CN112891543B - Rassf4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病及肝癌治疗的靶点及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物在治疗肝脏炎症、纤维化和脂肪变性药物中的应用。特别是在治疗抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤，促进凋亡药物中的应用。

Description

RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病及肝癌治疗的靶 点及应用

技术领域

本发明属于药物制备的生物工程技术领域，涉及RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点及应用。

背景技术

我国作为肝癌大国，现有的治疗方式主要包括药物治疗、手术治疗、放疗和化疗等；手术治疗存在复发率较高的问题，而放化疗也存在毒副作用较大的缺点；所以药物治疗至关重要，其中靶向药物一直都是研究重点。现有的靶向药物主要针对确诊为肝癌的患者，无法在更早的阶段进行靶向干预，这样治疗比较困难，且效果均不理想。因此有必要寻找新的肝癌靶向治疗药物靶点，改进提高肝癌治疗效果。我们研究的药物靶点基于T2DM合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变过程，不仅可在糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病患者疾病进展过程中使用，比如非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化；还可以在肝癌患者中进行靶向干预，阻止并改善疾病的进展。

近年来，糖尿病的患病率不断增加，大量流行病学研究表明二型糖尿病（T2DM）常会伴随着非酒精性脂肪性肝病的发生，这两种疾病均会导致肝癌的发病率增加。而对于肝癌的靶向治疗一直都是研究重点。RASSF4药物靶点源于对db/m和db/db小鼠的测序结果，并在非酒精性脂肪性肝炎患者和肝癌患者中进一步验证,细胞实验通过检测在不同肝癌细胞中过表达和敲减RASSF4基因对迁移、侵袭、增殖能力的影响，证实RASSF4对肝癌细胞潜在的治疗作用；以及通过在裸鼠皮下进行荷瘤实验，检测RASSF4对肝癌细胞成瘤的影响。我们还通过在db/db小鼠体内过表达RASSF4基因，发现脂肪变性、炎症、纤维化水平均有了明显的改善，证实了RASSF4对糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的治疗作用；进一步说明了该靶点不仅存在对肝癌的治疗作用，还能在疾病尚未进展为肝癌的时期进行靶向干预，部分逆转纤维化的程度，从而提高治疗效应。

发明内容

本发明公开了RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物在制备治疗肝脏炎症、纤维化和脂肪变性药物中的应用。特别是RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物在制备治疗抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤，促进凋亡药物中的应用。

实验结果显示与db/m小鼠相比，db/db小鼠肝脏具有更明显的纤维化、炎症和脂肪变性；进一步对小鼠肝组织进行转录组测序，并分析筛选出肿瘤相关基因RASSF4；该基因db/db小肝脏中表达下降，同时在NASH和肝癌患者中RASSF4的表达也均是下降的；在选择了三种肝癌细胞以及一种正常肝细胞中，RASSF4也在肝癌细胞中有着不同程度的下降。进一步在不同肝癌细胞中敲低或过表达RASSF4基因，同时检测肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力，以及细胞的凋亡水平结果显示RASSF4可以抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力，促进细胞的凋亡能力。过表达RASSF4的裸鼠皮下成瘤和集落形成实验显示RASSF4可以抑制肝癌细胞的成瘤和集落形成能力。db/db小鼠中过表达RASSF4显示了纤维化水平的改善，同时还出现了炎症和脂肪变性的改善；细胞共培养显示高糖高脂干预肝细胞会导致肝星状细胞的激活而促使纤维化的发生发展，而肝细胞中过表达RASSF4可以部分逆转这种效应。

本发明所述的RASSF4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示（参见NM_032023.4）：

ATGAAGGAAGACTGTCTGCCGAGTTCTCACGTGCCCATCAGTGACAGCAAGTCCATTCAGAAGTCGGAGCTCTTAGGCCTGCTGAAAACCTACAACTGCTACCATGAGGGCAAGAGCTTCCAGCTGAGACACCGTGAGGAAGAAGGGACTCTGATCATCGAGGGGCTCCTCAACATTGCCTGGGGGCTGAGGCGGCCCATCCGGCTGCAGATGCAGGATGACCGGGAGCAGGTGCACCTCCCCTCCACCTCATGGATGCCCAGACGGCCTAGCTGCCCTCTAAAGGAGCCATCGCCCCAGAACGGGAACATCACAGCCCAGGGGCCAAGCATTCAGCCAGTGCACAAGGCTGAGAGTTCCACAGACAGCTCGGGGCCCCTGGAGGAGGCAGAGGAGGCCCCCCAGCTGATGCGGACCAAGAGCGACGCCAGTTGCATGAGCCAGAGGAGGCCCAAGTGCCGCGCCCCCGGTGAGGCCCAGCGCATCCGGCGACACCGGTTCTCTATCAACGGCCACTTCTACAATCATAAGACCTCCGTGTTTACTCCAGCCTATGGATCCGTGACCAATGTGAGGGTCAACAGCACCATGACAACCCTGCAGGTGCTCACCCTGCTGCTGAACAAATTTAGGGTGGAAGATGGCCCCAGTGAGTTCGCACTCTACATCGTTCACGAGTCTGGGGAGCGGACAAAATTAAAAGACTGCGAGTACCCGCTGATTTCCAGAATCCTGCATGGGCCATGTGAGAAGATCGCCAGGATCTTCCTGATGGAAGCTGACTTGGGCGTGGAAGTCCCCCATGAAGTCGCTCAGTACATTAAGTTTGAAATGCCGGTGCTGGACAGTTTTGTTGAAAAATTAAAAGAAGAGGAAGAAAGAGAAATAATCAAACTGACCATGAAGTTCCAAGCCCTGCGTCTGACGATGCTGCAGCGCCTGGAGCAGCTGGTGGAGGCCAAGTAA

本发明所述的RASSF4氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示（参见NP_114412.2 ）：

MKEDCLPSSHVPISDSKSIQKSELLGLLKTYNCYHEGKSFQLRHREEEGTLIIEGLLNIAWGLRRPIRLQMQDDREQVHLPSTSWMPRRPSCPLKEPSPQNGNITAQGPSIQPVHKAESSTDSSGPLEEAEEAPQLMRTKSDASCMSQRRPKCRAPGEAQRIRRHRFSINGHFYNHKTSVFTPAYGSVTNVRVNSTMTTLQVLTLLLNKFRVEDGPSEFALYIVHESGERTKLKDCEYPLISRILHGPCEKIARIFLMEADLGVEVPHEVAQYIKFEMPVLDSFVEKLKEEEEREIIKLTMKFQALRLTMLQRLEQLVEAK

本发明更进一步公开了含有RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物的药物组合物，其特征在于包含治疗有效剂量的RASSF4、赋形剂、载体或稀释剂。

尽管本发明的药物可以不经任何配制直接给药，但所述的RASSF4优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径( 如静脉、肌肉给药) 及口服给药。

本发明RASSF4药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明RASSF4与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

药物组合物中含有的活性成份(RASSF4) 的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节。通常，RASSF4的量范围为组合物的0.5 ～ 90％ (重量)，另一优选的范围为0.5 ～ 70％。

本发明更加详细的描述如下：

db/db小鼠肝脏脂肪变性、炎症、纤维化水平明显升高

db/db小鼠肝组织显示有大量的脂肪空泡和脂滴蓄积（图1A），Western显示db/db组小鼠脂质合成、炎症和纤维化水平都有明显的升高(图1B、C)；RT-PCR进一步验证了脂质合成的升高(图1D)；免疫荧光进一步验证了纤维化的升高(图1E)。同时也间接表明了db/db小鼠患肝癌的风险较高（见图1）。

小鼠肝脏转录组测序并筛选验证肿瘤相关基因RASSF4

我们进一步留取db/m与db/db小鼠肝组织各3例进行转录组测序；并对测序结果进行分析，IPA分析结果显示测序结果中和癌症关联性最明显(图2A)；进一步对结果进行KEGGPathway分类，显示出富集基因最多的是信号转导通路(图2B)。再对富集在信号转导通路中的基因进行功能筛选，发现基因RASSF4在db/db小鼠肝组织中下降较为显著(图2C)，是一种潜在的肿瘤抑制基因，但其作用及机制尚不明确。紧接着我们就通过RT-PCR和Western对RASSF4的表达做了进一步验证，结果均显示其在db/db小鼠肝组织显著下降(图2D、E、F)（见图2）。

在NASH和肝癌中显著下降

我们在4例非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者肝组织和4例正常肝组织，以及3例配对的肝癌和癌旁组织中进行RT-PCR和Western Blot检测目的基因RASSF4的表达，结果显示目的基因在NASH及肝癌患者中都明显下降(图3A、B、C、D、E、F)。我们还选择了一种正常肝细胞(HL7702)和三种肝癌细胞（HepG2、MHCC-97H、Huh7），并通过RT-PCR和Western Blot检测RASSF4的表达(图3G、H、I)，结果显示RASSF4在三种不同肝癌细胞中均有不同程度的降低。同时肝癌患者的生存曲线也进一步表明了RASSF4表达水平较高的肝癌患者，生存率更高（图3J）。

可抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进凋亡

通过目的基因RASSF4在不同肝癌细胞中的表达水平不同，选择RASSF4表达相对较高的肝癌细胞（HepG2）和表达相对较低的肝癌细胞（MHCC-97H）进行后续实验。在HepG2细胞中转染siRNA敲减RASSF4以及在MHCC-97H细胞中转染质粒过表达RASSF4，Western Blot检测转染效率（图4A）及相应的统计分析结果（图4B、C）；再进行划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验、细胞增殖EdU染色和凋亡标志蛋白Western Blot检测。结果显示敲减RASSF4会促进肝癌细胞的迁移、侵袭（图4D、E）、增殖（图4F、G）,以及抑制细胞凋亡（图4H、I）；反之过表达RASSF4会抑制肝癌细胞的迁移、侵袭、增殖，和促进细胞凋亡。这就证实了RASSF4在肝癌中充当一种肿瘤抑制基因，并可能作为一个靶点治疗改善肝癌（见图4）。

可抑制肝癌细胞的成瘤能力

为了进一步在体内检测RASSF4对肝癌细胞成瘤能力的影响，我们构建稳定过表达RASSF4的HepG2细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测（图5A、B、C），并在裸鼠皮下进行注射。结果表明在注射后14天，过表达RASSF4组小鼠皮下肿瘤出现生长受限，皮下瘤体的体积开始低于对照组，但没有统计学意义；在21天时，过表达RASSF4组小鼠皮下瘤体体积低于对照组较为明显，并且有统计学意义；在28天的时候，过表达RASSF4组瘤体体积更加明显低于对照组，统计学意义也更加显著（图5D、E），此时的瘤体重量也是明显低于对照组，且有统计学意义（图5F、G）。进一步对瘤体切片的化学染色也表明了过表达RASSF4组PCNA和Ki-67表达低于对照组（图5H）。同样在细胞实验中，通过平板集落形成实验检测了过表达RASSF4对肝癌细胞集落形成能力的影响，结果和裸鼠实验类似，过表达了RASSF4的肝癌细胞和对照组相比，在培养了两周之后具有更少的集落数，且有统计学意义（图5I、J）。这就更说明了RASSF4在肝癌中发挥的抑癌作用，以及作为治疗靶点的意义。

对肝脏纤维化的具有一定的抑制作用

为了验证RASSF4是否在T2DM合并NAFLD进展为肝癌的过程中扮演重要作用，以及是否可作为靶点提前终止肝癌的发生。我们选择了在db/db小鼠体内过表达RASSF4。Western检测结果表明过表达RASSF4的db/db小鼠肝脏纤维化水平有了明显的改善（图6A、B）；同时，过表达RASSF4的小鼠肝脏脂质合成和炎症水平也都有一定的逆转（图6C、D、E），HE染色也显示过表达RASSF4后db/db小鼠肝组织脂肪变性明显下降（图6F）。这就说明了RASSF4对可能作为一个靶点对T2DM合并NAFLD的治疗作用。另外，我们还选择了正常肝细胞(HL7702)和肝星状细胞（LX-2）；首先将高糖高脂干预不同时间下的肝细胞与肝星状细胞进行共培养，发现在高糖高脂干预肝细胞一定时间后，肝星状细胞被激活分化（图6G、H），同时为了验证这种作用是否为高糖高脂对肝星状细胞的直接作用，我们还进行了高糖高脂对肝星状细胞的直接干预，结果显示在相同浓度和时间处理下肝星状细胞没有明显的激活分化（图6I）；就进一步说明了高糖高脂通过对肝细胞的某种影响，进一步激活肝星状细胞，促使了肝纤维化的形成和发展。为了进一步验证这种作用是否是RASSF4所介导的，我们在高糖高脂干预肝细胞的基础上在肝细胞中转染质粒过表达RASSF4，再与肝星状细胞共培养；结果表明过表达RASSF4逆转了高糖高脂干预肝细胞对肝星状细胞的激活作用（图6J、K）；而单纯在肝细胞中敲低RASSF4后与肝星状细胞共培养结果显示激活了肝星状细胞导致的纤维化（图6J、L）;这就证明了高糖高脂会导致肝细胞中RASSF4的下降，进而导致肝星状细胞激活分化，促使肝纤维化的形成和发展；也表明了RASSF4对糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病中的纤维化具有一定的治疗作用（见图6）。

附图说明

1.图1db/db小鼠肝脏脂肪变性、炎症、纤维化水平明显升高；

A: db/m与db/db小鼠肝组织大体图像、HE染色、油红O染色；

B、C: db/m与db/db小鼠肝组织脂质合成、炎症、纤维化指标Western Blot及统计图；

D: db/m与db/db小鼠肝组织脂质代谢RT-PCR;

E: db/m与db/db小鼠肝组织纤维化指标α-SMA免疫荧光染色；

图2db/db小鼠肝脏转录组测序并筛选验证肿瘤相关基因RASSF4；

A: 根据db/m与db/db小鼠肝组织转录组测序结果进行基因富集分析；

B: 根据db/m与db/db小鼠肝组织转录组测序结果进行KEGG通路分类；

C: 根据在db/db小鼠肝组织转录组测序结果中全部下降基因所做热图及进一步根据KEGG通路分类筛选和肿瘤关联性较高基因；

D、E、F: 通过RT-PCR和Western Blot验证筛选出的RASSF4基因在db/m和db/db小鼠中的表达及统计图；

图3 RASSF4在NASH和肝癌中显著下降；

A、B、C: 通过RT-PCR和Western Blot验证筛选出的RASSF4基因在人非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者中的表达及统计图；

D、E、F: 通过RT-PCR和Western Blot验证筛选出的RASSF4基因在人肝癌和癌旁组织中的表达及统计图；

G、H、I: 通过RT-PCR和Western Blot检测RASSF4在正常肝细胞（HL）和三种肝癌细胞（HepG2、97H、Huh7）中的表达及统计图；

J: 肝癌病人中RASSF4表达不同水平患者生存曲线图；

图4 RASSF4可抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进凋亡；

A、B、C：Western Blot验证HepG2中转染siRNA和MHCC-97H细胞中转染过表达质粒结果及统计图；

D:转染siRNA和质粒后进行的细胞划痕实验；

E: 转染siRNA和质粒后进行Transwell迁移和侵袭实验；

F、G：转染siRNA和质粒后进行细胞增殖EdU染色及统计图；

H、I：转染siRNA和质粒后Western Blot检测细胞凋亡标志蛋白及统计图；

图5 RASSF4可抑制肝癌细胞的成瘤能力；

A、B、C:构建稳定过表达RASSF4的肝癌细胞的RT-PCR和Western Blot验证结果及统计图；

D:过表达RASSF4的肝癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验，饲养4周后小鼠图像，圈出部位为肿瘤细胞注射处；

E:裸鼠皮下肿瘤体积随生长时间的变化；

F、G:饲养4周结束后取出的裸鼠皮下肿瘤图像及肿瘤重量；

H:裸鼠皮下肿瘤切片的H&E染色、PCNA和Ki67免疫组化染色；

I、J:过表达RASSF4的肿瘤细胞平板集落形成实验及统计图；

图6RASSF对肝脏纤维化的具有一定的抑制作用；

A、B:db/db小鼠过表达RASSF4后Western Blot检测肝组织纤维化水平变化及统计图；

C、D、E：Western Blot和RT-PCR检测肝脏脂质代谢和炎症因子表达情况；

F: 小鼠肝组织HE染色；

G、H: 高糖高脂干预的肝细胞与肝星状细胞共培养不同时间对纤维化指标的Western Blot检测及统计图；

I: 高糖高脂干预肝星状细胞不同时间对纤维化指标的Western Blot检测；

J、K、L: 高糖高脂干预和转染后的肝细胞与肝星状细胞共培养对纤维化指标的Western Blot检测。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用RASSF4（自行构建表达载体质粒并进行转染纯化）其他原料及试剂均有市售。

实施例1

RASSF4过表达载体质粒构建

1.1 PCR扩增RASSF4

(1)在PCR管中配制如下体系：

（2）配置好上述体系后，离心机瞬离，使用PCR仪器进行扩增；反应条件如下：

预变性95℃ 5分钟，变性95℃ 10秒，退火62℃ 30秒，延伸72℃ 2分钟，40个循环；

（3）把样品加入到6×DNA loading中，并加入到配置好的1%琼脂糖凝胶中，DNA电泳仪150V，15分钟左右，将电泳后的凝胶拿到暗室，在紫外灯照射下，尽量将只含有目的条带的凝胶切割下来，放入干净的1.5ml EP管中。

1.2 切胶回收

（1）称取所切凝胶重量，按100mg 凝胶加入300ul BM Buffer；

（2）把加入Buffer的凝胶放入42℃金属浴加热10分钟，中间观察凝胶融化情况并用手指弹匀；

（3）将液体转移入试剂盒配套的带有滤芯的吸附柱中，并将吸附柱放入收集管，高速离心机12000 rpm 离心1分钟，并弃收集管中液体；

（4）加入700ul WB Buffer到吸附柱中，12000 rpm离心30秒，弃去滤液，并重复一次；

（5）最后将30ul 提前65℃预热的ddH₂O加入到吸附柱中，并放在一个新的1.5mlEP管中，室温静置1分钟，12000 rpm 离心1分钟，收集离心液并测浓度，此时EP管中液体即为PCR回收的RASSF4 DNA液体。

1.3 RASSF4切胶回收后加A尾

（1）在EP管中配制如下体系：

（2）配好体系后，瞬离并放入72℃金属浴中加热20分钟，再于冰上静置2分钟。

1.4酶切RASSF4切胶回收后产物及载体

在EP管中分别配制如下体系：

体系①：

体系②：

（2）配好体系好瞬离，并放入37℃金属浴中加热2小时。

（3）把样品加入6*DNA loading 后加入到配制好的 1％琼脂糖凝胶中， 用 DNA电泳仪 150V, 15 分钟左右，将电泳后的凝胶拿到暗室，在紫外灯照射下，将只含有目的条带的凝胶切割下来，放入干净的1.5ml EP管中；

（4）用切胶回收试剂盒回收质粒DNA，同步骤1.2。

1.5 T4连接酶连接载体和RASSF4

（1）在EP管中配制如下体系：

（2）体系配制好瞬离后室温静置1-2小时。

1.6重组质粒转化

（1）取50ul感受态细胞放在冰上5-10分钟等待其融化，将T4连接体系放入其中，轻柔混匀后冰上静置30分钟；

（2）将体系放入42℃金属浴中加热90秒，然后迅速置于冰上2-3分钟；

（3）往感受态细胞体系中加入1ml的LB培养基，并放入37℃摇床中1小时；

（4）使用离心机瞬离30秒，观察管底沉淀情况

（5）在超净台中将管中LB培养基弃去一部分，并将剩余液体混匀后沾取适量，涂于含有氨苄抗性的固体LB培养皿上；

（6）放于37℃孵育箱过夜，第二天观察LB培养皿中菌落生长情况。

1.71重组质粒验证

（1）在超净台中，从培养皿中随机挑选5个菌落，并用10ul枪头挑起放入3ml加有氨苄抗性的LB培养液中；

（2）放入37℃恒温摇床中过夜；

（3）用小提质粒试剂盒进行质粒提取，并用酶切验证的方法将验证正确的质粒送测序；

（4）测序正确的质粒进行大量无内毒素质粒提取，留做以后实验备用。

实施例2

以RASSF4作为活性成分，加入药学可接收的辅料按常规方法可制成各种规格的液体注射剂。RASSF4的给药途径包括多种，如注射给药，腔内给药等。

（1）注射剂的制备：

RASSF4 200 mg，甘露醇700 mg，PEG3000 10mg，蒸馏水100 ml，使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3mg/ml，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。

（2）片剂的制备：

RASSF4 10 mg ，微晶纤维素 35 mg，淀粉 45 mg，聚乙烯吡咯烷酮 4 mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg，硬脂酸镁 0.5 mg，滑石粉1 mg；将RASSF4活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。

（3）胶囊的制备

RASSF4 10 mg，活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料充分混合，加入羟丙甲纤维素溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60℃烘箱中干燥约2-3小时，将硬脂酸镁和滑石粉与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用2号胶囊灌装。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津医科大学朱宪彝纪念医院（天津医科大学代谢病医院、天津代谢病防治中心）

<120> RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病及肝癌治疗的靶点及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaggaag actgtctgcc gagttctcac gtgcccatca gtgacagcaa gtccattcag 60

aagtcggagc tcttaggcct gctgaaaacc tacaactgct accatgaggg caagagcttc 120

cagctgagac accgtgagga agaagggact ctgatcatcg aggggctcct caacattgcc 180

tgggggctga ggcggcccat ccggctgcag atgcaggatg accgggagca ggtgcacctc 240

ccctccacct catggatgcc cagacggcct agctgccctc taaaggagcc atcgccccag 300

aacgggaaca tcacagccca ggggccaagc attcagccag tgcacaaggc tgagagttcc 360

acagacagct cggggcccct ggaggaggca gaggaggccc cccagctgat gcggaccaag 420

agcgacgcca gttgcatgag ccagaggagg cccaagtgcc gcgcccccgg tgaggcccag 480

cgcatccggc gacaccggtt ctctatcaac ggccacttct acaatcataa gacctccgtg 540

tttactccag cctatggatc cgtgaccaat gtgagggtca acagcaccat gacaaccctg 600

caggtgctca ccctgctgct gaacaaattt agggtggaag atggccccag tgagttcgca 660

ctctacatcg ttcacgagtc tggggagcgg acaaaattaa aagactgcga gtacccgctg 720

atttccagaa tcctgcatgg gccatgtgag aagatcgcca ggatcttcct gatggaagct 780

gacttgggcg tggaagtccc ccatgaagtc gctcagtaca ttaagtttga aatgccggtg 840

ctggacagtt ttgttgaaaa attaaaagaa gaggaagaaa gagaaataat caaactgacc 900

atgaagttcc aagccctgcg tctgacgatg ctgcagcgcc tggagcagct ggtggaggcc 960

aagtaa 966

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> RASSF4氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Glu Asp Cys Leu Pro Ser Ser His Val Pro Ile Ser Asp Ser

1 5 10 15

Lys Ser Ile Gln Lys Ser Glu Leu Leu Gly Leu Leu Lys Thr Tyr Asn

20 25 30

Cys Tyr His Glu Gly Lys Ser Phe Gln Leu Arg His Arg Glu Glu Glu

35 40 45

Gly Thr Leu Ile Ile Glu Gly Leu Leu Asn Ile Ala Trp Gly Leu Arg

50 55 60

Arg Pro Ile Arg Leu Gln Met Gln Asp Asp Arg Glu Gln Val His Leu

65 70 75 80

Pro Ser Thr Ser Trp Met Pro Arg Arg Pro Ser Cys Pro Leu Lys Glu

85 90 95

Pro Ser Pro Gln Asn Gly Asn Ile Thr Ala Gln Gly Pro Ser Ile Gln

100 105 110

Pro Val His Lys Ala Glu Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Pro Leu Glu

115 120 125

Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Leu Met Arg Thr Lys Ser Asp Ala Ser

130 135 140

Cys Met Ser Gln Arg Arg Pro Lys Cys Arg Ala Pro Gly Glu Ala Gln

145 150 155 160

Arg Ile Arg Arg His Arg Phe Ser Ile Asn Gly His Phe Tyr Asn His

165 170 175

Lys Thr Ser Val Phe Thr Pro Ala Tyr Gly Ser Val Thr Asn Val Arg

180 185 190

Val Asn Ser Thr Met Thr Thr Leu Gln Val Leu Thr Leu Leu Leu Asn

195 200 205

Lys Phe Arg Val Glu Asp Gly Pro Ser Glu Phe Ala Leu Tyr Ile Val

210 215 220

His Glu Ser Gly Glu Arg Thr Lys Leu Lys Asp Cys Glu Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Ile Ser Arg Ile Leu His Gly Pro Cys Glu Lys Ile Ala Arg Ile Phe

245 250 255

Leu Met Glu Ala Asp Leu Gly Val Glu Val Pro His Glu Val Ala Gln

260 265 270

Tyr Ile Lys Phe Glu Met Pro Val Leu Asp Ser Phe Val Glu Lys Leu

275 280 285

Lys Glu Glu Glu Glu Arg Glu Ile Ile Lys Leu Thr Met Lys Phe Gln

290 295 300

Ala Leu Arg Leu Thr Met Leu Gln Arg Leu Glu Gln Leu Val Glu Ala

305 310 315 320

Lys

Claims (2)

1.RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物在制备治疗肝脏炎症、纤维化和脂肪变性药物中的应用。

2.RASSF4作为糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌演变治疗的靶点药物在制备治疗抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤，促进凋亡药物中的应用。

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