CN114728024B - 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体的用于预防或治疗肾脏疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物，其包含从用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。相比于现有的从间充质干细胞中分离的外泌体，本发明的外泌体表现出进一步改善的肾脏疾病预防或治疗效果，因此，可有效用于相关研发及产品化。

Description

包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌 体的用于预防或治疗肾脏疾病的组合物

【技术领域】

本发明涉及用于预防或治疗肾脏疾病的组合物，其包含源自用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体作为有效成分。

【背景技术】

间充质干细胞作为具备多分化能的基质细胞，是指可分化成成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等多种细胞的一种细胞。由于间充质细胞可分化成软骨、骨组织、韧带、骨髓基质等多种缔结组织，因此，多被用于研究其在治疗因关节炎、外伤、烧伤等引起的软组织缺损等各种疾病层面上的用途。

最近，正在积极研究利用间充质干细胞分泌的外泌体对多种疾病的治疗效果，而并非间充质干细胞本身。为了实现这种外泌体的商业应用性，需要大量优质的外泌体。但是，可从间充质干细胞中获取的外泌体量极少，而且，间充质干细胞的功能和增殖能力也会随着传代的重复而减退，为此，需要开发在具备与间充质干细胞相同或更优秀功能的同时能够确保优秀增殖能力的细胞的技术。

另一方面，肾脏共有两个，分别位于左右侧，每个肾脏由约100万个称为肾单位(nephron)的基本结构组成，一个肾单位由称为肾小球的微细毛细血管团和肾小管组成，起到过滤功能和吸收功能。

肾脏疾病是指肾脏因不能正常发挥排泄、调节、代谢及内分泌功能而导致整体退化或异常的状态，肾脏疾病根据病情进展状态分为急性肾衰竭、慢性肾衰竭，并且，根据发病原因分为因血管复合物沉积引起的肾小球肾炎、因糖尿病或高血压等并发症引起的糖尿病肾病、因给药抗生素或抗癌药等引起的中毒性肾病、因细菌感染引起的尿路感染等。

与导致肾脏疾病的肾脏疾病种类无关地，当因慢性肾功能障碍进展而导致肾小球滤过率减少至50％以下时，在大部分情况下，肾小球滤过率将持续降低，最终导致肾衰竭末期，并且产生血液学异常、神经系统并发症、胃肠道并发症、免疫系统并发症、感染或骨营养不良等并发症，在严重的情况下会导致死亡。

肾脏疾病的发病率在全球范围内每年都在增加，即使在早期发现，也往往会因无症状或难以识别其症状而导致肾衰竭末期。韩国也有约45万肾衰竭患者，若包括早期肾衰竭患者在内，则预计患者数量将会更多。肾衰竭治疗方法有长期透析、肾脏移植(renaltransplantation)等治疗方法，但是，这种方法难以解决慢性肾衰竭的初期、中期治疗问题，而且，因高昂的治疗费用而对国家和患者家庭带来沉重的经济负担。

因此，对开发更加安全且有效治疗肾脏疾病的新型治疗用组合物的需求正在增加。

【发明内容】

【技术问题】

本发明人致力于研究开发一种利用间充质干细胞的外泌体的肾脏疾病治疗剂。结果，建立了相比于诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)来源间充质细胞处于未分化阶段的间充质干细胞的前体细胞，并证实来源于用预处理物质预处理或未经预处理的上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体表现出优秀的肾脏疾病预防或治疗效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗肾脏疾病(Kidney disease)的药物组合物，其包含从诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)来源间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

本发明的再一目的在于，提供从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体。

本发明的另一目的在于，提供用于预防或治疗肾脏疾病(Kidney disease)的药物组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotentstem cell)来源间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

本发明的又一目的在于，提供从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体。

【技术方案】

本发明人致力于研究开发一种利用间充质干细胞外泌体的肾脏疾病治疗剂。结果，建立了相比于诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)来源间充质细胞处于未分化阶段的间充质干细胞的前体细胞，并证实了来源于用预处理物质预处理或未经预处理的上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体表现出优秀的肾脏疾病预防或治疗效果。

本发明涉及从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体、包含其作为有效成分的用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物及从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体、包含其作为有效成分的用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物。

以下，进一步详细说明本发明。

本发明的一方面涉及用于预防或治疗肾脏疾病(Kidney disease)的药物组合物，其包含从诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)来源间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

在本说明书中，术语“干细胞”作为未分化细胞，是指具有自我复制能力且具有可分化成两种以上不同类型细胞能力的细胞。本发明的干细胞可以为自体或同种组织来源干细胞。

在本说明书中，术语“诱导多能间充质干细胞(iPSC，induced pluripotentstemcell)”是指通过诱导如体细胞等已分化细胞的逆分化(dedifferentiation)来使其返回至初始的未分化状态，从而具有多能性(pluripotency)的细胞。

上述逆分化通过导入特定基因(例如，Sox2、c-Myc、Klf4、Oct-4等)来表达，或者，可通过注射导入上述特定基因的细胞中制备的逆分化诱导蛋白来诱导。

上述多能性是指可被分化成源于构成生物体的三种胚层(germ layer)，即内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)及外胚层(ectoderm)的组织或器官的能力。

在本说明书中，术语“间充质干细胞”作为具有多分化能的细胞，是指可被分化成包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等在内的多种细胞的干细胞。作为上述间充质干细胞最常用的是骨髓来源间充质干细胞，但是，除骨髓外，还可来源于脐带或脐带血、脂肪组织、羊水、臼齿牙蕾(tooth bud)。间充质干细胞还被称为基质细胞(stromal cell)。

上述间充质干细胞的前体细胞是源自“本发明人开发的”诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)的间充质干细胞的前体细胞(BxC)，而并非来源于普通的间充质干细胞。

上述“诱导多能干细胞”是指从分化的细胞中通过人工逆分化过程诱导的具有多能分化能力的细胞，也被称作逆分化干细胞。

上述人工逆分化过程通过利用逆转录病毒、慢病毒及仙台病毒等的病毒介导或非病毒性载体，并通过导入利用蛋白质或细胞提取物等的非病毒性介导逆分化因子来执行，或者包括通过干细胞提取物、化合物等执行的逆分化过程。

上述诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞几乎相同的特性，具体地，两者呈现相似的细胞形状，基因及蛋白质表达方式相似，在体外(in vitro)及体内(In vivo)具有全能性，并形成畸胎瘤(teratoma)，当插入于小鼠的囊胚(blastocyst)时，将形成嵌合体(chimera)小鼠，并且，可进行基因的生殖系传递(germline transmission)。

本发明的诱导多能干细胞可包括人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠、兔子等所有来源的诱导多能干细胞，但优选为人源诱导多能干细胞。

并且，本发明的上述诱导多能干细胞逆分化前的体细胞可以为来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、羊水或胎盘等的体细胞，但不限于此。

具体地，上述体细胞包括成纤维细胞(fibroblast)、肝细胞(hepatocyte)、脂肪细胞(adipose cell)、上皮细胞(epithelial cell)、表皮细胞(epidermal cell)、软骨细胞(chondrocyte)、肌肉细胞(muscle cell)、心肌细胞(cardiac muscle cell)、黑色素细胞(melaonocyte)、神经细胞(neural cell)、胶质细胞(glial cell)、星状胶质细胞(astroglial cell)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)等，但不限于此。

在本发明的一实例中，相比于相同数量的间充质干细胞，本发明的上述间充质干细胞的前体细胞以更高水平表达选自由ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4及ACKR3组成的组中的一种以上基因。

并且，在本发明的再一实例中，相比于相同数量的间充质干细胞，本发明的上述间充质干细胞的前体细胞以更低水平表达选自由DHRS3、BMPER、IFI6、PRSS12、RDH10及KCNE4组成的组中的一种以上基因。

上述间充质干细胞的前体细胞及相同数量的间充质干细胞来源于同种组织。更具体地，上述间充质干细胞的前体细胞是指源自诱导多能干细胞间充质干细胞的前体细胞。

在本发明的一实施例中，上述间充质干细胞是源自脐带组织来源诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞，与其相比较的相同数量的间充质干细胞是源自脐带组织的间充质干细胞。

本发明人将上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞命名为BxC(brexogen stem cell)。在本说明书中，还可将上述“诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)”表达为“诱导多能干细胞来源间充质前体细胞”。

相比于同种组织来源(例如：脐带组织)的间充质干细胞(MSC)，本发明的同种组织来源(例如，脐带组织)的诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞(BxC)，其染色体核型未见异常且增殖能力更为优异。具体地，当完成9次以上的传代时，相比于同种组织来源间充质干细胞(MSC)，本发明的BxC表现出10倍以上的增殖能力差异，并且，即使完成12次以上的传代也未观察到增殖能力的减退。而且，在与细胞增殖能力相关标记Ki67的表达量层面上，显示BxC相比于MSC高出2倍以上。

相比于相同数量的间充质干细胞，上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)分泌大量的内皮抑素(Endostatin)、内皮素-1(Endothelin-1)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、凝血栓蛋白2(Thrombospondin-2)、胎盘生长因子(PlGF)、血小板衍生因子(PDGF-AA)、β神经生长因子(beta-NGF)及肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)等功能蛋白。

在本说明书中，上述内皮抑素(Endostatin)作为源自天然生成的type XVIII胶原蛋白的20kDa C末端片段，其被报道是一种抗血管生成抑制剂。

在本说明书中，上述内皮素-1(endothelin-1)也被称为内皮素前体-1(preproendothelin-1，PPET1)，是指由EDN1基因编码的蛋白，生成于血管内皮细胞。已知内皮素-1(endothelin-1)是一种强效血管收缩剂。

在本说明书中，上述血管内皮生长因子A(VEGF-A，vascular endothelial growthfactor A)作为由VEGFA基因编码的蛋白，已知其通过与血管内皮细胞的VEGFR1及VEGFR2的相互作用来诱导血管的生长。

在本说明书中，上述凝血栓蛋白2(Thrombospondin-2)作为由THBS2基因编码的蛋白，已知其介导细胞-细胞相互作用或细胞-基质相互作用。虽然凝血栓蛋白2(Thrombospondin-2)对癌症发挥的作用仍存在争议，但据报道，其可调节间充质干细胞的细胞表面特性并参与细胞粘附及细胞迁移。

在本说明书中，上述胎盘生长因子(PlGF，placental growth factor)作为由PFG基因编码的蛋白，已知其作为血管内皮生长因子亚家族(VEGF sub-family)的成员，是指在胚胎发育期间主要起到血管生成作用的蛋白。

在本说明书中，上述血小板衍生因子(PDGF-AA，platelet-derived growthfactor)作为用于调节细胞生长及细胞分裂的生长因子，已知其在血管的生成及生长、间充质干细胞的增殖、化学趋化性及迁移方面起到重要作用。

在本说明书中，神经生长因子(NGF，Nerve growth factor)作为神经亲和性因子和神经肽，主要参与神经的生长、维持、增殖和存活。神经生长因子为三种蛋白的复合物，其中，alpha-、beta-及gamma-NGF的表达比例约为2：1：2。已知其中的gamma-NGF用作丝氨酸蛋白酶，通过切割beta-NGF的N-末端来激活NGF。

在本说明书中，上述肝素结合表皮生长因子(HB-EGF，heparin-binding EGF-likegrowth factor)作为由HBEGF基因编码的EGF家族(EGF family)蛋白的成员。已知HB-EGF在心脏发育及血管分布方面起到重要作用，在表皮创伤愈合方面属于上皮化过程所需的蛋白质。

在本说明书中，术语“外泌体(exosome)”作为囊泡(membrane vesicle)，其从细胞向细胞外分泌，或具有由存在于细胞内的脂质双分子层构成的膜结构，几乎存在于所有真核生物的体液。外泌体的直径约为30nm～1000nm，当多泡体(multivesicular bodies)与细胞膜融合时，从细胞中释放或直接从细胞膜中释放。已知外泌体起到输送细胞内的生物分子蛋白、生物活性脂质及RNA(miRNA)的作用，以实现其在介导凝固、细胞-细胞之间通讯及细胞免疫方面的功能性作用。

上述外泌体的概念包括微泡(microvesicle)。已知外泌体的标记蛋白有CD63、CD81等，除此之外，还有如EGFR等细胞表面受体、信号传导相关分子、细胞粘附相关蛋白、MSC相关抗原、热休克蛋白(heat shock protein)、囊泡形成相关的Alix等蛋白。

在本发明中，上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离的外泌体是指存在于上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)内或从BxC分泌的外泌体。

在本说明书中，术语“包含......作为有效成分”是指以足以达到肾脏疾病预防或治疗活性的量包含从诱导多能干细胞间充质干细胞中分离的外泌体。

上述肾脏疾病可以为肾脏纤维化、糖尿病肾病、高血压肾病、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎、多囊肾病、肾衰竭、肾小球硬化、移植后急性排斥反应和/或药物性肾损害，但不限于此。

上述药物可以为抗癌药，例如，可以为顺铂(Cisplatin)，但不限于此。

在本说明书中，所使用的术语“预防”是指通过给药本发明的组合物来抑制或延缓肾脏疾病进展的一切行为。

在本说明书中，所使用的术语“治疗”具有如下含义：(a)抑制肾脏疾病进展；(b)减轻肾脏疾病症状；以及(c)消除肾脏疾病。

除有效成分外，本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。在此情况下，药学上可接受的载体是指制剂时通常使用的载体，包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。并且，除上述成分外，还可额外包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的药物组合物可根据所需方法，使用口服给药或肠胃外给药方式(例如，应用于静脉内、皮下、腹腔内或局部)，给药量因患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径及时间而不同，但本发明所属技术领域的普通技术人员可以作出适当选择。

本发明的药物组合物以药学上的有效量给药。在本发明中，“药学上的有效量”是指以适用于医药治疗的合理收益/风险比例治疗疾病的充足量，有效量可根据包括患者的疾病种类、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及排泄率，治疗时间、并用药物在内的因素及其他医学领域中已知的要素来确定。

本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂并用给药，也与现有的治疗剂依次或同时给药，并且，可单次或多次给药。综合考虑以上因素，重要的是以最小量达到最大效果且无副作用，这对本发明所属技术领域的普通技术人员是容易确定的。

具体地，本发明的药物组合物的有效量可因患者的年龄、性别、状态、体重、体内的活性成分吸收率、失活率、排泄速度、疾病种类及并用药物而不同。

本发明的再一方面涉及从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体。

本发明的上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-e)是指具备现有外泌体特性的外泌体。如本发明的实施例所证实，确认到上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体具有优秀的肾脏细胞再生效果(图2)。并且，还确认到本发明的BxC-e不仅在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中抑制炎症、细胞凋亡，而且，还抑制内质网应激(图4a至图6b)。

本发明的另一方面涉及肾脏疾病治疗方法，其包括向个体给药上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体的步骤。

上述“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人类灵长类、小鼠(mouse)、狗、猫、马及牛等。

本发明的还有一方面涉及上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体的肾脏疾病治疗用途。

上述肾脏疾病治疗方法及治疗用途与上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体及包含其的药物组合物具有相同的组分，因此，为了避免本说明书变得过度复杂，将省略两者之间的相同内容。

本发明的又一方面涉及用于预防或治疗肾脏疾病(Kidney disease)的药物组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stemcell)来源间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

在本说明书中，术语“预处理”是指在诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞的培养过程中，使得添加预处理物质的细胞培养基与诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞产生接触的过程。

上述预处理可通过如下方法执行，即，在包含预处理物质的细胞培养基中培养上述诱导多能干细胞间充质干细胞的前体细胞。

上述细胞培养基可以为通常用于动物细胞培养的任何培养基，例如，可使用DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium)、DMEM和F12的混合物、Eagles'sMEM(Eagle's minimum essential medium)、α-MEM、Iscove's MEM、199培养基、CMRL 1066、RPMI 1640、F12、F10、Way-mouth's MB752/1、McCoy's5A及MCDB系列等。

上述培养可执行6小时至48小时。

具体地，上述培养可执行6小时至42小时、6小时至36小时、6小时至30小时、6小时至27小时、12小时至48小时、12小时至42小时、12小时至36小时、12小时至30小时、12小时至27小时、18小时至48小时、18小时至42小时、18小时至36小时、18小时至30小时、18小时至27小时、21小时至48小时、21小时至42小时、21小时至36小时、21小时至30小时或21小时至27小时。

上述预处理物质可以为艾塞那肽(Exendin-4)。

本发明的艾塞那肽(Exendin-4)为胰高糖素样肽(GLP，glucagon-like peptide)受体的肽激动剂。已知艾塞那肽可促进胰岛素分泌，在临床上用于治疗2型糖尿病及帕金森病。

上述艾塞那肽能够以1nM至100nM的浓度包含在细胞培养基中。

具体地，上述艾塞那肽能够以1μM至90μM、1μM至80μM、1μM至70μM、1μM至60μM、1μM至50μM、1μM至40μM、1μM至30μM、10μM至90μM、10μM至80μM、10μM至μM、10μM至60μM、10μM至50μM、10μM至40μM及10μM至30μM的浓度包含在细胞培养基中。

上述预处理物质可以为拉尼兰诺(Lanifibranor)。

本发明的拉尼兰诺是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR，peroxisomeproliferator-activated receptors)激动剂(agonist)，可分别激活称为PPARα、PPARδ及PPARγ的三种PPAR异构体，已知是可诱导体内抗纤维化、抗炎及有益的代谢变化的小分子(small molecule)。PPAR为配体激活的转录因子，属于调节基因表达的核激素受体家族。PPAR在调节细胞分化、发育及肿瘤形成中起到重要作用。已知其通过激活调节纤维化的PPAR来减少缔结组织的异常生长。并且，拉尼兰诺在临床上用于治疗全身硬化症治疗剂、特发性肺纤维化治疗剂等。

上述拉尼兰诺能够以1nM至100nM的浓度包含在细胞培养基中。

具体地，上述拉尼兰诺能够以1μM至1000μM、1μM至500μM、1μM至100μM、1μM至90μM、1μM至80μM、1μM至70μM、1μM至60μM、1μM至50μM、1μM至40μM、1μM至30μM、1μM至20μM、5μM至1000μM、5μM至500μM、5μM至100μM、5μM至90μM、5μM至80μM、5μM至70μM、5μM至60μM、5μM至50μM、5μM至40μM、5μM至30μM、5μM至20μM的浓度包含在细胞培养基中。

本发明的又一方面涉及从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体。

本发明的上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-G63e)是指具备现有外泌体特性的外泌体。如本发明的实施例所证实，确认到本发明的BxC-G63e不仅在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中抑制炎症、细胞凋亡，而且，还抑制内质网应激(图4a至图6b)。

本发明的又一方面涉及肾脏疾病治疗方法，其包括向个体给药上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体的步骤。

上述“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人类灵长类、小鼠(mouse)、狗、猫、马及牛等。

本发明的又一方面涉及上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体的肾脏疾病治疗用途。

上述肾脏疾病治疗方法及治疗用途与本发明的上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体及包含其的药物组合物具有相同的组分，因此，为了避免本说明书变得过度复杂，将省略两者之间的相同内容。

【发明的效果】

本发明涉及用于预防或治疗肾脏疾病的药物组合物，其包含从用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。相比于现有的从间充质干细胞中分离的外泌体，本发明的外泌体表现出进一步改善的肾脏疾病预防或治疗效果，因此，可有效用于相关研发及产品化。

【附图说明】

图1a为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)的平均尺寸及分布的图。

图1b为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)的电子显微镜照片。

图2a至图2c为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)在多种肾脏细胞中的肾脏细胞再生效果的图。

图3a为示出从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)的平均尺寸及分布的图。

图3b为示出从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)的电子显微镜照片。

图3c为示出从用拉尼兰诺(Lanifibranor)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-V37e)的平均尺寸及分布的图。

图3d为示出从用拉尼兰诺(Lanifibranor)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-V37e)的电子显微镜照片。

图4a及图4b为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)及从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的多种肾脏细胞中的炎症(Inflammation)抑制效果的图。

图5a及图5b为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)及从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的多种肾脏细胞中的细胞凋亡(Apoptosis)抑制效果的图。

图6a及图6b为示出从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-e)及从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的多种肾脏细胞中的内质网应激(ER Stress)抑制效果的图。

图7a及图7b为示出用于确认从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)中分离的外泌体(BxC-G63e)在诱导肾衰竭(Kidneyfailure)的肾脏细胞中的肾损害治疗及恢复功能的图。

图8为示出从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的细胞凋亡(Apoptosis)抑制效果的图(其中，*为p＜0.05vs.TGFβ-，#为p＜0.05vs.TGFβ+，+为p＜0.05vs.TGFβ+e)。

图9a至图9d为示出通过I型胶原(Collagen I)、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及纤粘连蛋白(Fibronectin)表达抑制来确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的肾脏纤维化(Fibrosis)抑制效果的图(其中，*为p＜0.05vs.TGFβ-，#为p＜0.05vs.TGFβ+，+为p＜0.05vs.TGFβ+e)。

图10a至图10e为通过节结(Nodule)生成抑制来确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的肾脏纤维化(Fibrosis)抑制效果的图。

图11为示出通过Smad2磷酸化抑制来确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidneyfailure)的肾脏细胞中的肾脏纤维化(Fibrosis)抑制效果的图。

图12a至图12c为示出通过作为肾脏细胞的纤维化(Fibrosis)相关重要机制的上皮细胞间质转型(EMT，Epithelial-mesenchymal transitio)途径(pathway)调节效果来确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的肾脏纤维化(Fibrosis)抑制效果的图(其中，*为p＜0.05vs.TGFβ-，#为p＜0.05vs.TGFβ+，+为p＜0.05vs.TGFβ+e)。

图13a至图13b为示出通过作为肾脏细胞的纤维化(Fibrosis)相关重要机制的上皮细胞间质转型(EMT，Epithelial-mesenchymal transitio)途径(pathway)的子信号(snail1及slug mRNA表达)调节效果来确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的肾脏纤维化(Fibrosis)抑制效果的图(其中，*为p＜0.05vs.TGFβ-，#为p＜0.05vs.TGFβ+，+为p＜0.05vs.TGFβ+e)。

图14a及图14b为用于确认从用拉尼兰诺预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中的肾损害治疗及恢复功能的图。

【具体实施方式】

【本发明的最佳实施方式】

本发明涉及用于预防或治疗肾脏疾病(Kidney disease)的药物组合物，其包含从诱导多能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)来源间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

【本发明的实施方式】

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于进一步具体说明本发明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围并不限定于这种实施例。

在本说明书的全文内容中，除非另有定义，否则用于表示特定物质相关浓度的“％”表示固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％。

【制备例：诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)的分离及培养】

首先，在添加10％的FBS及10ng/ml的bFGF的DMEM中培养诱导多能干细胞(iPSC)7天。然后，通过FASC从培养的诱导多能干细胞中分离在细胞表面不表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4，stage-specific embryonic antigen-4)蛋白的SSEA-4(-)细胞。并且，针对分离的SSEA-4(-)细胞进行传代并在与上述相同的培养基中进一步培养7天，从而制备本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。本发明人将上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞命名为BxC(brexogen stem cell)。

在培养基[(high glucose DMEM(Gibco，Cat no.11995-065)，10％Fetal bovineSerum(HyClone)，1％MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco，Catno.11140-050)]中进一步培养被命名为BxC的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。

【实施例1：分离源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)的外泌体】

收集通过上述制备例培养的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(以下，称为BxC)培养基，并在300xg的条件下离心分离10分钟来去除剩余的细胞和细胞残渣。采集上清液并利用0.22μm的过滤器进行过滤后，使用高速离心机(high speedcentrifuge)以10000xg及4℃的条件进行70分钟的离心分离。再次采集离心分离的上清液并利用超高速离心机(ultracentrifuge)以100000xg及4℃的条件进行90分钟的离心分离来去除上清液。在磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferd salin)中稀释下层残留的外泌体来用于以下实验。

【实验例1：确认源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC-e)外泌体的特性】

针对通过上述实施例1分离的外泌体(以下，称为BxC-e)，使用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking assay)(NanoSight NS300，Malvern)对外泌体的尺寸分布进行确认，并使用电子显微镜对外泌体的形态进行确认。

通过确认图1a及图1b可知，本发明的源自BxC的外泌体具有外泌体的特性。

【实验例2：确认源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-e)的肾脏细胞再生效果】

针对通过上述实施例1分离的外泌体，确认到用顺铂(Cisplatin)或脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)处理对于损伤的肾脏细胞的再生效果。

【2-1.顺铂损伤】

首先，在96孔培养皿(culture dish)每孔接种(seeding)1×10⁴个作为上皮细胞株(epithelial cell line)的HK-2(韩国细胞株银行)、作为肾脏上皮细胞(kidneyepithelial cell)的肾近端小管上皮细胞(RPTEC，龙沙(Lonza)，CC-2553)及作为肾脏上皮细胞的肾小球内皮细胞(GEC，Glomerular Endothelial Cells，Cell Systems，ACBRI128)。

细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基(serum free growthmedia)处理25μM顺铂(Sigma P4394)24小时。24小时后，去除上清液并用DPBS(HyCloneSH30028.02)洗涤，随后，与新的无血清生长培养基一并处理50μg(低剂量(low dose))或100μg(高剂量(high dose))的通过上述实施例1分离的外泌体48小时。

最后，添加10μL的CCK-8溶液(Cell Counting Kit-8，Enzo ALX-850-039-KI01)，在CO₂培养箱中以37℃的温度条件培养2小时。确认颜色变化并在450nm处测定吸光度。

【2-2.脂多糖损伤】

除代替上述实验例2-1的顺铂使用20μg/mL的脂多糖(Sigma L2880)进行处理外，与上述实验例2-1相同方法进行实验。

通过确认图2a至图2c可知，本发明的源自BxC的外泌体(BxC-e)对于多种肾脏细胞的再生效果非常优秀。

【实验例2：分离源自用预处理物质处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-G63e)】

【2-1.分离源自用艾塞那肽(Exendin-4)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-G63e)】

在包含20nM艾塞那肽(Exendin-4)的培养基[high glucose DMEM(Gibco，Catno.11995-065)；10％Fetal bovine Serum(HyClone)，1％MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100X)(Gibco，Cat no.11140-050)]中培养通过上述制备例制备的诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)24小时。

完成培养后，洗涤用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的BxC，并在添加10％的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中进一步培养72小时。之所以使用去除外泌体的FBS，是因为通常使用的FBS中包含大量的牛血清源外泌体，因此，其目的在于，除细胞分泌的外泌体外，防止混入FBS源外泌体。

培养72小时后，收集用预处理物质进行处理的BxC培养基并在300xg的条件下离心分离10分钟来去除剩余的细胞和细胞残渣。采集上清液并利用0.22μm的过滤器进行过滤后，使用高速离心机(high speed centrifuge)以1000xg及4℃的条件进行70分钟的离心分离。再次采集离心分离的上清液并利用超高速离心机(ultracentrifuge)以100000xg及4℃的条件进行90分钟的离心分离来去除上清液。在磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferdsalin))中稀释下层残留的外泌体来用于以下实验。

【2-2.分离源自用拉尼兰诺处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)】

在包含10μM拉尼兰诺(Lanifibranor)的培养基[high glucose DMEM(Gibco，Catno.11995-065)；10％Fetal bovine Serum(HyClone)，1％MEM Non-Essential AminoAcids Solution(100X)(Gibco，Cat no.11140-050)]中培养通过上述制备例制备的诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)24小时。

完成培养后，洗涤用拉尼兰诺(Lanifibranor)预处理的BxC，并在添加10％的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中进一步培养72小时。

培养72小时后，收集用预处理物质进行处理的BxC培养基并在300xg的条件下离心分离10分钟来去除剩余的细胞和细胞残渣。采集上清液并利用0.22μm的过滤器进行过滤后，使用高速离心机(high speed centrifuge)以1000xg及4℃的条件进行70分钟的离心分离。再次采集离心分离的上清液并利用超高速离心机(ultracentrifuge)以100000xg及4℃的条件进行90分钟的离心分离来去除上清液。在磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferdsalin)中稀释下层残留的外泌体来用于以下实验。

【实验例3：确认源自用预处理物质处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体的特性】

针对通过上述实施例2分离的外泌体(BxC-V37e、BxC-G63e)，使用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking assay)(NanoSight NS300，Malvern)对外泌体的尺寸分布进行确认，并使用电子显微镜对外泌体的形态进行确认。

通过确认图3a至图3d可知，本发明的用艾塞那肽(Exendin-4)及拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的BxC来源外泌体具有外泌体的特性。

【实验例4：评估源自用艾塞那肽(Exendin-4)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-G63e)的肾脏疾病治疗活性】

针对通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)及通过上述实施例2-1分离的(BxC-G63e)进行以下实验。

【4-1.炎症(Inflammation)抑制效果】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种作为上皮细胞株的HK-2、作为肾脏上皮细胞的肾近端小管上皮细胞(RPTEC)及作为肾脏上皮细胞的肾小球内皮细胞(GEC)。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基(serum free growth media)处理25μM顺铂或20μg/mL脂多糖及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或通过上述实施例2分离的外泌体(BxC-G63e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用顺铂或脂多糖处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA(totalRNA)。利用总RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定TNFα基因的表达。

通过确认图4a及图4b可知，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-G63e)在通过顺铂或脂多糖处理诱发毒性的多种肾脏细胞中具有显著抑制炎症的效果。

【4-2.细胞凋亡(Apoptosis)抑制效果】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种作为上皮细胞株的HK-2、作为肾脏上皮细胞的肾近端小管上皮细胞(RPTEC)及作为肾脏上皮细胞的肾小球内皮细胞(GEC)。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基(serum free growth media)处理25μM顺铂或20μg/mL脂多糖及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或通过上述实施例2分离的外泌体(BxC-G63e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用顺铂或脂多糖处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。利用总RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定半胱天冬酶-3(caspase-3)基因的表达。

通过确认图5a及图5b可知，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-G63e)在通过顺铂或脂多糖处理诱发毒性的多种肾脏细胞中具有显著抑制细胞凋亡的效果。

【4-3.内质网应激(ER Stress)抑制效果】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种作为上皮细胞株的HK-2、作为肾脏上皮细胞的肾近端小管上皮细胞(RPTEC)及作为肾脏上皮细胞的肾小球内皮细胞(GEC)。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基(serum free growth media)处理25μM顺铂或20μg/mL脂多糖及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或通过上述实施例2分离的外泌体(BxC-G63e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用顺铂或脂多糖处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。利用总RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定C/EBP同源蛋白(CHOP)基因的表达。

通过确认图6a及图6b可知，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-G63e)在通过顺铂或脂多糖处理诱发毒性的多种肾脏细胞中具有显著抑制内质网应激的效果。

【4-4.肾损害治疗及恢复功能】

在通过顺铂(Cisplatin)诱导肾衰竭(Kidney failure)的小鼠肾损害模型中，确认从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-G63e)的肾损害治疗及恢复功能。

向8周龄的Balb/c雄性小鼠的腹腔内给药顺铂(cisplatin)(15mg/kg)来诱发肾损害。注射顺铂(cisplatin)后，给药从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-G63e)IV，3天后，分离血液并测定肌酐(Creatinine)、尿素氮(BUN)水平来确认BxC-G63e的肾损害治疗及恢复功能。

【表1】

	正常对照组	空白对照组	BxC-G63e
				尿素氮水平(mg/dL)	21.2	316	157

【表2】

	正常对照组	空白对照组	BxC-G63e
				肌酐水平(mg/dL)	0.1	1.5	0.9

实验结果，从图7a、图7b及表1、表2确认到，本发明的从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-G63e)可显著减少因顺铂(Cisplatin)而增加的肾脏中的尿素氮(BUN)值和肌酐(Creatinine)值，由此，确认到BxC-G63e外泌体对于恢复受损肾脏功能具有显著效果。

【实验例5：评估源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)的肾脏疾病治疗活性】

【5.1.细胞凋亡(Apoptosis)抑制效果】

在孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基处理TGF-β(10ng/mL)及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。然后，利用以下表3的引物并用RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定半胱天冬酶-3基因的表达。

【表3】

序号	名称	序列(5’→3’)	备注
				1	人半胱天冬酶-3_正向引物	TCTGGTTTTCGGTGGGTGTG
2	人半胱天冬酶-3_反向引物	CGCTTCCATGTATGATCTTTGGTT

【表4】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+V37e
					半胱天冬酶-3mRNA(A.U.)	1.2	5.2	1.1	0.9

通过确认图8及表4可知，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGF-β处理诱发纤维化的肾脏细胞中具有显著抑制细胞凋亡的效果。

【5.2.纤维化(Fibrosis)抑制效果】

【5.2.1.胶原I、CTGF、α-SMA及纤粘连蛋白表达抑制】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基处理TGF-β(10ng/mL)及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。然后，利用以下表5的引物并用RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定胶原I、CTGF、α-SMA及纤粘连蛋白基因的表达。

【表5】

序号	名称	序列(5’→3’)	备注
				3	人胶原1_正向引物	CACAGAGGTTTCAGTGGTTT
4	人胶原1_反向引物	GCACCAGTAGCACCATCATT
				5	人CTGF_正向引物	CAAGGGCCTCTTCTGTGACT
6	人CTGF_反向引物	ACGTGCACTGGTACTTGCAG
				7	人αSMA_正向引物	AGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGC
8	人αSMA_反向引物	CTCTCTGTCCACCTTCCAGCAG
				9	人纤粘连蛋白_正向引物	AAGATTGGAGAGAAGTGGGACC
10	人纤粘连蛋白_反向引物	GAGCAAATGGCACCGAGATA

【表6】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+V37e
					胶原I mRNA(A.U.)	1	98.2	63.8	4.2

【表7】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+V37e
					CTGF mRNA(A.U.)	1.8	5.7	5.2	1.7

【表8】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+V37e
					α-SMA mRNA(A.U.)	1.7	5.8	1.9	1.7

【表9】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+V37e
					纤粘连蛋白mRNA(A.U.)	1.4	13.6	6.7	1.2

从图9a至图9d及表6至表9确认到，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGFβ处理诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中显著减少作为肾脏细胞的纤维化(Fibrosis)相关基因的胶原I、CTGF、α-SMA及纤粘连蛋白的表达。

【5.2.2.对节结(Nodule)形成的抑制】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。当接种细胞时，用无血清生长培养基处理TGF-β及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用甲醇在4℃的温度条件下固定5分钟后，添加天狼猩红溶液(Picrosirius Redsolution)进行第一次处理并用乙酸溶液(Acetic Acid solution)洗涤2次，利用显微镜观察节结(Nodule)形成程度并进行比较，用0.1N KOH溶解天狼猩红染料(Picrosirius Reddye)并在540nm处测定吸光度来与阳性对照组进行比较。

【表10】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+v37e
					与对照组之比	1	1.71	1.28	1.14

从图10a至图10e及表10确认到，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGFβ处理诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中显著减少节结(nodule)的生成。

【5.2.3.防止Smad2磷酸化】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基处理TGF-β及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，收集细胞并用NP40缓冲液提取蛋白质。针对蛋白质，通过蛋白质印迹法(western blot)分析总Smad2蛋白和磷酸化蛋白。对每种总蛋白磷酸化的Smad2蛋白进行定量并与未用TGF-β处理的阴性对照组进行比较。

从图11确认到，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGFβ处理诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中抑制TGF-β的Smad2蛋白磷酸化。

【5.2.4.上皮细胞间质转型(EMT，Epithelial–mesenchymal transitio)途径(pathway)调节】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基处理TGF-β及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。然后，使用表11的引物并用RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定E-cadherin(E-钙黏蛋白)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)基因的表达。

【表11】

序号	名称	序列(5’→3’)	备注
				11	人E-钙黏蛋白_正向引物	GCTGGACCGAGAGAGTTTCC
12	人E-钙黏蛋白_反向引物	CGACGTTAGCCTCGTTCTCA
				13	人N-钙黏蛋白_正向引物	GACAATGCCCCTCAAGTGTT
14	人N-钙黏蛋白_反向引物	CCATTAAGCCGAGTGATGGT
				15	人波形蛋白_正向引物	CTCCCTGAACCTGAGGGAAAC
16	人波形蛋白_反向引物	TTGCGCTCCTGAAAAACTGC

【表12】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+v37e
					E-钙黏蛋白mRNA(A.U.)	1.39	0.74	0.79	0.9

【表13】

【表14】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+v37e
					波形蛋白mRNA(A.U.)	1.56	26.77	9.9	0.90

从图12a至图12c及表12至表14确认到，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGFβ处理诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中具有优秀的作为纤维化(Fibrosis)相关重要机制的上皮细胞间质转型(EMT，Epithelial-mesenchymaltransitio)途径(pathway)调节效果。

【5.2.5.snail1及slug的mRNA表达抑制】

在6孔培养皿中以每孔1×10⁵个接种肾脏上皮细胞。细胞接种16小时后，确认细胞状态并用无血清生长培养基处理TGF-β(10ng/mL)及100μg通过上述实施例1分离的外泌体(BxC-e)或源自用拉尼兰诺(Lanifibranor)处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体(BxC-V37e)24小时。在此情况下，作为阳性对照组使用仅用TGF-β处理诱导肾衰竭的组。

24小时后，去除上清液并用DPBS洗涤，随后，用Trizol处理来提取总RNA。然后，使用表5的引物并用RNA合成cDNA后，通过qRT-PCR测定Snail、Slug基因的表达。

【表15】

序号	名称	序列(5’→3’)	备注
				17	人Snail1_正向引物	CCTGTCTGCGTGGGTTTTTG
18	人Snail1_反向引物	ACCTGGGGGTGGATTATTGC
				19	人Slug_正向引物	ACTGGACACACATACAGTGATT
20	人Slug_反向引物	ACTCACTCGCCCCAAAGATG

【表16】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+v37e
					Snail1 mRNA(A.U.)	1.3	104.2	101.7	6.8

【表17】

	TGFβ-	TGFβ+	TGFβ+e	TGFβ+v37e
					Slug mRNA(A.U.)	1.07	6.38	3.48	0.62

从图13a、图13b及表16、表17确认到，本发明的外泌体(BxC-e及BxC-V37e)在通过TGFβ处理诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中具有优秀的作为纤维化(Fibrosis)相关重要机制的上皮细胞间质转型(EMT，Epithelial-mesenchymal transitio)途径的下层信息的snail1及slug mRNA的表达(Expression)调节效果。

【5.3.肾损害治疗及恢复功能】

在通过顺铂(Cisplatin)诱导肾衰竭(Kidney failure)的小鼠肾损害模型中，确认从用拉尼兰诺(Lanifibranor)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)的肾损害治疗及恢复功能。

向8周龄的Balb/c雄性小鼠的腹腔内给药顺铂(cisplatin)(15mg/kg)来诱发肾损害。注射顺铂(cisplatin)后，给药从用拉尼兰诺(Lanifibranor)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-G63e)IV，3天后，分离血液并测定肌酐(Creatinine)水平、尿素氮水平来确认BxC-G63e的肾损害治疗及恢复功能。

【表18】

	正常对照组	空白对照组	BxC-V37e
				尿素氮水平(mg/dL)	21.2	316	212

【表19】

	正常对照组	空白对照组	BxC-V37e
				肌酐水平(mg/dL)	0.1	1.5	0.3

实验结果，从图14a、图14b及表18、表19确认到，本发明的从用艾塞那肽(Exendin-4)预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体(BxC-V37e)可显著减少因顺铂(Cisplatin)增加的肾脏中的尿素氮(BUN)值和肌酐(Creatinine)值，由此，确认到BxC-V37e外泌体对于恢复受损肾脏功能具有显著效果。

【小结】

综合上述内容可知，在诱导肾衰竭(Kidney failure)的肾脏细胞中，本发明的BxC-e、BxC-G63e及BxC-V37e不仅可抑制炎症、细胞凋亡，而且，还可抑制内质网应激，因此，在预防或治疗肾脏疾病的层面上具有显著功效。

【产业上的可利用性】

本发明涉及用于预防或治疗肾脏疾病的组合物，其包含从用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分。

序列表

<110> Brexogen Inc.

<120> 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞外泌体的用于预防或治疗肾脏疾病的组合物

<130> PP200075

<150> KR 10-2019-0144420

<151> 2019-11-12

<150> KR 10-2020-0149965

<151> 2020-11-11

<160> 20

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_半胱天冬酶-3_正向引物

<400> 1

tctggttttc ggtgggtgtg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_半胱天冬酶-3_反向引物

<400> 2

cgcttccatg tatgatcttt ggtt 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_胶原1_正向引物

<400> 3

cacagaggtt tcagtggttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_胶原1_反向引物

<400> 4

gcaccagtag caccatcatt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_CTGF_正向引物

<400> 5

caagggcctc ttctgtgact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_CTGF_反向引物

<400> 6

acgtgcactg gtacttgcag 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_aSMA_正向引物

<400> 7

aggtaacgag tcagagcttt ggc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_aSMA_反向引物

<400> 8

ctctctgtcc accttccagc ag 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_纤粘连蛋白_正向引物

<400> 9

aagattggag agaagtggga cc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_纤粘连蛋白_反向引物

<400> 10

gagcaaatgg caccgagata 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_E-钙黏蛋白_正向引物

<400> 11

gctggaccga gagagtttcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_E-钙黏蛋白_反向引物

<400> 12

cgacgttagc ctcgttctca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_N-钙黏蛋白_正向引物

<400> 13

gacaatgccc ctcaagtgtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_N-钙黏蛋白_反向引物

<400> 14

ccattaagcc gagtgatggt 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_波形蛋白_正向引物

<400> 15

ctccctgaac ctgagggaaa c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_波形蛋白_反向引物

<400> 16

ttgcgctcct gaaaaactgc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_Snail1_正向引物

<400> 17

cctgtctgcg tgggtttttg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_Snail1_反向引物

<400> 18

acctgggggt ggattattgc 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_Slug_正向引物

<400> 19

actggacaca catacagtga tt 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人_Slug_反向引物

<400> 20

actcactcgc cccaaagatg 20

Claims (3)

1.用于治疗或预防肾脏疾病的药物组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离的外泌体作为有效成分，

其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞是在细胞表面不表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)蛋白的SSEA-4(-)细胞的培养的细胞，其中所述SSEA-4(-)细胞来源于诱导多能干细胞，

其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞在包含所述预处理物质的细胞培养基中培养12～36小时，且

其中所述预处理物质为10～100nM艾塞那肽或5～50μM拉尼兰诺。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肾脏疾病选自由肾脏纤维化、糖尿病肾病、高血压肾病、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎、多囊肾病、肾衰竭、肾小球硬化、移植后急性排斥反应及药物性肾损害组成的组中。

3.外泌体在制造用于治疗或预防肾脏疾病的药物组合物中的用途，其中所述外泌体从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离，

其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞是在细胞表面不表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)蛋白的SSEA-4(-)细胞的培养的细胞，其中所述SSEA-4(-)细胞来源于诱导多能干细胞，

其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞在包含所述预处理物质的细胞培养基中培养12～36小时，

其中所述预处理物质为10～100nM艾塞那肽或5～50μM拉尼兰诺，且

其中所述肾脏疾病选自由肾脏纤维化、糖尿病肾病、高血压肾病、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎、多囊肾病、肾衰竭、肾小球硬化、移植后急性排斥反应及药物性肾损害组成的组中。