CN114025776B - 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物 - Google Patents

包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物，其包含从用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体作为有效成分。本发明的外泌体，相较于从现有间充质干细胞中分离出的外泌体，其在预防或治疗非酒精性脂肪肝炎的效果方面更为改善，因此，可用于相关的研发和产品化。

Description

包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞的外泌 体的非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物
技术领域
本专利申请就2019年08月22日提交给大韩民国专利厅的大韩民国专利申请第10-2019-0103186号，2020年08月04日提交给大韩民国专利厅的大韩民国专利申请第10-2020-0097398号提出优先权要求，并将上述专利申请的公开内容作为参考引入本说明书中。
本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物，其包含外泌体作为有效成分，所述外泌体来源于用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞。
背景技术
间充质干细胞作为一种具有多分化能的基质细胞，指的是可分化成成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等多种细胞的一种细胞。间充质细胞可分化成软骨、骨组织、韧带和骨髓基质等各种缔结组织，因此，多被用于研究其在治疗各种疾病(如：治疗因关节炎、外伤、烧伤等引起的软组织缺损)方面的用途。
最近，在研究间充质干细胞对各种疾病的治疗功效方面，大多选择使用间充质干细胞分泌的外泌体，而非间充质干细胞本身。为实现这种外泌体的商业应用性，就需要大量优质的外泌体。但，可从间充质干细胞中获取的外泌体数量极少，而且，间充质干细胞的功能和增殖能力也会随着继代的重复而减退，为此，需要开发一种建立细胞的技术，而该细胞应在功能方面等于或优于间充质干细胞，且具有优异的增殖能力。
一方面，非酒精性脂肪肝的特征在于，在未摄入大量酒精的情况下，中性脂肪，即甘油三酯在干细胞内积聚。由于现代人摄入高脂肪、高碳水化合物及相关营养过剩，导致非酒精性脂肪肝不断增加。非酒精性脂肪肝常见于肥胖、糖尿病患者，但已知有多种因素与非酒精性脂肪肝有关。据报道，80％患有非酒精性脂肪肝的成人会发展到出现代谢紊乱疾病，如：胰岛素抵抗性糖尿病、心脏病等。
非酒精性脂肪肝分为非酒精性单纯性脂肪肝(non-alcoholic simplesteatosis)和伴有炎症的非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis；NASH)，如果长期放任不管，会发展到肝炎、肝纤维化、肝硬化等严重的肝脏疾病。非酒精性脂肪肝的特征在于，脂肪在肝细胞(hepatocyte)内积聚(脂肪浸润)。
已知非酒精性单纯性脂肪肝可以发展到非酒精性脂肪肝炎，非酒精性脂肪肝中的脂肪积聚与不同程度的肝的炎症和疤痕有关，多数情况下与胰岛素抵抗性、血脂异常和高血压有关。非酒精性脂肪肝炎常见于体重超重、胆固醇和甘油三酯数值高、及/或有胰岛素抵抗症的人群。
最近，随着肥胖人口数量的增加以及非酒精性脂肪肝炎患者人数的增加，使得非酒精性脂肪肝炎治疗剂的市场已发展到拥有庞大的市场规模，而且，在非酒精性脂肪肝炎的发病原因和机制被揭示后，非酒精性脂肪肝炎治疗剂的开发也开始广受关注。但，在开发可安全且长期服用的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的水平上，仍存在诸多不足。
通常，在治疗非酒精性脂肪肝炎方面，使用的是肥胖治疗剂、胰岛素抵抗治疗剂、高血脂治疗剂、高血脂治疗剂、肝细胞保护剂、抗氧化剂等。但，这些药物并不是非酒精性脂肪肝炎的实质性治疗剂，而是作为症状改善剂使用，且长期服用时会产生副作用。
为此，越来越需要开发一种新型治疗用组合物，其应更安全且可长期服用，并适用于治疗慢性疾病非酒精性脂肪肝炎。
发明内容
技术问题
本发明人潜心研究，旨在开发一种使用间充质干细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎治疗剂。结果表明，通过建立由处于分化阶段的间充质细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞，取代诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞，证实来源于由用预处理物质预处理或未经预处理的上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞的外泌体，在预防或治疗非酒精性脂肪肝炎方面，表现出优异的效果，借以完成了本发明。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis；NASH)的预防或治疗用药剂学组合物，其包含从诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)中分离出的外泌体作为有效成分。
本发明的另一个目的在于，提供一种从诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)中分离的外泌体。
本发明的另一个目的在于，提供一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis；NASH)的预防或治疗用药剂学组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体作为有效成分。
本发明的另一个目的在于，提供一种从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体。
技术方案
本发明人潜心研究，旨在开发一种使用间充质干细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎治疗剂。结果表明，通过建立由处于分化阶段的间充质细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞，取代诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞，证实来源于由用预处理物质预处理或未经预处理的上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞的外泌体，在预防或治疗非酒精性脂肪肝炎方面，表现出优异的效果。
本发明涉及一种从由诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞中分离出的外泌体，及包含其作为有效成分的非酒精性脂肪肝炎的预防或治疗用药剂学组合物；以及从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体，及包含其作为有效成分的非酒精性脂肪肝炎的预防或治疗用药剂学组合物。
以下，对本发明进行更详细的说明。
依据本发明的一个方面，本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis；NASH)的预防或治疗用药剂学组合物，其包含从诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)中分离出的外泌体作为有效成分。
依据本发明的另一个方面，本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎的预防、缓解、改善或治疗用药剂学组合物，其包含从诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体作为有效成分。
本说明书中的术语“非酒精性脂肪肝炎”，是指一种进行性肝脏疾病，其特征在于，属于非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)之一，伴有脂肪肝、炎症或纤维化症状，是引发肝硬化或肝癌的前驱疾病。
在本说明书中，术语“干细胞”作为一种未分化细胞，指的是，具有自我复制能力，且具有可分化成两种以上不同类型细胞的能力的细胞。本发明的干细胞可以是自体或同种组织来源干细胞。
在本说明书中，术语“诱导多能间充质干细胞”，指的是，通过诱导已分化的细胞(如：体细胞)的逆分化(dedifferentiation)，返回到初始的未分化状态，从而具有多能性(pluripotency)的细胞。
上述逆分化，可通过导入和表达特定基因(例如：Sox2、c-Myc、Klf4、Oct-4等)或通过注射逆分化诱导蛋白(其在导入上述特定基因的细胞中制备)来诱导。
上述多能性，指的是一种分化能力，其可分化为源于构成生物体的三个胚层(germlayer)，即内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)和外胚层(ectoderm)的组织或器官。
在本说明书中，术语“间充质干细胞”作为一种具有多分化能的细胞，指的是，可分化成包含成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等在内的各种细胞的干细胞。上述间充质干细胞最常用的就是骨髓来源间充质干细胞，但，除骨髓之外，还可以来源于脐带或脐带血、脂肪组织、羊水、臼齿牙蕾(tooth bud)。间充质干细胞又被称作基质细胞(stromalcell)。
上述间充质干细胞的前体细胞，并不是来源于一般的间充质干细胞，而是来源于【本发明人开发的】诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的间充质干细胞的前体细胞。
在本发明中，诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞，可以不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白。
在本发明中，诱导多能干细胞来源间充质干细胞，可以由不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来。
上述“诱导多能干细胞”是指通过人为逆分化过程，从分化的细胞中诱导出的具有多能性分化能力的细胞，也被称作逆分化干细胞。
上述人为逆分化过程，通过使用病毒性介导(其使用逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒)或非病毒性载体，并通过导入非病毒性介导的逆分化因子(其使用蛋白或细胞提取物等)完成；或包括借由干细胞提取物、化合物等完成的逆分化过程。
上述诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞几乎相同的特性，具体地，两者具有相似的细胞形状，基因和蛋白表达相似，在体外(in vitro)和体内(In vivo)具有全能性，并形成畸胎瘤(teratoma)，当插入到小鼠的囊胚(blastocyst)中时，会形成嵌合体(chimera)小鼠，并可进行基因的生殖系传递(germline transmission)。
本发明的诱导多能干细胞，可包括所有来源(如：人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠、鼠、兔子)的诱导多能干细胞，但优选地，是人类来源的诱导多能干细胞。
另外，本发明的上述诱导多能干细胞逆分化前的体细胞，可以是来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、羊水或胎盘等的体细胞，但不限于此。
具体地，上述体细胞包括：成纤维细胞(fibroblast)、干细胞(hepatocyte)、脂肪细胞(adipose cell)、上皮细胞(epithelial cell)、表皮细胞(epidermal cell)、软骨细胞(chondrocyte)、肌细胞(muscle cell)、心肌细胞(cardiac muscle cell)、黑色素细胞(melaonocyte)、神经细胞(neural cell)、胶质细胞(glial cell)、星形胶质细胞(astroglial cell)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)等，但不限于此。
在本发明的一个实现例中，上述本发明的间充质干细胞，相较于等量的间充质干细胞，其以更高的水平表达选自由ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4，及ACKR3组成的组中的一个或多个基因。
另外，在本发明的另一个实现例中，上述本发明的间充质干细胞，相较于等量的间充质干细胞，其以更低的水平表达选自由DHRS3、BMPER、IFI6、PRSS12、RDH10，及KCNE4组成的组中的一个或多个基因。
上述间充质干细胞和等量的其他间充质干细胞属于同种来源。更具体地，上述间充质干细胞是来源于诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞。
在本发明的一个实施例中，上述间充质干细胞，是来源于脐带组织来源诱导多能干细胞的间充质干细胞，与其相比较的等量间充质干细胞则是脐带组织来源间充质干细胞。
本发明人将由上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞，命名为BxC(brexogen stem cell)。在本说明书中，上述“诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)”也可用“诱导多能干细胞来源间充质细胞”来表达。
本说明书中的术语“诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞”，是处于从诱导多能干细胞完全分化为间充质干细胞之前的阶段的细胞，可看作是诱导多能干细胞来源间充质干细胞的一种，其指的是，不表达SSEA-4蛋白，通过进一步培养，从而具有完整的间充质干细胞性质的一种细胞。
本发明的同种组织来源(例如：脐带组织)的诱导多能干细胞的间充质干细胞(BxC)，相较于同种组织来源(例如：脐带组织)的间充质干细胞(MSC)，其染色体核型未见异常且增殖能力更为优异。具体地，当BxC完成9次以上的继代时，相较于同种组织来源间充质干细胞(MSC)，其表现出10倍以上的增殖能力差异，且即使完成12次以上的继代，也未观察到增殖能力的减退迹象。另外，BxC在与细胞增殖能力相关的标记Ki67的表达量方面，显示高出MSC 2倍以上。
上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)，相较于等量的间充质干细胞，其分泌大量的内皮抑素(Endostatin)、内皮素-1(Endothelin-1)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、Thrombospondin-2、胎盘生长因子(PlGF)、血小板衍生因子(PDGF-AA)、β神经生长因子(beta-NGF)，及肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)等功能性蛋白。
在本说明书中，上述内皮抑素(Endostatin)是来源于天然生成的type XVIII胶原蛋白的20kDa C末端片段，其被报道是一种抗血管生成抑制剂。
在本说明书中，上述内皮素-1(endothelin-1)，也称为内皮素前体-1(PPET1)，是一种由EDN1基因编码的蛋白，生成于血管内皮细胞。已知内皮素-1(endothelin-1)是一种强效血管收缩剂。
在本说明书中，上述血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA，VEGF-A)，作为一种由VEGFA基因编码的蛋白，已知其借助与血管内皮细胞的VEGFR1和VEGFR2的相互作用，诱导血管的生长。
在本说明书中，上述Thrombospondin-2，作为一种由THBS2基因编码的蛋白，已知其介导细胞－细胞相互作用或细胞－基质相互作用。Thrombospondin-2在癌症中发挥的作用仍存在争议，但据报道称，其可调节间充质干细胞的细胞表面特性，并参与细胞细胞粘附和细胞迁移。
在本说明书中，上述胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)是由PFG基因编码的蛋白，已知其作为血管内皮生长因子亚家族(VEGF sub-family)的一员，是在胚胎发育期间的血管生成方面发挥主要作用的一种蛋白。
在本说明书中，上述血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF-AA)作为一种调节细胞生长和分裂的生长因子，已知其在血管的生成和生长，及间充质干细胞的增殖、趋化和迁移方面发挥重要作用。
在本说明书中，神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)作为一种神经亲和性因子和神经肽，其主要参与神经的生长、维持、增殖和存活。NFG是三种蛋白的复合物，其中，alpha-、beta-，和gamma-NGF的表达比例约为2：1：2。已知其中的gamma-NGF发挥丝氨酸蛋白酶的作用，通过切割beta-NGF的N-末端来激活NGF。
在本说明书中，上述肝素结合表皮生长因子(hepari-binding EGF-like growthfactor,HB-EGF)是一种由HBEGF基因编码的EGF家族(EGF family)蛋白的成员。已知HB-EGF在心脏发育和血管分布方面发挥重要作用，其在表皮创伤愈合方面，还是上皮化过程中的必需蛋白。
在本说明书中，术语“外泌体(exosome)”是一种囊泡(membrane vesicle)，其从细胞向细胞外分泌，或具有由存在于细胞内的脂质双分子层构成的膜结构。外泌体的直径约为30-1000nm，外泌体在多泡体(multivesicular bodies)与细胞膜融合时从细胞中释放出来，或直接从细胞膜中释放出来。已知外泌体发挥运输细胞内的生物分子蛋白、生物活性脂质和RNA(miRNA)的作用，以实现其在介导凝固、细胞间通讯和细胞免疫方面的功能性作用。
上述外泌体的概念包括微泡(microvesicle)。已知外泌体的标记蛋白有CD63、CD81等，除此之外，已知的还有细胞表面受体(如：EGFR)，信号传导相关分子、细胞粘附相关蛋白、MSC相关抗原、热休克蛋白(heat shock protein)、囊泡形成相关Alix等蛋白。
在本发明中，上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体，指的是，存在于上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中或由BxC分泌的外泌体。
在本发明中，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体，可以从由不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞中分离出来。
在本说明书中，术语“作为有效成分包含”，指的是，从诱导多能干细胞间充质干细胞分离出的外泌体，包含足以达到酒精性脂肪肝炎预防或治疗活性的量。
在本发明中，药剂学组合物，以外泌体蛋白为准，可包含1至10000μg、1至1000μg、10至10000μg、10至1000μg、100至10000μg、100至1000μg、50至10000μg、50至1000μg或50至500μg的从诱导多能干细胞来源间充质干细胞中从分离出的外泌体，但不限于此。
本发明中使用的术语“预防”，指的是，通过施用本发明的组合物，抑制或延缓非酒精性脂肪肝炎病情进展的一切行为。
本说明书中使用的术语“治疗”，指的是，(a)抑制非酒精性脂肪肝炎的病情进展；(b)减轻非酒精性脂肪肝炎的症状；及(c)消除非酒精性脂肪肝炎。
依据本发明的药剂学组合物，除有效成分外，还可包含药剂学上可接受的载体。本发明的药剂学组合物中可包含的药剂学上可接受的载体，通常在进行制剂时使用，其包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。此外，除上述成分之外，还可额外包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。
本发明的药剂学组合物可根据所需方法，使用口服或肠胃外给药方式(例如：应用于静脉内、皮下、腹腔内或局部)，给药量会因患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径和时间而不同，但本领域技术人员可以适当进行选择。
本发明的药剂学组合物，仅施用药剂学上的有效量。在本发明中，“药剂学上的有效量”是指，以适用于医药治疗的合理收益/风险比例治疗疾病的充足的量，其有效量可根据患者的疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和排泄率，治疗期、并用药物等因素，及医学领域的其他已知要素决定。
依据本发明的药剂学组合物，可以作为单独的治疗剂给药，或与其他治疗剂并用给药，也与传统治疗剂依次或同时给药，且可单次或多次给药。综合考虑以上因素，重要的是应以最小的量达到最大的效果且无副作用，这对本领域技术人员来说是很容易确定的。
具体地，本发明的药剂学组合物的有效量会有所不同，其取决于患者的年龄、性别、状态、体重、体内的活性成分吸收度、失活率、排泄速度、疾病类型和并用药物。
依据本发明的另一个方面，涉及一种从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体。
本发明的上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分化而来的间充质干细胞中分离出的外泌体(BxC-e)，是具有传统外泌体的特性的一种外泌体。正如本发明实施例所证实的，确认到上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分离出的外泌体，在抑制脂肪分化方面效果优异。(图2)。另外，还确认到，本发明的BxC-e不仅抑制诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中的脂肪生成、抑制炎症，还抑制内质网应激(图5至图7)。
依据本发明的另一个方面，涉及一种非酒精性脂肪肝炎治疗方法，其包括向个体施用上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体的步骤。
上述“个体”，指的是，需要治疗疾病的对象，更具体地，是指哺乳动物，如：人类或非人类灵长类，小鼠(mouse)、狗、猫、马和牛等。
依据本发明的另一个方面，涉及一种上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体的非酒精性脂肪肝炎治疗用途。
上述非酒精性脂肪肝炎治疗方法和治疗用途，与上述从诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体及包含它的药剂学组合物和组分相同，因此，在此省略记述两者的共同内容，以免本说明书过于繁琐。
依据本发明的另一个方面，涉及一种包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)中分离出的外泌体作为有效成分的非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis)的预防或治疗用药剂学组合物。
在本发明中，诱导多能干细胞来源间充质干细胞，可以由不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来。
在本说明书中，术语“预处理”，指的是，在诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞的培养过程中，使添加有预处理物质的细胞培养基，与诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞发生接触的一个过程。
上述预处理，可借由在包含预处理物质的细胞培养基中培养上述诱导多能干细胞间充质干细胞的方法完成。
上述细胞培养基，可以是常用于动物细胞培养基中的任何一种培养基，例如：可以使用DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium)、DMEM和F12的混合物、Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium)、α-MEM、Iscove's MEM、199培养基、CMRL1066、RPMI 1640、F12、F10、Way-mouth's MB752/1、McCoy's5A和MCDB系列等。
上述培养可在6至48小时内完成。
具体地，上述培养可在6至42小时、6至36小时、6至30小时、6至27小时、12至48小时、12至42小时、12至36小时、12至30小时、12至27小时、18至48小时、18至42小时、18至36小时、18至30小时、18至27小时、21至48小时、21至42小时、21至36小时、21至30小时或21至27小时内完成。
上述预处理物质可以是1-(苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid]或Exendin-4。
上述1-(苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸[1-(6-benzothiazolylsulfonyl)-5-chloro-1H-indole-2-butanoic acid]可使用名称“Lanifibranor”，其为过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)的激动剂。
上述Lanifibranor可以以1至100μM的浓度包含在细胞培养基中。
具体地，上述Lanifibranor可以以1至90μM、1至80μM、1至70μM、1至60μM、1至50μM、1至40μM、1至30μM、10至90μM、10至80μM、10至70μM、10至60μM、10至50μM、10至40μM和10至30μM的浓度包含在细胞培养基中。
在本发明的一个实现例中，Lanifibranor可以以1至1000μM、1至500μM、1至100μM、1至90μM、1至80μM、1至70μM、1至60μM、1至50μM、1至40μM、1至30μM、1至20μM或10μM浓度添加到培养基中，但不限于此。
在本发明的一个实现例中，外泌体可以是，在以1000μM、1至500μM、1至100μM、1至90μM、1至80μM、1至70μM、1至60μM、1至50μM、1至40μM、1至30μM、1至20μM、10至90μM、10至80μM、10至70μM、10至60μM、10至50μM、10至40μM和10至30μM或10μM的浓度添加有1-(苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸的培养基中培养的，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离出的外泌体。
本发明的Exendin-4是胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide；GLP)受体的肽激动剂。已知Exendin-4可促进胰岛素分泌，在临床上被用于治疗2型糖尿病和帕金森病。
上述Exendin-4可以以1至100μM的浓度包含在细胞培养基中。
具体地，上述Exendin-4可以以1至90μM、1至80μM、1至70μM、1至60μM、1至50μM、1至40μM、1至30μM、10至90μM、10至80μM、10至70μM、10至60μM、10至50μM、10至40μM和10至30μM或20μM的浓度包含在细胞培养基中。
在本发明的一个实现例中，外泌体可以是，在以1至90μM、1至80μM、1至70μM、1至60μM、1至50μM、1至40μM、1至30μM、10至90μM、10至80μM、10至70μM、10至60μM、10至50μM、10至40μM和10至30μM或20μM的浓度添加有Exendin-4的培养基中培养的，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离出的外泌体，但不限于此。
在本发明中，药剂学组合物，其以外泌体蛋白为准，可以包含浓度为1至10000μg、1至1000μg、10至10000μg、10至1000μg、100至10000μg、100至1000μg、50至10000μg、50至1000μg或50至500μg的，从用1-(苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离出来的外泌体，但不限于此。
在本发明中，药剂学组合物，其以外泌体蛋白为准，可以包含浓度为1至10000μg、1至1000μg、10至10000μg、10至1000μg、100至10000μg、100至1000μg、50至10000μg、50至1000μg或50至500μg的，从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞中分离出来的外泌体，但不限于此。
依据本发明的另一个方面，涉及一种从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体。
本发明的上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体(BxC-V37e和BxC-G63e)，是具有传统外泌体特性的一种外泌体。正如本发明实施例所证实的，确认到BxC-V37e和BxC-G63e不仅抑制诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中的脂肪生成、抑制炎症，还抑制内质网应激(图5至图10)。
依据本发明的另一个方面，涉及一种非酒精性脂肪肝炎的缓解、抑制或改善用食品组合物，其包含从诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体。
依据本发明的另一个方面，涉及一种非酒精性脂肪肝炎的缓解、抑制或改善用食品组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体。
依据本发明的食品组合物，与上述本发明的从诱导多能干细胞间充质干细胞分离出的外泌体及包含它的药剂学组合物和组分相同，因此，在此省略记述两者的共同内容，以免本说明书过于繁琐。
依据本发明的食品组合物可包含食品生产中通常添加的成分，例如，可包括：蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂和增香剂，但不限于此。
依据本发明的食品组合物中可包含的碳水化合物，可包括：葡萄糖果糖等单糖、麦芽糖、蔗糖、寡糖等二糖、糊精、环糊精等多糖、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇类。
依据本发明的食品组合物中可包含的增香剂，可包括：索马甜和甜菊提取物等天然增香剂，及糖精、阿斯巴甜等合成增香剂，但不限于此。
依据本发明的另一个方面，涉及一种非酒精性脂肪肝炎治疗方法，其包括向个体施用上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体的步骤。
上述“个体”，指的是，需要治疗疾病的对象，更具体地，是指哺乳动物，如：人类或非人类灵长类，小鼠(mouse)、狗、猫、马和牛等。
依据本发明的另一个方面，涉及一种上述从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞分离出的外泌体的非酒精性脂肪肝炎治疗用途。
上述非酒精性脂肪肝炎治疗方法和治疗用途，与上述本发明的从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞间充质干细胞分离出的外泌体及包含它的药剂学组合物和组分相同，因此，在此省略记述两者的共同内容，以免本说明书过于繁琐。
发明的效果
本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物，其包含从用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞中分离出的外泌体作为有效成分。本发明的外泌体，相较于从现有间充质干细胞中分离出的外泌体，其在预防或治疗非酒精性脂肪肝炎的效果方面更为改善，因此，可用于相关的研发和产品化。
附图说明
图1a示出的是，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)的平均大小和分布图。
图1b示出的是，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)的电子显微镜照。
图2a示出的是，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)抑制脂肪分化的效果照。
图2b示出的是，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC)抑制脂肪分化的效果图。
图3a示出的是，从用LANIFIBRANOR预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-V37e)的平均大小和分布图。
图3b示出的是，从用LANIFIBRANOR预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-V37e)电子显微镜照。
图4a示出的是，从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-G63e)的平均大小和分布图。
图4b示出的是，从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-G63e)的电子显微镜照。
图5示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)和从用LANIFIBRANOR预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-V37e)对脂肪变性(Steatosis)的抑制效果图。
图6a和6b示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)和从用LANIFIBRANOR预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-V37e)对炎症(Inflammation)的抑制效果图。
图7示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，从诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-e)和从用LANIFIBRANOR预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-V37e)对内质网应激(ER Stress)的抑制效果图。
图8a至图8c示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，Exendin-4和从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-G63e)对脂肪变性(Steatosis)的抑制效果图。
图9a至图9b示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，Exendin-4和从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-G63e)对炎症(Inflammation)的抑制效果图。
图10示出的是，在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，Exendin-4和从用Exendin-4预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)中分离出的外泌体(BxC-G63e)对内质网应激(ER Stress)的抑制效果图。
图11a示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e处理组(MCD-V37e)的苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin；H&E)染色结果图。
图11b示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e处理组(MCD-V37e)的油红O(oil red O)染色结果图。
图12a示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e处理组(MCD-G63e)的苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin；H&E)染色结果图。
图12b示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e处理组(MCD-G63e)的油红O(oil red O)染色结果图。
图13a示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e处理组(MCD-V37e)的NAS评分图表。
图13b示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e处理组(MCD-G63e)的NAS评分图表。
图14a示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e处理组(MCD-V37e)的免疫组织化学染色结果照。
图14b示出的是，在诱导脂肪变性的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(MCD-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e处理组(MCD-G63e)的免疫组织化学染色结果照。
图15a示出的是，在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e(TAA-V37e)处理组的肝组织照。
图15b示出的是，在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e(TAA-G63e)处理组的肝组织照。
图16a示出的是，在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e(TAA-V37e)处理组的苏木精伊红染色结果照。
图16b示出的是，在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e(TAA-G63e)处理组的苏木精伊红染色结果照。
图17a示出的是,在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-V37e处理的BxC-V37e(TAA-V37e)处理组的天狼猩红(picrosirius red)染色结果照。
图17b示出的是,在诱导纤维化的小鼠肝细胞中，未经物质处理的正常组(Normal)、经PBS处理的对照组(TAA-PBS)和经BxC-G63e处理的BxC-G63e(TAA-G63e)处理组的天狼猩红(picrosirius red)染色结果照。
最新实施方式
涉及一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis)的预防、缓解、抑制或治疗用药剂学组合物，其包含从诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)中分离的外泌体作为有效成分。
具体实施方式
以下，结合实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于举例说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
在本说明书中，用于表示特定物质的浓度的“％”，即固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％，除非另有提及。
制备例：诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞的分离和培养
首先，在添加有10％的FBS和10ng/ml的bFGF的DMEM中，培养诱导多能干细胞(iPSC)7天。然后，通过FASC从培养的诱导多能干细胞中，分离出细胞表面不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的SSEA-4(-)细胞，从中获取诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。另外，对分离出的SSEA-4(-)细胞进行继代，并在上述相同的培养基中进一步培养7天，从而制备出本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞。本发明人将上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞命名为BxC(brexogenstem cell)。
在培养基【high glucose DMEM(Gibco，Cat no.11995-065)，10％Fetal bovineSerum(HyClone)，1％MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco,Catno.11140-050)】中，进一步培养被命名为BxC的诱导多能干细胞来源间充质干细胞。
实施例1：分离源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC)的外泌体(BxC-e)
收集通过上述制备例培养的诱导多能干细胞来源间充质干细胞(以下，称BxC)培养基，以300xg的条件离心10分钟，去除剩余的细胞和细胞残渣。取上清液，使用0.22μm过滤器过滤后，使用高速离心机(high speed centrifuge)，以1,000xg，4℃的条件离心70分钟。再取上清液，使用超高速离心机(ultracentrifuge)，以100,000xg，4℃的条件离心90分钟，去除上清液。在磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体后用于以下实验。
实验例1：确认诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC-e)特性
针对通过上述实施例1分离出的外泌体(以下，称BxC-e),使用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking assay)(NanoSight NS300,Malvern)对外泌体的大小分布进行了确认，并使用电子显微镜对外泌体的形态进行了确认。
通过确认图1a和图1b可知，本发明的源自BxC的外泌体具有外泌体的特性。
实验例2：确认诱导多能干细胞来源间充质干细胞(BxC-e)的抑制脂肪细胞分化的效果
针对通过上述实施例1分离出的外泌体，确认到，其具有抑制脂肪分化的效果。
将人脂肪细胞(primary human adipocyte,ATCC,USA)分株到6孔板中，使用添加有1％青霉素-链霉素和10％CS的DMEM培养基(Gibo,USA)，在37℃，5％CO2的培养箱中对其进行培养，直至其长到融合(confluent)状态(最长6天)。
脂肪细胞培养6天后，再在添加有1％青霉素-链霉素和10％FBS的DMEM(Gibo,USA)培养基中加入脂肪分化培养基【34μM泛酸盐(pantothenate，Sigma)、66μM生物素(biotin,Sigma)、0.5mM胰岛素(Sigma)、1mM地塞米松(dexamethasone，Sigma)和0.05M IBMX(Sigma)】的基础培养基中，进一步培养5天。然后，在DMEM(Gibo,USA)培养基中加入脂肪分化培养基【34μM泛酸盐(pantothenate，Sigma)、66μM生物素(biotin,Sigma)、0.5mM胰岛素(Sigma)、1mM地塞米松(dexamethasone,Sigma)】的培养基中，进一步培养9天。
这时，阴性对照(Negative Control)是在添加有10％FBS的DMEM的培养基中培养14天的脂肪细胞，载体对照(Vehicle control)是未经BxC-e的处理，在脂肪分化条件下培养14天的脂肪细胞，BxC-e处理组是在包含BxC-e的脂肪分化条件下培养14天的脂肪细胞。
完全去除培养液后，用PBS洗涤两次，以400ul/孔的条件添加10％福尔马林溶液，固定细胞1小时。用PBS洗涤后，以400ul/孔的条件添加油红O工作液(Oil-red O workingsolution)，对分化2小时的脂肪细胞中的脂肪进行染色。然后，去除油红O工作液(油红O工作液)，使用二次蒸馏水，将附着在孔壁上的油红O工作液(Oil-red O working solution)完全去除，再放入干燥器中干燥5分钟后，添加异丙醇(isopropyl alcohol)至500ul/孔。
使用酶标仪(Model 680microplate reader,Bio-Rad,USA)对490nm处的吸光度进行测量，并对脂肪量进行了比较。
通过确认图2a和图2b可知，本发明的源自BxC的外泌体(BxC-e)在抑制脂肪细胞的脂肪生成(lipogenesis)方面效果优异。
实施例2：分离源自用预处理物质处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体
2-1.源自用LANIFIBRANOR处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体(BxC-V37e)
在包含10μM LANIFIBRANOR的培养基【high glucose DMEM(Gibco，Cat no.11995-065)；10％Fetal bovine Serum(HyClone)，1％MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(100X)(Gibco,Cat no.11140-050)】中，培养通过上述制备例制备的诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞(BxC)24小时。
完成培养后，洗涤用LANIFIBRANOR预处理的BxC，并在添加10％的去除外泌体的胎牛血清(FBS)的培养基中，进一步培养72小时。之所以使用去除外泌体的FBS，是因为常用FBS中包含大量的牛血清来源的外泌体，因此，这样做的目的在于，避免混入细胞分泌的外泌体之外的FBS来源的外泌体。
培养72小时后，收集用预处理物质处理的BxC培养基，以300xg的条件离心10分钟，去除剩余的细胞和细胞残渣。取上清液，使用0.22μm过滤器过滤后，使用高速离心机(highspeed centrifuge)，以1，000xg，4℃的条件离心70分钟。再取上清液，使用超高速离心机(ultracentrifuge)，以100,000xg，4℃的条件离心90分钟，去除上清液。在磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferd salin))中稀释下层残留的外泌体后用于以下实验。
2-2.源自用Exendin-4处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体(BxC-G63e)
进行Exendin-4(20nM)处理，代替实施例2-1的LANIFIBRANOR，其余则是以与上述实施例2-1相同的方法，对外泌体进行了分析。
实验例3：确认源自用预处理物质处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体的特性
针对通过上述实施例2分离出的各个外泌体(BxC-V37e和BxC-G63e)，使用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking assay)(NanoSight NS300,Malvern)对外泌体的大小分布进行了确认，并使用电子显微镜对外泌体的形态进行了确认。
通过确认图3a至图4b可知，本发明的源自用IVA337处理的BxC的外泌体(图3a和图3b)和源自用Exendin-4处理的BxC的外泌体(图4a和图4b)均具有外泌体的特性。
实验例4：评估源自用LANIFIBRANOR处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体(BxC-V37e)的非酒精性脂肪肝炎治疗活性
针对通过上述实施例1分离出的外泌体(BxCe)和上述实施例2-1分离出的(BxC-37e)，进行了以下实验。
4-1.诱导脂肪变性(Steatosis)
材料和试剂
DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养基购自Hyclone(Pittsburgh,PA,USA)公司，胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)购自Gibco(Grand Island,NY,USA)公司。不包含游离脂肪酸的不含脂肪酸的BSA(Fatty acid-free bovine serum albumin，不含脂肪酸的牛血清白蛋白)、棕榈酸酯(palmitate)和油酸盐(oleate)购自Sigma(St.Louis，MO,USA)公司。
培养人肝细胞株(HepG2)
人肝细胞株(HepG2,ATTC)在包含10％FBS(Gibco)，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，以37℃、5％CO2的条件完成培养。将培养的细胞等量(5x105个细胞/1000μ孔)分株到6孔板中，待细胞完全贴壁且呈现出细胞形状后，当细胞达到95％的饱和度时予以使用。
制备游离脂肪酸(FreeFattyAcid；FFA)
(1)1M棕榈酸酯(palmitate)和1M油酸盐(oleate)储备液的制备
在60℃下，使用70％乙醇和三次蒸馏水(ddH2O)作为溶剂进行制备，并使用0.2μm的过滤器进行过滤后，进行了灭菌。
(2)不包含游离脂肪酸的1％(w/v)的BSA溶液的制备
使用三次蒸馏水作为溶剂进行制备后灭菌，4℃冷藏保存。
(3)制备棕榈酸酯和油酸盐的混合浓度达到100mM的混合脂肪酸
使用上述(2)制备的不包含游离脂肪酸的1％(w/v)的BSA溶液作为溶剂进行制备，直至上述(1)制备的脂肪酸的浓度达到100mM。以1:1的体积，在70℃的加热块中(heatblock)中混合了【上述(1)制备的1M棕榈酸酯10μl+1％(w/v)的BSA290μl(33mM)】和【在上述(1)制备的1M油酸盐10μl+1％(w/v)的BSA 140μl(66mM)】。
(4)制备最终浓度为1mM的混合游离脂肪酸(FFA)
在无菌环境下，将上述(3)制备的混合脂肪酸100mM溶液10μl(包含1％(w/v)的BSA的油酸盐和棕榈酸酯以2:1的浓度比混合)，混合到包含1％青霉素-链霉素的无血清(serum-free)DMEM培养基990μl中进行制备，直至FFA的最终浓度达到1mM。
(5)BSA对照溶液的制备
使用上述(2)制备的1％1％(w/v)的BSA作为对照溶液。
诱导脂肪变性(Steatosis)
弃掉上述达到95％饱和度的HePG2细胞的培养基，用PBS洗涤1次后，将上述(4)制备的1mA混合游离脂肪酸放入6孔中，每孔1ml。对于载体对照(Vehicle Control)，则放入用同量载体(vehicle)处理的无血清(serum-free)培养基。所有处理均过夜(overnight)(16小时)。
4-2.评估非酒精性脂肪肝炎治疗活性
用PBS洗涤上述经过16小时处理的HepG2细胞1次，在1ml无血清(serum-free)培养基中，分别对通过上述实施例分离出的BxC-e 100μg和通过上述实施例2分离出的BxC-V37e100μg培养24小时后，进行了以下每个实验。
①抑制脂肪生成(Lipogenesis)效果
6孔板每孔添加1ml Trizol溶液，分解人肝细胞后，添加氯仿(chloroform)200μl涡旋(vortex)后，以4℃，12,000rpm条件离心15分钟。将上清液移至新管，使其与异丙醇(isoprophanol)500μl混合。经上下50次后，冰上静置5分钟，然后，以4℃，12,000rpm条件离心10分钟，去除上清液。在剩余的沉淀物中加入70％乙醇1ml后，以4℃，12,000rpm条件离心5分钟。去除乙醇后，在室温不可见情况下，干燥装有RNA沉淀物的管，并使用无核酸酶水(nuclease free water)溶解RNA颗粒。使用Nanodrop，测量在260nm和280nm波长处提取的RNA样品的浓度，并使用RT premix合成了cDNA。
使用合成的cDNA和制备的引物(Cosmogene Tech)(参照下表1)，并利用实时聚合酶链反应(PCR，Real time-polymerase chain reaction)对FABP4的mRNA表达变化进行了确认。
【表1】
通过图5可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-V37e处理的组中，脂肪生成相关FABP4的基因表达，较比未处理组有所降低。由此可确认到，BxC-V37e抑制脂肪生成的功能极其优异。
②抑制炎症(Inflammation)的效果
使用与上述实施例4-①相同的方法，确认了TNF-α和MCP1的mRNA表达变化。所用基因的引物如下表2所示。
【表2】
通过图6a和图6b可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-V37e处理的组中，诱导炎症时表达的TNF-α和MCP1的表达，较比未处理组显著降低。由此可确认到，在脂肪生成诱导的炎症环境下，BxC-V37e抑制炎症的功能极其优异。
③抑制内质网应激(ER Stress)的效果
使用与上述实施例4-①相同的方法，确认了CHOP的mRNA表达变化。所用基因的引物如下表3所示。
【表3】
通过图7可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-V37e处理的组中，内质网应激相关CHOP基因表达，较比未处理组显著降低。由此可确认到，BxC-V37e抑制脂肪生成诱导的内质网应激的功能极其优异。
实验例5.评估源自经Exendin-4处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的外泌体(BxC-G63e)的非酒精性脂肪肝炎治疗活性
针对Exendin-4和上述实施例2-2分离出的(BxC-G63e)，进行了以下实验。
5-1.诱导脂肪变性(Steatosis)
材料和试剂
DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养基购自Hyclone(Pittsburgh,PA,USA)公司，胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)购自Gibco(Grand Island,NY,USA)公司。不包含游离脂肪酸的不含脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA，Fatty acid-free bovineserum albumin)、棕榈酸酯(palmitate)和油酸盐(oleate)购自Sigma(St.Louis，MO，USA)公司。
培养人肝细胞株(HepG2)
人肝细胞株(HepG2,ATTC)在包含10％FBS(Gibco)，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，以37℃、5％CO2的条件完成培养。将培养的细胞等量(5x105个细胞/1000μl孔)分株到6孔板中，待细胞完全贴壁且呈现出细胞形状后，当细胞达到95％的饱和度时予以使用。
制备游离脂肪酸(FreeFattyAcid；FFA)
(1)1M棕榈酸酯(palmitate)和1M油酸盐(oleate)储备液的制备
在60℃下，使用70％乙醇和三次蒸馏水(ddH2O)作为溶剂进行制备，并使用0.2μm的过滤器进行过滤后，进行了灭菌。
(2)不包含游离脂肪酸的1％(w/v)的BSA溶液的制备
使用三次蒸馏水作为溶剂进行制备后灭菌，4℃冷藏保存。
(3)制备棕榈酸和油酸盐的混合浓度达到100mM的混合脂肪酸
使用上述(2)制备的不包含游离脂肪酸的1％(w/v)的BSA溶液作为溶剂进行制备，直至上述(1)制备的脂肪酸的浓度达到100mM。以1:1的体积，在70℃的加热块中(heatblock)中混合了【上述(1)制备的1M棕榈酸酯10μl+1％(w/v)的BSA290μl(33mM)】和【在上述(1)制备的1M油酸盐10μl+1％(w/v)的BSA 140μl(66mM)】。
(4)制备最终浓度为1mM的混合游离脂肪酸(FFA)
在无菌环境下，将上述(3)制备的混合脂肪酸100mM溶液10μl(包含1％(w/v)的BSA的油酸盐和棕榈酸酯以2:1的浓度比混合)，混合到包含1％青霉素-链霉素的无血清(serum-free)DMEM培养基990μl中进行制备，直至FFA的最终浓度达到1mM。
(5)BSA对照溶液的制备
使用上述(2)制备的1％1％(w/v)的BSA作为对照溶液。
诱导脂肪变性(Steatosis)
弃掉上述达到95％饱和度的HePG2细胞的培养基，用PBS洗涤1次后，将上述(4)制备的1mA混合游离脂肪酸放入6孔中，每孔1ml。对于载体对照(Vehicle Control)，则放入用同量载体(vehicle)处理的无血清(serum-free)培养基。所有处理均过夜(overnight)(16小时)。
5-2.评估非酒精性脂肪肝炎治疗活性
用PBS洗涤上述经过16小时处理的HepG2细胞1次，在1ml无血清(serum-free)培养基中，对20nM Exendin-4 100μg或通过上述实施例2分离出的BxC-G63e 100μg培养24小时后，进行了以下每个实验。
①抑制脂肪生成(Lipogenesis)效果
6孔板每孔添加1ml Trizol溶液，分解人肝细胞后，添加氯仿(chloroform)200μl涡旋(vortex)后，以4℃，12,000rpm条件离心15分钟。将上清液移至新管，使其与异丙醇(isoprophanol)500μl混合。经上下50次后，冰上静置5分钟，然后，以4℃，12,000rpm条件离心10分钟，去除上清液。在剩余的沉淀物中加入70％乙醇1ml后，以4℃，12,000rpm条件离心5分钟。去除乙醇后，在室温不可见情况下，干燥装有RNA沉淀物的管，并使用无核酸酶水(nuclease free water)溶解RNA颗粒。使用Nanodrop，测量在260nm和280nm波长处提取的RNA样品的浓度，并使用RT premix合成了cDNA。
使用合成的cDNA和制备的引物(Cosmogene Tech)(参照下表4)，并利用实时聚合酶链反应(PCR，Real time-polymerase chain reaction)对FABP4、ACC1和SREBP1的mRNA表达变化进行了确认。
【表4】
通过图8a至8c可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-G63e处理的组中，脂肪生成相关FABP4、ACC1、SREBP1的基因表达，较比未处理组有所降低。由此可确认到，BxC-G63e抑制脂肪生成的功能极其优异。
②抑制炎症(Inflammation)的效果
使用与上述实施例5-①相同的方法，确认了TNF-α和IL-10的mRNA表达变化。所用基因的引物如下表5所示。
【表5】
通过图9a和图9b可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-G63e处理的组中确认到的TNF-α和IL-10的表达结果显示，具有促发炎(pro-inflammation)功能的TNF-α的表达显著降低，具有抗发炎(anti-inflammation)功能的IL-10的表达较比对照组显著降低。由此可确认到，在脂肪生成诱导的炎症环境下，BxC-G63e抑制炎症的功能极其优异。
③抑制内质网应激(ER Stress)的效果
使用与上述实施例5-①相同的方法，确认了CHOP的mRNA表达变化。所用基因的引物如上表3所示。
通过图10可以看出，在诱导人肝细胞的脂肪变性(steatosis)且经过BxC-G63e处理的组中，内质网应激相关CHOP基因表达，较比未处理组显著降低。由此可确认到，BxC-G63e抑制脂肪生成诱导的内质网应激的功能极其优异。
实验例6：使用MCD-diet小鼠模型评估BxC-V37e和BxC-G36e的非酒精性脂肪肝炎治疗活性
针对通过实施例2-1分离出的外泌体(BxC-V37e)和通过实施例2-2分离出的外泌体(BxC-G63e)，进行了以下实验。
6-1.诱导MCD-diet小鼠的脂肪变性
MCD-diet小鼠饲养环境
在温度23±3℃，相对湿度55±15％，换气次数10～20次/小时，光照时间12小时(上午8点开灯～下午8点关灯)及照度150～300Lux的设定环境下，饲养C57BL/6NHsd雄性小鼠，并定期测量环境条件。
MCD diet供给
为6周龄的C57BL/6NHsd雄性小鼠供应5天的MCD diet，然后，供应正常饲料2天，以此种方式交替供应MCD diet和正常饲料，持续12周，确保其自由摄入。
给药受试物质的制备和给药
在PBS中稀释BxC-G63e或BxC-V37e，制备各自的受试物质。静脉给药100μg/head至400μg/head的受试物质的蛋白量，每天1次，每周3次，持续给药4周。进行受试物质给药时，将6周龄的C57BL/6NHsd雄性小鼠放入固定架中固定，使用装有26gauge针头的注射器，以小于1mL/min的速度，通过尾静脉缓慢注射。
6-2.评估非酒精性脂肪肝炎治疗活性
摘除上述完成受试物质给药的C57BL/6NHsd雄性小鼠的肝，拍照后称重，肝右叶固定在10％中性福尔马林缓冲液中，肝左叶则用液氮速冻后，用于以下实验。
①抑制脂肪生成(Lipogenesis)效果
组织病理学检查
完成对固定的肝组织的修整、脱水、石蜡包埋、切片等一般组织处理过程之后，制备用于组织病理学检查的标本，然后进行苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin；H&E)和油红O(oil red O)染色，再用光学显微镜(Olympus BX53,Japan)，观察组织病理学变化。
NAS评分(scoring)
针对微囊性脂肪变性(Microvesicular steatosis)、大泡性脂肪变性(Macrovesicular steatosis)、肝细胞肥大(hypertrophy)，用40倍率或100倍率显微镜视野进行观察，根据待观察区域所占面积分别给予0-3分，并在100倍率视野中随机选取5个位点计0-3分后，进行了组间比较。
通过图11a至图11b，及图12a至图12b观察到，在通过MCD diet诱导脂肪变性且经过BxC-G63e或BxC-V37e处理的组中，脂滴(lipid droplet)的大小和数量，较比未处理对照组显著减少。
另外，通过图13a或图13b可以看出，微囊性脂肪变性(Microvesicularsteatosis)、大泡性脂肪变性(Macrovesicular steatosis)、肝细胞肥大(hypertrophy)的NAS评分均有降低。由此确认到，BxC-G63e或BxC-V37e抑制脂肪生成的功能极其优异。
②抑制炎症(Inflammation)的效果
完成对固定的肝组织的修整、脱水、石蜡包埋、切片等一般组织处理过程之后，制备用于免疫组织化学染色的标本，然后，利用一抗与抗TNF-α(anti-TNF-α)反应后，再次与特异性二抗反应，然后观察TNF-α蛋白的表达变化。
实验结果如图14a和图14b所示，可以看出，在通过MCD diet诱导炎症(inflammation)且经过BxC-G63e或BxC-V37e处理的组，较比经PBS处理的对照组，其TNF-α蛋白的表达显著降低。另外，通过图13a确认到，在经BxC-V37e处理的组中，炎症评分(inflammation score)下降。由此确认到，BxC-G63e或BxC-V37e抑制炎症的功能极其优异。
实验例7:使用TTA小鼠模型评估BxC-V37e和BxC-G36e的非酒精性脂肪肝炎治疗活性
针对通过实施例2-1分离出的外泌体(BxC-V37e)和通过实施例2-2分离出的外泌体(BxC-G63e)，进行了以下实验。
7-1.诱导TAA小鼠的纤维化
TAA diet小鼠饲养环境
在温度23±3℃，相对湿度55±15％，换气次数10～20次/小时，光照时间12小时(上午8点开灯～下午8点关灯)及照度150～300Lux的设定环境下，饲养C57BL/6雄性小鼠，并定期测量环境条件。
TAA药物给药
为6周龄的C57BL/6雄性小鼠给药浓度为200mg/kg的TAA，每天1次，每周3次，持续给药12周。
给药受试物质的制备和给药
在PBS中稀释BxC-G63e或BxC-V37e，制备各自的受试物质。皮下给药400μg/head的受试物质，每天1次，每周3次，持续给药4周，同时，给药浓度为200mg/kg的TAA，每天1次，每周2次，持续给药4周。进行受试物质给药时，使用70％酒精对给药部位进行消毒，用拇指和食指牵拉小鼠大腿部的皮肤，使皮肤和肌肉之间留出空间后，从动物的前面利用胰岛素注射器扎入拇指和食指之间的皮下空间，完成给药。
7-2.评估非酒精性脂肪肝炎治疗活性
摘除上述完成受试物质给药的C57BL/6雄性小鼠的肝，拍照后称重，肝右叶固定在10％中性福尔马林缓冲液中，肝左叶则用液氮速冻后，用于以下实验。
①抑制纤维化(Fibrosis)的效果
组织病理学检查
完成对固定的肝组织的修整、脱水、石蜡包埋、切片等一般组织处理过程之后，制备用于组织病理学检查的标本，然后进行苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin；H&E)和天狼猩红(picrosirius red)染色，再用光学显微镜(Olympus BX43,Japan)，观察组织病理学变化。
通过图15a至图15b可确认到，相较于未经任何处理的Normal组，TAA-PBS组的肝组织表面不光滑，且经BxC-G63e或BxC-V37e处理后，可观察到肝组织显著恢复。
另外，通过图16a至图16b可观察到，H&E染色结果显示，因TAA而损伤的肝组织，因BxC-G63e或BxC-V37e而得到显著恢复。
此外，通过确认图17a至图17b可确认到，天狼猩红染色结果显示，因TAA而积聚在肝组织内部的胶原蛋白量，因BxC-G63e或BxC-V37e而得到显著减少。
综上所述，可确认到，BxC-G63e或BxC-V37e抑制纤维化的功能极其优异。
小结
综合上述内容可知，本发明的BxC-e、BxC-V37e和BxC-G63e在诱导脂肪变性(Steatosis)的肝细胞中，不仅可以抑制脂肪生成、抑制炎症，还可以抑制内质网应激，因此，在预防或治疗非酒精性脂肪肝炎方面具有卓越功效。
商业可利用性
本发明涉及一种非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物，其包含外泌体作为有效成分，所述外泌体来源于由用预处理物质预处理或未经预处理的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来的间充质干细胞。
序列表
<110> Brexogen Inc.
<120> 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物
<130> PP200040CN
<150> KR 10-2019-0103186
<151> 2019-08-22
<150> KR 10-2020-0097398
<151> 2020-08-04
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
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Claims (6)

1.非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis；NASH)的治疗或预防用药剂学组合物，其包含从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)中分离出的外泌体作为有效成分，其中所述预处理物质选自：1-(6-苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸和Exendin-4。
2.如权利要求1所述的药剂学组合物，其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞由不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来。
3.如权利要求1所述的药剂学组合物，其中所述诱导多能干细胞是人类来源的诱导多能干细胞。
4.从用预处理物质预处理的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)来源间充质干细胞(mesenchymalstem cell；MSC)中分离出的外泌体用于制造非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis；NASH)的治疗或预防用药剂学组合物的用途，其中所述预处理物质选自：1-(6-苯并噻唑磺酰基)-5-氯-1氢-吲哚-2丁酸和Exendin-4。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述诱导多能干细胞来源间充质干细胞由不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞分化而来。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述诱导多能干细胞是人类来源的诱导多能干细胞。
CN202080043654.6A 2019-08-22 2020-08-12 包含源自诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞的外泌体的非酒精性脂肪肝炎预防或治疗用组合物 Active CN114025776B (zh)

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