JP2022544698A - 人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞に由来するエキソソームを含む非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、前処理物質で前処理した又は前処理していない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。本発明のエキソソームは、従来の間葉系幹細胞から分離されたエキソソームに比べて、より改善された非アルコール性脂肪性肝炎予防又は治療効果を示し、これに関連する研究開発及び製品化に有用に利用可能である。【選択図】図１７Ａ

Description

本特許出願は、２０１９年８月２２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願１０－２０１９－０１０３１８６号、２０２０年８月４日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願１０－２０２０－００９７３９８号に対して優先権を主張し、これらの特許出願の開示事項は、本明細書に援用により組み込まれる。

本発明は、前処理物質で前処理した又は前処理していない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞から分化した間葉系幹細胞に由来するエキソソームを有効成分として含む非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用組成物に関する。

間葉系幹細胞は、多能性の間質細胞で、骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞へと分化可能な細胞のことを指す。間葉系幹細胞は、軟骨や骨組織、靭帯、骨髄間質細胞などの様々な結合組織へと分化可能なことから、関節炎や、外傷、火傷などによって生じた軟部組織の欠陥など、様々な疾患に対する治療用途として研究されている。

最近では、間葉系幹細胞自体を使用せず、間葉系幹細胞が分泌するエキソソームを用いて、様々な疾患への治療効果を積極的に研究している。このようなエキソソームを商業的に用いるためには、多量かつ高品質のエキソソームが必要である。しかしながら、間葉系幹細胞から得られるエキソソームの量は非常に少なく、間葉系幹細胞の機能及び増殖能も継代を繰り返すと減少するため、間葉系幹細胞と比較して同等又はより優れた機能性を有しながらも、増殖能に優れた細胞を樹立する技術の開発の必要性が台頭した。

一方、非アルコール性脂肪症は、過度なアルコール摂取がないにもかかわらず肝細胞にトリグリセリドが蓄積されることが特徴である。非アルコール性脂肪症は、現代人の高脂質及び高炭水化物の摂取と関連する過剰な栄養によって増加し続けている。肥満や糖尿病において非アルコール性脂肪症がよく観察されるが、様々な因子が非アルコール性脂肪症と関連していると知られている。非アルコール性脂肪症を持つ成人の８０％が、インスリン抵抗性糖尿病及び心臓疾患などの代謝性疾患を発症することが報告されている。

非アルコール性脂肪症は、非アルコール性の単純性脂肪肝（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）と、炎症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）とに分類されるが、長期間治療せずに放置すると、肝炎、肝線維症、肝硬変などの重篤な肝疾患に発展することがある。非アルコール性脂肪症は、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）において脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を特徴とする。
非アルコール性の単純性脂肪肝は、非アルコール性脂肪性肝炎に進行することがある。非アルコール性脂肪性肝炎において、脂肪の蓄積は、様々な程度の肝臓の炎症及び肝臓の瘢痕化と関連し、多くの場合にインスリン抵抗性、異常脂質血症、及び高血圧と関連すると知られている。非アルコール性脂肪性肝炎は、過剰な体重、過剰な血中コレステロール及びトリグリセリドレベル、及び／又はインスリン抵抗性を有する人々からしばしば発生する。

近年、肥満人口の増加に伴う非アルコール性脂肪性肝炎患者の増加に伴い、非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤市場は大規模に発展している。非アルコール性脂肪性肝炎の発生原因及び機序の解明は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤開発に強い関心を集めている。しかしながら、安全で長期的に服用可能な非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤の開発は、まだごく僅かである。
非アルコール性脂肪性肝炎の治療のために、通常、肥満治療薬、インスリン耐性治療薬、高脂血症治療薬、肝保護剤、及び抗酸化剤などが使用される。しかしながら、それらの薬剤は、非アルコール性脂肪性肝炎の本質的な治療剤ではなく、症状改善剤として使用され、長期間服用すると副作用がある。
このため、より安全で且つ長期的な服用が可能であり、慢性疾患である非アルコール性脂肪性肝炎の治療に適する新しい治療用組成物の開発への要求は高まりつつある状況である。

本発明者らは、間葉系幹細胞のエキソソームを用いた非アルコール性脂肪性肝炎治療剤の開発に関する集中的かつ徹底的な研究の結果、前駆細胞から分化した人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来の間葉系幹細胞を樹立し、前処理物質で前処理した又は前処理していない前記前駆細胞から分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の間葉系幹細胞に由来するエキソソームは、アルコール性脂肪性肝炎に対して優れた予防および治療効果を示すことを発見した。

したがって、本発明の目的は、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを提供することである。

本発明者らは、間葉系幹細胞のエキソソームを用いた非アルコール性脂肪性肝炎治療剤の開発に関する集中的かつ徹底的な研究を行った。その結果、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）から由来した間葉系幹細胞は、その前駆細胞の分化により樹立され、前処理物質で前処理した又は前処理していない前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞に由来するエキソソームは、非アルコール性脂肪性肝炎の優れた予防又は治療効果を示すことを究明した。
本発明は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化した間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム、及びこれを有効成分として含む非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用薬剤学的組成物、並びに前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム、及びこれを有効成分として含む非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一態様は、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
本発明の他の態様は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎の予防、緩和、改善、又は治療用薬剤学的組成物に関する。

本明細書上の用語“非アルコール性脂肪性肝炎”は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の一つで、炎症又は繊維症を伴う脂肪肝を特徴とする進行性肝疾患であり、肝硬変や肝癌を誘発する前駆疾患を意味する。

本明細書において、用語“幹細胞”は、自己複製能を有し、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する未分化細胞を示す。本発明の幹細胞は、自己幹細胞又は相同幹細胞であってよい。

本明細書において、用語“人工多能性幹細胞”は、体細胞のような既に分化した細胞に脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導し、未分化の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）状態にリプログラミングされた細胞のことを意味する。
前記脱分化は、特定の遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ－４等）を導入して発現させるか、又は前記特定の遺伝子が導入された細胞で発現される脱分化誘導タンパク質を注入して誘導することができる。
前記多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）は、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）の３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）の任意の起源の組織又は器官に分化し得る能力を意味する。

本明細書において用語“間葉系幹細胞”は、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞に分化可能な多能性細胞を指す。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞が最も多用されているが、骨髄の他に、臍帯又は臍帯血、脂肪組織、羊膜液、奥歯の歯蕾（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来してもよい。間葉系幹細胞は、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。
前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、一般の間葉系幹細胞の前駆細胞ではなく、（本発明者らが開発した）人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞である。

本発明において、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないものであってよい。
本発明において、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化したものであってよい。

前記“人工多能性幹細胞”は、分化した細胞からの人工的なリプログラミングプロセスによって、多能性分化能を有するように誘導された細胞を示し、リプログラミングされた幹細胞とも称する。
人工的なリプログラミングプロセスは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介リプログラミング因子、又は非ウイルス性ベクター、タンパク質、及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介リプログラミング因子の導入によって行われる。リプログラミングプロセスには、幹細胞抽出物、化合物などによるリプログラミングも含まれる。
人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ特性を有し、特に類似の細胞形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで多能性を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入するとキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成し、遺伝子の生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。
本発明の人工多能性幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなど全ての哺乳動物由来の人工多能性幹細胞を含むが、好ましくはヒト由来の人工多能性幹細胞である。
また、本発明の前記人工多能性幹細胞がリプログラミングする前の体細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水、又は胎盤などに由来する体細胞であるが、これに限定されない。具体的には、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などを含むが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施形態において、本発明の間葉系幹細胞は、同等な数の他の間葉系幹細胞に比べて、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子をより高いレベルで発現する。

本発明の他の一実施形態において、本発明の間葉系幹細胞は、同等な数の他の間葉系幹細胞に比べて、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子をより低いレベルで発現する。

前記間葉系幹細胞及び同等な数の他の間葉系幹細胞は、同種組織由来である。より具体的には、前記間葉系幹細胞は、人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞である。

本発明の一実施形態において、前記間葉系幹細胞は、臍帯組織の人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞であり、これと比較される同等な数の他の間葉系幹細胞は、臍帯組織由来の間葉系幹細胞である。

本発明者らは、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化した間葉系幹細胞を、ＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。本明細書において、前記“人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）”は、“人工多能性幹細胞由来間葉系細胞”とも表現される。

本明細書上の用語“人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞”とは、人工多能性幹細胞から間葉系幹細胞に完全に分化する直前の段階の細胞であって、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の一種とみなされてよく、ＳＳＥＡ－４タンパク質を発現せず、追加培養によって完全な間葉系幹細胞となる細胞を意味する。

本発明の同一組織由来（例えば、臍帯組織）の人工多能性幹細胞の間葉系幹細胞（ＢｘＣ）は、同一組織由来（例えば、臍帯組織）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、染色体の核型において異常がなく、増殖能にも優れている。具体的には、本発明のＢｘＣは、継代を９回以上繰り返す場合に、同一組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して１０倍以上の増殖能の差を示し、１２回以上の継代を繰り返しても増殖能の減少が観察されない。また、ＢｘＣは、ＭＳＣに比べて、細胞増殖能と関連するマーカーであるＫｉ６７の発現量も２倍以上高く現れる。

前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）は、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１、ＶＥＧＦ－Ａ、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－２、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びＨＢ－ＥＧＦなどの機能性タンパク質を、同等な数の他の間葉系幹細胞と比較して多量に分泌する。

本明細書において、前記エンドスタチンは、天然に生成されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａのＣ末端フラグメントであり、抗血管新生剤として報告されている。
本明細書において、前記エンドセリン－１は、プレプロエンドセリン（ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１（ＰＰＥＴ１）とも知られており、ＥＤＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質であり、血管内皮細胞で生産される。エンドセリン－１は、強力な血管収縮剤として知られている。
本明細書において、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ））は、ＶＥＧＦＡ遺伝子によってコードされるタンパク質で、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２との相互作用によって血管の成長を誘導することが知られている。
本明細書において、前記トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－２は、ＴＨＢＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質で、細胞間相互作用又は細胞－マトリックス相互作用を媒介するものと知られている。トロンボスポンジン－２の癌に対する役割には論議の余地があるが、間葉系幹細胞の細胞表面特性を調節することが報告されており、細胞接着及び細胞移動に関与するものと知られている。
本明細書において、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＰＧＦ遺伝子によってコードされるタンパク質で、ＶＥＧＦサブファミリーのメンバーとして胚発生段階における血管新生に主要な役割を果たすタンパク質として知られている。
本明細書において、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ－ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、細胞の成長及び分裂を調節する成長因子であり、血管の形成及び成長、及び間葉系幹細胞の増殖、化学走性、及び遊走において重要な役割を担うものと知られている。
本明細書において、神経成長因子（ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、主にニューロンの成長、維持、増殖、及び生存に関与する神経栄養因子、及び神経ペプチドである。ＮＧＦは、ａｌｐｈａ－ＮＧＦ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びｇａｍｍａ－ＮＧＦが、約２：１：２の割合で発現する３種のタンパク質の複合体である。ｇａｍｍａ－ＮＧＦはセリンプロテアーゼとして作用し、ｂｅｔａ－ＮＧＦのＮ末端を切断してＮＧＦを活性化させるものと知られている。
本明細書において、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＨＢＥＧＦ遺伝子によってコードされるＥＧＦファミリータンパク質のメンバーである。ＨＢ－ＥＧＦは、心臓の発達及び血管分布に重要な役割を担うものと知られており、皮膚の創傷治癒において上皮化に必須なタンパク質であることが知られている。

本明細書において、用語“エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）”は、細胞が細胞外に分泌される、又は細胞内に存在する脂質二重層で構成された膜構造を有する膜小胞（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）を指し、ほとんどの真核生物の体液に存在する。エキソソームの直径は、３０～１０００ｎｍ程度であり、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合するときに、細胞膜から直接エキソソームが放出される。エキソソームは、タンパク質、生物活性脂質、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの細胞内生体分子を輸送することにより、凝固、細胞間コミュニケーション、細胞性免疫を仲介する機能的な役割を果たすことはよく知られています。

前記エキソソームは、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を包含する概念である。エキソソームのマーカータンパク質としては、ＣＤ６３、ＣＤ８１などが知られている。さらに、例えば、ＥＧＦＲのような細胞表面受容体、シグナル伝達関連分子、細胞接着関連タンパク質、ＭＳＣ関連抗原、ヒートショックタンパク質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）、小胞形成に関連しているアリックス（Ａｌｉｘ）などのタンパク質が知られている。

本発明において、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームは、上述した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）内に存在するか、ＢｘＣから分泌されたエキソソームを意味する。
本発明において人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームは、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化した間葉系幹細胞から分離されたものであってよい。

本明細書において、用語‘有効成分として含む’とは、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームが、非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療するための活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。

本発明において、薬剤学的組成物は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを、エキソソームタンパク質基準で１～１００００μｇ、１～１０００μｇ、１０～１００００μｇ、１０～１０００μｇ、１００～１００００μｇ、１００～１０００μｇ、５０～１００００μｇ、５０～１０００μｇ、又は５０～５００μｇ含むものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において使われる用語“予防”は、本発明の組成物の投与により非アルコール性脂肪性肝炎を抑制する、又は非アルコール性脂肪性肝炎の進行を遅延させる全ての行為を意味する。

本明細書において使われる用語“治療”は、（ａ）非アルコール性脂肪性肝炎の進行の抑制；（ｂ）非アルコール性脂肪性肝炎の軽減；及び、（ｃ）非アルコール性脂肪性肝炎の除去を意味する。

本発明に係る薬剤学的組成物は、有効成分に加え、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。それが薬剤学的組成物を調製するために一般的に使用される限り、任意の薬剤学的に許容される担体が本開示の薬剤学的組成物に含まれ得る。薬剤学的に許容される担体の例にはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。また、これらの成分に加えて、本発明に係る薬剤学的組成物は、潤滑剤、保湿剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤などをさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、目的とする方法に応じて、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は局所に適用）することができる。投与量は、患者の状態及び体重、疾病の重症度、製剤の種類、投与経路、及び投与時間を含む様々な要因によって異なるが、当業者にとって適宜に選択可能である。
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与することができる。本発明において、“薬剤学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスクの割合であり、疾患を治療するのに十分な量を意味する。有効量は、患者の疾患の種類、重症度、薬剤の活性、薬剤に対する感受性、投与時間、投与経路、排泄率、治療期間、同時使用される薬剤、及びその他医療分野によく知られた他の要素によって決定されてよい。
本発明に係る薬剤学的組成物は、個々の治療薬として単独で、又は他の治療薬と組み合わせて投与することができる。後者の場合、投与は順次又は同時に投与されてよい。また、組成物は、単回投与又は分割された複数回投与されてよい。前記要素を全て考慮して、副作用無しに最大効果が得られる最小量を投与することが重要であり、これは当業者にとって容易に決定可能である。
具体的には、本発明の薬剤学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重、体内での有効成分の吸収率、不活性率、排泄率、疾病の種類、及び併用される薬剤によって変わってよい。

本発明のさらに他の態様は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームに関する。
本発明の前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化した間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）は、従来のエキソソームとしての特性を有するエキソソームである。本発明の実施例から立証されるように、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたエキソソームは、脂質への分化に対して優れた抑制効果を有する（図２）。また、本発明のＢｘＣ－ｅは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において脂質生成、及び炎症、並びに小胞体ストレスを抑制することを確認した（図５～図７）。

本発明のさらに他の態様は、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを個体に投与する段階を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療方法に関する。
前記“個体”とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。

本発明のさらに他の態様は、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームの非アルコール性脂肪性肝炎治療用途に関する。
前記非アルコール性脂肪性肝炎治療方法及び治療用途は、上述した本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム、及びこれを含む薬剤学的組成物と構成成分が共通するので、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明のさらに他の態様は、前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

本発明において、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化したものであってよい。

本明細書において、用語“前処理”とは、前駆細胞の培養過程において、前処理物質が添加された細胞培養培地を、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に接触させる過程を意味する。

前記前処理は、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞を、前処理物質を含む細胞培養培地で培養する方法によって行われてよい。
前記細胞培養培地は、動物細胞培養に通常用いられるいかなる培地も利用可能である。例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２との混合物、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ、１９９培地、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ１２、Ｆ１０、Ｗａｙ－ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、及びＭＣＤＢシリーズなどが用いられてよい。

前記培養は、６～４８時間行われてよい。
具体的に、前記培養は、６～４２時間、６～３６時間、６～３０時間、６～２７時間、１２～４８時間、１２～４２時間、１２～３６時間、１２～３０時間、１２～２７時間、１８～４８時間、１８～４２時間、１８～３６時間、１８～３０時間、１８～２７時間、２１～４８時間、２１～４２時間、２１～３６時間、２１～３０時間、又は２１～２７時間行われてよい。

前記前処理物質は、１－（６－ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸［１－（６－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－２－ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ］、又はエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）であってよい。
“ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）”と名付けられた前記１－（６－ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸［１－（６－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－２－ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ］は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＰＡＲｓ）のアゴニストである。

前記ラニフィブラノールは、細胞培養培地中に１～１００μＭの濃度で含まれてよい。
具体的に、前記ラニフィブラノールは、細胞培養培地中に１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１０～９０μＭ、１０～８０μＭ、１０～７０μＭ、１０～６０μＭ、１０～５０μＭ、１０～４０μＭ、及び１０～３０μＭの濃度で含まれてよい。

本発明の一実施形態において、ラニフィブラノールは、培地中に１～１０００μＭ、１～５００μＭ、１～１００μＭ、１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１～２０μＭ、又は１０μＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

本発明の一実施形態において、エキソソームは、１－（６－ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸が、１０００μＭ、１～５００μＭ、１～１００μＭ、１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１～２０μＭ、１０～９０μＭ、１０～８０μＭ、１０～７０μＭ、１０～６０μＭ、１０～５０μＭ、１０～４０μＭ、１０～３０μＭ、又は１０μＭの濃度で添加された培地で培養された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたエキソソームであってよい。

本発明のエキセンジン－４は、グルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＧＬＰ）受容体のペプチドアゴニストである。エキセンジン－４は、インスリン放出を刺激し、２型糖尿病及びパーキンソン病の治療用途として臨床的に使用されてきた。

前記エキセンジン－４は、細胞培養培地中に１～１００ｎＭの濃度で含まれてよい。
具体的には、前記エキセンジン－４は、細胞培養培地中に１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１０～９０ｎＭ、１０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、１０～４０ｎＭ、１０～３０ｎＭ、又は２０ｎＭの濃度で含まれてよい。

本発明の一実施形態において、エキソソームは、エキセンジン－４が１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１０～９０ｎＭ、１０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、１０～４０ｎＭ、１０～３０ｎＭ又は２０ｎＭの濃度で添加された培地で培養された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、薬剤学的組成物は、１－（６－ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたエキソソームを、エキソソームタンパク質基準で１～１００００μｇ、１～１０００μｇ、１０～１００００μｇ、１０～１０００μｇ、１００～１００００μｇ、１００～１０００μｇ、５０～１００００μｇ、５０～１０００μｇ、又は５０～５００μｇ含むものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、薬剤学的組成物は、エキセンジン－４で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたエキソソームを、エキソソームタンパク質基準で１～１００００μｇ、１～１０００μｇ、１０～１００００μｇ、１０～１０００μｇ、１００～１００００μｇ、１００～１０００μｇ、５０～１００００μｇ、５０～１０００μｇ、又は５０～５００μｇ含むものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームに関する。
本発明の前記前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）は、従来のエキソソームとしての特性を有するエキソソームである。本発明の実施例から立証されるように、本発明のＢｘＣ－Ｖ３７ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において脂質形成、炎症、及び小胞体ストレスを抑制する（図５～図１０）。

本発明のさらに他の態様は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを含む非アルコール性脂肪性肝炎の緩和、抑制又は改善用食品組成物である。

本発明のさらに他の態様は、前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを含む、非アルコール性脂肪性肝炎の緩和、抑制又は改善用食品組成物である。
本発明に係る食品組成物は、上述した本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム、及びこれを含む薬剤学的組成物と構成成分が共通するので、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明に係る食品組成物は、食品の製造時に通常添加される成分、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、栄養素、調味料、及び香味料を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明に係る食品組成物に含有可能な炭水化物としては、グルコース及びフルクトースなどの単糖、マルトース及びスクロースなどの二糖、オリゴ糖、デキストリン、及びシクロデキストリンなどの多糖、キシリトール、ソルビトール、及びエリトリトールなどの糖アルコールなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明に係る食品組成物に含有可能な香味料は、タウマチン、ステビア抽出物などの天然香料、及びサッカリン、アスパルテームなどの合成香料などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、前記前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを個体に投与する段階を含む、非アルコール性脂肪性肝炎治療方法に関する。

前記“個体”とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。

本発明のさらに他の態様は、前記前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームの非アルコール性脂肪性肝炎治療用途に関する。
前記非アルコール性脂肪性肝炎治療方法及び治療用途は、上述した本発明の前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソーム、及びこれを含む薬剤学的組成物と構成成分が共通するので、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明は、前処理物質で前処理した又は前処理していない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。本発明のエキソソームは、従来の間葉系幹細胞から分離されたエキソソームに比べて、より改善された非アルコール性脂肪性肝炎予防又は治療効果を示し、これに関連する研究開発及び製品化に有用に用いることができる。

図１Ａは、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の平均サイズ及び分布を示す図である。 図１Ｂは、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の電子顕微鏡写真である。 図２Ａは、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の脂質生成に対する抑制効果を示す写真である。 図２Ｂは、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の脂質生成に対する抑制効果を示す図である。 図３Ａは、ラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の平均サイズ及び分布を示す図である。 図３Ｂは、ラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の電子顕微鏡写真である。 図４Ａは、エキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の平均サイズ及び分布を示す図である。 図４Ｂは、エキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の電子顕微鏡写真である。 図５は、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及びラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）による脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を示す図である。 図６Ａは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及びラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）による炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）抑制効果を示す図である。 図６Ｂは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及びラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）による炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）抑制効果を示す図である。 図７は、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及びラニフィブラノール前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）による小胞体ストレス（ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ）抑制効果を示す図である。 図８Ａは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を示す図である。 図８Ｂは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を示す図である。 図８Ｃは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を示す図である。 図９Ａは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）抑制効果を示す図である。 図９Ｂは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）抑制効果を示す図である。 図１０は、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞においてエキセンジン－４及びエキセンジン－４前処理した人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）から分離したエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）による小胞体ストレス（ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ）抑制効果を示す図である。 図１１Ａは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｖ３７ｅ）のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）染色結果を示す写真である。 図１１Ｂは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｖ３７ｅ）のオイルレッドＯ（ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色結果を示す写真である。 図１２Ａは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｇ６３ｅ）のヘマトキシリン及びエオシン染色結果（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）を示す写真である。 図１２Ｂは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｇ６３ｅ）のオイルレッドＯ（ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色結果を示す写真である。 図１３Ａは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ（ＭＣＤ－Ｖ３７ｅ）処理群のＮＡＳ点数を示すグラフである。 図１３Ｂは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ（ＭＣＤ－Ｖ６３ｅ）処理群のＮＡＳ点数を示すグラフである。 図１４Ａは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｖ３７ｅ）の免疫組織化学染色結果を示す写真である。 図１４Ｂは、脂肪症誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＭＣＤ－ＰＢＳ）及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ処理群（ＭＣＤ－Ｇ６３ｅ）の免疫組織化学染色結果を示す写真である。 図１５Ａは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ（ＴＡＡ－Ｖ３７ｅ）処理群の肝組織を示す写真である。 図１５Ｂは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ（ＴＡＡ－Ｇ６３ｅ）処理群の肝組織を示す写真である。 図１６Ａは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ（ＴＡＡ－Ｖ３７ｅ）処理群のヘマトキシリン及びエオシン染色結果を示す写真である。 図１６Ｂは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ（ＴＡＡ－Ｇ６３ｅ）処理群のヘマトキシリン及びエオシン染色結果を示す写真である。 図１７Ａは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理したＢｘＣ－Ｖ３７ｅ（ＴＡＡ－Ｖ３７ｅ）処理群のピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）染色結果を示す写真である。 図１７Ｂは、線維化誘発マウスの肝細胞に、物質を処理していないノーマル群（Ｎｏｒｍａｌ）、ＰＢＳを処理した対照群（ＴＡＡ－ＰＢＳ）、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理したＢｘＣ－Ｇ６３ｅ（ＴＡＡ－Ｇ６３ｅ）処理群のピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）染色結果を示す写真である。

人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防、緩和、抑制又は治療用薬剤学的組成物に関する。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために用いられる“％“は、特に言及しない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

製造例：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）の分離及び培養
まず、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された人工多能性幹細胞から、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離し、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を得た。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代して前記と同じ培地で７日間さらに培養し、本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞を作製した。本発明者らは、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。
ＢｘＣと命名された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞を、培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］でさらに培養した。

実施例１：人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）由来エキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の分離
前記製造例で培養された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（以下、ＢｘＣ）培養培地を回収して３００×ｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞片を除去した。上清を取って０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上清を再び取り、超遠心分離器（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清を除去した。下層に残っているエキソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎ）に希釈し、以下の実験に使用した。

実験例１：人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の特性確認
前記実施例１で分離されたエキソソーム（以下、ＢｘＣ－ｅ）に対して、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエキソソームのサイズ分布を確認し、電子顕微鏡を用いてエキソソームの形態を確認した。
図１Ａ及び図１Ｂから確認できるように、本発明のＢｘＣから由来したエキソソームは、エキソソームとしての特性を有することが分かる。

実験例２：人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の脂肪分化に対する抑制効果の確認
前記実施例１で分離されたエキソソームに対して、脂肪分化に対する抑制効果を確認した。
ヒト脂肪細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を６ウェルプレートに分注し、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を用いて、３７℃、５％ ＣＯ_２培養器でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態に育つまで（最大で６日）培養した。
脂肪細胞を６日間培養した後、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に、脂肪分化培地［３４μＭパントテン酸塩（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）、６６μＭビオチン（ｂｉｏｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）、及び０．０５Ｍ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）］が添加された基本培地で５日間培養した。その後、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に脂肪分化培地［３４μＭパントテン酸塩（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）、６６μＭビオチン（ｂｉｏｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭインスリン（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）］が添加された培地からさらに９日間培養した。
このとき、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で１４日間培養した脂肪細胞であり、ビークル対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＢｘＣ－ｅを処理せず、脂肪分化条件で１４日間培養された脂肪細胞であり、ＢｘＣ－ｅ処理群は、ＢｘＣ－ｅが含まれた脂肪分化条件で１４日間培養された脂肪細胞である。
培養液を完全に除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を４００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、細胞を１時間固定させた。ＰＢＳで洗浄し、オイルレッドＯワーキング溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を４００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、２時間、分化した脂肪細胞内の脂肪を染色させた。その後、オイルレッドＯワーキング溶液を除去し、２次蒸留水を用いてウェルの壁に付いているオイルレッドＯワーキング溶液を完全に除去した後、乾燥器に入れて５分間乾燥させた後、イソプロピルアルコール（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を５００μｌ／ｗｅｌｌとなるようにウェルに添加した。
マイクロプレートリーダ（Ｍｏｄｅｌ ６８０ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定し、脂質の量を定量的に比較した。
図２Ａ及び図２Ｂから確認できるように、本発明のＢｘＣから由来したエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）は、脂肪細胞の脂質生成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）を抑制する効果に優れていることが分かった。

実施例２：前処理物質の処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソームの分離
２－１．ラニフィブラノール処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）
ラニフィブラノール１０μＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］で、前記製造例で製造された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）を２４時間培養した。
培養を完了した後、ラニフィブラノールが前処理されたＢｘＣを洗浄し、エキソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エキソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエキソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエキソソームの他にＦＢＳ由来エキソソームが混入することを防止するためである。
７２時間培養後、前処理物質が処理されたＢｘＣ培養培地を回収して３００×ｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞片を除去した。上清を取り、０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上清を再び取り、超遠心分離器（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上清を除去した。下層に残っているエキソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎ）に希釈し、以下の実験に使用した。

２－２．エキセンジン－４処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）
前記実施例２－１のラニフィブラノールに代えてエキセンジン－４（２０ｎＭ）を処理した以外は、前記実施例２－１と同じ方法でエキソソームを分離した。

実験例３：前処理物質の処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソームの特性確認
前記実施例２で分離されたそれぞれのエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）に対して、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエキソソームのサイズ分布を確認し、電子顕微鏡を用いてエキソソームの形態を確認した。
図３Ａ～図４Ｂから確認できるように、本発明のＩＶＡ３３７処理によるＢｘＣ由来エキソソーム（図３Ａ及び図３Ｂ）、及びエキセンジン－４処理によるＢｘＣ由来エキソソーム（図４Ａ及び図４Ｂ）はいずれもエキソソームとしての特性を有することが分かる。

実験例４：ラニフィブラノール処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）の非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記実施例１で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－ｅ）及び前記実施例２－１で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）に対して、下記のように実験した。

４－１．脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導
材料及び試薬
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）社から、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）はＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）社から購入した。遊離脂肪酸が含まれていないＢＳＡ（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｆｒｅｅ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、パルミチン酸塩（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、及びオレイン酸塩（ｏｌｅａｔｅ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）社から購入した。
ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２）の培養
ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２，ＡＴＴＣ）は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した。培養された細胞は、６ウェルプレートに一定の数（５×１０^５細胞／１０００μｌ／ウェル）で分注した後、細胞が完全な形態でウェルに完全に付着し、細胞が９５％コンフルエントに到達するまでインキュベートした。
遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ；ＦＦＡ）の製造
（１）１Ｍパルミチン酸塩及び１Ｍオレイン酸塩貯蔵溶液の調製
溶液は、７０％エタノール及び脱イオン蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）を溶媒として用いて、６０℃で調製し、０．２μｍのフィルターを用いて濾過した後、滅菌した。
（２）遊離脂肪酸が含まれていない１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液の製造
溶媒として脱イオン蒸留水を用いて調製した後に滅菌し、４℃で冷蔵した。
（３）パルミチン酸塩及びオレイン酸塩の濃度が１００ｍＭとなるように混合した混合脂肪酸の調製
前記（２）で製造した遊離脂肪酸が含まれていない１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液を溶媒として用いて、前記（１）で製造した脂肪酸の濃度が１００ｍＭとなるように調製した。［前記（１）で製造した１Ｍパルミチン酸塩１０μｌ＋１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ ２９０μｌ（３３ｍＭ）］、及び［前記（１）で製造した１Ｍオレイン酸塩１０μｌ＋１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ １４０μｌ（６６ｍＭ）］を７０℃ヒートブロック（ｈｅａｔｂｌｏｃｋ）中で、１：１の体積比で混合した。
（４）最終濃度１ｍＭの混合遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の調製
前記（３）で製造した混合脂肪酸１００ｍＭ溶液１０μｌ（１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むオレイン酸塩及びパルミチン酸塩を２：１の濃度比で混合）を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた無血清ＤＭＥＭ培地９９０μｌに混合し、ＦＦＡの最終濃度が１ｍＭとなるように調製した。
（５）ＢＳＡ対照溶液の調製
前記（２）で製造した１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを対照溶液として使用した。
脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）の誘導
前記９５％コンフルエントに到達したＨｅｐＧ２細胞の培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄した後、前記（４）で製造した１ｍＭ混合遊離脂肪酸を、６ウェルに各ウェルにつき１ｍｌずつ入れた。ビヒクル対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）には、同量のビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）で処理された無血清培地を入れた。全ての処理は一晩（１６時間）行われた。

４－２．非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記１６時間処理されたＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳで１回洗浄し、前記実施例で分離されたＢｘＣ－ｅ １００μｇ及び前記実施例２で分離されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅ １００μｇをそれぞれ１ｍｌ無血清培地に２４時間処理した後、下記各実験を行った。

［１］脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果
６ウェルプレートのウェルにつきトリゾール溶液１ｍｌを添加してヒト肝細胞を分解した。クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）２００μｌを添加し、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移した後、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐｈａｎｏｌ）５００μｌと混ぜた。５０回逆さまにし、氷上で５分間放置した後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、残ったペレットに７０％エタノール１ｍｌを加えた後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。エタノールを除去した後、ＲＮＡペレットが入っているチューブを室温で乾燥させ不可視化した。ヌクレアーゼフリー水（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）を用いてＲＮＡペレットを溶解させた。ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で抽出されたＲＮＡサンプルの濃度を測定し、ＲＴ ｐｒｅｍｉｘを用いてｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡについて、合成されたプライマー（コスモジンテック）（下記表１参照）を使用してリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＦＡＢＰ４のｍＲＮＡ発現をモニターした。

図５から確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群において、脂質生成に関連するＦＡＢＰ４遺伝子の発現レベルが、処理していない群に比べて減少した。このことから、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの脂質生成に対して高度な抑制活性を持っていることが確認できた。

［２］炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の抑制効果
前記実施例４－［１］と同じ方法を用いて、ＴＮＦ－α及びＭＣＰ１のｍＲＮＡ発現変化を確認した。使用したプライマーは、下記表２に示した。

図６Ａ及び図６Ｂから確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群において、炎症誘導時に発現するＴＮＦ－αとＭＣＰ－１の発現レベルが、処理していない群に比べて顕著に減少した。このことから、脂質生成によって誘発された炎症状態においてＢｘＣ－Ｖ３７ｅの抗炎症活性が非常に優れていることが確認できた。

［３］小胞体ストレス（ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ）の抑制効果
前記実施例４－［１］と同じ方法を用いて、ＣＨＯＰのｍＲＮＡ発現変化を確認した。使用したプライマーは、下記表３に示す。

図７から確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群において、小胞体ストレスに関連するＣＨＯＰ遺伝子発現レベルが、処理していない群に比べて顕著に減少した。このことから、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの脂質生成によって誘導された小胞体ストレスに対する抑制活性が非常に優れていることが確認できた。

実験例５：エキセンジン－４処理による人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞由来エキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）の非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
エキセンジン－４及び前記実施例２－２で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）に対して、下記のように実験した。

５－１．脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導
材料及び試薬
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）社から、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）はＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）社から購入した。遊離脂肪酸が含まれていないＢＳＡ（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｆｒｅｅ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、パルミチン酸塩（パルミチン酸塩）及びオレイン酸塩（オレイン酸塩）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）社から購入した。
ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２）培養
ヒト肝細胞株（ＨｅｐＧ２，ＡＴＴＣ）は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した。培養された細胞は６ウェルプレートに一定の数（５×１０^５細胞／１０００μｌ／ウェル）で分注した後、細胞が完全な形態でウェルに完全に付着し、細胞が９５％コンフルエントに到達するまでインキュベートした。
遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ；ＦＦＡ）製造
（１）１Ｍパルミチン酸塩及び１Ｍオレイン酸塩貯蔵溶液の調製
溶液は、７０％エタノール及び脱イオン蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）を溶媒として用いて、６０℃で調製し、０．２μｍのフィルターを用いて濾過した後、滅菌した。
（２）遊離脂肪酸が含まれていない１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液の製造
脱イオン蒸留水を溶媒として用いて調製した後に滅菌し、４℃で冷蔵した。
（３）パルミチン酸塩及びオレイン酸塩の濃度が１００ｍＭとなるように混合した混合脂肪酸の調製
前記（２）で製造した遊離脂肪酸が含まれていない１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液を溶媒として用いて、前記（１）で製造した脂肪酸の濃度が１００ｍＭとなるように調製した。［前記（１）で製造した１Ｍパルミチン酸塩１０μｌ＋１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ ２９０μｌ（３３ｍＭ）］、及び［前記（１）で製造した１Ｍオレイン酸塩１０μｌ＋１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ １４０μｌ（６６ｍＭ）］を７０℃ヒートブロック（ｈｅａｔｂｌｏｃｋ）中で、１：１の体積比で混合した。
（４）最終濃度１ｍＭの混合遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の調製
前記（３）で製造した混合脂肪酸１００ｍＭ溶液１０μｌ（１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むオレイン酸塩及びパルミチン酸塩を２：１の濃度比で混合）を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた無血清ＤＭＥＭ培地９９０μｌに混合し、ＦＦＡの最終濃度が１ｍＭとなるように調製した。
（５）ＢＳＡ対照溶液の調製
前記（２）で製造した１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを対照溶液として使用した。
脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導
前記９５％コンフルエントに到達したＨｅｐＧ２細胞の培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄した後、前記（４）で製造した１ｍＭ混合遊離脂肪酸を６ウェルの各ウェルにつき１ｍｌずつ入れた。ビークル対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）には、同量のビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）で処理された無血清培地を入れた。全ての処理は一晩（１６時間）行われた。

５－２．非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記１６時間処理されたＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２０ｎＭエキセンジン－４ １００μｇ又は前記実施例２で分離されたＢｘＣ－Ｇ６３ｅ １００μｇを１ｍｌ無血清培地に２４時間処理した後、下記各実験を行った。

［１］脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果
６ウェルプレートのウェルにつきトリゾール溶液１ｍｌを添加してヒト肝細胞を分解した。クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）２００μｌを添加し、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移した後、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐｈａｎｏｌ）５００μｌと混ぜた。５０回逆さまにし、氷上で５分間放置した後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、残ったペレットに７０％エタノール１ｍｌを加えた後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。エタノールを除去した後、ＲＮＡペレットが入っているチューブを室温で乾燥させ不可視化した。ヌクレアーゼフリー水を用いてＲＮＡペレットを溶解させた。ナノドロップを用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で抽出されたＲＮＡサンプルの濃度を測定し、ＲＴ ｐｒｅｍｉｘを用いてｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡについて、合成されたプライマー（コスモジンテック）（下記表４参照）を使用してリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＦＡＢＰ４、ＡＣＣ１、及びＳＲＥＢＰ１のｍＲＮＡ発現変化をモニターした。

図８Ａ～図８Ｃから確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理した群において、脂質生成に関連するＦＡＢＰ４、ＡＣＣ１、ＳＲＥＢＰ１遺伝子発現レベルが、処理していない群に比べて減少した。このことから、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅの脂質生成に対する抑制機能が非常に優れていることが確認できた。

［２］脂肪生成（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の抑制効果
前記実施例５－［１］と同じ方法を用いて、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１０のｍＲＮＡ発現変化を確認した。使用したプライマーは、下記表５に示す。

図９Ａ及び図９Ｂから確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理した群において、ＴＮＦ－αとＩＬ－１０の発現レベルを確認した結果、炎症誘発（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）機能をするＴＮＦ－αの発現レベルは顕著に減少し、抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）機能をするＩＬ－１０の発現レベルは、対照群に比べて顕著に増加した。このことから、脂質生成によって誘導された炎症状況においてＢｘＣ－Ｇ６３ｅの炎症抑制効果が非常に優れていることが確認できた。

［３］小胞体ストレス（ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ）抑制効果
前記実施例５－［１］と同じ方法を用いて、ＣＨＯＰのｍＲＮＡ発現変化を確認した。使用した遺伝子のプライマーは、前記表３に示した。
図１０から確認できるように、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘導したヒト肝細胞に、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅを処理した群において、小胞体ストレスに関連するＣＨＯＰ遺伝子発現レベルが、処理していない群に比べて顕著に減少した。このことから、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅの脂質生成によって誘導された小胞体ストレスに対する抑制活性が非常に優れていることが確認できた。

実験例６：ＭＣＤ－ｄｉｅｔマウスモデルを用いたＢｘＣ－Ｖ３７ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅの非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記実施例２－１で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）及び前記実施例２－２で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）に対して、下記のように実験した。

６－１．ＭＣＤダイエットマウスの脂肪症誘導
ＭＣＤダイエットマウス飼育環境
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ雄マウスを温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、換気回数１０～２０回／ｈｒ、照明時間１２時間（午前８時点灯～午後８時消灯）、及び照度１５０～３００Ｌｕｘに設定した環境で飼育しながら、環境条件を定期的に測定した。
ＭＣＤダイエット給与
６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ雄マウスに、ＭＣＤ食餌を５日間供給し、その後２日間は通常の食餌を供給する方式で１２週間、ＭＣＤ食餌及び通常の食餌を交互に自由摂取させた。
投与試験物質の調製及び投与
ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＰＢＳに希釈してそれぞれの試験物質を調製した。試験物質のタンパク質量１００μｇ／匹～４００μｇ／匹を、１日１回及び週３回、４週間静脈投与した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ雄マウスをホルダーに拘束し、２６ゲージ注射針が装着された注射器を用いて、試験物質を尾静脈から１ｍＬ／分の速度で徐々に注入した。

６－２．非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記試験物質が投与されたＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ雄マウスの肝臓を摘出して写真撮影後に重量を測定した。右葉は１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、左葉は液体窒素を用いて急速冷凍させ、以下の実験に使用した。

［１］脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果
組織病理学的検査
トリミング、脱水、パラフィン包埋、切片化などの一般的な組織処理過程の後、固定された肝臓組織を用いて病理学的検査のための検体を作製した。検体をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）及びオイルレッドＯ（ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色を施し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３，Ｊａｐａｎ）を用いて組織病理学的変化を観察した。
ＮＡＳスコアリング
微小空胞変性（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、巨大空胞変性（Ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝細胞肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）に対して、顕微鏡下で４０倍から１００倍の倍率で視野に影響を与えた総面積のパーセンテージに基づいて、０～３点に等級付けした。炎症は、１００倍率視野における５つの病巣について、１００倍の倍率で０～３点に点数化した後、群間で比較した。
図１１Ａ及び図１１Ｂ、並びに図１２Ａ及び１２Ｂから確認できるように、ＭＣＤ食餌によって脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）を誘導し、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群は、脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）のサイズ及び数が、試験物質を処理していない対照群に比べて格段に減少していることが観察された。
また、図１３Ａ又は図１３Ｂから分かるように、微小空胞変性（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、巨大空胞変性（Ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝細胞肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）のＮＡＳスコアがいずれも減少した。このことから、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅの脂質生成に対する抑制効果が非常に優れていることを確認した。

［２］炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の抑制効果
トリミング、脱水、パラフィン包埋、切片化などの一般的な組織処理過程の後、固定された肝臓組織を用いて病理学的検査のための検体を作製した。検体を、１次抗体として抗ＴＮＦ－α（ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α）と反応させた後、これに特異的な２次抗体とさらに反応させた後、ＴＮＦ－αタンパク質発現変化量を観察した。
図１４Ａ及び図１４Ｂから観察できるように、ＭＣＤ食餌を用いて炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を誘導し、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群が、ＰＢＳを処理した対照群に比べて、ＴＮＦ－αタンパク質発現レベルが格段に減少していることを確認した。また、図１３Ａから確認できるように、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを処理した群において、炎症スコア（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）が減少していた。したがって、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅの炎症に対する抑制活性が非常に優れていることを確認した。

実験例７：ＴＡＡマウスモデルを用いたＢｘＣ－Ｖ３７ｅ及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅの非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記実施例２－１で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）及び前記実施例２－２で分離されたエキソソーム（ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ）に対して、下記のように実験した。

７－１．ＴＡＡマウスの線維化誘導
ＴＡＡダイエットマウス飼育環境
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、換気回数１０～２０回／ｈｒ、照明時間１２時間（午前８時点灯～午後８時消灯）、及び照度１５０～３００Ｌｕｘに設定した環境で飼育しながら、環境条件を定期的に測定した。
ＴＡＡ薬物投与
６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに２００ｍｇ／ｋｇ濃度のＴＡＡを１日１回、週に３回、１２週間投与した。
投与試験物質の調製及び投与
ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＰＢＳに希釈してそれぞれの試験物質を調製した。試験物質を４００μｇ／匹ずつ、１日１回、週３回、４週間皮下投与し、同時に２００ｍｇ／ｋｇ濃度のＴＡＡを１日１回、週２回、４週間投与した。物質の注射のために、投与部位を７０％アルコールで消毒した。親指と人差し指で右側マウス大腿部の皮膚を引っ張って皮膚と筋肉との間に空間を作った後、動物の前方から親指と人差し指との間の皮下腔に、インスリン注射器を差し込みそのまま投与した。

７－２．非アルコール性脂肪性肝炎治療活性評価
前記試験物質が投与されたＣ５７ＢＬ／６雄マウスの肝臓を摘出して写真撮影した後、重量を測定した。右葉は１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、左葉は液体窒素を用いて急速冷凍させ、以下の実験に使用した。

［１］線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の抑制効果
組織病理学的検査
トリミング、脱水、パラフィン包埋、切片化などの一般的な組織処理過程の後、固定された肝臓組織を用いて病理学的検査のための検体を作製した。検体をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）及びピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）染色を施し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３，Ｊａｐａｎ）を用いて組織病理学的変化を観察した。
図１５Ａ及び図１５Ｂから確認できるように、何ら処理もしていないノーマル群に比べて、ＴＡＡ－ＰＢＳ群の肝臓組織の表面が滑らかでないことが確認できた。ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅによる処理は、肝臓組織を有意に回復させることが観察できた。
また、図１６Ａ及び図１６Ｂから確認できるように、Ｈ＆Ｅ染色の結果、ＴＡＡによって損傷した肝臓組織がＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって著しく回復したことを観察できた。
そして、図１７Ａ及び図１７Ｂから確認できるように、ピクロシリウスレッド染色の結果、ＴＡＡによる肝臓組織内に蓄積されたコラーゲン量が、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって大幅に減少したことが確認できた。
要するに、ＢｘＣ－Ｇ６３ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅが繊維症に対して優れた抑制活性を持っていることが確認できた

まとめ
前記内容を総合すると、本発明のＢｘＣ－ｅ、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ、及びＢｘＣ－Ｇ６３ｅは、脂肪症（Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）誘発性肝細胞において脂質生成、炎症、及び小胞体ストレスも抑制するため、非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療において非常に有利な用途を見出す。

本発明は、前処理物質で前処理した又は前処理していない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞から分化した間葉系幹細胞に由来するエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎の予防又は治療用組成物に関する。

Claims (12)

1. 人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防、緩和、抑制又は治療用薬剤学的組成物。
2. 前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に由来する、請求項１に記載の薬剤学的組成物
3. 前記人工多能性幹細胞は、ヒト由来の人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
4. 人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分離されたエキソソーム。
5. 前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に由来する、請求項４に記載の薬剤学的組成物。
6. 前処理物質で前処理された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の予防、緩和、抑制又は治療用薬剤学的組成物。
7. 前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に由来する、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
8. 前記前処理物質は、１－（６－ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸［１－（６－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－２－ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ］及びエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）からなる群から選ばれるものである、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
9. 前記人工多能性幹細胞は、ヒト由来の人工多能性幹細胞である、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
10. 人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエキソソームを有効成分として含む、非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の緩和、抑制又は改善用食品組成物。
11. 前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しない人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に由来する、請求項１０に記載の食品組成物。
12. 前記人工多能性幹細胞は、ヒト由来の人工多能性幹細胞である、請求項１０に記載の食品組成物。
    
    

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