 나타낸 도이다.
도 4b는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)와 동종 조직 유래 중간엽 줄기세포(MSC)의 세포 증식성 인자인 Ki-67의 발현 비율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 5a-5d는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)에서 발현하는 기능성 단백질의 분비량을 비교하여 나타낸 도이다. (5a: endostatin, endothelin-1; 5b: VEGF-A, thrombospondin-2; 5c: PlGF, PDGF-AA; 5d: beta-NGF, HB-EGF)
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)와 동종 조직 유래 중간엽 줄기세포(MSC)의 증식능력을 비교하기 위하여 CFU-F assay 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)와 동종 조직 유래 중간엽 줄기세포(MSC) 사이에 발현량의 차이가 나는 유전자를 확인하기 위하여 수행된 RNA-seq 분석 결과의 모식도를 나타낸 도이다. 도 7b는 상기 MSC와 비교하여 BxC에서 발현량이 높은 유전자를 나타낸 도이고, 도 7c는 상기 MSC와 비교하여 BxC에서 발현량이 낮은 유전자를 나타낸 도이다.
도 8a는 본 발명의 BxC에서 분리한 엑소좀의 수와 크기 분포를 확인한 그래프이고, 도 8b는 엑소좀 특이적 표면 항원인 TSG101 및 CD63의 발현을 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 중간엽 줄기세포 전구세포(BxC)의 분리 및 배양
먼저 유도만능줄기세포(iPSC)를 10%의 FBS 및 10 ng/ml의 bFGF를 첨가한 DMEM에서 7일간 배양하였다. 다음으로, 배양된 유도만능줄기세포에서 FACS를 통하여 세포 표면에 SSEA-4(stage-specific embryonic antigen 4) 단백질을 발현하지 않는 SSEA-4 (-) 세포를 분리하였다. 또한 분리된 SSEA-4 (-) 세포를 계대하여 상기와 동일한 배지에서 7일간 추가 배양하여, 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 제작하였다. 본 발명자들은 상기 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 BxC(brexogen stem cell)로 명명하고 “한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)"에 수탁번호 "KCTC14019BP"로 기탁하였다.
BxC로 명명된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포를 배양배지[high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)]에서 추가 배양하였다.
상기한 0일차 유도만능줄기세포(iPSC) (D0), 7일 배양 후 유도만능줄기세포 (Pre-BxC) (D7), 및 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC)의 각 세포별 세포표면 마커 SSEA-4 비율은 하기 표 1 및 도 1a-1c, 도 2에 나타내었다.
최초의 유도만능줄기세포 집단의 96.6%는 세포 표면에 SSEA-4 단백질을 발현하였으나(도 1a), 7일간 배양한 후에는 SSEA-4 단백질을 발현하는 SSEA-4 (+) 세포 집단이 전체 세포의 35.8%로 감소하였다(도 1b). 전체 세포 중 나머지 64.2%에 속하는 SSEA-4 (-) 세포를 분리하고 계대하여 7일간 배양한 후(BxC세포)에는 SSEA-4 단백질 발현 세포가 전체 세포 집단의 3% 이하인 것을 확인하였다(도 1c).
따라서 본 발명의 유도만능줄기세포 (iPSC) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC) 세포 집단에는 SSEA-4 단백질의 발현율이 5% 이하임을 알 수 있다.
실시예 2: 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC ) 세포 표면 마커 발현
0일차 유도만능줄기세포(iPSC) (D0), 7일 배양 후 유도만능줄기세포 유래 분화 세포 (Pre-BxC) (D7), 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포(BxC), 및 중간엽 줄기세포(MSC)의 각 세포별 세포표면 마커(SSEA-4, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105)를 다음과 같이 분석하였다.
각 단계의 세포를 TrypLETM Express (Gibco, 12604-021)를 처리하여 단일세포화 하고, PBS로 세척하였다. SSEA-4 (BD560128), CD73 (BD550257), CD90 (BD5555950), CD105 (BD560839), CD45 (BD555483) 및 CD34 (BD348053)에 특이적으로 결합하는 항체의 파장이 겹치지 않도록 튜브에 나누어 담아 원심분리 하였다. 세포 펠렛을 FACS용 buffer 100μL에 재부유 시켜서 6μL의 항체를 파장이 겹치지 않도록 2개씩 함께 넣어 30분간 암(dark) 상태의 실온에서 30분간 정치한 후 PBS로 워싱한 다음 300μL FACS buffer에 부유시켜 FACS 장비로 분석하였다.
줄기세포의 세포표면 마커(SSEA-4, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105) 별 발현 비율은 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.
위 결과로부터, 본 발명의 유도만능줄기세포 (iPSC) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC) 세포 집단에는 CD73, CD90 및 CD105 단백질의 발현율이 90% 이상임을 알 수 있었다.
Differentiation
Stage		 SSEA-4
(%)		 CD34
(%)		 CD45
(%)		 CD73
(%)		 CD90
(%)		 CD105
(%)
iPSC 96.7 0.1 0.7 0.3 0.6 0.9
Pre-BxC 38.8 0.4 0.9 1.3 1.7 3.8
BxC 2.7 1.4 1.2 99.0 96.9 98.6
MSC 0.2 0.3 0.5 99.7 99.2 98.6
실시예 3: 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC ) 염색체 분석
본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 유도만능줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MSC)의 염색체 이상 여부를 확인하기 위하여 각각 6번씩 계대한 BxC와 MSC의 핵형을 분석하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BxC와 MSC는 염색체 수와 구조에 이상이 없음을 확인하였다.
실시예 4: 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC ) 증식능 특성 비교
본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 유도만능줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MSC)의 증식능을 비교하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
동일한 계대수 (P4)의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 동종 조직(제대) 유래의 중간엽줄기세포(MSC)를 6-웰 배양 플레이트에 웰 당 1X105 cells씩 시딩(seeding) 한 후, 3.5일 (1주일에 2번)마다 배양 배지를 제거하고 PBS로 워싱한 후 TrypLETM Express를 처리하여 세포를 떼어내었다. 300xg, 5분간 원심분리한 다음 1 mL의 배양 배지로 재부유 시킨 다음 세포수를 측정하였다. 세포수를 측정한 세포는 다시 well 당 1X105 cells씩 seeding 한 후 3.5일 간격으로 배양을 반복하며 계대 별 세포 수 증가량을 확인하였다.
또한, 각 세포의 세포증식 표지자인 Ki67의 발현 비율을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
동일한 계대수 (P4)의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 동종 조직(제대) 유래의 중간엽줄기세포(MSC)를 TrypLETM Express (Gibco, 12604-021)를 처리하여 단일세포화 하고, PBS로 세척하였다. 세척 후 세포를 cold 80% 에탄올(ethanol)에 넣어 -20℃에서 2시간 이상 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. PE Mouse Anti-Ki-67 kit (BD556027)에 포함되어 있는 buffer 100 μL당 20 μL의 Ki-67 특이적 항체를 새로운 튜브에 옮겨 담아 실온에서 30분 정치한 후 PBS로 세척하고 표지자가 부착된 이차 항체와 반응시킨 후 암(dark) 상태의 실온에서 30분간 정치한 후 FACS 장비로 분석하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 중간엽줄기세포(MSC)와 비교하여 9번째 계대부터는 10배이상 증식능의 차이를 나타내었다. 또한, 중간엽줄기세포(MSC)는 12계대 부터는 증식능이 감소하였으나, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 12계대 이상 계대하여도 증식능이 감소하지 않았다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 중간엽줄기세포(MSC)와 비교하여 세포증식 표지자인 Ki67의 발현량이 2배 이상 높게 나타났다.
따라서, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 중간엽줄기세포(MSC)보다 증식능의 면에서 매우 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC ) 단백질 분비 능력 비교
본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 유도만능줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MSC)의 기능성과 관련된 단백질의 분비 능력을 비교하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
동일한 계대수의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 중간엽 줄기세포(MSC)를 6-웰 배양 플레이트에 웰 당 1X105 cells씩 시딩한 후 24시간 후에 상층액을 제거하였다. DPBS로 워싱 한 다음 무혈청 배지(serum free media)를 1 mL씩 넣고 48시간 후에 배지를 제거하였다. 300xg, 5분간 원심분리하여 죽은 세포나 찌꺼기를 가라앉히고 상층액만 취하여 -80℃에서 보관하였다. R&D systems의 Luminex High performance assay의 custom service를 이용하여 array kit를 제작 후 Luminex assay를 진행하였다.
단백질 MSC BxC
Endostatin 3516.6 pg/ml 6682.0 pg/ml
Endothelin-1 17.0 pg/ml 79.4 pg/ml
VEGF-A 32.2 pg/ml 78.5 pg/ml
Thrombospondin-2 21802.9 pg/ml 36912.7 pg/ml
PlGF 5.8 pg/ml 9.4 pg/ml
PDGF-AA 29.2 pg/ml 328.4 pg/ml
beta-NGF 10.5 pg/ml 17.3 pg/ml
HB-EGF 3.9 pg/ml 15.7 pg/ml
도 5a-5d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 유도만능줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MSC)와 비교하여 중간엽줄기세포(MSC)의 기능성과 관련된 단백질들을 상대적으로 다량 분비하였다. 따라서 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 기능성의 면에서 중간엽줄기세포(MSC)보다 강화되었음을 알 수 있었다.
실시예 6. 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC ) Stemness 조사
본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 중간엽 줄기세포(MSC)의 줄기세포성(Stemness)을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
10 mL 배양배지[high glucose DMEM(Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum(HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco, Cat no.11140-050)]가 포함된 100mm 세포배양 디쉬(dish)에 중간엽 줄기세포 및 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)를 각각 디쉬당 1000 세포씩 접종하고 21일 동안 배양하였다. 배양된 세포가 부착된 디쉬를 PBS로 2회 세척하고 상온에서 약 2분간 95% 메탄올로 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액[crystal violet(sigma, C-3886, USA) 5g, 메탄올 100ml]을 첨가한 후 5분 동안 염색하고 물로 세척 후 실온에서 건조하였다. 각 디쉬에서 50개 이상의 세포로 구성된 콜로니의 수를 계수하여 비교하였다.
도 6a-6b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)보다 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(MSC)는 세포집락형성 단위-섬유아세포(CFU-F)의 개수가 약 3배 정도 높았다. 따라서 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 중간엽 줄기세포(MSC)보다 줄기세포성(stemness)가 우수함을 확인하였다.
실시예 7. 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC )의 특징적인 유전자 발현 양상 조사
본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)와 중간엽 줄기세포(MSC)의 유전자 발현 양상의 차이를 확인하고자, 각 세포집단에서 mRNA를 추출하고, RNA-seq 분석법으로 세포별로 유전자의 발현량을 비교하였다.
유전자 발현량의 차이가 나는 유전자의 종류와 발현량 차이(BxC의 유전자 발현량/MSC의 유전자 발현량)를 하기 표 2 및 도 7a-7c에 나타내었다.
도 7a-7c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)는 동등한 수의 중간엽 줄기세포(MSC)보다 ANKRD1, CPE, NKAIN4, LCP1, CCDC3, MAMDC2, CLSTN2, SFTA1P, EPB41L3, PDE1C, EMILIN2, SULT1C4, TRIM58, DENND2A, CADM4, AIF1L, NTM, SHISA2, RASSF4, 및 ACKR3의 유전자 발현량이 적어도 10배 이상, 많게는 55배 정도 높게 나타났다.
이에 반해, DHRS3, BMPER, IFI6, PRSS12, RDH10, 및 KCNE4의 유전자는 본 발명의 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)에서 적게는 10배부터 많게는 20배나 더 적게 발현되었다.
No. Gene Description Fold Change
1 ANKRD1 ankyrin repeat domain 1 55.1
2 CPE carboxypeptidase E 38.8
3 NKAIN4 sodium/potassium transporting ATPase interacting 4 34.3
4 LCP1 lymphocyte cytosolic protein 1 28.8
5 CCDC3 coiled-coil domain containing 3 25.4
6 MAMDC2 MAM domain containing 2 19.9
7 CLSTN2 calsyntenin 2 19.1
8 SFTA1P surfactant associated 1, pseudogene 16.4
9 EPB41L3 erythrocyte membrane protein band 4.1 like 3 16.1
10 PDE1C phosphodiesterase 1C 15.4
11 EMILIN2 elastin microfibril interfacer 2 15.1
12 SULT1C4 sulfotransferase family 1C member 4 13.8
13 TRIM58 tripartite motif containing 58 13.2
14 DENND2A DENN domain containing 2A 12.5
15 CADM4 cell adhesion molecule 4 12.2
16 AIF1L allograft inflammatory factor 1 like 11.6
17 NTM neurotrimin 11.5
18 SHISA2 shisa family member 2 11.0
19 RASSF4 Ras association domain family member 4 10.9
20 ACKR3 atypical chemokine receptor 3 10.1
실시예 8. 유도만능줄기세포 ( iPSC ) 유래 기능강화 중간엽 전구세포 ( BxC )에서 유래한 엑소좀의 분리 및 확인
상기 실시예 1에서 제조한 유도만능줄기세포 유래 기능강화 중간엽 전구세포 (BxC)를 엑소좀이 제거된 FBS(Exosome-depleted FBS)를 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 배양하였다. 72 시간 동안 배양한 후, BxC 세포 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포찌꺼기를 제거하였다. 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10000xg, 4℃에서 70분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 된 상층액을 초고속원심분리기 (ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고, 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS(phosphate buffered saline)로 희석하여 사용하였다. 분리된 엑소좀을 각각 nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern)를 통해 엑소좀의 수와 크기 분포를 확인하였다(도 8a). 웨스턴 블랏으로 엑소좀 특이적인 표면항원인 TSG101 및 CD63 발현을 확인하였다(도 8b).
한국생명공학연구원 KCTC14019BP 20191113

Claims (10)

  1. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 전구세포를 포함하는 세포집단에 있어서, 상기 세포집단은 적어도 80% 이상의 세포가 CD73+, CD90+, 또는 CD105+인, 세포집단.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포집단은 많아도 5% 이하의 세포가 SSEA-, CD34+, 또는 CD45+인, 세포집단.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 동등한 수의 동종조직 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 ANKRD1, CPE, NKAIN4, LCP1, CCDC3, MAMDC2, CLSTN2, SFTA1P, EPB41L3, PDE1C, EMILIN2, SULT1C4, TRIM58, DENND2A, CADM4, AIF1L, NTM, SHISA2, RASSF4, 및 ACKR3로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 높은 수준으로 발현하는 것인, 세포집단.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 동등한 수의 동종조직 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 DHRS3, BMPER, IFI6, PRSS12, RDH10, 및 KCNE4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 더 낮은 수준으로 발현하는 것인, 세포집단.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 유도만능줄기세포에서 유래된 것인, 세포집단.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포의 전구세포는 수탁번호 KCTC14019BP로 기탁된 것인, 세포집단.
  7. 다음 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 전구세포의 제조방법:
    유도만능줄기세포를 FBS 및 bFGF를 포함하는 배지에서 1-10일간 배양하는 단계; 및
    SSEA-4 (-) 세포를 분리하여 FBS 및 bFGF 를 포함하는 배지에서 1-10일간 배양하는 단계.
  8. 다음 단계를 포함하는 엑소좀의 생산방법:
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포집단을 세포배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 세포배양 배지로부터 엑소좀을 분리하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포배양 배지는 엑소좀이 제거된 우태아혈청이 함유된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 유도만능줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포의 전구세포에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 인간의 제대에서 유래하고, 상기 전구세포는 수탁번호 KCTC14019BP로 기탁된 것인, 전구세포.
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