CN110646621B - Chrna4在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用高脂高糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,简称NASH)小鼠揭示了CHRNA4可作为NASH的潜在治疗靶点,并证实了其拮抗剂盐酸洛贝林对NASH的治疗作用,为治疗NASH提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体是CHRNA4在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,简称NAFLD)在全世界的发病率逐年上升,已经成为儿童和成年人中最常见的的肝脏疾病之一。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,简称NASH)是非酒精性肝脏脂肪变(NAFL)进一步发展的形式,伴随有肝细胞损伤及肝脏炎症,进而可发展为肝纤维化、肝硬化,增加肝癌以及其他肝脏相关死亡的风险。NASH正在成为肝移植的最主要诱因,并且尚无有效药物。因此,探索潜在的治疗靶点,开发有效的药物治疗手段成为当务之急。
烟碱型乙酰胆碱受体(non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors,简称nAChR)是一类配体门控离子通道,广泛分布于全身的神经和非神经细胞中。nAChR通常以5个亚基组成同源或异源五聚体的形式存在,然而目前,人们对nAChR在非神经系统中的病理生理学功能了解甚少。
CHRNA4是构成nAChR的最常见的亚基之一,其在神经系统中的功能已有广泛研究。美国FDA已有关于CHRNA4拮抗剂洛贝林治疗冰毒依赖的临床试验(NCT00439504)。CHRNA4是注意力缺陷/多动障碍的重要影响因素,有临床研究将其作为注意力缺失/多动障碍的诊断和治疗靶点。同时,CHRNA4被认为是影响尼古丁依赖的关键基因,CHRNA4的拮抗剂洛贝林也曾被广泛应用于治疗烟瘾。在中国,盐酸洛贝林作为一种呼吸兴奋剂,临床上主要用于各种原因引起的中枢性呼吸抑制,常用于新生儿窒患,一氧化碳中毒、阿片中毒等。但是CHRNA4在非神经系统中的功能以及非神经系统疾病中的应用尚无深入研究。
发明内容
解决的技术问题:本发明针对目前NASH临床治疗手段不足的问题,提供了CHRNA4作为靶点在筛选非酒精性脂肪性肝炎治疗药物、制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物或制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
CHRNA4在筛选非酒精性脂肪性肝炎治疗药物、制备非酒精性脂肪性肝炎治疗药物或制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用。
进一步地,所述药物可以为小分子化合物,抗体药,蛋白,核酸分子,多肽,脂类,碳水化合物。
CHRNA4拮抗剂在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
进一步地,所述CHRNA4拮抗剂为盐酸洛贝林、苄索氯铵、Dihydro-β-erythroidine、亚硝基降烟碱、异戊巴比妥、苯巴比妥、金雀花碱或美加明。
有益效果:本发明首次揭示了靶向抑制CHRNA4是NASH潜在的治疗手段,并证实盐酸洛贝林能够有效缓解NASH,减轻肝脏脂质沉积、炎症及纤维化,从而可用于NASH治疗。
附图说明
图1为实施例1中利用qPCR检测HFD和HFFD模型中CHRNA4和CHRNB2的基因表达水平。
图2为实施例1中利用免疫荧光检测人肝脏样本中CHRNA4的蛋白表达水平。
图3为实施例1中肝脏过表达CHRNA4的HFD模型小鼠体内ALT和AST水平。
图4为实施例1中肝脏过表达CHRNA4的HFFD模型小鼠体内ALT和AST水平。
图5实施例1中肝脏过表达CHRNA4的HFD模型的苏木素-伊红染色和天狼猩红染色实验结果。
图6为实施例1中肝脏过表达CHRNA4的HFFD模型的苏木素-伊红染色和天狼猩红染色实验结果。
图7为实施例1中肝实质细胞过表达CHRNA4之后qPCR检测的结果。
图8为实施例1中肝实质细胞过表达CHRNA4之后刺激巨噬细胞迁移的小室迁移实验结果。
图9为实施例2中给药期间小鼠的体重、摄食和饮水的变化情况。
图10为实施例2中肝脏内炎性因子基因及胶原合成相关基因表达的qPCR检测结果。
图11为实施例2中苏木素-伊红染色实验结果和天狼猩红染色实验结果。
图12为实施例2中给药结束后小鼠血液ALT和AST测试结果。
图13为实施例2中给药结束后小鼠肝脏内甘油三酯含量。
图14为实施例2中Western Blot方法检测肝星状细胞标志物α-SMA的表达。
具体实施方式
发明人发现,nAChR家族的CHRNA4亚基能够在肝实质细胞中表达。发明人的研究首次揭示了,以高脂高糖饮食诱导的NASH小鼠中(存在明显的肝细胞损伤和肝脏炎症),肝脏的CHRNA4与CHRNB2的表达水平与单纯高脂诱导(未存在明显的肝细胞损伤和肝脏炎症)的小鼠相比显著升高,并且CHRNA4可能与CHRNB2亚基以(α4)2(β2)3五聚体的形式发挥功能。更重要的是,在NASH病人肝脏中CHRNA4亚基的表达水平明显高于健康人。在高脂喂养的野生型小鼠肝脏中过表达CHRNA4能够显著加重肝脏炎症和纤维化。进一步的研究显示,肝实质细胞内CHRNA4过表达之后,炎性因子和Toll样受体的表达随之明显上升,而CHRNA4表达量下降之后,炎性因子和Toll样受体家族表达亦随之显著下降。同时,过表达CHRNA4的肝实质细胞更容易募集骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,简称BMDM),提示CHRNA4在激活与诱发肝脏炎症中起了关键的调控作用。最重要的是,CHRNA4的拮抗剂盐酸洛贝林能够有效抑制肝脏脂质沉积、炎症反应及星状细胞的活化和细胞外基质中胶原蛋白的表达。因此,靶向抑制CHRNA4是NASH的潜在的治疗手段。
盐酸洛贝林作为一种呼吸兴奋剂,临床上主要用于各种原因引起的中枢性呼吸抑制,常用于新生儿窒患,一氧化碳中毒、阿片中毒等,在临床试验中也用于多种神经性疾病。根据已有的研究,盐酸洛贝林能够拮抗nAChR家族中的(α4)2(β2)3亚型。经过本发明的实施例2证明,盐酸洛贝林能够有效缓解NASH,减轻肝脏脂质沉积、炎症反应及肝纤维化。目前尚未有盐酸洛贝林针对NASH的治疗作用的研究被公开。
下面就本发明提供的CHRNA4在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用做详细说明。以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
CHRNA4是NASH的潜在治疗靶点
1、高脂喂养(HFD)以及高脂高糖喂养(HFFD)模型的构建:5周龄雄性C57BL/6J小鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)在标准SPF环境(无特殊病原体,恒温25℃,12小时间隔照明)中饲养。开始造模时小鼠分为两组,一组小鼠用高脂喂养(HFD)(高脂饲料购买自美国Research Diet公司,货号D12492),另一组小鼠用高脂饲料以及含果糖的水(2.31g果糖/100mL饮用水)喂养(HFFD),自由摄食,喂养21周之后解剖小鼠,取材并检测。
总RNA提取及qPCR检测:取适量上述HFD及HFFD模型小鼠肝脏组织于匀浆管,管内有少量陶珠,加1mL Trizol,在组织研磨机上匀浆1分钟;充分研磨之后每管加入三氯甲烷0.2mL,充分混匀后室温静置3分钟,以12000g、4℃的条件离心15分钟;离心之后取上清,转移到新的无菌无酶离心管中,加入等体积异丙醇,充分混匀后室温静置10分钟,以10000g、4℃的条件离心10分钟;弃去上清,向沉淀中加入1mL 75%的乙醇,充分混匀后以7500g、4℃的条件离心5分钟,弃去上清,室温挥干残留溶剂,之后加入适量DEPC处理水,60℃溶解。充分溶解之后测总RNA浓度,而后逆转录RNA为cDNA(逆转录操作按照逆转录试剂盒内提供的方法)。cDNA制备后通过荧光定量PCR方法检测目的基因表达。
鼠源Chrna4引物序列:
Antisense 5’-CTCCTGCTGCTCTTAGGGAC-3’(SEQ ID NO.1)
Sense 5’-CATCTGGTTTTTCTCATCCACATCA-3’(SEQ ID NO.2);
鼠源Chrnb2引物序列:
Antisense 5’-GTGCTCCAACTCTATGGC-3’(SEQ ID NO.3)
Sense 5’-CGCTCGTGCACACTGATG-3’(SEQ ID NO.4)。
如图1所示,相对于HFD诱导的小鼠,HFFD诱发的NASH小鼠的肝脏中,CHRNA4和CHRNB2的表达量更高,这说明了CHRNA4和CHRNB2的表达水平伴随着NASH的疾病发展而上升。
2、人肝脏组织切片免疫荧光染色:取健康人和NASH患者的肝脏组织石蜡切片,60℃脱蜡30分钟,冷却至室温。切片依次在二甲苯中浸泡5分钟×3次、100%乙醇3分钟×2次、95%乙醇3分钟×2次、70%乙醇3分钟×1次、蒸馏水3分钟×1次。转移至PBS中浸泡2分钟,转移至200mL 1×抗原修复液(pH 6.0)中,盖紧孵育槽盖子之后微波炉加热(设置如下:800w 3分钟、200w 5分钟、检查修复液体积,确保组织浸泡在液面以下、800w 10秒,200w5分钟)。打开盖子冷却15分钟至室温。切片置于蒸馏水中3分钟,然后置于PBS中3分钟。组织用抗体稀释液(DAKO,货号S3022)室温浸润30分钟,每块组织大概准备50μL封闭液即可。封闭结束后吸掉封闭液,组织上滴加用封闭液稀释的一抗(CHRNA4抗体,货号ab41172,购自美国Abcam公司),4℃孵育过夜。次日切片在PBS中洗5分钟×3次,尽量擦干组织周围的液体,在避光条件下滴加封闭液稀释的二抗(荧光二抗Alexa Fluor 568,货号A11011,购自美国Invitrogen公司),室温避光孵育60分钟。切片用PBS洗2分钟×3次,擦干多余的PBS,用DAKO荧光封片剂封片。荧光显微镜下拍照,图片比例尺为50μm。
如图2所示,相对于健康人(Healthy)的肝脏,NASH患者(NASH)的肝脏中CHRNA4的蛋白表达水平更高,这说明了CHRNA4的表达水平伴随着NASH的疾病发展而上升。
3、在HFD和HFFD模型小鼠肝脏内过表达CHRNA4:8周龄雄性C57BL/6J小鼠在标准SPF环境(无特殊病原体,恒温25℃,12小时间隔照明)中饲养,按上述方法构建HFD和HFFD模型。HFD造模时同时尾静脉注射等量的包裹了对照质粒的腺病毒以及包裹了人源CHRNA4过表达质粒的腺病毒。注射病毒之后两周解剖小鼠,取材并检测。HFFD造模3周之后以相同的条件注射等量的包裹了对照质粒的腺病毒以及包裹了人源CHRNA4过表达质粒的腺病毒。注射病毒之后两周解剖小鼠,取材并检测。
(1)谷丙转氨酶及谷草转氨酶活力的检测:取注射CHRNA4过表达病毒和对照病毒的HFD模型小鼠血清、注射CHRNA4过表达病毒和对照病毒的HFFD模型小鼠血清,每个反应孔中加20μL预热到37℃的基质液,并加5μL血清,混匀,对照孔中加20μL预热到37℃的基质液。整个酶标板置于恒温箱中37℃孵育30分钟,然后取出,反应孔及对照孔中加20μL苯肼溶液,之后对照孔中加5μL血清,混匀。整个酶标板置于恒温箱中37℃孵育20分钟,取出,加入200μL的浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液,混匀之后室温孵育15分钟,酶标仪上以510纳米波长检测吸光度。
标准曲线的绘制:每个反应孔中加梯度体积的基质液(0、2、4、6、8、10μL),等体积20μL的苯肼溶液,等体积5μL的磷酸盐缓冲液,梯度体积的丙酮酸钠(20、18、16、14、12、10μL),混匀,室温静置15分钟,以510纳米波长检测吸光度,并绘制标准曲线。结合标准曲线计算样品血清中谷丙转氨酶活力。
谷草转氨酶活力检测方法类似于谷丙转氨酶,具体参考试剂盒所提供之说明书。
如图3和图4所示,通过qPCR检测可知,在HFD和HFFD模型中肝脏内过表达CHRNA4成功;利用ALT和AST检测试剂盒检测可知,在HFD和HFFD模型下,CHRNA4过表达促进小鼠体内ALT和AST水平显著升高。血液中ALT和AST水平是肝脏损伤的重要指标,实验结果说明肝脏内CHRNA4表达水平的升高会导致肝脏损伤。
(2)苏木素-伊红染色及NAS评分标准:取注射CHRNA4过表达病毒或对照病毒的HFD模型小鼠肝脏,以及注射CHRNA4过表达病毒或对照病毒的HFFD模型小鼠的肝脏组织制备石蜡切片,脱蜡方法与人肝脏组织切片免疫荧光染色中脱蜡方法相同。脱蜡之后切片于苏木素中浸染2.5分钟,流水下漂洗2分钟洗去多余染液,然后在1%盐酸水溶液中浸三下分化,然后在1%氨水水溶液中浸三下返蓝,之后再蒸馏水中浸泡3分钟,80%乙醇溶液中浸泡3分钟,然后在伊红染料中浸染3分钟,而后在80%乙醇,95%乙醇,100%乙醇和三个二甲苯中依次浸泡3分钟,中性树脂封片。在数字病理切片扫描仪下扫描之后进行NAS评分(NASscore)。图片比例尺为50μm。
NAS评分标准参考《中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》,即(1)肝细胞脂肪变性:0分(<5%),1分(5%-33%),2分(34%-66%),3分(>66%);(2)小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶):0分(无),1分(<2个),2分(2-4个),3分(>4个);(3)肝细胞气球样变:0分(无),1分(少见),2分(多见)。
(3)天狼猩红染色及定量:取注射CHRNA4过表达病毒(对照病毒)的HFD模型小鼠肝脏组织石蜡切片、注射CHRNA4过表达病毒(对照病毒)的HFFD模型小鼠的肝脏组织石蜡切片,依次浸泡在二甲苯中20分钟×2次、无水乙醇中5分钟×2次、75%乙醇中5分钟×1次,流水漂洗1分钟,天狼猩红染料中浸染10分钟,无水乙醇中浸两下,洗去多余染料之后干净的二甲苯浸泡5分钟,中性树脂封片。切片在数字病理切片扫描仪上扫描并导出成图片之后,利用ImageJ 5.0计算阳性区域(胶原纤维的染色区域)占肝组织总面积(Percentage ofpositive area)的百分比,从而可以量化对比天狼猩红染色程度。图片比例尺为50μm。
如图5和图6所示,相对于对照病毒组(Ad-GFP),CHRNA4过表达病毒组(Ad-Chrna4)中CHRNA4在肝脏的过表达会使肝脏脂肪变性降低,而炎性浸润、气球样变和胶原沉积增加。也说明了CHRNA4过表达会推动NASH发展
4、肝实质细胞内过表达CHRNA4:肝实质细胞AML12在Lipo2000转染试剂的帮助下转染CHRNA4过表达质粒Chrna4-Flag(购买自美国OriGene公司,货号MR209587)及其对照质粒Flag(购买自美国OriGene公司,货号PS100001),同时转染能够特异性敲低CHRNA4的小干扰RNA siChrna4(购买自美国Dharmcon公司,货号M-065416-01)及其对照序列si-GLO(购买自美国Dharmcon公司,货号D-001630-01)。具体分组为:Ctrl组,转染对照质粒Flag;sictrl组,转染Chrna4-Flag同时转染对照小干扰RNA si-GLO;siChrna4组,转染Chrna4-Flag和siChrna4。转染24h之后提取细胞总RNA并且qPCR检测相关基因。
如图7所示,在肝实质细胞中,CHRNA4过表达之后细胞炎性因子及Toll样受体表达显著上升,而CHRNA4表达降低之后,炎性因子及Toll样受体表达亦随之显著下降。说明CHRNA4调控肝实质细胞炎症通路。
鼠源Tlr2引物序列:
Antisense 5’-CATCACCGGTCAGAAAACAA-3’(SEQ ID NO.5)
Sense 5’-ACCAAGATCCAGAAGAGCCA-3’(SEQ ID NO.6)
鼠源Tlr3引物序列:
Antisense 5’-ATGATACAGGGATTGCACCC-3’(SEQ ID NO.7)
Sense 5’-ATAGGGACAAAAGTCCCCCA-3’(SEQ ID NO.8)
鼠源Tnf引物序列:
Antisense 5’-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3’(SEQ ID NO.9)
Sense 5’-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3’(SEQ ID NO.10)
鼠源Cxcl1引物序列:
Antisense 5’-TGCACCCAAACCGAAGTC-3’(SEQ ID NO.11)
Sense 5’-GTCAGAAGCCAGCGTTCACC-3’(SEQ ID NO.12)
鼠源Ifna2引物序列:
Antisense 5’-AGCAGATCCAGAAGGCTCAA-3’(SEQ ID NO.13)
Sense 5’-CATTCCAAGCAGCAGATGAA-3’(SEQ ID NO.14)
5、肝实质细胞过表达CHRNA4之后与骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow derivedmacrophages,简称BMDM)共培养
(1)按上述方法进行肝实质细胞转染CHRNA4过表达质粒和对照质粒。
(2)BMDM分离:解剖野生型雄性C57BL/6J小鼠,用预冷的含有10%胎牛血清和1%抗生素的RMPI-1640培养基从小鼠胫骨和股骨中冲出细胞。冲出的细胞在含有20%胎牛血清,10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(购买自美国PeproTech公司,货号315-02)和1%抗生素的RMPI-1640培养基,培养4-5天。保持贴壁的BMDM细胞可用于接下来的实验。
(3)肝实质细胞和BMDM的共培养,以及BMDM迁移实验:2×105个BMDM种在24孔迁移小室的上层中继续培养12h。之后将迁移小室转移到24孔板中,24孔板中已经种植了转染了过表达CHRNA4质粒或者对照质粒的肝实质细胞AML12。BMDM和AML12共培养2h。之后迁移小室内的BMDM用4%多聚甲醛固定30min,然后用0.1%的结晶紫染料染色2h。染色之后流水冲洗掉多余的染料,用棉球擦去迁移小室上层的细胞,在显微镜下拍摄迁移到下层的BMDM细胞。
如图8所示,相对于转染对照质粒的肝实质细胞,过表达CHRNA4的肝实质细胞与BMDM共培养,能刺激更多的BMDM细胞迁移。说明CHRNA4促进肝脏招募炎性细胞。
以上结果说明,CHRNA4促进肝脏炎症。
实施例2
盐酸洛贝林(Lobeline Hydrochloride)对NASH的治疗作用
HFFD模型的构建以及盐酸洛贝林给药方案:5周龄雄性C57BL/6J小鼠在标准SPF环境(无特殊病原体,恒温25℃,12小时间隔照明)中饲养。造模时用高脂饲料以及含果糖的水(2.31g果糖/100mL饮用水)喂养(HFFD),自由摄食,喂养10周之后分组,分为溶剂对照组(Vehicle)和盐酸洛贝林给药组(Lobeline)(购买自美国Apexbio公司,货号B6586)。每日小鼠腹腔注射浓度为2mg/mL的盐酸洛贝林溶液(盐酸洛贝林固体粉末用生理盐水常温溶解为无色透明溶液),每10g体重注射0.1mL盐酸洛贝林溶液,给药剂量相当于每千克体重10mg盐酸洛贝林。每24小时给药一次,连续给药6周。给药期间保持HFFD饮食。造模和给药期间每周记录小鼠体重,摄食量及饮水量。给药结束后小鼠解剖,取材并检测。
如图9所示,小鼠给药期间体重,摄食和饮水正常,盐酸洛贝林没有明显改变小鼠体重和饮食,说明盐酸洛贝林没有明显副作用。
1、总RNA提取及qPCR检测,操作方法同实施例1。
利用qPCR检测肝脏内炎性因子基因及胶原合成相关基因的表达。结果如图10所示,盐酸洛贝林显著降低多种趋化因子,白介素IL-18和胶原蛋白的基因表达,说明盐酸洛贝林可以缓解肝脏炎症和胶原沉积。
鼠源Cxcl9引物序列:
Antisense 5’-GGAGTTCGAGGAACCCTAGTG-3’(SEQ ID NO.15)
Sense 5’-GGGATTTGTAGTGGATCGTGC-3’(SEQ ID NO.16)
鼠源Cxcl10引物序列:
Antisense 5’-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3’(SEQ ID NO.17)
Sense 5’-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3’(SEQ ID NO.18)
鼠源Il18引物序列:
Antisense 5’-CCTCGAACACAGGCTGTCTT-3’(SEQ ID NO.19)
Sense 5’-CCTGAAGAAAATGGAGACCTGGA-3’(SEQ ID NO.20)
鼠源Ccl5引物序列:
Antisense 5’-GCTGCTTTGCCTACCTCTCC-3’(SEQ ID NO.21)
Sense 5’-TCGAGTGACAAACACGACTGC-3’(SEQ ID NO.22)
鼠源Col1a1引物序列:
Antisense 5’-ACATGTTCAGCTTTGTGGACC-3’(SEQ ID NO.23)
Sense 5’-TAGGCCATTGTGTATGCAGC-3’(SEQ ID NO.24)。
2、苏木素-伊红染色和天狼猩红染色,操作方法同实施例1。
通过对小鼠肝脏切片进行苏木素-伊红染色和天狼猩红染色,观察盐酸洛贝林对小鼠肝脏病理状态的影响。如图11所示,盐酸洛贝林明显减轻肝脏脂肪变性、炎性浸润和胶原沉积,起到保护肝脏的作用。
3、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力的检测,操作方法同实施例1。
利用试剂盒检测给药结束后小鼠血液ALT和AST。如图12所示,盐酸洛贝林给药组的ALT和AST相较于溶剂组明显下降,说明盐酸洛贝林可以起到保护肝脏,减轻肝损伤的作用。
4、肝脏甘油三酯含量检测:称重研磨管,记录每个管子的重量。放入肝脏组织,再次称重管子,即可得到肝脏组织重量。按重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入9倍体积的无水乙醇,组织研磨机上研磨2分钟,以2500转/分钟,4℃离心15分钟,转移上清至新的管子,即为待检测样品。酶标板孔中分别加入2.5μL蒸馏水(空白孔),2.5μL标准品(标准孔)和待检测样品,然后每个孔中都加入250μL工作液,混匀,37℃孵育10分钟,在510纳米波长下检测吸光度,并参考产品说明书中提供的公式计算待检测样品中甘油三酯浓度。
如图13所示,盐酸洛贝林给药组的小鼠肝脏内甘油三酯含量相较于溶剂组明显下降,说明盐酸洛贝林能够减缓肝脏脂肪堆积。
5、Western Blot方法检测α-SMA在肝脏中的表达:小鼠肝脏样本称重,并按组织块重量(mg):裂解液体积(μL)=1:10比例加裂解液,于组织研磨仪上充分研磨之后,以12000g、4℃离心15分钟,转移上清至新的管子中。酶标板每孔中加入100μL蛋白定量工作液以及10μL待测样品蛋白上清或者标准品,混匀后37℃孵育30分钟,而后在562纳米波长下检测吸光度,绘制标准曲线,并由此计算待测样品蛋白浓度。加入适量Loading Buffer,混匀,99℃加热10分钟即可制成蛋白样品。配置适宜浓度的丙烯酰胺凝胶,准备好电泳缓冲液和湿转缓冲液,按一般操作进行电泳和湿转。湿转结束后切下目的蛋白所在区域的膜,于5%脱脂奶粉中室温封闭1小时,而后在用5%脱脂奶粉1:1000倍稀释的一抗溶液中,4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜5分钟×3次,在用5%脱脂奶粉1:3000稀释的二抗中室温孵育1.5小时,TBST缓冲液洗膜5分钟×3次,避光条件下在化学发光工作液中孵育5分钟,曝光。
如图14所示,盐酸洛贝林组小鼠肝脏中α-SMA的表达明显较低,说明盐酸洛贝林可以抑制肝脏星状细胞激活,缓解肝脏炎症。
以上结果表明,盐酸洛贝林可以减降低脂肪变性,缓解肝脏炎症,抑制胶原沉积,起到保护肝脏的作用。
由上述实施例可知,CHRNA4能够增加肝脏炎症和肝损伤从而促进NASH发展,是NASH治疗的新靶点,而CHRNA4拮抗剂盐酸洛贝林可以有效保护肝脏,减缓脂肪变性、肝脏炎症和胶原沉积。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> CHRNA4在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用
<130> 20190930
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctgctgc tcttagggac 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catctggttt ttctcatcca catca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgctccaac tctatggc 18
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<212> DNA
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cgctcgtgca cactgatg 18
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<212> DNA
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catcaccggt cagaaaacaa 20
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accaagatcc agaagagcca 20
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atgatacagg gattgcaccc 20
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<212> DNA
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<212> DNA
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acggcatgga tctcaaagac 20
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agatagcaaa tcggctgacg 20
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tgcacccaaa ccgaagtc 18
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gtcagaagcc agcgttcacc 20
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agcagatcca gaaggctcaa 20
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cattccaagc agcagatgaa 20
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ggctcgcagg gatgatttca a 21
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taggccattg tgtatgcagc 20
Claims (4)
1. CHRNA4在筛选非酒精性脂肪性肝炎治疗药物或制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物可以为小分子化合物、抗体药、蛋白、核酸分子、多肽、脂类或碳水化合物。
3. CHRNA4拮抗剂在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述CHRNA4拮抗剂为盐酸洛贝林、苄索氯铵、Dihydro-β-erythroidine、亚硝基降烟碱、异戊巴比妥、苯巴比妥、金雀花碱或美加明。
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