CN111603551B - 融合蛋白ifn-elp(v)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用 - Google Patents

融合蛋白ifn-elp(v)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白IFN‑ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述融合蛋白IFN‑ELP(V)在通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，早期抑制肿瘤的复发。同时术后与化疗联合产生协同抗肿瘤作用，有效改善患者预后。本发明填补了肿瘤(尤其是GBM)手术与术后放化疗之间的“治疗空白期”，提供了最早的术后干预措施以减少肿瘤复发。

Description

融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(GBM)恶性度高，预后极差。尽管外科技术取得了较大进步，但仍难以完全切除，即使术后联合放疗和化疗，其复发依然难以控制。目前公认的手术切除联合术后放化疗的综合治疗模式存在的缺陷：1、手术与随后放化疗之间的几周时间没有任何治疗，在这段“治疗空白期”内残余肿瘤细胞已经开始增值；2、受损的血脑屏障依然有较高的选择性，治疗药物无法通过系统给药有效到达中枢神经系统，从而杀伤肿瘤细胞。因此，术中将抗肿瘤药物局部递送至GBM切除腔，是一种非常可行的方式。到目前为止，包含化疗试剂卡莫司汀的可生物降解的
Figure BDA0002454019850000011
是美国食品药品管理局(FDA)唯一批准的用于术中局部治疗GBM的药物。然而，由于该药物缓释差，且易流动不能有效固定于残腔，患者总体受益并不明显。因此，迫切需要开发新的递药系统以有效抑制手术后GBM复发。
免疫疗法近年来已取得突破，但在GBM临床试验中未见明显效果，主要与GBM独特的免疫抑制微环境相关。因此，克服GBM微环境中的免疫抑制作用可诱导有效的抗肿瘤免疫反应。干扰素(IFN)是一种具有多种功能的细胞因子，已被多种恶性肿瘤的抗肿瘤研究，包括GBM。同时，IFN可以与化疗药物能够产生协同作用。但是，IFN的短循环半衰期极大地限制了它们在GBM治疗中的应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明首先提供了融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。
本发明中的“融合蛋白IFN-ELP(V)”具体指IFN和ELP(V)的融合蛋白，其中，IFN指干扰素，ELP(V)指类弹性蛋白多肽，且其多肽序列的重复单元为VGVPG。
作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)的重复单元共重复30～180次，优选重复60～120次，更优选重复90次。
作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)融合于所述IFN的C末端。
本发明进一步提供了编码融合蛋白IFN-ELP(V)的核酸或含有所述核酸的生物材料在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系。
当然，在此应用中的融合蛋白IFN-ELP(V)可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的优选方案。
本发明进一步提供一种药物组合物，含有所述的融合蛋白IFN-ELP(V)和一种或多种药学上适宜的赋形剂，所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。
在神经胶质瘤治疗中，很少会有抗肿瘤药物适合于术中瘤腔原位给药，以抑制肿瘤早期复发。然而本发明发现(作用机制示意图见图1)，融合蛋白IFN-ELP(V)在通过瘤腔给药时具有很好的效果，经验证可以粘附着于瘤腔，不易移位，具有很好的应用效果，因此优选所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。
在药物组合物中的融合蛋白IFN-ELP(V)也可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的优选方案。
本发明在进一步探究中发现IFN-ELP(V)在与TMZ(替莫唑胺)联合给药时，在提升原位免疫反应、抑制肿瘤复发等方面具有协同效果，因此优选所述药物组合物中还含有TMZ。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的融合蛋白及药物通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，第一时间抑制肿瘤的复发。同时术后与化疗联合并产生协同作用，有效改善患者预后。
(2)本发明填补了肿瘤(尤其是GBM)手术与术后放化疗之间的“治疗空白期”，提供了最早的术后干预措施以减少肿瘤复发。
(3)本发明发现了IFN-ELP(V)与化学疗法(TMZ)的协同作用，有利于其在临床中进行更好的应用。
(4)本发明为肿瘤(尤其是GBM)治疗提供了一种生物安全的疗法。其中，IFN和TMZ已被美国FDA批准用于癌症治疗，而ELP是具有生物相容性且可生物降解的生物聚合物，可以减轻对机体的副作用。
附图说明
图1为本发明的作用机制示意图。
图2为本发明试验例1中通过ITC纯化获得IFN-ELP(V)和镍柱亲和层析纯化获得IFN的结果示意图。
图3为本发明试验例1中的MALDI-TOF分析IFN-ELP(V)和IFN的分子量的结果示意图；
图4为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的水合半径结果示意图；
图5为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的二级结构示意图；
图6为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的相转变特性及浓度依赖性结果示意图；其中，a图为不同浓度的IFN-ELP(V)其温度变化与浑浊度变化关系，b图为IFN-ELP(V)的浓度与相转变温度的关系；
图7为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)体外释放试验结果示意图；
图8为本发明试验例2中的IFN-ELP(V)和IFN体外生物活性结果示意图；其中，a图为IFN-ELP(V)和IFN对人Daudi B细胞的抑制曲线，b图为IFN-ELP(V)和IFN对人源性U87MG细胞的抑制作用；
图9为本发明试验例2中TMZ体外抑制增值情况结果示意图；其中，a图为TMZ对人源性U87MG细胞的抑制作用，b图为TMZ分别与IFN-ELP(V)和IFN联合对U87MG细胞；
图10为本发明试验例3中IFN-ELP(V)和IFN在颅内最大使用剂量测定的结果示意图；其中，a图为IFN的测定结果，b图为IFN-ELP(V)的测定结果；
图11为活体成像技术显示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示意图；
图12为荧光显微镜下展示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示意图；其中，a图为切除前U87MG-mCherry-luc肿瘤的白光显微照片，b、c图为切除前后的荧光显微照片；
图13为本发明试验例3中最大剂量IFN-ELP(V)和IFN在颅内GBM切除腔中形态结果示意图；
图14为本发明试验例3中手术切除腔注射荧光标记的IFN-ELP(V)和IFN后荧光强度变化的结果示意图；其中，a图为荧光变化示意图，b图为荧光强度定量示意图；
图15为本发明试验例3中手术切除腔注射最大量IFN-ELP(V)和IFN在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化及药时曲线面积随时间变化曲线的结果示意图；其中，a图为血药浓度随时间的变化示意图，b图为药时曲线面积随时间变化示意图；
图16为本发明试验例4中IFN-ELP(V)和IFN在体内的生物分布结果示意图；
图17为本发明试验例5中手术切除腔置入最大耐受量IFN-ELP(V)和IFN后小鼠肿瘤复发的活体成像结果示意图；
图18为本发明试验例5中的小鼠肿瘤荧光强度变化的定量及小鼠生存分析示意图；其中，a图为肿瘤荧光强度变化的定量示意图，b图为小鼠生存曲线示意图；
图19为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠活体成像示意图；
图20为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肿瘤复发趋势示意图；
图21为本发明试验例6中的各组小鼠术后21天脑组织标本形态及病理检测示意图；
图22为本发明试验例6中的各组小鼠的体重变化示意图；
图23为本发明试验例6中的各组小鼠的生存曲线示意图；
图24为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小胶质细胞活化程度变化的结果示意图；
图25为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞颅内浸润程度变化的结果示意图；
图26为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞M1极化情况的结果示意图；其中，a图为CD86的变化趋势，b图为Ly6C的变化趋势，c图为MHCII的变化趋势；
图27为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组中性粒细胞颅内浸润变化的结果示意图；
图28为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组免疫因子变化的结果示意图；其中，a图为IL-1β的变化示意图，b图为IL-12的变化示意图，
图29为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后裸鼠各脏器的组织学变化情况的结果示意图；
图30为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠的血液分析的结果示意图；
图31为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠凝血功能变化的结果示意图；
图32为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肝功能变化情况的结果示意图；
图33为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肾功能变化情况的结果示意图；
图34为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠心肌酶谱变化情况的结果示意图；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例中，构建IFN-ELP(V)的融合蛋白质粒并在大肠杆菌中表达，具体如下：
ELP(V)序列的氨基酸重复单元为:VGVPG(SEQ ID NO：1)，共重复90次。
由生工生物技术(上海，中国)合成包含重复单元和BseRI/AcuI粘性末端的基因片段。
上游片段：
5’GCGTGGGTGTTCCGGGCGTAGGTGTCCCAGGTGTGGGCGTACCGGGCGTTGGTGTTCCTGGTGTCGGCGTGCCGGGC3’(SEQ ID NO：2)
下游片段：
5’TAGCCCGGCACGCCGACACCAGGAACACCAACGCCCGGTACGCCCACACCTGGGACACCTACGCCCGGAACACCCAC3’(SEQ ID NO：3)
通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-25b(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得18个如上重复单元的质粒。
IFN基因序列(NCBI GI 386795)由生工生物技术(上海，中国)合成并插入
Figure BDA0002454019850000051
载体中。利用PCR技术，从
Figure BDA0002454019850000052
载体中扩增IFN编码序列，通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-25b(+)载体中，通过质粒构建获得含有IFN-ELP基因的质粒，其中，IFN基因序列如下：
ATGTGTGATCTGCCTCAGACTCATTCTCTGGGTAGTCGTCGTACGCTGATGCTGCTGGCTCAAATGCGCCGTATTAGCCTGTTTTCTTGCCTGAAAGATCGCCACGATTTTGGGTTTCCACAGGAAGAATTTGGCAACCAGTTCCAGAAAGCCGAAACAATTCCGGTACTGCACGAGATGATTCAACAAATCTTTAACCTGTTCAGCACCAAAGACTCTTCTGCTGCCTGGGATGAAACACTGCTGGACAAATTCTATACCGAGCTGTATCAGCAACTGAACGATCTGGAGGCATGTGTTATTCAGGGTGTTGGTGTGACTGAAACTCCGCTGATGAAAGAGGATAGCATTCTGGCAGTCCGTAAATATTTTCAGCGTATCACACTGTATCTGAAAGAGAAAAAATATAGCCCGTGTGCCTGGGAAGTTGTTCGTGCCGAAATCATGCGCAGCTTTAGTCTGTCTACCAACCTGCAAGAGAGCCTGCGTTCTAAAGAA(SEQ ID NO：4)
该IFN基因序列引物如下：
上游引物：
5’GAGATAGAGGAGTACATATGGGCTGTGATCTGCCTCAGACTCATT3’(SEQ ID NO：5)
下游引物：
5’TTTCCGCTGAAGGCAGAGAGCCACCGCCACCGGATCCTTCTTTAGAACGCAGGCTCT 3’(SEQ IDNO：6)
IFN-ELP质粒构建后在大肠杆菌(Rosetta-gami(DE3)pLysS，Novagen)中表达。先将转化得到的单克隆菌接种在50mL TB培养基中，在37℃、180rpm条件下培养震荡过夜。第二天转入1L TB培养基当中(卡那霉素浓度为100μg/mL)，在37℃、200rpm条件下震荡培养5h，随后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将培养温度设为18℃，终浓度为0.5mM，培养约16h后收集菌体。
实施例2
本实施例中，将实施例1培养获得的IFN-ELP融合蛋白提取并纯化，具体如下：
本实施例中采用反相转变循环技术(Inverse transition cycling,ITC)纯化IFN-ELP(V)。具体方法如下：
(1)将1L大肠杆菌培养液收集于离心瓶，以3000×g离心力离心收集菌体，去除上层培养液。
(2)用30mL冰冷PBS重悬菌体，在4℃条件下超声破碎细胞，然后将破碎产物在4℃、14000×g离心力下离心15分钟，收集上清。
(3)上一步骤收集的上清液中加入2mL聚乙烯亚胺(PEI，10％)，再次离心15分钟，以除去细胞裂解液中的核酸及其他带负电物质，将得到的上清液进行ITC纯化：加入终浓度为3M的NaCl，37℃充分溶解后14000×g离心力下离心15分钟，去上清，沉淀溶解在提前预冷的10mM PBS中，完全溶解后离心，得到上清。此过程重复2-3次即可获得样品。
试验例1
本试验例中，对实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)融合蛋白样品进行物理化学参数的表征，具体如下：
(1)用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试纯度，使用二辛可宁酸(BCA)测定以确定蛋白质的浓度。图2显示了IFN和IFN-ELP(V)的表达与纯化。从左至右依次为蛋白标样、IFN和IFN-ELP(V)，结果表明，通过大肠杆菌进行表达，纯化后获得纯度＞95％的蛋白，该蛋白即为IFN-ELP融合蛋白。
(2)用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定所获得纯化产物的分子量，所用仪器为4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析仪(AB SCIEX)，结果如图3所示，表明IFN和IFN-ELP(V)的实验所测分子量与理论值接近。
(3)在Malvern Zetasizer Nano-zs90上用动态光散射(DLS)方法测定IFN和IFN-ELP(V)的水合半径，结果见图4，IFN的水合半径为2.9nm，而IFN-ELP(V)的水合半径为12.8nm。
(4)IFN-ELP(V)的二级结构用圆二色性谱(CD)分析：样品用水溶液稀释至0.2mg/mL，用Pistarπ-180(Applied Photophysics有限公司)在200-250nm波长范围内进行紫外扫描分析，图5显示了圆二色性色谱分析IFN和IFN-ELP的二级结构，为典型的α螺旋结构，且与IFN曲线重叠良好，表明ELP融合并没有干扰IFN的二级结构。
(5)IFN-ELP(V)的热响应行为测定：通过在SpectraMax M3微孔板读数器(Molecular Devices)上监测350nm的吸光度，研究了IFN-ELP(V)的可逆相变行为随温度的变化。根据加热曲线，LCST定义为最大浊度为50％时的温度。结果如图6所示，通过浊度分析法可以观察到响应温度变化的IFN-ELP(V)的急剧相变行为，发现LCST是浓度依赖性的，即降低浓度会增加LCST。
(6)IFN-ELP(V)的体外释放试验：在37℃下于16000g离心10分钟分离出5mg IFN等效的IFN-ELP(V)，除去上清液，并加入600μLPBS。将样品在37℃下放置30天，并在不同时间点通过Ellisa测量IFN的浓度。结果如图7所示，在37℃的体温下，IFN-ELP(V)在原位形成聚集体后，可以缓慢扩散到上清液中。
试验例2
本试验例中，对实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)融合蛋白和IFN的体外生物活性进行检测，抗细胞增殖活性选取人Burkitt’s B淋巴瘤细胞(Daudi B)和U87MG-mCherry-luc细胞，其中Daudi B细胞对IFN-α2具有较高的敏感度。将Daudi B细胞和U87MG-mCherry-luc细胞按一定的密度(50μL/孔，104个细胞)种植在96孔板，再将DMEM中的IFN和IFN-ELP(V)样品按一系列浓度加至96孔板中，常规孵育72小时后，使用MTT测定法测量细胞活力。同样测量了TMZ在不同浓度下对U87MG-mCherry-luc的细胞毒性，还测定了TMZ联合IFN和IFN-ELP(V)对U87MG-mCherry-luc的抑制作用。结果如图8所示，确定IFN-ELP(V)对Daudi B细胞的抗增殖活性(IC50＝53.47pg/mL)为IFN的37.9％(IC50＝20.27pg/mL)，表明C末端ELP融合在一定程度上降低了IFN的抗增殖活性。另一方面，即使高浓度107pg/mL的干扰素和IFN-ELP(V)也没有对U87MG-mCherry-luc细胞产生明显的毒性，U87MG-mCherry-luc细胞在体外对IFN和IFN-ELP(V)不敏感。而图9显示了TMZ对U87MG-mCherry-luc细胞具有明显的细胞毒性，IC50约为600μg/mL，同时，IFN-ELP(V)或IFN与TMZ的联合未发现对U87MG-mCherry-luc细胞毒性的协同作用。
试验例3
本试验例中，对实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)融合蛋白和IFN的药物代谢动力学进行测试，具体如下：
首先，本试验例对小鼠脑内药物的最大耐受剂量进行了实验，结果见图10，测得IFN和IFN-ELP(V)在小鼠脑组织中的最大注射剂量分别为0.3mg和1mg；接着，本试验例建立了U87MG-mCherry-luc原位胶质母细胞瘤切除模型，图11利用活体成像仪评估了手术前后脑肿瘤的荧光强度变化；图12在动物荧光显微镜下显示了手术前后脑肿瘤的变化。这说明本试验例的显微手术达到了近全切除肿瘤的目的。本试验例在肿瘤切除残腔以最大耐受剂量注入IFN或IFN-ELP(V)，图13显示最大剂量的IFN和IFN-ELP(V)在肿瘤残腔中的形态，可见IFN-ELP(V)明显浑浊并沉淀于瘤腔，这有利于形成药物储库并缓慢释放干扰素，持续作用于周围组织。
接着，本试验例将荧光染料Cy7标记的最大剂量IFN或IFN-ELP(V)分别置于肿瘤残腔，利用活体成像仪(IVIS)在不同时间点观察荧光信号强度变化，从而评估IFN或IFN-ELP(V)在体内的代谢。结果如图14，Cy7标记的IFN-ELP(V)的荧光在21d内随时间缓慢下降，表明IFN-ELP(V)可以长时间持续释放到周围的脑组织和循环系统中。相反，Cy7标记的IFN的荧光在3d内迅速降至零，表明IFN在体内的代谢时间较短。
同时，将原位胶质母细胞瘤切除模型小鼠分为两组，最大剂量瘤腔置入IFN和IFN-ELP(V)后，在不同时间点抽取静脉血，利用人IFN-α2ELISA试剂盒来测定血清中的干扰素含量，从而评估IFN和IFN-ELP(V)在肿瘤模型中的药物动力学。结果如图15所示，血浆IFN-ELP(V)在8h时升高至5.21±0.47μg/L，然后在超过三周的长时间内及其缓慢地下降，相比之下，IFN的血浆水平在2h迅速升高至5.14±0.03μg/L，然后迅速下降。具体而言，IFN-ELP(V)的循环半衰期(t1/2)长达280±0.5h，比IFN半衰期(2.4±0.1h)长116倍。IFN-ELP(V)的曲线下面积(AUC)(1.7±0.7mg/L·h)比IFN(0.046±0.016mg/L·h)大37倍。特别是，IFN-ELP(V)的AUC与时间呈线性相关，证实了三周零级持续释放。相反，IFN的AUC与时间呈对数相关。这些药代动力学数据表明，IFN-ELP(V)可以从切除腔中的库释放到周围系统中，并具有三周零阶缓释动力学的特征。
试验例4
本试验例中，研究实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)融合蛋白和IFN在组织中的分布情况，具体如下：将肿瘤切除模型分为两组，分别置入最大剂量的IFN和IFN-ELP(V)，给药24h，72h，30d后分别处死裸鼠，收集主要器官如脑、心、肾、肝脏、脾脏、肺、胰腺、胃、肌肉、小肠。组织用提取缓冲液(PBS含1mM EDTA，0.5％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，按1:100比例稀释的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich))破碎后，离心取上清提取液，IFN的浓度用ELISA方法定量测定。结果如图16，在24h，72h和3w时，脑组织中IFN-ELP(V)的水平远高于其他主要组织，而IFN的水平只在24h和72h时高于其他主要组织。值得注意的是，分别在24h，72h和3w时脑中的IFN-ELP(V)水平分别高于IFN，这表明与IFN相比，IFN-ELP(V)在大脑中的储留能力明显提高。肾脏中高水平的IFN和IFN-ELP(V)表明，可以通过肾脏过滤将它们从体内清除。这说明IFN-ELP(V)在脑组织中的储留能力明显优于IFN。
试验例5
本试验例中，研究实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)融合蛋白和IFN在GBM切除模型中抑制肿瘤复发的情况，具体如下：将原位GBM模型小鼠随机分为3组(每组n＝5)。第一组：手术；第2组：手术+IFN；第3组：手术+IFN-ELP(V)。其中2、3组的小鼠按最大剂量注入IFN或IFN-ELP(V)于肿瘤残腔。术后通过IVIS定期监测GBM复发情况，并计算生存时间。结果如图17，与IFN相比，IFN-ELP(V)给药后脑组织中肿瘤细胞的荧光信号明显减弱。图18显示荧光信号的变化以及生存预后。可见手术+IFN-ELP(V)(28d)的中位生存时间分别比手术+IFN(23d)和单独手术(20d)长1.2倍和1.4倍。这些结果表明，由于与IFN相比，IFN-ELP(V)在该模型中抑制GBM复发方面比IFN具有更高的效率。
试验例6
本试验例中，研究实施例1中纯化后的IFN-ELP(V)联合TMZ在抑制GBM复发中的协同作用，具体如下：将原位GBM模型的小鼠随机分为4组。第1组：手术(n＝6)；第2组：手术+IFN-ELP(V)(n＝8)；第3组：手术+TMZ(n＝8)；第4组：手术+IFN-ELP(V)+TMZ(n＝10)。将最大剂量的IFN-ELP(V)注入第2组和第4组的切除腔中。然后将TMZ溶解在含有85％PBS和15％二甲基亚砜(DMSO)的溶液中。切除后两天，在第3组和第4组腹膜内注射TMZ，剂量为每天50mg/kg，共5天。通过IVIS检测GBM复发，统计生存时间。手术后3周，取每组的代表性脑组织进行形态学及病理学评估GBM复发。结果如图19，从荧光信号的变化可知，术后IFN-ELP(V)+TMZ比单独的IFN-ELP(V)或TMZ更有效地抑制了肿瘤复发。图20显示手术+IFN-ELP(V)+TMZ，手术+TMZ，手术+IFN-ELP(V)和单独手术治疗的小鼠的无肿瘤率分别为60％，12.5％，0％和分别为0％。图21显示，除手术+IFN-ELP(V)+TMZ组外，在病理切片中观察到广泛的复发肿瘤细胞和血管生成。图22为术后各组小鼠的体重变化，可见手术+IFN-ELP(V)+TMZ组体重非常稳定，其它小组小鼠体重均有不同程度的下降。图23则展示了治疗后各组小鼠的生存预后，可见手术+IFN-ELP(V)+TMZ组的小鼠较其它组的生存期明显延长，第90天时该治疗组60％的小鼠仍然存活，远远高于其它小组。综上，这些结果都表明原位IFN-ELP(V)的瘤腔给药与术后TMZ组合在抑制术后肿瘤复发方面的协同作用。
试验例7
本试验例中，对各治疗组进行原位免疫反应方面的评估，具体如下：各组治疗后7天，将小鼠脑组织收集在组织储存液中，然后在冷D-PBS中洗涤。切成约0.5cm的碎片后，将它们转移到装有酶P和酶A的试管中，再将脑组织研磨，然后清除残渣并去除血细胞。然后，按照说明用荧光标记的抗体CD45，CD3，CD49b，CD11b，MHCII，CD86，LY6C，LY6G对样品进行染色。使用流式细胞仪测量染色的细胞，并使用FlowJo软件分析数据。同样，在治疗后7天收集脑组织并研磨形成均匀的细胞悬液，以12000g离心12分钟后，收集上清液，根据ELISA试剂盒操作说明检测IL-1β和IL-12的水平。首先，通过检测(CD11b+ CD45lo)MHCII表达来分析每个治疗组中小胶质细胞活化的程度，结果如图24，与手术组相比，观察到手术+IFN-ELP(V)组和手术+IFN-ELP(V)+TMZ组的小胶质细胞MHCII表达分别增加了4.4倍和4.1倍，而手术+TMZ组几乎没有发现变化，这些数据说明IFN-ELP(V)可以激活小胶质细胞。此外如图25所示，手术+IFN-ELP(V)组的大脑中巨噬细胞(CD11b+CD45hi)的百分比增加到45.1％，而手术+IFN-ELP(V)+TMZ组的大脑中的巨噬细胞百分比提高到43.8％，而手术组和手术+TMZ组分别为17.8％和15.8％。这些数据表明，IFN-ELP(V)诱导了巨噬细胞浸润到脑组织中。为了解这些巨噬细胞的极化状态，本试验例检测了经典的M1激活标记CD86，Ly6C和MHCII的表达，如图26所示，手术+IFN-ELP(V)组和手术+IFN-ELP(V)+TMZ组与手术组相比，CD86+，Ly6C+和MHCII+巨噬细胞(CD11b+CD45hi)均有不同程度的增加。这些数据表明，IFN-ELP(V)可以刺激巨噬细胞向M1型极化，引起原位免疫反应从而抑制肿瘤复发。同时在图27中，本试验例观察到标记中性粒细胞的特异性抗体LY6G在手术+IFN-ELP(V)组和手术+IFN-ELP(V)+TMZ组也较其它两组升高。
而对脑组织细胞因子的检测进一步证实了这一结果，见图28。观察到在手术+IFN-ELP(V)组和手术+IFN-ELP(V)+TMZ组中，用来定义巨噬细胞M1型特征的白介素-1β(IL-1β)和白介素12(IL-12)水平明显升高，而其它组未发现明显变化。
试验例8
本试验例中，对各治疗组进行生物安全性方面的评估，具体如下：各治疗组的小鼠于第10天处死，收集主要组织，按照标准步骤进行H&E染色，观察形态变化。同时眶后取血，使用血液分析仪进行血液常规检查，使用自动生化分析仪检测生化指标。结果如图29，与对照组相比，各主要组织(如脑，肾，肝，脾，肺和心脏)HE切片的组织形态未观察到组织形态的明显变化，而血液化学分析和血液常规检查也表明各治疗组的血液学参数变化不大。图30为小鼠的血液分析白细胞和红细胞的变化；图31为各组小鼠凝血功能的变化示意图；图32为小鼠肝功能变化；图33为各组小鼠肝肾功能的变化情况；图34为心肌酶谱的变化情况。这些结果表明，IFN-ELP(V)与TMZ的组合不会引起明显的副作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京大学
<120> 融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用
<130> KHP201110316.5
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gly Val Pro Gly
1 5
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtgggtgt tccgggcgta ggtgtcccag gtgtgggcgt accgggcgtt ggtgttcctg 60
gtgtcggcgt gccgggc 77
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcccggca cgccgacacc aggaacacca acgcccggta cgcccacacc tgggacacct 60
acgcccggaa cacccac 77
<210> 4
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtgtgatc tgcctcagac tcattctctg ggtagtcgtc gtacgctgat gctgctggct 60
caaatgcgcc gtattagcct gttttcttgc ctgaaagatc gccacgattt tgggtttcca 120
caggaagaat ttggcaacca gttccagaaa gccgaaacaa ttccggtact gcacgagatg 180
attcaacaaa tctttaacct gttcagcacc aaagactctt ctgctgcctg ggatgaaaca 240
ctgctggaca aattctatac cgagctgtat cagcaactga acgatctgga ggcatgtgtt 300
attcagggtg ttggtgtgac tgaaactccg ctgatgaaag aggatagcat tctggcagtc 360
cgtaaatatt ttcagcgtat cacactgtat ctgaaagaga aaaaatatag cccgtgtgcc 420
tgggaagttg ttcgtgccga aatcatgcgc agctttagtc tgtctaccaa cctgcaagag 480
agcctgcgtt ctaaagaa 498
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagatagagg agtacatatg ggctgtgatc tgcctcagac tcatt 45
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttccgctga aggcagagag ccaccgccac cggatccttc tttagaacgc aggctct 57

Claims (4)

1.融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用；
在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)的氨基酸重复单元为:VGVPG，共重复30～180次；ELP(V)融合于所述IFN的C末端；
所述药物被配置成用于术中瘤腔原位给药。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有TMZ。
3.编码融合蛋白IFN-ELP(V)的核酸或含有所述核酸的生物材料在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系；
在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)的氨基酸重复单元为:VGVPG，共重复30～180次；ELP(V)融合于所述IFN的C末端；
所述药物被配置成用于术中瘤腔原位给药。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中还含有TMZ。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632682A (zh) * 2015-08-04 2017-05-10 清华大学 融合蛋白ifn-elp及其应用
CN108578709A (zh) * 2018-07-09 2018-09-28 清华大学 温敏性长效缓释药物载体及其应用
CN110179994A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 北京大学 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7709227B2 (en) * 2006-01-04 2010-05-04 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Multimeric ELP fusion constructs

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632682A (zh) * 2015-08-04 2017-05-10 清华大学 融合蛋白ifn-elp及其应用
CN108578709A (zh) * 2018-07-09 2018-09-28 清华大学 温敏性长效缓释药物载体及其应用
CN110179994A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 北京大学 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Correlation of the response of recurrent malignant gliomas treated with interferon alpha with tumor interferon alpha gene content;Jeffrey J Olson et al.;《Int J Oncol》;20040831;第419-427页 *
Enhancing Pharmacokinetics, Tumor Accumulation, and Antitumor Efficacy by Elastin-Like Polypeptide Fusion of Interferon Alpha;Jin Hu et al.;《Adv Mater》;20151202;第7320-7324页 *
One-month zero-order sustained release and tumor eradication after a single subcutaneous injection of interferon alpha fused with a body-temperature-responsive polypeptide;Zhuoran Wang et al.;《Biomater Sci》;20181218;第104-112页 *
Spatiotemporal combination of thermosensitive polypeptide fused interferon and temozolomide for post-surgical glioblastoma immunochemotherapy;Ping Liang et al.;《Biomaterials》;20201010;文献号：120447 *
Thermoresponsive and Protease-Cleavable Interferon-Polypeptide Conjugates with Spatiotemporally Programmed Two-Step Release Kinetics for Tumor Therapy;Zhuoran Wang et al.;《Adv Sci (Weinh)》;20190614;文献号：1900586 *
Two phase II trials of temozolomide with interferon-alpha2b (pegylated and non-pegylated) in patients with recurrent glioblastoma multiforme;M D Groves et al.;《Br J Cancer》;20090818;第101卷(第4期);第615页右栏第1段-第616页左栏第1段，第616页左栏第4段 *

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