CN104125836A - 改善医疗治疗的方法 - Google Patents

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朱迪思·坎皮斯
马可·德马利亚
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Abstract

本文提供了通过给予试剂来增加医疗治疗效力的方法，所述试剂抑制可被给予个体的医疗治疗诱导的生物损伤应答。在某些实施方案中，提供了给予抗衰老细胞试剂的方法，所述抗衰老细胞试剂抑制生物应答，包括医疗治疗引起的细胞衰老。

Description

改善医疗治疗的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2011年12月13日递交的美国临时申请第61,570,166号和2012年8月23日递交的美国临时申请第61/692,680号的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质拷贝提供，并在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为200201_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件大小为30KB，于2012年12月13日生成，并通过EFS-Web电子递交。
政府利益申明
本申请根据国立卫生研究院授予的第AG025901、AG09909和AG017242号拨款，在政府资助下进行。政府享有本申请的某些权益。
发明背景
技术领域
本文提供了增加用于治疗疾病如癌症、HIV/AIDS和自身免疫疾病的各种医疗治疗效力的方法。这些方法中使用的试剂包括抑制生物损伤应答的试剂。
相关领域的描述
每年有数十万患者被给予细胞毒性和遗传毒性治疗，以治疗各种疾病，最主要是癌症。癌症包括大量的疾病，并影响全球范围内约四分之一的个体。在美国，癌症是第二大主要死因，占所有死亡的23％。虽然诊断的所有癌症的5年相对存活率为约68％，不同癌症类型的治疗及其成功率存在差异。尽管化疗和放疗旨在靶向癌症细胞，但治疗不利地影响正常细胞和组织的程度可使得癌症治疗的治疗效应得到极大折中。
给予感染HIV且已发展AIDS的男性和女性的高活性抗逆转录病毒治疗有助于延长寿命并改善那些感染患者的整体健康。然而，该治疗也可不利地影响正常细胞生理。
发明概述
简而言之，本文提供了通过给予抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答(包括细胞衰老)的试剂，增加医疗治疗效力的方法。本文还提供了以下实施方案。
在一个实施方案中，本文提供了增加个体中的医疗治疗效力的方法，所述方法包括将抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂给予个体。在具体的实施方案中，增加个体中的医疗治疗效力的方法包括将抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂给予个体，其中所述试剂在给予医疗治疗之前、之后或同时给予。在某些实施方案中，医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。在另一具体的实施方案中，提供了增加个体中的医疗治疗效力的方法，包括将抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂给予个体，其中所述试剂在给予医疗治疗之前、之后或同时给予，其中所述试剂选自(a)选择性破坏一种或多种衰老细胞或者促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏的试剂；和(b)抑制衰老细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌的试剂。在具体的实施方案中，在给予医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少30、至少60或至少90天，将试剂给予个体。在具体的实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞或者促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。在另一实施方案中，在给予医疗治疗之前，将试剂给予个体。在具体的实施方案中，在给予医疗治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周，将试剂给予个体。在另一具体的实施方案中，将试剂与给予的医疗治疗的至少一部分同时给予。在上述和本文的实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂抑制衰老细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌。在具体的实施方案中，试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。在某些实施方案中，医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。在另一具体的实施方案中，医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。在某些实施方案中，个体患有癌症、癌症在缓解、存在发展癌症复发的风险，或存在发展癌症的风险，并且其中所述医疗治疗包括抗癌症治疗。在更具体的实施方案中，癌症包括实体瘤，并且在其他具体的实施方案中，癌症包括液体肿瘤。在上述和本文方法的其他具体的实施方案中，癌症为转移性癌症。在另一具体的实施方案中，当个体患有癌症且已接受了或将接受干细胞移植，并且其中医疗治疗为高剂量化疗或高剂量放疗或其组合时，可使用上述和本文的增加医疗治疗效力的方法。在具体的实施方案中，干细胞移植为自体或异体干细胞移植。
在上述和本文方法的另一具体实施方案中，抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗，其中在一个实施方案中，HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。在上述和本文方法的另一具体实施方案中，个体患有心血管疾病或存在发展心血管疾病的风险，并且医疗治疗为血管紧张素治疗。在上文和本文方法的又一具体实施方案中，个体患有糖尿病，且医疗治疗为胰岛素治疗。
在一个实施方案中，提供了增加个体中的医疗治疗效力的方法，包括(a)给予个体医疗治疗，所述医疗治疗诱导个体的一种或多种细胞的衰老；然后(b)给予个体抗衰老细胞试剂，所述试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞，或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。在具体的实施方案中，在给予医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少10天、至少30天、至少60天或至少90天，将试剂给予个体。在具体的实施方案中，试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。在某些实施方案中，医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。在某些实施方案中，医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。在具体的实施方案中，个体患有癌症、癌症在缓解、存在发展癌症复发的风险，或存在发展癌症的风险，并且其中所述医疗治疗包括抗癌症治疗。在另一具体的实施方案中，癌症包括实体瘤，且在另一具体的实施方案中，癌症为液体肿瘤。在其他具体的实施方案中，癌症为转移性癌症。在另一具体的实施方案中，当个体患有癌症且已接受过或将接受干细胞移植，并且其中所述医疗治疗为高剂量化疗或高剂量放疗或其组合时，可使用上述和本文的增加医疗治疗效力的方法。在具体的实施方案中，干细胞移植为自体或异体干细胞移植。
在上述和本文方法的另一具体的实施方案中，抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗，其中在一个实施方案中，HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。在上述和本文方法的另一具体的实施方案中，个体患有心血管疾病或存在发展心血管疾病的风险，并且医疗治疗为血管紧张素。在上述和本文方法的另一具体的实施方案中，个体患有糖尿病，且所述医疗治疗为胰岛素治疗。
在另一实施方案中，提供了抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂在增加医疗治疗效力中的用途，其中所述试剂适于在给予医疗治疗之前、之后同时给予。在具体的实施方案中，试剂适于在给予医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天,、至少7天、至少10天、至少30天、至少60天或至少90天给药。在一个实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。在另一具体的实施方案中，试剂在给予医疗治疗之前给药。在另一实施方案中，试剂在给予医疗治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周给药。在另一具体的实施方案中，试剂与给予的医疗治疗的至少一部分同时给予。在某些实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂抑制衰老细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌。在某些实施方案中，试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。在另一具体的实施方案中，医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。在一个实施方案中，医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。在另一实施方案中，医疗治疗为抗癌症治疗。在另一实施方案中，癌症包括实体瘤或液体肿瘤，其在某些实施方案中，为转移性癌症。在其他实施方案中，抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗。在另一实施方案中，HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。在具体的实施方案中，医疗治疗为高剂量化疗或高剂量放疗或其组合，其在给予干细胞移植之前或之后给予。在另一实施方案中，干细胞移植选自(a)自体干细胞移植和(b)异体干细胞移植。在又一实施方案中，试剂可用于治疗或预防心血管疾病，其中所述医疗治疗为血管紧张素。在另一实施方案中，试剂可用于治疗或预防糖尿病，其中所述医疗治疗为胰岛素治疗。
本文还提供了抗衰老细胞试剂在增加医疗治疗效力中的用途，其中所述医疗治疗诱导一种或多种细胞的衰老，并且其中所述试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞，或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。
在下文的描述中，叙述了某些具体的细节，以提供对各种实施方案的完整理解。然而，本领域技术人员应当理解本发明可不使用这些细节来实施。在其他情形下，未详细显示或描述熟知的结构以避免不必要地掩盖实施方案的说明。除非上下文另有要求，在整个说明书和所附的权利要求中，词语“包括(comprise)”及其变型如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应理解为开放式、包括性含义，即“包括但不限于”。另外，术语“包括(comprising)”(及相关术语如“包括(comprise)”或“包括(comprises)”或“具有(having)”或“包括(including)”)不试图排除，在其他的某些实施方案中，例如，本文描述的物质、组合物、方法或过程等的任何组分的实施方案，可由所述的特征“组成”或“基本上由其组成”。本文提供的标题仅为方便目的，并且不解释要求保护的实施方案的范围或含义。
在本说明书全篇中，提及“一个实施方案”或“实施方案”指结合实施方案描述的具体特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，本说明书全篇各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”未必都指相同的实施方案。此外，具体的特征、结构或特性可以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。
另外，如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“非人的动物”可指一只或多只非人的动物，或众多的该动物，并且提及“细胞”或“所述细胞”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种细胞及其等同物(例如，众多细胞)等。当描述或要求保护方法步骤，并且步骤被描述为以特定顺序发生时，描述第一步骤发生(或被执行)在第二步骤“之前”(即，在前面)，与改写为第二步骤发生(或被执行)在第一步骤“之后”状态时的含义相同。术语“约”在提及数字或数值范围时指提及的数字或数值范围为在实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，因此该数字或数值范围可在所述的数字或数值范围的1％至15％间变化。还应当注意术语“或”通常以其包括“和/或”的含义采用，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“至少一种”在提及至少一种化合物或至少一种组分时，与术语“一种或多种”具有相同的含义和理解。
附图说明
图1A和1B显示了辐照诱导p16-3MR转基因小鼠中的持续性衰老细胞，并且GCV治疗引起衰老细胞消除和几种SASP(衰老相关分泌表型)生物标志的水平降低。将转基因p16-3MR小鼠模拟辐照(对照)或辐照(IR)(7Gy全身X射线)，关养3个月，然后用本文所述的媒介物或GCV处理。分离了不同的组织(这里显示的结果为肺组织的)并测量了生物发光(A)以及编码p16INK4a、mRFP、IL-6和MMP-3蛋白的mRNA的丰度。结果显示为将对照水平设定为1后的任意单位(AU)。
图2A-2C显示了p16-3MR转基因小鼠中辐照诱导的衰老细胞促进原发性和转移性肿瘤生长。将转基因p16-3MR小鼠模拟辐照(对照)或辐照(IR)。3个月后，用媒介物(IR)或GCV(IR+GCV)处理辐照的小鼠，然后用表达fLUC的B16黑素瘤细胞注入尾静脉中。15天后，测量B16黑素瘤细胞的生物发光。
图3显示了来自图2A-2C的小鼠的B16黑素瘤细胞的全身发光测量。第15-16天时，辐照的小鼠为濒死状态，并将其处死。
图4A-4C表明消除衰老细胞可抑制转移的发展。将图2的p16-3MR转基因小鼠再跟踪3天(即第18天)。用GCV处理的辐照的小鼠(其中衰老细胞得到消除)最终在肺中发展出原发性肿瘤(A)。但是，尽管在肺中存在原发性肿瘤，脂肪组织和肝组织保持相对的无转移(C)。相反，未以GCV处理的辐照的小鼠(其保留了衰老细胞)在肝组织和脂肪组织(B)中显示了转移性肿瘤。
图5A-5B表明用阿霉素处理诱导p16-3MR转基因小鼠中的持续性衰老细胞。将转基因p16-3MR小鼠用媒介物(对照)模拟处理，或用10mg/kg的阿霉素(DOXO)处理。分离了不同的组织(肝、心脏、肺、肾和脾)，并测量了编码mRFP(A)和p16INK4a(B)的mRNA的丰度(标准化为肌动蛋白)。
图6表明阿霉素诱导p16-3MR转基因小鼠中的持续性衰老细胞，并且GCV治疗引起衰老细胞消除并降低SASP生物标志物、p16INK4和mRFP水平。分离了皮肤活检样品，并测量了p16INK4和mRFP的丰度(标准化为肌动蛋白)。结果显示为将对照水平设定为1后的任意单位(AU)。
图7显示了p16-3MR转基因小鼠中阿霉素治疗促进的原发性肿瘤生长诱导的衰老细胞。将转基因p16-3MR小鼠用媒介物处理(对照)或用阿霉素(10mg/kg)处理。7天后，将阿霉素处理的小鼠用媒介物(DOXO)或GCV(DOXO+GCV)模拟处理，然后皮下注射表达fLUC的B16黑素瘤细胞。12天后，测量B16黑素瘤细胞的生物发光。
图8表明阿霉素处理的p16-3MR转基因小鼠中衰老细胞的清除能减少肿瘤大小。用媒介物处理(对照)转基因p16-3MR小鼠，或用阿霉素(10mg/kg)处理。7天后，用媒介物(DOXO)或GCV(DOXO+GCV)模拟处理阿霉素处理的小鼠，然后皮下注射表达fLUC的B16黑素瘤细胞。12天后，测量原发性肿瘤直径。
图9表明相比未清除或减少衰老细胞的小鼠，衰老细胞的消除抑制K-Ras诱导的肺肿瘤的多样性。
图10A-10D提供了衰老细胞中选择性表达的示例性转基因——含有p16Ink4a启动子-FKBP-半胱天冬酶-IRES-GFP核酸构建体的pBLUESCRIPT II KS载体的核酸序列表(SEQ ID NO:1)。
图11A-11F提供了图10的标记了不同的载体组分和构建体组分的核酸序列表。
图12A-12E表明皮质酮和皮质醇部分地抑制SASP。(A)在含有所示浓度的皮质酮或最高浓度的DMSO(媒介物对照)的培养基加10％血清中，孵育以10Gy(Sen(XRA))经X射线辐照的衰老HCA2纤维母细胞。在辐照后立即给予细胞皮质酮或DMSO，并于6天后进行分析。在无皮质酮以产生条件培养基的无血清培养基中洗涤并孵育细胞。通过ELISA分析来自衰老前的(Pre)和对照或皮质酮处理的Sen(XRA)细胞的条件培养基的IL-6。(B)处理细胞，并产生条件培养基，并按(A)中所述(除了使用所示浓度的皮质醇外)进行分析。(C)从衰老前(PRE)的或按(A)中所述以DMSO、皮质酮(50nM)或皮质醇(100nM)处理的衰老(XRA)细胞中收集条件培养基。通过抗体检测分析条件培养基。将来自PRE和XRA DMSO细胞的平均信号用作基线。高于基线的信号为浅灰色(见右侧标尺上的+1)；低于基线的信号为深灰色，其表示为PRE DMSO(见右侧标尺上的-1)。颜色强度表示与均值的log2-倍数变化。样品间的分层聚类关系显示为系统树图(左侧)。*被皮质醇显著(P<0.05)抑制的因子。被皮质酮显著(P<0.05)抑制的因子。(D)用表达RAS或MKK6的慢病毒感染细胞。挑选后，给予细胞DMSO、500nM皮质酮(C1)和100nM皮质醇(C2)6天。按之前所述产生条件培养基，并通过ELISA分析其IL-6。*与DMSO处理有显著差异(P<0.05)的因子。(E)在X射线辐照(XRA，以箭头指示)之前或之后，用500nM皮质酮将细胞处理所示的时间间隔(a-d，以下图中的粗线表示)。制备条件培养基，并通过ELISA分析其IL-6(上图)。*与DMSO治疗有显著差异(P<0.05)的因子。
图13A-13G表明SASP上糖皮质激素的影响取决于糖皮质激素受体(GR)。(A1)从衰老前的(Pre)或以DMSO、500nM皮质酮(C1)或100nM皮质醇(C2)处理的(如图12的图例中所述)处理的衰老的(Sen(XRA))HCA2细胞中提取mRNA。(A2)从衰老前的(模拟)或以DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇处理的(如图12中所述)衰老的X射线辐照的HCA2细胞中提取mRNA。通过定量PCR对IL-5、IL-6、IL-8、MMP-3、IL-1α、MCP-2、MCP-3和GM-CSF的转录物进行定量(标准化为微管蛋白)。*与DMSO处理有显著差异的因子(P<0.05)。(B)从衰老前的和按之前所述以DMSO、500nM皮质酮(C1)或100nM皮质醇(C2)处理的Sen(XRA)细胞中提取mRNA，并通过PCR对GR的转录物进行定量(标准化为微管蛋白)。尽管衰老细胞中的GR mRNA水平倾向于被轻微提高，但其增加无统计学差异。(C)在X射线辐照后1、4和7天，免疫染色衰老前的和按先前所述用DMSO\500nM皮质酮或100nM皮质醇处理的Sen(XRA)细胞的GR。(D)用表达shRNA的慢病毒针对GFP(对照)或GR感染细胞，并进行挑选。挑选后7天，提取mRNA，并通过PCR对转录物的GR进行定量(标准化为微管蛋白)。(E)从(D)中描述的表达shGFP和shGR的细胞制备总细胞溶解物，并通过蛋白质印迹分析GR和肌动蛋白(对照)。(F)用X射线辐照感染了表达shGFP或shGR的慢病毒的细胞，并在其后立即用DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇进行处理。7天后收集条件培养基，并通过ELISA分析IL-6。(G)按(F)中所述(除了加入所示剂量的RU-486外)处理细胞。收集条件培养基，并通过ELISA分析IL-6分泌。
图14A-14C表明糖皮质激素抑制IL-1α表达。(A)用DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇将衰老前的(Pre)HCA2细胞处理24小时，或通过X射线辐照(Sen(XRA))诱导其衰老，并在其后立即给予DMSO、皮质酮或皮质醇。在所示的时间间隔后提取mRNA，并通过PCR对转录物的IL-1α进行定量(标准化为微管蛋白)。(B)将从(A)中所述的细胞中提取的mRNA用于对转录物的IL-6进行定量(标准化为微管蛋白)。(C)免疫染色按(A)中所述制备的Pre和(XRA)细胞的IL-1α。在辐照后7天对Sen(XRA)细胞进行免疫染色。
图15A-15F表明糖皮质激素能修复IL-1α/NF-κB通道并抑制SASP诱导肿瘤细胞浸润的能力。(A)从衰老前的(Pre)细胞或在重组IL-1α蛋白(rIL-1α)不存在(左图)或存在(右图)下以DMSO、500nM皮质酮(C1)或100nM皮质醇(C2)处理的衰老细胞(Sen(XRA))，制备总HCA2细胞溶解物。通过蛋白质印迹分析溶解物的IRAK1、IκBα、RelA和肌动蛋白(对照)。(B)辐照后，给予Sen(XRA)细胞DMSO、50nM皮质酮或100nM皮质醇。6天后，在无血清培养基中，在糖皮质激素存在下给予细胞所示剂量的重组IL-1α蛋白。24小时后收集条件培养基，并通过ELISA分析其IL-6。(C)从Pre细胞和按如上所述用DMSO、500nM皮质酮(C1)或100nM皮质醇(C2)处理的Sen(XRA)细胞制备细胞核提取物，并分析NF-κB DNA结合活性。(D)用携带NF-κB-荧光素酶报告子构建体的慢病毒感染细胞，辐照，并允许其衰老。辐照后，立即用DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇加0.5μM RU-486或2.5ng mL-1IL-1α(如图所示)处理细胞。辐照后7天，将细胞胰蛋白酶化，计数，溶解，并分析荧光素酶活性，其被标准化为细胞数。(E)制备了来自衰老前的(Pre)或按图12中所述以皮质酮(C1)或皮质醇(C2)处理的衰老的(Sen(XRA))细胞的条件培养基。然后检测条件培养基刺激T47D人乳腺癌细胞侵入基膜的能力，如实验方案中所述。(F)从Pre细胞和在重组IL-1α蛋白(rIL-1α)不存在(左图)或存在(右图)下以DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇处理的Sen(XRA)处理细胞制备细胞核提取物，并分析其NF-κB DNA结合活性。
图16A显示了通过X射线辐照(10Gy；Sen(XRA))诱导衰老并在辐照后立即用所示浓度的皮质酮或最高浓度的DMSO(媒介物对照)处理7天的IMR-90纤维母细胞。通过ELISA分析来自衰老前的(Pre)以及对照和糖皮质激素处理的Sen(XRA)细胞的条件培养基的IL-6。图16B显示了用DMSO、500nM皮质酮(C1)或100nM皮质醇(C2)处理了7天的Sen(XRA)HCA2细胞。对表达SA-Bgal的衰老前的(Pre)和Sen(XRA)细胞的百分比进行了评分(上图)。还显示了对应于每种条件的代表性视野(下图)。图16C显示了对(B)中描述的Pre和Sen(XRA)HCA2细胞，给予BrdU 24小时，固定，并进行免疫染色以对细胞核BrdU进行染色，然后分析BrdU阳性细胞的百分比。图16D显示了(B)中描述的Pre和Sen(XRA)细胞，针对53BP1进行免疫染色。使用CELL PROFILER软件确定具有>253BP1细胞核灶的细胞百分比。每种条件至少分析200个细胞。图16E显示了使用CELL PROFILER软件确定的来自(D)的53BP1灶的平均数。
图17A显示了针对盐皮质激素受体进行了免疫染色的衰老前的(A)或Sen(Xra)HCA2细胞。辐照后立即给予Sen(XRA)细胞DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇，并在其后免疫染色1天或7天。图17B显示了在RU486存在或不存在(-)下以DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇处理，并针对GR进行免疫染色的Sen(XRA)HCA2细胞。
图18从以DMSO、500nM皮质酮或100nM皮质醇处理24小时的Pre HCA2细胞，以及在X射线辐照后立即开始用这些化合物处理7天的Sen(XRA)HCA2细胞提取mRNA。通过定量PCR分析mRNA提取物的IκBα转录物(标准化为微管蛋白)。将DMSO处理的Pre细胞中的IκBαmRNA水平任意地赋与值1。
图19表明芹黄素处理部分地抑制SASP。通过多重ELISA for SASP表达分析来自对照(模拟辐照的、DMSO处理的)、DMSO处理的(DMSO)或芹黄素处理的衰老的(Api)细胞的条件培养基。结果显示为相比对照(模拟辐照的、DMSO处理的)细胞的倍数差异，垂直轴为对数分度。
发明详述
本文提供了通过给予抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂，增加医疗治疗效力的方法。医疗治疗如癌症化疗、放疗、激素治疗和各种抗病毒治疗，预期且旨在靶向导致疾病的异常或不正常细胞，这是因为推测异常的新陈代谢、增殖、修复能力和/或其他生理和生物特性对这些治疗更为敏感。然而，这些医疗治疗，尤其是系统给药的那些，作用于正常细胞，造成细胞损伤、细胞毒性和/或遗传毒性效应，包括诱导细胞衰老。损伤的正常细胞和组织对医疗治疗的生物应答可造成该疗法治疗潜在疾病的效力下降，例如，通过促进对医疗治疗的抗性和/或通过恶化潜在的疾病。因此，本文的公开通过给予抑制损坏性生物应答的试剂来提供增加医疗治疗效力的方法，有助于医疗领域。
在一个实施方案中，能抑制生物损伤应答以及可用于本文描述的方法的试剂包括以下试剂(本文中称为抗衰老细胞试剂)：(a)选择性破坏(杀伤、清除、去除)一种或多种衰老细胞或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏、杀伤、清除或去除的试剂，和/或(b)抑制衰老细胞产生和分泌一种或多种衰老细胞相关分子(例如，通过非限制实例来说，细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶)的试剂。如本文所例示的，即使在动物中由于暴露于癌症治疗而确立了细胞衰老后，通过抗衰老细胞试剂去除衰老细胞增加了治疗抑制肿瘤进展的效力，并显著降低了转移性疾病。本文中还描述了，当生物损伤应答包括诱导细胞衰老时，抑制衰老细胞表达或分泌衰老细胞相关分子的试剂抑制肿瘤细胞侵入。
增加医疗治疗效力的方法
通过抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答，给予有需要的个体的抑制性试剂提供了医疗治疗效力(即，疗效)的提高(即，改善)。给予抑制可被治疗诱导的生物损伤应答的试剂，造成相比未给予该试剂时观察到的益处的改善的或增加的医疗治疗治疗性益处和/或预防性益处。在某些实施方案中，增加医疗治疗的效力包括抑制医疗治疗的有害生物和生理效应。
如本文所述，提供了增加有需要的个体中的医疗治疗效力的方法，所述方法包括将能抑制(即减少、降低、防止、抑制、减轻)可被暴露于医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂给予个体。可在给予医疗治疗之前或之后，将抑制生物损伤应答的试剂给予个体。在某些实施方案中，可在医疗治疗同时给予试剂。这些试剂包括，例如小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。
可被医疗治疗诱导的生物损伤应答包括个体的细胞、组织相关的和/或全身应答，所述应答通过将治疗的个体暴露于治疗而引起。可被本文中描述的医疗治疗诱导的生物损伤应答包括但不限于细胞衰老、DNA损伤应答(本文和本领域中还称为DDR)、患癌个体中的促肿瘤应答或其组合。在某些情形下，当医疗治疗诱导细胞衰老时，个体中衰老细胞的比例增加。换句话说，个体中衰老细胞的数目大于未接受医疗治疗个体中存在的数目。
用于抑制生物损伤应答的试剂包括试剂以减弱或减少(抑制)生物损伤应答的方式改变衰老细胞的活性或生理。抑制(即，以统计或临床显著的方式减少或抑制)生物损伤应答的试剂包括抑制或减少细胞响应细胞损伤性的医疗治疗而表达和/或上调的多肽(例如，衰老细胞相关多肽)表达和/或分泌的那些。因此，此类试剂包括抑制、防止或破坏细胞信号转导通路，或者抑制或减少或以某些方式干扰多肽的转录或翻译或运输的那些。
在诱导的生物损伤应答包括诱导和确立细胞衰老时的情况下，可用的试剂包括通过破坏或促进衰老细胞的毁坏(或清除、杀伤、去除)抑制损伤应答的抗衰老细胞试剂。因此，在具体的实施方案中，提供的方法包括给予个体医疗治疗，所述医疗治疗诱导个体一种或多种细胞的衰老；然后给予个体抗衰老细胞试剂，所述试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。还可使用的试剂改变(例如，阻止或抑制)生物活性或以一些方式改变衰老细胞生理使得试剂能抑制生物损伤应答。在某些实施方案中，试剂抑制细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌。
如本文较详细描述的，减低衰老细胞相关多肽的产生和分泌可抑制癌症相关的生物损伤应答，从而减少肿瘤进展和/或转移。衰老细胞相关多肽包括如本文和本领域的较详细描述的那些，其为衰老细胞的衰老相关分泌表型(SASP)的组分或分子。在某些实施方案中，可用于抑制生物损伤应答的试剂包括选择性破坏(或杀伤、去除、清除)一种或多种衰老细胞或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏、杀伤、清除或去除的试剂(本文中还称为抗衰老细胞试剂)。体外细胞研究表明衰老在暴露于辐照后约3-10天确立，这由SASP确立前的时间证明(参见，例如Coppe et al.,PLoSBiol.6:2853-68(2008)；Rodier et al.,Nature Cell Biol.11:973-70(2009)；Laberge et al.,Aging Cell 11(4):569-578(2012).doi:10.1111/j.1474-9726.2012.00818.x.Epub2012Apr17))。在具体的实施方案中，可用于本文所述方法的试剂包括一旦其通过将细胞和组织暴露于医疗治疗而被诱导时能抑制、阻止、消除或减少生物损伤应答(例如细胞衰老)的那些。因此，在一个实施方案中，此类抑制该生物损伤应答的试剂在给予医疗治疗之后给药。
可用于本文所述方法的试剂还包括特异性结合并与衰老细胞相关分子相互作用来抑制衰老细胞相关分子的一种或多种生物活性的试剂。可选地，试剂可结合衰老细胞相关分子的同源配体(例如，细胞受体或其他细胞表面多肽、信号转导分子、分泌型分子)，从而阻止或抑制衰老细胞相关分子与其同源配体结合。然后该抑制或阻止在其他情形下可抑制在不存在试剂下可能发生的生物损伤活性。
如本文较详细描述的，令人吃惊的是，减少SASP特征性衰老细胞相关分子的多肽产生和/或分泌，和/或减少衰老细胞群(特征为衰老相关分泌表型)可改善治疗(或预防)结果(例如，降低肿瘤进展和/或转移)。在一个实施方案中，提供了增加癌症治疗(例如，辐照、化疗)的医疗治疗效力的方法。如本文所描述的，癌症治疗如放疗和化疗药物诱导的生物损伤应答包括细胞衰老。衰老细胞的存在促进肿瘤进展，其可包括促进肿瘤生长和增加大小、促进转移和改变分化。如本文所例示，当衰老细胞受损时，肿瘤进展被显著抑制，造成肿瘤尺寸减少，并且观察到很少的或没有转移性生长。
可被包括癌症治疗(例如，放疗或化疗)的医疗治疗诱导的生物损伤应答，包括衰老细胞相关分子的表达。因此，在某些实施方案中，可用于本文所述方法的试剂包括促进一种或多种衰老细胞相关分子如一种或多种衰老细胞相关多肽(例如，通过非限制性实例的方式来说，细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶)的产生和分泌减少的试剂。如本领域所述和本文中较详细描述的，衰老细胞表型如称为衰老相关分泌表型(SASP)的表型，其代表为多种细胞因子(例如，炎症细胞因子)、生长因子、细胞外基质组分(ECM)和ECM降解酶，以及例如蛋白酶的分泌。在某些情形下，如在患癌个体中，这些因子的分泌可为有害的，例如，通过促进不良的炎性反应。
促进一种或多种衰老细胞相关分子的产生和分泌减少的试剂可在诱导生物损伤应答的医疗治疗之前、之后或同时给予。在具体的实施方案中，促进或造成一种或多种衰老细胞相关分子的产生和分泌减少的试剂可在给予放疗或化疗之后立即或不久(如24、48或72小时内)给予。例如，试剂包括糖皮质激素，如皮质酮和皮质醇、强的松、雄甾酮；黄酮类(例如，芹黄素、木犀草素、柚皮素)；甲磺氮草脲；氯磺丙脲；格列齐特；非那雄胺；甲基炔诺酮-(-)-D；雌二醇-17-β；米诺地尔；苯磷硫胺；钙化醇；那可丁和普罗布考。
如本公开中所提供的，糖皮质激素抑制一些(例如，IL-6、IL-1α信号转导)，但非所有(例如，衰老生长停滞)的因子，包括SASP。通过背景来说，糖皮质激素是一类类固醇激素，其包括皮质醇、皮质酮、地塞米松及相关类似物，其对代谢和免疫功能均具有广泛的组织特异性效应(参见，例如Gross and Cidlowski,2008,Trends Endocrinol.Metabl.19:331-339；Zanchi et al.,2010,J.Cell.Physiol.224:311-315)。(参见，例如Schlossmacher et al.,2011,J.Endocrinol.211:17-25)。据信糖皮质激素分别通过诱导免疫细胞凋亡，或通过激活抗炎性细胞因子或抑制编码促炎性细胞因子的基因来抑制炎症。后一活性由广泛表达的糖皮质激素受体(GR)介导，所述受体以多种同种型和翻译后修饰状态存在(参见，例如Zanchi etal.,2010,J.Cell.Physiol.224:311-315；Oakley and Cidlowski,2011,J.Biol.Chem.286:3177-3184)。如本文所述，糖皮质激素(例如，皮质酮和皮质醇)可在临床上用于其中SASP被认为有害的病症中。例如，如本文所详细描述的，DNA损伤放疗和化疗可体内诱导SASP(参见，例如Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868)，其可能具有有害的全身效应，以及刺激抗癌症治疗未消除的肿瘤细胞再生长的能力。此类促进或造成一种或多种衰老细胞相关分子的产生和分泌减少的试剂的应用，在本文所述的抑制生物损伤应答的方法中是有用的。
在另一具体的实施方案中，提供了通过将本文所述试剂如抑制一种或多种衰老相关分子(例如，SASP因子或组分)的表达、产生和/或分泌的试剂给予有需要的个体，减少、抑制或防止发生(即，减少发生的可能性)或降低放疗或化疗的有害副作用(其可能在某些具体的实施方案中与生物损伤应答相关或由其引起)的严重性的方法。例如，有害副作用包括但不限于恶心、呕吐、周围神经病、疲乏、贫血、脱发、疼痛、感染、黏膜炎、液体潴留、腹泻、便秘、指甲或皮肤问题、口腔、牙龈或咽喉问题，或者放疗或化疗造成的任何副作用(参见，例如国家癌症研究所网站)。
可用于本文所述方法的试剂包括防止(即，减少发生可能性)个体中的正常细胞衰老的那些。此类试剂可抑制或阻止或以一些方式干扰生物损伤应答，包括抑制、防止或破坏细胞信号转导通路，或者抑制或减少或以一些方式干扰转录或多肽翻译，或者干扰能产生损伤应答的一种或多种其他衰老细胞相关分子的产生的那些。例如，可用的试剂包括以一些方式促进IL-1α(其为SASP的上游调节物)减少的试剂。IL-1α通过激活转录因子细胞核因子-κB(NF-κB)，确立和维持SASP(参见，例如Orjalo etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:17031-36(2009)；Freund et al.,EMBO J.30:1536-48(2011))。作为另一个实例，还可使用抑制以下物质的表达和/或活性的试剂：(a)WNT16B，其调节p53活性和PI3K/AKT通路；(b)p16，其为p53的上游正调节物；(c)ARF，其为pRB的上游正调节物；(d)p21，p53的下游调节物；(e)一种或多种递送促有丝分裂信号至癌基因通路如RAS-RAF-MEK通路的因子；(f)一种或多种刺激雄激素受体通路的因子；或抑制活性氧类产生的试剂，所述活性氧类能刺激衰老相关信号转导通路。
如本文所描述的，抑制生物损伤应答的试剂可在医疗治疗之前(在前面)、之后(在后面)或同时给药。在某些实施方案中，当发生生物损伤应答(包括细胞衰老)时，可在给予医疗治疗之后将试剂给予个体，例如，在个体接受医疗治疗之后至少2、3、4、5、6、7、8、10、30、60天或至少90天，或至少3-10天、10-30天、30-60天或至少60-90天。在具体的实施方案中，在给予医疗治疗之后2-10天(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10天)给予试剂。可用于在给予医疗治疗之后给药的试剂包括，通过非限制性实例的方式来说，选择性破坏衰老细胞或促进衰老细胞的选择性毁坏的试剂(例如，作为抗衰老细胞试剂)。其他试剂包括阻止或抑制衰老细胞相关分子活性，或者抑制衰老细胞相关分子的表达和/或分泌从而减低分子活性引起的生物损伤的那些。关于包括给予多于一轮医疗治疗的医疗治疗方案，试剂可在一轮或多轮治疗后(之后)(包括在每轮后)给药。
在其他实施方案中，提供的方法采用了能阻止或抑制细胞开始损伤应答的试剂，或能减弱(即，降低严重性)细胞和组织暴露于医疗治疗后的损伤应答的那些。因此，在一个实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂在给予医疗治疗之前给药。在某些实施方案中，例如在给予治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周，给予此类试剂。关于包括给予多于一轮医疗治疗的医疗治疗方案，试剂可在一轮或多轮治疗前(之前)(包括在每轮前)给药。
同时给药指试剂在给予医疗治疗1-24小时内给药。并发治疗可包括重叠的医疗治疗和试剂给予。在具体的实施方案中，试剂与医疗治疗的一部分同时给予。例如，试剂给药可在给予医疗治疗1-24小时内给予，并在完成医疗治疗过程后继续给予试剂。例如，试剂最初在给予医疗治疗1-24小时内给予，并再另外继续给予试剂1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10天或多于10天(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10天)。换句话说，递送的试剂总量的至少一部分的部分试剂与给予的医疗治疗同时(1-24小时内)给予。在某些实施方案中，可以将试剂给药延长的时段，在该时段中确立细胞衰老(例如，通过细胞SASP例示)。该治疗方案可以显著减少其他情形下未给予试剂时发生的生物损伤的方式，改变衰老细胞的分泌表型。关于包括给予多于一轮医疗治疗的医疗治疗方案，试剂可与一轮或多轮治疗同时给药(包括与每轮的医疗治疗给予同时给予)。
本文还包括通过给予至少两种抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂(即，两种或更多中试剂)，增加医疗治疗效力的方法。为方便起见，至少两种试剂在本文中称为第一试剂和第二试剂，并且一起可以递增方式或协同方式抑制生物损伤应答。
在另一个实施方案中，当给予抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的至少两种试剂时，至少一种试剂(为方便起见，称为第一试剂)为试剂能阻止或抑制细胞开始损伤应答，或能减弱(即，降低严重性)细胞和组织暴露于医疗治疗时产生的损伤应答。此类试剂包括本文描述的防止(即，减少发生可能性)个体中的正常细胞衰老的那些。因此，该试剂在给予医疗治疗之前给予。至少一种另外的试剂(在本文中为方便起见称为第二试剂)为选择性破坏一种或多种衰老细胞，或促进因为暴露于医疗治疗而存在的一种或多种衰老细胞的选择性毁坏、杀伤、清除或去除的抗衰老细胞试剂。在给予能诱导生物损伤应答的医疗治疗之后，给予第二试剂。
当个体需要数轮治疗生物损伤的医疗治疗时，可以使用包括给予至少两种试剂的方案。在一个实施方案中，医疗治疗为癌症治疗，如放疗或化疗或放疗与化疗的组合。以足以允许试剂抑制生物损伤应答的时间在给予医疗治疗之前给予第一试剂，例如在给予治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周。在个体接受医疗治疗之后至少3、4、5、6、7、8、10、30、60天或至少90天，给予第二试剂，例如，在所用的时间后细胞诱导和确立衰老。给予第一和第二试剂中的每种的时间点取决于治疗类型和每轮治疗间的时间长度。在某些具体的实施方案中，根据医疗治疗周期之间的时间间隔(也称为间隙(gap))，在给予医疗治疗之前至少1天、至少2-6天或至少1周，给予第一试剂，并在个体接受医疗治疗之后至少3、4、5、6、7、8、9或10天，给予第二试剂。
生物损伤应答
可被医疗治疗诱导(即，激活、促进或刺激)的生物损伤应答包括将处理的个体暴露于治疗后引起的个体的细胞、组织相关的和/或全身应答。可被本文所述的医疗治疗诱导的生物损伤应答包括但不限于细胞衰老、DNA损伤应答(本文和本领域中也称为DDR)、促肿瘤应答及其组合。
可被引发衰老的医疗治疗诱导的生物损伤应答可造成表观遗传损伤或基因损伤。受损端粒产生持续性DDR，其启动并维持衰老生长停滞。许多衰老细胞还在非端粒位点具有基因损伤，其能产生衰老生长停滞所需的持续性DDR信号转导。生物损伤应答可包括不存在可检测的DDR信号转导时的细胞衰老(参见，例如Rodier et al.,J.Cell Biol.192:547-56(2011)，以及其中引用的参考文献)。另外，通常情况下使得衰老生长停滞的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)(主要是p21WAF1和p16INK4a)的异位表达，可造成无明显DDR的衰老。
在某些实施方案中，除医疗治疗预期靶向的细胞(例如，肿瘤细胞)之外以及/或正常细胞被医疗治疗损害或损伤。例如，感染的正常细胞包括作为医疗治疗靶标的细胞和组织周围的、邻近的或包围其的微环境。例如，关于治疗癌症，包括放疗或化疗的医疗治疗靶向肿瘤细胞；然而，肿瘤(其可以实体或液体)周围或邻近的微环境的良性细胞在暴露于治疗后可展现医疗治疗诱导的损伤应答。
细胞衰老是稳定的，且基本上永久停止细胞增殖，其相伴有广泛的基因表达改变。许多类型的细胞(正常细胞和肿瘤细胞)响应压力而经历衰老。如本领域所述，衰老细胞的表型如称为衰老相关分泌表型(SASP)的表型，其代表为分泌的多种细胞因子(例如，炎性细胞因子)、生长因子、细胞外基质组分(ECM和ECM降解酶以及例如蛋白酶。虽然增殖停滞给肿瘤进展造成了很大的障碍(参见，例如Campisi,Curr.Opin.Genet.Dev.21:107-12(2011)；Campisi,Trends Cell Biol.11:S27-31(2001)；Prieur et al.,Curr.Opin.Cell Biol.20:150-55(2008))，并且衰老细胞分泌的分子能够刺激组织修复(参见，例如Adams,Molec.Cell 36:2-14(2009)；Rodier et al.,J.Cell Biol.192:547-56(2011))，衰老细胞也分泌能造成炎症的分子(参见，例如Freund et al.,Trends Mol.Med.16:238-46(2010)；Davalos et al.,Cancer Metastasis Rev.29:273-83(2010))。低水平的慢性炎症是老化组织的一个标志，并且炎症是几乎每种主要的年龄相关病理，包括癌症的主要原因或造成因素(Ferrucci et al.,2004,Aging Clin.Exp.Res.16:240-243；Franceschi et al.,2007,Mech.Ageing Dev.128:192-105；Chung et al.,2009,Ageing Res.Rev.8:18-30；Davalos et al.,2010,Cancer Metastasis Rev.29:273-283；Freund et al.,2010,Trends Molec.Med.16:238-248)。因此，随年龄增加的和年龄相关病理位点处的衰老细胞，可能刺激局部慢性炎症和组织重建，从而加速老化退行性疾病以及年龄相关癌症。
衰老细胞可展现以下特性中的任何一种或多种：(1)衰老生长停滞基本为永久性的，并且不能通过已知的生理刺激逆转。(2)衰老细胞大小增加，有时增大到未衰老相对物大小的多于两倍。(3)衰老细胞表达衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)，其部分地反映溶酶体质量的增加。(4)大多数衰老细胞表达p16INK4a，其通常不由静止或终末分化细胞表达。(5)具有持续性DDR信号转导的衰老细胞具有持续性细胞核灶，称为具有增强衰老的染色质改变的DNA片段(DNA-SCARS)。这些灶含有活化的DDR蛋白，且可与瞬时损伤灶相区别。DNA-SCARS包括功能失调端粒或端粒功能失调诱导的灶(TIF)。(6)衰老细胞表达且可分泌本文中称为衰老细胞相关分子的分子，其在某些情况下，可在持续性DDR信号转导存在下观察到。
衰老细胞相关分子包括生长因子、蛋白酶、细胞因子(例如，炎性细胞因子)、趋化因子、细胞相关代谢物、活性氧类(例如，H2O2)，以及能刺激炎症和/或可促进或加剧个体的潜在疾病的其他生物效应或应答的其他分子。衰老细胞相关分子包括本领域描述的那些，包括衰老相关分泌表型(SASP)、衰老信息传送分泌组和DNA损伤分泌程序(DDSP)。如本领域所述，衰老细胞相关分子的这些组群含有共同的分子，并且不试图描述3组单独的不同分子组群。衰老细胞相关分子包括某些表达和分泌的生长因子、蛋白酶、细胞因子，以及可能具有强自分泌和旁分泌活性的其他因子。不试图受到理论的束缚，据信衰老细胞的负面效应至少部分地是由于分泌促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶，包括衰老细胞的SASP而引起(参见，例如Coppe et al.,PLoS Biol.6:2853-68(2008))。包括SASP的衰老细胞相关分子可破坏正常组织结构和功能，并刺激恶性前或非侵入性癌症细胞的恶性表型(参见，例如Coppe et al.,supra；Coppe et al.J.Biol.Chem.281:29568-74(2006)；Coppe et al.PLoSOne5:39188(2010)；Krtolica et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:12072-77(2001)；Parrinello et al.,J.Cell Sci.118:485-96(2005))。ECM相关因子包括炎性蛋白和ECM重建调剂物，并且其强烈地诱导衰老细胞(参见，例如Kuilman et al.,Nature Reviews9:81-94(2009))。可对医疗治疗靶向细胞如肿瘤细胞具有旁分泌效应的因子，包括细胞中暴露于遗传毒性治疗性医疗治疗后具有增加的表达的胞外蛋白(参见，例如Sun et al.,NatureMedicine,18:1359-1368(2012))。还参见，例如Campisi,2003,Nature Rev.Cancer3:339-349Coppé et al.,2010,Annu.Rev.Pathol.5:99-118Williams,1957,Evolution 11:398-411Collado et al.,2010,Nature Rev.Cancer10:51-57Beausejour et al.,2006,Nature443:404-405Krizhanovsky et al.,2008,Cell134:657-667Jun et al.,2010,Nature Cell Biol.12:676-685Parrinello et al.,2005,J.Cell Sci.118:485-496Acosta et al.,2008,Cell133:1006-1018；Kuilman et al.,2008,Cell133:1019-1031Laberge et al.,2012,Cancer Microenivron.5:39-44。
衰老细胞相关分子包括可构成衰老细胞的促炎性表型(例如，SASP)的分泌因子。这些因子包括但不限于GM-CSF、GROα、GROα、β、γ、IGFBP-7、IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、MCP-2、MIP-1α、MMP-1、MMP-10、MMP-3、双调蛋白、ENA-78、Eotaxin-3、GCP-2、GITR、HGF、ICAM-1、IGFBP-2、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-1β、MCP-4、MIF、MIP-3α、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2、抑癌蛋白M、骨保护素、PIGF、RANTES、sgp130、TIMP-2、TRAIL-R3、Acrp30、血管生成素、Axl、bFGF、BLC、BTC、CTACK、EGF-R、Fas、FGF-7,G-CSF、GDNF、HCC-4、I-309、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-3、IL-1R1、IL-11、IL-15、IL-2R-α、IL-6R、I-TAC、瘦素、LIF、MMP-2、MSP-a、PAI-1、PAI-2、PDGF-BB、SCF、SDF-1、sTNF RI、sTNF RII、促血小板生成素、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β3、MIP-1-Δ、IL-4、FGF-7、PDGF-BB、IL-16、BMP-4、MDC、MCP-4、IL-10、TIMP-1、Fit-3配体、ICAM-1、Axl、CNTF、INF-γ、EGF、BMP-6。其他鉴定的因子包括本领域有时称为衰老消息发送分泌组(SMS)因子的那些，它们中的一些包括SASP多肽列表中，包括但不限于IGF1、IGF2和IGF2R、IGFBP3、IDFBP5、IGFBP7、PAl1、TGF-β、WNT2、IL-1α、IL-6、IL-8和CXCR2结合趋化因子。细胞相关的分子还包括但不限于Sun et al.,Nature Medicine,同上中描述的因子，并且包括，例如以下基因的产物：MMP1、WNT16B、SFRP2、MMP12、SPINK1、MMP10、ENPP5、EREG、BMP6、ANGPTL4、CSGALNACT、CCL26、AREG、ANGPT1、CCK、THBD、CXCL14、NOV、GAL、NPPC、FAM150B、CST1、GDNF、MUCL1、NPTX2、TMEM155、EDN1、PSG9、ADAMTS3、CD24、PPBP、CXCL3、MMP3、CST2、PSG8、PCOLCE2、PSG7、TNFSF15、C17orf67、CALCA、FGF18、IL8、BMP2、MATN3、TFP1、SERPINI 1、TNFRSF25和IL23A。衰老细胞相关蛋白还包括表达于衰老细胞上的细胞表面蛋白(或受体)，包括非衰老细胞的细胞表面上以可检测的较低量存在或不存在的蛋白。
抑制生物损伤应答的试剂
抑制生物损伤应答的试剂包括减少或抑制的损伤应答程度使得本领域技术人员认为抑制为统计或临床上显著的试剂。能抑制生物损伤应答的试剂包括小分子、多肽、肽、肽体、抗体、抗原结合片段(即，含有至少一个互补决定区(CDR)的肽和多肽)、重组病毒载体或核酸。
“选择性”破坏衰老细胞或促进衰老细胞的“选择性”毁坏的治疗剂为优先(或以很大程度)破坏衰老细胞或者促进衰老细胞的毁坏或者促进其清除或去除的试剂。换句话说，相比其破坏非衰老细胞或促进非衰老细胞的毁坏的能力，治疗剂能以生物、临床和/或统计上显著的方式破坏或促进衰老细胞的毁坏。通过非限制性实例的方式来说，治疗剂可通过下述方式直接或间接杀伤衰老细胞：破坏细胞膜完整性；抑制细胞中的一种或多种代谢过程；增强或刺激引起衰老细胞凋亡或坏死的信号转导通路；分别破坏细胞生存所必需的基因或蛋白的转录或翻译；或者与衰老细胞结合以促进细胞的清除或去除，例如被细胞清除，或以上的任何组合。
同样如本文中所述，抑制衰老细胞相关分子(例如，细胞因子趋化因子、生长因子、细胞外基质组分(ECM)和ECM降解性酶以及蛋白酶)的表达、分泌或生物活性的试剂，可用于本文所述的方法中。在某些实施方案中，试剂抑制(减少、降低、阻止)本文和本领域所述的一种或多种SASP因子(或组分)的产生和分泌。在某些实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂为抑制(即，减少、抑制、防止、阻止)IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF和BMP-4中的至少任何一种或多种的产生和/或分泌的试剂。在某些其他的实施方案中，试剂抑制IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF和BMP-4中的至少任何2、3、4、5、6、7、8种或所有的产生和/或分泌。
目标试剂包括活化的那些或通过相比非衰老细胞在衰老细胞中以更高水平表达的酶转化为活性形式的前药。其他目标试剂包括细胞的细胞表面上，与相比非衰老细胞在衰老细胞上专一性地存在或以更高水平存在的蛋白结合的那些。此类蛋白的实例包括突变β肌动蛋白；β-肌动蛋白(ACTB)；抗药相关蛋白LRP；穹窿体主蛋白(MVP)；甲状腺激素结合蛋白前体；脯氨酰4-羟化酶、β亚基前体(P4HB)；链A、人蛋白二硫化物异构酶(PDI)；电子转移黄素蛋白、β多肽(ETFP)；ATP合成酶、H+运输、线粒体F复合物、α亚基前体；组织蛋白酶B；和未命名的蛋白产物GI:35655、GI:158257194；和GI 158259937(参见，例如专利申请公开第WO 2009/085216号，表1，其通过引用整体并入本文中)。在某些实施方案中，相比非衰老细胞，特异性结合衰老细胞的治疗剂针对衰老细胞具有至少2、4、8、10、50、100或1000倍大的亲和力，或在某些实施方案中，试剂不与非衰老细胞可检测地结合。特异性结合衰老细胞的肽包括12个氨基酸的肽，其描述于PCT专利申请公开第2009/085216号。相比非衰老细胞在衰老细胞上以更高水平存在的蛋白，可以为通常为细胞内蛋白且非衰老细胞的细胞表面上不可检测的蛋白。抑制包括细胞衰老的生物损伤应答的其他试剂包括相比非衰老细胞在衰老细胞中更频繁或以更高速率发生的代谢过程激活的那些。
抑制包括细胞衰老的生物损伤应答的试剂包括直接或间隔抑制对衰老重要的基因产物的分泌和/或表达，或者抑制基因产物的生物活性的试剂。这些基因产物的实例提供在下表中；也参见Sun,et al.,同上。
基因符号 基因产物说明 GenBank# PubMed# logFC
CLCA2 CLCA家族成员2，氯离子通道调节物 BF003134 10362588，10437792 4.79
CLCA2 CLCA家族成员2，氯离子通道调节物 NM_006536 10362588，10437792 4.51
IL33 白介素33 AB024518 10566975，12477932 4.24
CLCA2 CLCA家族成员2，氯离子通道调节物 AF043977 10362588，10437792 4.22
CLCA2 CLCA家族成员2，氯离子通道调节物 NM_006536 10362588，10437792 3.87
RP4-692D3.1 假定蛋白LOC728621 AW364693 16710767 3.75
SYNPO2 突触极蛋白2 AI634580 8593614，11076863， 3.74
GLS 谷氨酰胺酶 AF097493 3531404，6682827，6 3.53
ABI3BP ABI基因家族，成员3(NESH)结合蛋白 NM_024801 11501947，12477932 3.52
BCHE 丁酰胆碱酯酶 NM_000055 1769657，1769658，2 3.51
LOC727770 类似于锚蛋白重复结构域20家族，成员A1 AI359676 3.51
OSAP 卵巢特异性酸性蛋白 AF329088 12477932 3.44
PLAT 纤维蛋白溶酶原激活剂，组织 NM_000930 1301152，1310033，1 3.42
IL1A 白介素1，α M15329 1548758，1584804，1 3.42
IFIT2 干扰素诱导的蛋白，具有四三共肽(tetratricopeptide)重复2 AA131041 1377167，2454816，3 3.39
CDH10 钙黏蛋白10，2型(T2-钙黏蛋白) NM_006727 2059658，10386616， 3.37
IL1B 白介素1，β NM_000576 1548758，1753956，1 3.33
SPATA18 精子发生相关的18同系物(大鼠) AI559300 12477932，14702039 3.31
AI422414 3.29
IL1B 白介素1，β M15330 1548758，1753956，1 3.29
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 AI110886 1721035，2422961，2 3.25
GLS 谷氨酰胺酶 NM_014905 3531404，6682827，6 3.23
ABI3BP ABI基因家族，成员3(NESH)结合蛋白 A8056106 11501947，12477932 3.2
SYNPO2 突触极蛋白2 AW009747 8593614，11076863， 3.16
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 BF107618 1721035，2422961，2 3.14
C11orf87 染色体11开放阅读框87 AA633992 12477932 3.12
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 BF107618 1721035，2422961，2 3.11
SLC16A4 溶质载体家族16，成员4(单羧酸转运体5) NM_004696 8125298，9373149，9 3.1
SCN2A 钠通道，电压门控，II型，α亚基 BF432956 1317301，1325650，1 3.09
RNF128 环指蛋白128 NM_024539 12477932，12705856 3.07
AKR1C3 醛酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟甾类脱氢酶，II型) AB018580 7626489，7650035，7 3.03
IL13RA2 白介素13受体，α2 NM_000640 8663118，9083087，9 2.99
GDF15 生长分化因子15 AF003934 8125298，9326641，9 2.93
SULF2 硫酸酯酶2 AL133001 10574462，11549316 2.92
KRT34 角蛋白34 NM_021013 2431943，7686952，9 2.89
FBXO32 F-box蛋白32 BF244402 11679633，11717410 2.89
AA594609 2.88
BC043411 2.88
ESM1 内皮细胞特异性分子1 NM_007036 8702785，11025405， 2.85
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 AA148534 1721035，2422961，2 2.81
MEG3 母系表达的3(非编码蛋白的) AI291123 8619474，9110174，1 2.8
C15orf48 染色体15开放阅读框48 AF228422 12209954，12477932 2.79
AK022198 2.77
USP53 泛素特异性肽酶53 H25097 10718198，12477932 2.75
SDPR 血清剥夺反应(磷脂酰丝氨酸结合蛋白) BF982174 2390065，8012384，8 2.71
MAP2 微管蛋白相关蛋白2 BF342661 1494913，1708129，2 2.69
RDH10 视黄醇脱氢酶10(全反式) AW150720 12407145，12477932 2.68
BMP2 骨形态发生蛋白2 AA583044 1487246，2004778，2 2.64
CRYAB 晶状体蛋白，αB AF007162 838078，1407707，15 2.64
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 BG434272 1721035，2422961，2 2.64
USP53 泛素特异性肽酶53 AW188464 10718198，12477932 2.63
KRTAP1-5 角蛋白相关蛋白1-5 AI406928 11279113，12228244 2.63
HSD11B1 羟甾类(11-β)脱氢酶1 NM_005525 1885595，3034894，7 2.62
GLS 谷氨酰胺酶 AB020645 3531404，6682827，6 2.6
ARRDC4 抑制蛋白结构域，含有4 AV701177 12477932，14702039 2.59
CCRL1 趋化因子(C-C基序)受体样1 NM_016557 8125298，9373149，9 2.58
MAMDC2 MAM结构域，含有2 AI862120 11076863，11256614 2.54
RTN1 网状蛋白1 NM_021136 7515034，7685762，7 2.52
PAPPA 妊娠相关血浆蛋白A，冠毛素1 BG620958 1721035，2422961，2 2.49
FBXO32 F-box蛋白32 BF244402 11679633，11717410 2.48
可用于本文所述方法的试剂包括但不限于抑制生物损伤应答(包括抑制细胞衰老)的小有机分子。试剂还包括破坏衰老细胞或促进衰老细胞的毁坏或去除或清除的小分子。可随机或通过SAR将目标小分子化合物衍生化，以获得具有改善的活性的化合物。小有机分子通常具有小于105道尔顿、小于104道尔顿或小于103道尔顿的分子量。
可用于本文所述的增加医疗治疗效力的方法的试剂包括抗体或抗原结合片段。抗原结合片段可为从全抗体制备的片段。抗原结合片段还包括包含至少一个互补决定区(CDR)的肽或多肽。可用的抗体和抗原结合片段包括特异性结合相比非衰老的正常细胞过表达、选择性表达或仅由衰老细胞表达的同源抗原的那些。抗体可以使通过与其同源抗原相互作用被衰老细胞内化的内化抗体或抗原结合片段。内化抗体或抗原结合片段可用于递送细胞毒性试剂至衰老细胞。
通常可使用免疫检测方法测定和评估抗体与其同源抗原的结合特性，例如，酶联免疫吸附检测(ELISA)、免疫沉淀、免疫印迹、对流免疫电泳、放射免疫检测、斑点印迹检测、抑制或竞争检测等，其可由本领域技术人员容易地实施(参见，例如Harlow et al.,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。如本文所用，如果抗体与抗原或免疫原以可检测的水平发生作用，则将抗体说成是同源抗原“免疫特异性的”、对其“具有特异性”或与其“特异性结合”。可使用常规技术容易地测定抗体和其抗原结合片段的亲和力，例如，Scatchard et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA51:660(1949))描述的那些，以及通过表面等离子体共振(SPR；BIAcoreTM,Biosensor,Piscataway,NJ)。
抗体可为多克隆或单克隆的，根据本领域常规实施和本文所述的方法和技术通过动物免疫和随后的抗体分离制备，或从特定B细胞克隆。可从抗原结合片段或肽文库鉴定和分离可变区或一个或多个互补决定区(CDR)。可重组改造和/或重组制备抗体或抗原结合片段。
抗体可属于任何免疫球蛋白类，例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA，且可获自或源自动物，例如家禽(如鸡)和哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或其他啮齿类、奶牛、马、绵羊、山羊、骆驼、人或其他灵长类。对于应用于人个体，抗体和抗原结合片段通常为人的、人源化的或嵌合的，以减少个体对非人肽和多肽序列的免疫应答。
抗体可为单克隆抗体，即人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或者由其制备或源于其的抗原结合片段(例如，F(ab')2、Fab、Fab'、Fv和Fd)。抗原结合片段还可为任何合成的或遗传改造的蛋白，其如同抗体一样结合特异性抗原形成复合物而起作用。例如，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的Fv片段、重组单链多肽分子(scFv蛋白)，以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。在某些其他的实施方案中，抗体为多聚抗体片段如小抗体、双特异性和双功能抗体(包含对与具有不同抗原特异性的第二Fv相关的抗原具有特异性的第一Fv)，以及双体等。可使用的方法通常描述于，例如Hayden et al.,Curr Opin.Immunol.9:201-12(1997)；Coloma et al.,Nat.Biotechnol.15:159-63(1997)；美国专利第5,910573号)；Holliger et al.,Cancer Immunol.Immunother.45:128-30(1997)；Drakeman et al.,ExpertOpin.Investig.Drugs6:1169-78(1997)；Koelemij et al.,J.Immunother.22:514-24(1999)；Marvin et al.,Acta Pharmacol.Sin.26:649-58(2005)；Daset al.,Methods Mol.Med.109:329-46(2005)。
可从肽文库鉴定最小识别单位或其他抗原结合片段。此类肽可鉴定和分离自组合文库(参见，例如国际专利申请第PCT/US91/08694和PCT/US91/04666号)，以及噬菌体展示肽文库(参见，例如Scott et al.,Science249:386(1990)；Devlin et al.,Science249:404(1990)；Cwirla et al.,Science276:1696-99(1997)；美国专利第5,223,409号；美国专利第5,733,731号；美国专利第5,498,530号；美国专利第5,432,018号；美国专利第5,338,665号；1994；美国专利第5,922,545号；国际申请公开第WO96/40987和WO 98/15833号)。可通过计算机建模技术鉴定最小识别单位或CDR(即，存在于重链可变区中的3个CDR中的任意一个或多个，和/或存在于轻链可变区中的3个CDR中的一个或多个)肽，其可用于比较和预测特异性结合如本文所述的目标多肽的肽序列(参见，例如Bradley etal.,Science309:1868(2005)；Schueler-Furman et al.,Science310:638(2005))。
抗体通常可通过本领域技术人员已知的多种技术中的任意一种制备。用于免疫动物和/或筛选具有期望特异性的抗体的免疫原包括分离自衰老细胞的蛋白，例如，相比非衰老细胞在衰老细胞细胞表面上以更大量存在或具有不同结构的那些；以及衰老细胞提取物，包括外膜制备物、分离自衰老细胞的细胞器等。还可从人免疫球蛋白噬菌体文库、兔免疫球蛋白噬菌体文库，小鼠免疫球蛋白噬菌体文库，和/或鸡免疫球蛋白噬菌体文库鉴定和分离抗体(参见，例如Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12:433-55(1994)；Burton et al.,Adv.Immunol.57:191-280(1994)；美国专利第5,223,409号；Huse et al.,Science246:1275-81(1989)；Schlebusch et al.,Hybridoma16:47-52(1997)以及其中引用的参考文献；Rader et al.,J.Biol.Chem.275:13668-76(2000)；Popkov et al.,J.Mol.Biol.325:325-35(2003)；Andris-Widhopf et al.,J.Immunol.Methods242:159-31(2000))。通常可根据本文所述的和本领域已知的方法改造分离自非人的物种或非人免疫球蛋白文库的抗体，以将或其片段“人源化”。
可用于设计人源化抗体的策略可以包括，通过示例性而非限制性实例的方式，鉴定与嵌合抗体的非人骨架区最同源的人可变骨架区(参见，例如Jones et al.,Nature321:522-25(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-27(1988))。可将人源化抗体设计为包含非人可变区的CDR环结构和结构决定区，例如通过计算机建模，然后将将CDR环和决定区与已知的人CDR环结构和决定区比较(参见，例如Padlan et al.,FASEB9:133-39(1995)；Chothia et al.,Nature,342:377-83(1989))。计算机建模还可用于将通过序列同源性挑选的人结构模板与非人可变区比较。
可将试剂如衰老细胞特异性的多肽、肽、肽体、抗体和抗原结合片段(即，包含至少一个抗体V区的肽或多肽)或其他试剂，与选择性破坏衰老细胞或促进衰老细胞的选择性毁坏的第二试剂连接(即，缀合、融合或以某些方式结合或粘合)。当通过将试剂与衰老细胞结合来递送至衰老细胞时，细胞毒性部分选择性破坏衰老细胞。如果试剂为重组产生的，则可将编码细胞毒性部分的核酸序列与试剂和一个或多个调控表达序列连接在框内，以制备包含试剂和细胞毒性部分的融合蛋白。此类第二试剂包括细胞毒性分子，其包含源自植物和微生物的毒素，以及未连接至上述抗体、多肽或肽时不选择性结合衰老细胞的小分子。
抑制生物损伤应答的试剂包括肽免疫球蛋白(Ig)恒定区融合多肽，其包含肽-IgFc融合多肽(在本领域也称为肽体(参见，例如美国专利第6,660,843号))。肽可为任何天然存在的或重组制备的分子。肽-Ig恒定区融合多肽如肽-IgFc融合多肽，包含具生物活性的、能改变目标蛋白活性的肽或多肽。Fc多肽还可为突变蛋白Fc多肽。可从组合文库(参见，例如国际专利申请第PCT/US91/08694和PCT/US91/04666号)和噬菌体展示肽文库(参见，例如Scott et al.,Science249:386(1990)；Devlin et al.,Science249:404(1990)；Cwirla et al.,Science276:1696-99(1997)；美国专利第5,223,409号；美国专利第5,733,731号；美国专利第5,498,530号；美国专利第5,432,018号；美国专利第5,338,665号；1994；美国专利第5,922,545号；国际申请公开第WO 96/40987和WO 98/15833号)中，鉴定和分离改变细胞生物功能如免疫细胞的免疫应答的肽。
在某些实施方案中，抑制生物损伤应答的试剂为与细胞的基因组或mRNA的一部分特异性杂交的多核苷酸或寡核苷酸，所述细胞为衰老细胞，或处于疾病微环境中并且可通过生物损伤性(即，细胞损伤性)医疗治疗诱导衰老。本文提供的多核苷酸和寡核苷酸与编码衰老细胞目标多肽的核苷酸序列(例如，短干扰核酸、反义多核苷酸、核酶或肽核酸)的至少一部分互补，并且可用于改变基因和/或蛋白表达。如本文所描述的，这些与编码细胞多肽的核酸分子特异性结合或杂交的多核苷酸可使用本领域可用的核苷酸序列制备。在另一实施方案中，非序列特异性的核酸分子如适体也可用于改变基因和/或蛋白表达。
反义多核苷酸以序列特异性方式与核酸如mRNA或DNA结合。可用作反义试剂的寡核苷酸和核酶的鉴定，以及编码用于靶标递送的基因的DNA的鉴定包括本领域熟知的方法。例如，此类寡核苷酸所需的性能、长度和其他特征是公知的。反义技术可用于通过干扰聚合酶、转录因子或其他调控分子结合控制基因表达(参见，Gee et al.,Huber and Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co.(Mt.Kisco,NY；1994))。
短干扰RNA可用于调节(降低或抑制)编码衰老细胞相关多肽的基因的表达。例如，可根据本文所述方法用小核酸分子如短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发卡RNA(shRNA)分子来调节目标细胞多肽的表达。siRNA多核苷酸优选包括双链RNA(dsRNA)，但可包括单链RNA(参见，例如Martinez et al.Cell110:563-74(2002))。siRNA多核苷酸可包括其他天然存在的重组或合成单链或双链核苷酸聚合物(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或二者的组合)，和/或如本文提供的和本领域技术人员已知和使用的核苷酸类似物。
在具体的实施方案中，多核苷酸或寡核苷酸可通过重组载体递送，所述载体中已整合有目标多核苷酸或寡核苷酸。在其他实施方案中，重组病毒载体可为重组表达载体，其中插入有编码作为目标试剂的抗体、抗原结合片段、多肽或肽的多核苷酸序列，以便编码序列与一个或多个调节对照序列可操作地结合来驱动目标多肽、抗体、抗原结合片段或肽的表达，重组载体或重组表达载体可为病毒重组载体或病毒重组表达载体。示例性的病毒载体包括但不限于慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、牛痘病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可为活的、减毒的、条件复制性的或复制缺陷性的，并且通常为非病原性的(缺陷型的)、能复制的病毒载体。设计和制备此类病毒载体的步骤和技术为本领域技术人员熟知和常规实施。
可用于本文所述方法的试剂可通过本文和本领域所述技术和方案进行鉴定或筛选或定征。抑制生物损伤应答的试剂(包括抑制细胞衰老的那些)可通过利用细胞系如肿瘤细胞系的体外检测进行鉴定。可将培养的细胞同时或以任何顺序暴露于医疗治疗和候选试剂。此类检测可在基质(或阵列)中进行，所述基质(或阵列)可包括高通量筛选格式。高通量格式通常包括自动化筛选大量候选试剂，其可获自合成的或天然的产物文库。可将待筛选的候选试剂编组在高通量筛选格式中，例如使用基于微流体的装置或96孔板格式，或其他规则的二维阵列如384孔、48孔或24孔板格式，或试管阵列。因此，该格式易于自动化。置于计算机或其他可编程的控制器控制下的自动化装置可用于本文所述方法的一个或多个步骤中。控制器可监控方法的每个步骤的结果，并可响应这些结果而自动改变检测模式。
还可使用动物模型来鉴定或定征抑制生物应答的试剂，包括抑制细胞衰老的那些。例如，可使用包含在衰老细胞特异性启动子的控制下表达的转基因的非人的动物，尤其是经遗传改造的非人的动物。通过可操作地(即，操作性地)将转基因的衰老细胞特异性启动子与编码目标多肽(例如，可检测的标记或细胞毒性激活分子)的核酸序列连接，可以可控的和使用者决定的方式监控动物中的衰老细胞(参见本文的实施例)。示例性的转基因包括(1)与编码以下物质的多核苷酸可操作地连接的衰老细胞特异性启动子：(a)至少一种可检测的标记，(b)细胞毒性剂，(c)细胞毒性激活分子，(d)RNA，或(e)(a)、(b)、(c)和(d)的任意组合；并展现肿瘤。示例性的动物模型包括转基因，其包含(a)与编码FKBP-半胱天冬酶融合多肽的多核苷酸序列和编码绿色荧光蛋白的多核苷酸序列可操作地连接的p16Ink4a启动子(p16-FKBP-半胱天冬酶转基因)(参见，例如Baker et al.,Nature479:232-36(2011),其通过引用整体并入本文)；或(b)与编码包含荧光素酶、红色荧光蛋白和截断的单纯疱疹病毒胸苷激酶(tTK)(p16-3MR转基因)的融合多肽的多核苷酸序列可操作地连接的p16Ink4a启动子，所述胸苷激酶在本文中可称为三峰融合蛋白(3MR)。在某些转基因动物中，荧光素酶为海肾萤光素酶，且红色荧光蛋白为单体红色荧光蛋白。
可将多种细胞毒性激活分子中的任何一种可操作地与衰老细胞特异性启动子相连，以制备合适的用于动物模型的转基因。在其以衰老细胞特异性方式表达后，细胞毒性激活分子能诱导衰老细胞的可控杀伤，其中其在将激活试剂给予转基因动物后表达。细胞毒性激活分子的示例性实例包括单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)多肽和FK506结合蛋白(FKBP)(或其变体)-半胱天冬酶融合多肽。再例如，转基因编码的细胞毒性激活分子为单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)多肽(包括截断的TK多肽)，并且激活试剂是前药更昔洛韦，其转化为致死其得到表达的细胞的毒性部分。
可在此类动物模型中评估试剂抑制生物损伤应答的效力，在所述动物模型中可以测定试剂抑制细胞衰老的能力。因此，抑制细胞衰老的试剂可抑制动物模型中的肿瘤增殖。可通过肿瘤大小确定肿瘤增殖，其中肿瘤大小可以肿瘤动物领域技术人员熟悉的各种方式进行测量，如通过触诊或测量瘤体积或面积(其可在死后进行)、肿瘤位置(例如，在肿瘤细胞已从原发性肿瘤位点(即，肿瘤细胞最初拓展的位点)转移时测定)。还可通过检测肿瘤细胞分化评估治疗试剂或肿瘤增殖的影响。
可通过本领域描述的技术和程序测定衰老细胞和衰老细胞相关分子。例如，可通过检测衰老标记SA-βgal(SA-Bgal)的组织化学或免疫组织化学技术分析衰老细胞(包括获自组织的衰老细胞)(参见，例如Dimri etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9363-9367(1995)。可通过本领域实施的数种免疫化学方法中的任何一种如免疫印迹测定衰老细胞相关多肽p16的存在。可通过本领域实施的多种技术包括定量PCR测量细胞中编码衰老细胞相关多肽(包括p16mRNA)的核酸的表达。可通过使用本领域描述的自动化和高通量检测如自动化的Luminex阵列检测，测定衰老细胞相关多肽(例如，SASP的多肽)的存在和水平(参见，例如Coppe et al.,PLoSBiol6:2853-68(2008))。对于监测包括DNA损伤应答的生物损伤应答，可检测各种DNA损伤应答指示物，例如，根据Rodier et al.,Nature CellBiol11:973-979(2009)的方法。
本公开还提供了体外鉴定和定征选择性抑制衰老相关分泌表型(SASP)的试剂的方法，所述方法包括：使衰老细胞与静止(非衰老)细胞与一种或多种检测试剂(即，候选试剂)接触(即，混合、组合或以一些方式促进其间的相互作用)；测定衰老细胞和静止期细胞产生的一种或多种SASP特征性组分的水平。本文所述方法的每个步骤均在对每个步骤足够合适的条件和时间下进行。此类条件和时间在本文和实施例中提供的示例性方法中有论述，并且其可由本领域技术人员容易地测定。
例如，测定和比较每种衰老细胞和静止期细胞分泌的SASP分子如细胞因子(例如，炎性细胞因子)、生长因子、细胞外基质组分(ECM)和ECM降解酶，以及蛋白酶的水平。在静止期细胞中减少一种或多种SASP组分的产生而不产生总细胞毒性且不诱导SASP的检测试剂为选择性抑制衰老相关分泌表型的试剂。通过挑选无总细胞毒性的检测试剂，可将通过细胞死亡降低SASP组分的化合物排除在外。测量细胞毒性(或细胞生活力)的各种方法为本领域已知，并且包括，例如评估细胞膜完整性的方法(台盼蓝或碘化丙啶)、乳酸脱氢酶检测、MTT或MTS检测、ATP检测、磺酰罗丹明B检测和WST检测。在某些实施方案中，可通过测定ATP水平测量总细胞毒性或细胞活力。
在某些实施方案中，挑选检测试剂步骤包括：挑选在静止期细胞中减少一种或多种SASP组分的产生而无细胞毒性且不诱导SASP，且不逆转衰老生长停滞的检测试剂，如选择性抑制衰老相关分泌表型的候选试剂。
在某些实施方案中，SASP特征性的一种或多种衰老相关组分为分泌型衰老相关分子。在某些实施方案中，SASP特征性的一种或多种分子包括本文描述的和本领域已知的任何一种或多种SASP因子。在某些实施方案中，用于本文公开方法的、抑制生物损伤应答的目标试剂为抑制(即，减少、抑制、防止、阻止)IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF和BMP-4中的任何一种或多种的产生和/或分泌的试剂。在某些其他的实施方案中，目标试剂抑制IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF和BMP-4中的至少任意2、3、4、5、6、7、8种或所有的产生和/或分泌。在某些实施方案中，目标试剂抑制一种或多种SASP特征性组分的产生和/或分泌，其中一种或多种SASP特征性组分包括IL-6。
可通过多种方法测量SASP特征性组分的产生。在某些实施方案中，SASP特征性组分可在培养细胞的培养基中进行测量。培养基可为条件培养基，其中在以检测试剂处理细胞后，在不存在检测试剂的无血清培养基中将细胞洗涤并孵育一段时间，以产生条件培养基。可通过使用本领域描述的自动化和高通量检测如自动化的Luminex阵列检测，确定衰老细胞相关分子(例如，SASP的多肽)的存在和水平(参见，例如Coppe et al.,PLoS Biol6:2853-68(2008))。在某些实施方案中，使用免疫检测测量SASP特征性组分，包括，例如蛋白印迹、ELISA、抗体检测、横向流免疫检测、磁性免疫检测、放射免疫检测、FACS和环绕光纤免疫检测(SOFIA)。
在某些实施方案中，鉴定或定征选择性抑制SASP的化合物的方法为高通量筛选法。从合成或天然产物文库高通量筛选(通常为自动化筛选)大量候选治疗试剂可用于鉴定治疗试剂。试剂可为批准的或临床前化合物。可以高通量筛选格式如使用基于微流体的装置或96孔板形式或其他规则的二维阵列如1536孔、384孔、48孔或24孔板格式，或试管阵列，编组待筛选的候选治疗试剂。因此，所述格式易于自动化。可将置于计算机或其他可编程控制器控制下的自动化的装置用于本文所述方法的一个或多个步骤中。控制器可监测方法的每个步骤的结果，并且可以响应那些结果而自动改变检测模式。对本领域技术人员显而易见的是，可采用各种筛选模式，例如可将不同的检测试剂放入不同的容器或孔中，或者多种检测试剂合并在单个孔或容器中，或它们的组合。
在某些实施方案中，鉴定选择性抑制本文公开的SASP的化合物的方法中使用的衰老细胞和静止(即，非衰老)细胞包括纤维母细胞。在具体的实施方案中，细胞包括人纤维母细胞。在某些实施方案中，鉴定选择性抑制如本文所述的SASP的化合物的方法可包括进行和/或重复使用来自相同或不同物种的一种或多种纤维母细胞系和/或原初纤维母细胞的方法。在某些其他的实施方案中，可使用来自相同或不同物种的2种、3种、4种或更多种纤维母细胞系和/或纤维母细胞最初来源，进行和/或重复鉴定选择性抑制如本文所述的SASP的化合物的方法。
为了维持细胞包括纤维母细胞和肿瘤细胞的活力，在培养基中，并且在本领域针对合适地在培养基中维持细胞所实施的条件下培养细胞，所述培养基包括这样的培养基(有或无抗体)，其还有缓冲剂和营养物质(例如，葡萄糖、氨基酸(例如，谷氨酰胺)、盐、矿物质(例如，硒))，并且还可以含有体外培养细胞所需的或有利于体外培养细胞的其他添加剂或补充剂(例如，胎牛血清或不需要补充血清的替代性制剂；转铁蛋白；胰岛素；腐胺；黄体酮)以及本领域技术人员熟知的那些(参见，例如GIBCO培养基，INVITROGEN Life Technologies,Carlsbad,CA)。类似于标准细胞培养方法和实施，将本文所述的细胞培养物维持在针对此类应用设计的组织培养箱中，以便能够控制二氧化碳(通常为5％)、湿度和温度的水平。细胞培养体系还可以包括加入外源性(即，并非由培养的细胞自身产生的)细胞生长因子，其可提供在，例如，培养基或基质或表面涂层中。用于本文所述方法的细胞的生长特性，可通过改变培养基组成或类型、调节一种或多种营养物和/或血清的量进行优化，这些程序为本领域技术人员所熟悉。组织培养领域的技术人员还应理解可能需要恰当地调节用于细胞培养(即，培养基、添加剂、营养物)的常规维持的条件，以用于细胞的某些操作，如确保本文所述技术(包括高通量筛选)的合适的细胞汇聚和生长特性。
在某些实施方案中，通过暴露于辐照(例如，X射线辐照)、暴露于化疗(例如，阿霉素)，或与表达一种或多种诱导衰老的蛋白如致癌蛋白(例如，MAPK-6、RAS、MYC、ERK、TRK、WNT)的核酸构建体转染，诱导用于鉴定或定征选择性抑制本文公开的SASP的化合物的方法的衰老细胞衰老。在某些实施方案中，衰老细胞包括与表达MAPK-6或RAS的构建体转染的细胞。
在某些实施方案中，方法还包括检测测试试剂减少/抑制/或阻止处理的衰老细胞的肿瘤侵入刺激能力的能力。肿瘤细胞侵入是转移性表型的一个标志。检测试剂的效应可通过其抑制SASP的有害性质的能力、SASP刺激肿瘤侵入的能力进行评估。本领域已知多种肿瘤侵入检测，包括，例如博伊登室检测及其修改(参见，例如Albini et al.,1987,Cancer Res.47:3239；Shaw,2005,Methods Mol.Biol.294:97-105；Nicolson,1982,J.Histochem.Cytochem.30:214-220；Rapesh,1989,Invasion&Metastasis9:192-208)。
本领域技术人员容易理解定征和鉴定本文所述的目标试剂的方法可利用设备、计算机(和计算机可读媒介)等常规用于执行该方法步骤的操作(例如，洗涤、加入试剂等)以及数据处理。分析工具如统计学分析工具也是本领域技术人员常规使用的。
疾病和医疗治疗
疾病和需要治疗的个体
需要本文所述治疗方法的个体(即，患者)为人或非人的动物。需要高功效的医疗治疗的个体可展现本文所述疾病的症状或后遗症，或者可能存在发展疾病的风险。可治疗的非人的动物包括哺乳动物，例如非人的灵长类(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类、猪类(例如，猪、小型猪)、马、犬类、猫科动物、牛和其他家畜、农场动物和动物园动物。
可接受抑制生物损伤应答试剂的个体包括患有癌症或存在发展癌症风险的个体。患有癌症的个体还包括部分或完全缓解中的(本文中也称为癌症缓解)个体。缓解指癌症标志和症状的减少或消失。在部分缓解中，癌症的一些但非所有的标志和症状消失。在完全缓解中，癌症的所有标志和症状均消失，并且如果仍有癌症细胞，它们是不可检测到的。部分或完全缓解中的，以及存在癌症复发风险的个体可从本文所述方法受益。
存在发展癌症风险的患者包括具有能增加个体发展癌症可能性的一种或多种遗传突变的那些。例如，人基因BRCA1和BRCA2属于一类称为肿瘤抑制物的基因。这些基因的突变与遗传性乳腺癌和卵巢癌相关。BRCA1突变还可增加女性发展结肠癌、子宫癌、宫颈癌和胰腺癌的风险。BRCA2的某些突变还增加胰腺癌和胃癌、胆囊癌和胆管癌以及黑素瘤的风险。具有某些BRCA1突变和/或BRCA2突变的男性同样具有增加的乳腺癌风险，并且可能滴，胰腺癌、睾丸癌和早发型前列腺癌的风险。存在发展癌症风险的个体还包括具有起因于XPD解旋酶突变的着色性干皮症的那些，其需要核苷酸切除修复。
如本文和本领域所用，术语癌症或肿瘤是临床描述性术语，其包括特征通常为展现异常细胞增殖的细胞的疾病。术语癌症通常用于描述恶性肿瘤或由肿瘤引起的疾病状态。可选地，异常生长在本领域通常可称为肿瘤。术语肿瘤如提及组织时，通常指任何异常组织生长，其特征至少部分为过量和异常细胞增殖。肿瘤可为转移性，并且能超过其解剖学起始位点和最初定植位置延伸至遍及个体身体的其他区域。癌症可包括实体瘤，或可包括液体肿瘤(例如，白血病)。
本文所述的方法可用于增加患有医学领域描述的肿瘤类型的任一种的个体中的医疗治疗(即癌症治疗)效力。癌症(肿瘤)类型包括以下：肾上腺皮质癌、儿童肾上腺皮质癌、艾滋病相关的癌症、肛门癌、附件癌、基底细胞癌、儿童基底细胞癌、膀胱癌、儿童膀胱癌、骨癌、脑瘤、儿童星形细胞瘤、儿童脑干胶质瘤、儿童中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、儿童中枢神经系统胚瘤、儿童中枢神经系统生殖细胞瘤、儿童颅咽管瘤脑瘤、儿童室管膜瘤脑瘤、乳腺癌、儿童支气管瘤、类癌瘤、儿童类癌瘤、胃肠道类癌瘤、原发灶不明癌、儿童原发灶不明癌、儿童心脏(heart)肿瘤、宫颈癌、儿童宫颈癌、儿童脊索瘤、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、儿童结肠直肠癌、胚外胆管癌、导管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、食管癌、儿童食管癌、儿童嗅神经母细胞瘤、眼癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃(stomach)癌、儿童胃(stomach)癌、胃肠道间质瘤(gist)、儿童胃肠道间质瘤(gist)、儿童路外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、妊娠滋养层瘤、胶质瘤、头颈癌、儿童头颈癌、肝细胞(肝)癌、下咽癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、维尔姆斯瘤、儿童肾瘤、朗格汉斯细胞增多病、喉癌、儿童喉癌、白血病、急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性粒细胞性白血病(cml)、毛细胞白血病、唇癌、肝癌(原发性)、儿童肝癌(原发性)、小叶原位癌(lcis)、肺癌、非小细胞性肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(cns)、黑素瘤、儿童黑素瘤、眼内(眼)黑素瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、儿童恶性间皮瘤、具有隐匿性原发灶的转移鳞状颈部癌(Metastatic squamous Neck Cancer with OccultPrimary)、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、儿童多发性内分泌瘤病综合征、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常瘤、骨髓增生性肿瘤、多发性骨髓瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、儿童鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、儿童口腔癌、口咽癌、卵巢癌、儿童卵巢癌、上皮性卵巢癌、低度恶性潜能肿瘤卵巢癌、胰腺癌、儿童胰腺癌、胰腺神经内分泌瘤(岛细胞瘤)、儿童乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、脑垂体瘤、浆细胞肿瘤、儿童胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、唾腺癌、儿童唾腺癌、尤文氏肉瘤家族肿瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、儿童横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎莱综合征、儿童皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、儿童鳞状细胞癌、睾丸癌、儿童睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、儿童胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、儿童甲状腺癌、尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)。
液体肿瘤性癌症在本领域中被归类为发生于血液、骨髓和淋巴结中的那些，并且通常包括白血病(骨髓性和淋巴细胞性)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤)和黑素瘤(包括多发性骨髓瘤)。白血病包括例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)和毛细胞白血病。实体瘤性的且在人体中以较大频率发生的癌症包括，例如黑素瘤、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、卡波西氏肉瘤、皮肤癌(包括鳞状细胞皮肤癌)、肾癌、头颈癌、咽喉癌、鼻、口腔、咽喉等的湿润粘膜内层上形成的鳞状癌层)、膀胱癌、骨肉瘤(骨癌)、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、肝癌和肾癌。本文所述的方法还可用于增加防止(即，减少发生可能性)、抑制、延迟或减缓转移性癌症进程的医疗治疗(即癌症治疗)效力。
增加医疗治疗效力的方法还可给予感染HIV的个体，包括已发展AIDS的患者。本文还描述了，患有糖尿病且接受了胰岛素的个体或通过给予血管紧张素作为医疗治疗可治疗的病症的患者，可通过接受抑制生物损伤应答的试剂受益。
医疗治疗
诱导、导致或促进生物损伤应答的医疗治疗包括遗传毒性(例如，DNA损伤)和细胞毒性治疗。此类医疗治疗的实例包括用于治疗癌症的大多数疗法，如辐照和多种化合物(即，化疗)。放疗和化疗为通过利用相比正常细胞具有不同特性的肿瘤细胞选择性靶向癌症细胞(即，肿瘤细胞)的细胞毒性试剂。例如，肿瘤细胞的不同特性和性能包括高增殖速率、组织缺氧、代谢异常、不太有效的修复能力和基因组不稳定性。
放疗包括使用高能辐照缩小肿瘤，并通过损坏其DNA杀伤癌症细胞。辐照包括X射线、γ射线和带电粒子。辐照可通过体外仪器(例如，外照射放疗)或置于体内癌细胞附近的放射性物质(即，内辐照治疗，也称为近距离治疗，其可用于，例如治疗乳腺癌和前列腺癌)递送。放疗还包括使用放射性物质如放射性碘的全身放射治疗(例如，用于治疗甲状腺癌)，其经全身递送(例如，肠道外或经口)。
可给与放疗旨在治愈癌症，例如，通过消除肿瘤或防止癌症复发或二者。在此类情形下，放疗可单独或与手术、化疗或手术和化疗组合使用。还可给与放疗以具有缓和效应，例如减轻症状(如缩小脑瘤、缩小施压于(pressing)脊柱上或骨中的肿瘤、缩小食道附近的妨碍吞咽能力的肿瘤)。本领域技术人员可容易地确定针对癌症类型、肿瘤位置和特定个体的合适的放疗方案方案(即，取决于年龄、总体健康状况等)。参见Lawrenceet al.,editors.Cancer:Principles and Practice of Oncology.8th ed.Philadelphia:Lippincott Williams and Wilkins,2008。
如本文所述，能诱导生物损伤应答的医疗治疗包括化疗(其包括组合化疗)，并且其可以称为化疗、化疗(chemotherapeutic或chemotherapeutic)药物。许多化疗为称为小有机分子的化合物。化疗被广泛用于治疗癌症。如本领域技术人员所理解，化疗还可指同步给予的两种或更多种化疗分子的组合，并且其可称为组合化疗。众多化疗药物被用于肿瘤学领域，并且包括但不限于烷化剂；抗代谢物；蒽环类、植物碱和拓扑异构酶抑制。烷化剂包括，例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、环磷酰胺、氮芥、瘤可宁、异环磷酰胺。示例性的抗代谢物包括核苷拮抗剂如嘌呤(例如，咪唑硫嘌呤、巯嘌呤)和嘧啶。核苷拮抗剂的其他实例包括5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、阿糖胞嘧啶、卡培他滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、氟达拉滨、吉西他滨和奈拉滨。长春花生物碱包括，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛；紫杉烷及其类似物和衍生物；以及紫杉烷。示例性的拓扑异构酶抑制剂为I型拓扑异构酶抑制剂如喜树碱，例如伊立替康和拓扑替康。其他拓扑异构酶抑制剂为II型拓扑异构酶抑制剂，例如amascrine、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷，其为表鬼臼毒素的半合成衍生物。可作为化疗试剂的细胞毒性抗生素包括但不限于阿霉素、道诺霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素。组合化疗通常通过本领域技术人员将会熟悉的缩写词提及，并且可包含上文和本领域描述的两种或更多种化疗药物(例如，CHOP、ABVD、BEACOPP、CAV、COPP、EPOCH、MACOP-B、MOPP、R-CHOP和Stanford V方案)。
某些化疗还可用于治疗其他病症如免疫疾病，包括自身免疫疾病(例如，强直性脊柱炎、多发性硬化、克罗恩氏病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、风湿性关节炎和硬皮病)。
生物损伤性的其他医疗治疗包括抗病毒治疗，例如，用于治疗HIV/AIDS的高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)。HAART方案可组合3种或更多种不同的药物，如两种核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)和蛋白酶抑制(PI)；两种NRTI和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)；或其他组合。
其他可诱导生物损伤应答的医疗治疗还包括激素治疗，其通常不为遗传毒性治疗。例如，已报导血管紧张素、血管紧张素II(Ang II)能促进血管炎症通过体外和体内诱导血管平滑肌细胞的提早衰老(参见，例如Kunieda et al.,Circulation114:953-60(2006))。血管紧张素是能造成血管收缩以及随后的血压增加的肽激素。已经进行了临床研究来确定给予血管紧张素至肉瘤患者是否会通过收缩血管对肿瘤具有抗肿瘤效应。胰岛素也被描述为诱导细胞衰老的激素。
医疗治疗还包括给予患有疾病如癌症，以及即将接受干细胞移植(自体或异体)个体的高剂量化疗或高剂量放疗。例如，干细胞替换疗法已被用于治疗再生障碍性贫血、霍奇金疾病、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌和白血病(包括急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、治疗相关的脊髓发育不良(t-MDS)和治疗相关的急性骨髓性白血病(t-AML))以及骨髓增生异常综合症。
术语“医疗治疗”应理解为包括本领域常规使用的其他术语，如医疗治疗、治疗剂等。医疗治疗包括给予需要治疗或预防(即，减少发生或复发的可能性)疾病或病症的个体的单种活性成分或组分、一种或多种活性成分或组分，或者多种活性成分或组分。如本文所述，作为化疗如癌症治疗的医疗治疗，可包含单种化疗试剂或可包含两种或更多种化疗药物的组合(也称为组合化疗)。再例如，如本文所述，HAART通常为3种不同病毒试剂的组合或混合物。
评估医疗治疗的效力
如本文所述，通过抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答，给予有需要的个体的抑制试剂提供了医疗治疗效力(即，疗效)的增加(即，改善)。相比未给予试剂时观察到的受益，增加医疗治疗效力造成治疗和/或预防受益的改善或增加。因此，增加医疗治疗效力可包括减弱(即，降低、减少、防止、抑制、阻止)医疗治疗的有害生物和生理效应。通过增加医疗治疗效力，可减少暴露于治疗的时间，因此，可减少生物损伤。
医疗和临床领域技术人员可容易地确定给予还接受了抑制生物损伤应答试剂的个体(即，患者)的医疗治疗效力。诊断方法的一种或任意组合,包括体格检查、临床症状的评估和监测以及进行分析测试和本文所述的方法，可用于监测个体的健康状况。
对被给予试剂的个体的治疗和/或预防受益包括，例如改善的临床结果，其中所述个体将被防止或减缓或延迟(减小)与疾病相关的不期望的生理改变，或被防止或减缓或延迟(减小)此类疾病的扩增或严重性。如本文所论述，增加医疗治疗效力可包括受益或所期望的临床结果，包括但不限于待治疗疾病导致的或相关的症状的减轻、减小或缓和；减少的症状发生；改善的生活治疗；较长的无疾病状态(即，减少个体呈现进行疾病诊断所基于的症状的可能性或倾向)；减小疾病程度；稳定(即，不恶化)疾病状态；延迟或减缓疾病进程；改善或减轻疾病状态；以及缓解(部分或总体)，不论是可检测的或不可检测的；和/或总体存活。增加医疗治疗效力还可指存活相比个体未接受抑制生物损伤应答的试剂时预期的存活延长。
在某些实施方案中，当医疗治疗为癌症治疗时，增加试剂的治疗效力造成相比未给予试剂时观察到的受益，治疗和/或预防效应改善或增加。例如，增强癌症治疗型医疗治疗包括以下任何一种或多种：减少肿瘤大小、抑制肿瘤进展、抑制肿瘤生长、延迟肿瘤定植，和/或抑制、防止或延迟肿瘤转移。增加治疗效力可包括防止、减缓或减少癌症(即，一种或多种肿瘤)对医疗治疗的耐受性的发展，从而允许另外的治疗周期和/或减少治疗周期间的时间间隔。
除了针对患有以上论述的癌症的患者的效应，对于患有医疗治疗包括高剂量化疗和/或高剂量放疗以及随后的自体或异体干细胞移植治疗的癌症的个体，可通过白细胞恢复的时间(即，天数)评估接受了抑制生物损伤应答试剂的个体中的改善的临床结果。对于接受了异体干细胞移植的个体，相比未接受试剂的个体的移植物抗肿瘤效应的改善以及移植物抗宿主病的缺少或减少，可指示增加的高剂量化疗或高剂量放疗效力。
当医疗治疗为抗病毒治疗，并且类似于癌症的放疗和化疗时，通过抑制生物损伤应答，可减少抗病毒治疗抗性的发展，可减少医疗治疗的剂量，或者可增加给予的两次剂量之间的时间间隔，从而减少暴露于治疗的时间。例如，减少完全或部分消除感染所需的时间；延长无疾病状态和/或总体存活；维持或改善免疫状态；或减小或减少病毒感染的一种或多种症状的严重性指示改善的临床结果。对于感染了HIV的人，除了上述改善的临床结果外，更有效的抗病毒治疗(包括HAART)还可提供稳定(即，降低递减速度)或改善T细胞计数；延迟或减少与严重免疫抑制相关疾病如卡波西肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤和机会感染(例如，念珠菌病、隐球菌脑膜炎、弓浆虫病；球孢子菌病；进行性多灶性白质脑病；HIV相关的脑病；带状疱疹；隐孢子虫病；CMV、分支杆菌(Mycobacterium)(包括肺结核杆菌)、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒B引起的感染、C型肝炎)发生的可能性。
患有糖尿病且接受胰岛素作为医疗治疗以及接受抑制生物损伤应答的试剂的个体的临床受益和改善，可通过葡萄糖水平的稳定性进行评估。例如，接受抑制生物应答试剂的患者中的胰岛素剂量之间的时间长度的增加或维持合适的葡萄糖水平所需的胰岛素剂量的减少指示胰岛素效力的改善。
药物组合物
本文还提供了包含任何一种或多种抑制生物损伤应答试剂的药物组合物。药物组合物可为无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂，其还包含生理上可接受的赋形剂(药学可接受的或合适的赋形剂或载体)(即，不干扰活性成分活性的无毒物质)。本文所述的赋形剂仅为示例性的，并且不具限制意义。有效量或治疗有效量指作为单一剂量或作为一系列剂量的一部分给予个体的试剂或包含一种或多种试剂的组合物的量，其可有效产生所期望的治疗效应。
通常可使用适合被治疗或预防病症的检测监测对个体的治疗效力，所述检测为本领域技术人员所熟悉，且在本文中有描述。可通过测定试剂在生物液体如血液、血液部分(例如，血清)和/或尿和/或来自个体的其他生物样品中的水平，监测给予个体的试剂的水平。可使用任何本领域实施的用于检测试剂的方法来测量治疗方案过程中的试剂水平。
本文所述的用于增加医疗治疗效力的试剂的剂量可取决于个体的状况，即疾病阶段、疾病造成的症状的严重性、总体健康状况，以及年龄、性别和体重，以及对医疗领域技术人员显而易见的其他因素。药物组合物可以医疗领域技术人员确定的适于待治疗疾病的方式给药。合适的剂量和合适的给药时间和频率取决于这样的因素如患者状况、患者的疾病的类型和严重性、活性成分的具体形式和给药方法。通常可使用实验模型和/或临床试验确定试剂的最佳剂量。最佳剂量可取决于个体的身体质量、体重或血容量。使用足以提供有效治疗的最小剂量通常是优选的。相关领域技术人员可容易地实现针对本文所述试剂(包括为获得预防受益而给予的)的临床前和临床研究的设计和执行。试剂的最佳剂量可取决于个体的身体质量、重量或血容量。例如，0.01mg/kg至1000mg/kg(例如，约0.1-1mg/kg、约1-10mg/kg、约10-50mg/kg、约50-100mg/kg、约100-500mg/kg或约500-1000mg/kg)体重的量。
可通过能有效递送有效量的试剂的几种途径中的任何一种，将药物组合物递送至有需要的个体。此类给药途径包括，例如经口、局部、肠胃外、经肠、经直肠、鼻内、口腔、舌下腺、肌肉内、经皮、阴道、直肠或通过颅内注射，或其任何组合。此类组合物可为固体、液体或气体(气溶胶)形式。
药学可接受的赋形剂为药学领域所述熟知，并且描述于，例如Roweet al.,Handbook of Pharmaceutical Excipients:A Comprehensive Guide toUses,Properties,and Safety,5th Ed.,2006,和Remington:The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro,21st Ed.Mack Pub.Co.,Easton,PA(2005))。示例性的药学可接受的赋形剂包括无菌盐水和生理pH的磷酸盐缓冲盐水。药物组合物中可提供有防腐剂、稳定剂、染剂、缓冲剂等。另外，还可使用抗氧化剂和悬浮剂。一般来说，基于给药模式以及活性成分的化学组成挑选赋形剂类型。可选地，本文所述的组合物可配制为冷冻干产物，或者可使用本领域已知的技术将试剂封装在脂质体中。可针对本文和本领域所述的任何合适的给药方式配制药物组合物。
药物组合物(例如，用于经口给药或通过注射递送的)可为液体形式。液体药物组合物可包含，例如下述一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、可用作溶剂或悬浮介质的固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂；抗氧化剂；螯合剂；调节紧张性的缓冲剂和试剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可封装在安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶中。使用生理盐水是优选的，并且可注射的要物组合物优选为无菌的。
对于口服制剂，至少一种本文所述的试剂可单独地或与合适的添加剂组合使用，以制备片剂、粉末、颗粒剂或胶囊，并且如果需要，可与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、着色剂和风味剂组合。试剂可与缓冲剂一起配制，以提供针对低pH的胃部环境的试剂保护和/或肠溶衣。可以配制组合物中包含的试剂，用于与风味剂一起，例如在液体、固体或半固体制剂中和/或与肠溶衣一起经口递送。
可以配制包含任何一种本文所述试剂的组合物用于持续或缓慢释放。此类组合物通常可使用熟知的技术制备，并通过例如，经口、直肠或皮下移植，或通过在期望靶标位点移植给药。缓释制剂可包含分散于载体基质中的和/或包含于由速率控制膜包围的容器中的试剂。用于此类制剂的赋形剂是生物相容的，并且还可为生无可降解的；优选地，该制剂制备相对恒定水平的活性成分释放。包含在缓释制剂中的活性试剂的量取决于移植位点、释放的速率和预期时间，以及待治疗或预防病症的性质。
提供了具有单位剂量的一种或多种本文所述试剂，通常为经口剂量或可注射剂量的试剂盒。此类试剂盒可包含含有单位剂量的容器、描述药物在治疗目标病理病症中的用途和伴随的受益的信息包装说明书，以及任选地用于递送组合物的器具或装置。
实施例
实施例1
p16-3MR转基因小鼠的制备
为了检测癌症中的衰老细胞在发展癌症的风险或在癌症治疗后出现的副作用中的作用，制备了包含与三峰融合蛋白可操作地连接的p16Ink4a启动子的转基因小鼠，以允许在那些转基因小鼠中检测衰老细胞和衰老细胞的选择性清除。
启动子p16Ink4a在衰老细胞而非非衰老细胞中具有转录活性(参见，例如Wang et al.,J.Biol.Chem.276:48655-61(2001)；Baker et al.,Nature,同上)，将其改造成为核酸构建体。将p16Ink4a基因启动子的片段(参见图5和6，其提供了示例性载体和示例性启动子序列)引入编码三峰受体融合蛋白的核苷酸序列的上游。三峰报告子蛋白被称为3MR，并且由海肾萤光素酶(rLUC)、单体红色荧光蛋白(mRFP)和截断的单纯性疱疹病毒胸苷激酶(tTK)组成(参见，例如Ray et al.,Cancer Res.64:1323-30(2004))。因此，3MR的表达仅由衰老细胞中的p16Ink4a启动子驱动。3种蛋白中的每种的多肽序列和编码多核苷酸均为本领域已知，并且可从公共数据库如GenBank获得。可检测的标记rLUC和mRFP允许分别通过生物发光和荧光检测衰老细胞。tTK的表达允许通过暴露于前药更昔洛韦(GCV)选择性杀伤衰老细胞，所述更昔洛韦被tTK转化为细胞毒性部分。使用已知的引入转基因至动物的方案建立了具有C57B16背景的转基因原种动物(founder animals)，并进行繁殖(参见，例如Baker et al.,Nature,同上)。转基因小鼠子在本文中称为p16-3MR。
实施例2
可检测和清除转基因p16-3MR小鼠中的衰老细胞
可使用多种生物标志检测衰老细胞，包括强上调的p16-INK4a肿瘤抑制蛋白(Campisi et al.,Nature Rev.Molec.Cell Biol.8:729-40(2007))。使用此类标记，表明在暴露于电离辐射或DNA损伤性化疗后，小鼠和人的正常细胞和肿瘤细胞均经历了衰老(Coppe et al.,PLoS Biol.6:2853-68(2008)；Schmitt et al.,Cell109:335-46(2002)；te Poele et al.,Canc.Res.62:1876-83(2002)；Le et al.,Aging Cell9:398-409(2010))。例如，p16-3MR转基因小鼠细胞在暴露于基因毒素(例如，电离辐射、DNA损伤性化学品)、表观遗传毒素(例如，扰乱组蛋白修饰或DNA甲基化的化合物)、强致有丝分裂信号(例如，激活的癌基因、增加的生长因子水平、某些激素)时将累积衰老。但是，如本文所述，p16-3MR转基因小鼠的一个优势是它们表达tTK，其允许通过给予前药更昔洛韦(GCV)至小鼠二选择性杀伤衰老细胞，因为GCV被tTK转化为细胞毒素。因此，在GCV治疗后检测了暴露于辐射的p16-3MR转基因小鼠中的衰老细胞的清除。
简而言之，将一组p16-3MR转基因小鼠暴露于全身电离辐射(7Gy X射线)，并且对对照组的p16-3MR转基因小鼠模拟辐照。3个月后，用GCV(25mg/kg)或仅媒介物处理小鼠，然后在至少2周后于给予rLUC基质后检测组织中的生物发光。
在几个组织中，辐照的小鼠(IR)显示大于小鼠(对照)2倍高的生物发光，表明rLUC在辐射暴露后3个月得到表达，因此，衰老细胞的存在是持久的(参见图1A，显示了肺组织中的生物发光结果)。此外，以GCV处理的小鼠展现与未辐照小鼠相当的rLUC表达水平，表明GCV造成衰老细胞清除(图1A)。
如文献中所已知的，衰老细胞还分泌能引起炎症的分子(Freund et al.,Trends Mol.Med.16:238-46(2010))，其如果为慢性，将刺激各种病理，包括癌症(Davalos et al.,Cancer Metastasis Rev.29:273-83(2010))–这通常称为衰老相关分泌表型(SASP)。例如，IL-6(白介素-6)和MMP-3(基质金属蛋白酶-3)是两种主要的SASP组分。因此，检测了与SASP相关的各种生物标志的RNA表达水平，包括p16INK4a(p16)、IL-6和MMP-3。另外，测量了mRFP报告子的水平。图1B表明GCV将p16INK4a(p16)、IL-6、MMP-3和mRFP表达水平回复至未辐照的对照小鼠中发现动物水平。此外，GCV显著地对给予至野生型非转基因C57Bl6小鼠时的表达水平无可检测的影响(数据未显示)。
实施例3
细胞衰老增加癌症和转移的可能性
为了检测衰老帮助、诱导或增加肿瘤形成或生长和转移可能性的作用，在清除了衰老细胞的p16-3MR转基因小鼠和具有衰老细胞(天然发展的或诱导的)小鼠中，监测了肿瘤移植物。
简而言之，在按实施例2中所述模拟辐照或辐照后约3个月，向p16-3MR转基因小鼠的尾静脉中注入106个B16小鼠黑素瘤细胞，其为与表达萤火虫荧光素酶(fLUC，以使得能够通过生物发光对其进行检测)的p16-3MR转基因小鼠(C57Bl6背景)同基因的高侵入性细胞系。每天用GCV(25mg/kg)或仅媒介物处理辐照的小鼠，为期7天，然后在最后的GCV剂量后3天，将B16小鼠黑素瘤细胞注入小鼠。B16小鼠黑素瘤细胞首先定植于肺，在注射后约2周它们在该处形成初始肿瘤，然后转移至远侧组织，形成次级肿瘤，例如胰腺、肝和内脏组织。生物发光标记fLUC和rLUC可以分辨，因为这些酶使用不同的底物。
如图2中所示，相比模拟辐照的小鼠，辐照的小鼠中的肿瘤进展的发生要快得多。注射后15天，模拟辐照的(对照)小鼠具有一些相对小的肺瘤(参见图2A)。相反，辐照的小鼠具有明显更多的原发性肿瘤，另外，这些动物具有大量的转移性肿瘤(参见图2B)–这些动物注射后第15天至第16天处于濒死状态。显著地，GCV治疗后清除了衰老细胞的辐照的小鼠显示少得多的原发性肿瘤和少许多的转移(参见图2C)。通过测量fLUC生物发光，于注射后～15-18天检测了小鼠的B16小鼠黑素瘤细胞。辐照的小鼠在辐照后第15-16天处于濒死状态，并将其处死。注射后15天，模拟辐照的(对照)小鼠和GCV治疗后清除了衰老细胞的辐照的小鼠均具有相对低的通过发光检测的B16细胞水平(参见图3)。辐照的小鼠具有通过发光检测的明显更大数目的B16细胞(参见图3)。在第18天，GCV治疗后清除了衰老细胞的辐照的小鼠仍显示相对低水平的B16细胞，与模拟辐照的对照(Ctrl)小鼠一样(参与图3)。
注射B16黑素瘤细胞后18天，在接受了GCV治疗的辐照的小鼠中明显可见大的原发性肺肿瘤(参见图4A)。但是，尽管肺中存在肿瘤，远侧器官保持几乎无转移(参见图4A；也参见图4C，其显示了肝和脂肪组织)。这与未以GCV处理的辐照的小鼠形成鲜明对比，其中肝和脂肪具有多个转移性肿瘤(参见图4B)，这些肿瘤到第15天时已存在。还对对照、辐照、和辐照+GCV处理的小鼠的发光转移性小瘤进行了计数，提供在表2中。因为脂肪组织中的小瘤难于计数，转移性细胞表示为总脂肪面积的估计％。
表2：注射后18天检测的转移性B16黑素瘤细胞
当用化疗剂阿霉素诱导衰老细胞积累时，观察到类似的结果。使用p16-3MR小鼠，治疗阿霉素(10mg/kg)诱导了组织中衰老细胞的持续性存在，类似于辐照的效应。分离了不同的组织(肝、心脏、肺、肾和脾)，并测量了编码mRFP和p16INK4a的mRNA的丰度作为衰老细胞的标志(分别参见图5A和5B)。相比未处理的对照小鼠，阿霉素处理的小鼠一致地在所有组织中表达高水平的mRFP和p16INK4a。
同样类似于辐照效应，阿霉素处理刺激了经皮下注射B16黑素瘤细胞的生长。此外，类似于辐射处理的小鼠，GCV(其清除p16-3MR小鼠中的衰老细胞)大幅减少了以阿霉素预处理的小鼠中的B16黑素瘤肿瘤的大小。简而言之，用媒介物(对照)或10mg/kg阿霉素处理p16-3MR转基因小鼠。阿霉素处理后7天，每天用GCV(25mg/kg)或仅媒介物处理小鼠，为期7天。最后的GCV处理后3天，经皮下将4x105B16小鼠黑素瘤细胞诸如p16-3MR转基因小鼠中，并在12天后处死小鼠用于分析。
采集皮肤活检样品，并测量衰老细胞生物标志的丰度(p16INK4a和mRFP mRNAs)。如图6所示，通过p16INK4a和mRFP表达测得，相比来自未处理得对照小鼠的皮肤活检样品，来自阿霉素处理小鼠的皮肤活检样品显示增加的衰老。相反，通过GCV处理清除了衰老细胞的阿霉素处理的小鼠显示低水平的p16INK4a和mRFP表达。
相比媒介物处理的对照小鼠，阿霉素处理的小鼠中的肿瘤生长增加(参见图7)。相反，GCV处理后清除了衰老细胞的阿霉素处理的小鼠显示小得多的原发性肿瘤(参见图7)。还测量了肿瘤直径，并且还证实通过GCV处理清除了衰老细胞的阿霉素处理的小鼠具有较小的肿瘤大小，并且阿霉素处理的小鼠具有增加的肿瘤大小(参见图8)。
总之，辐照或阿霉素诱导的衰老细胞群的增加与极大增加的原发性肿瘤大小和转移(仅辐照)相关，但当以GCV处理的小鼠中的衰老细胞被清除时，这被极大地消除。换句话说，这些结果表明在暴露于造成压力的衰老后衰老细胞的持续存在可促进原发性肿瘤的生长，并将推进转移发展。因此，衰老细胞清除或消除可延迟、防止或减少肿瘤形成或转移的风险或可能性。
实施例4
衰老细胞清除减小了K-Ras介导的肿瘤发生的可能性
为了检测衰老在帮助、诱导或增加K-Ras介导的肺肿瘤形成或生长和转移可能性中的作用，在INK-ATTAC转基因小鼠中检测了肿瘤形成，所述小鼠被去除了衰老细胞或具有衰老细胞(天然发展的或诱导的)。
简而言之，INK-ATTAC(通过靶向半胱天冬酶激活的p16Ink4a凋亡)转基因小鼠具有置于p16Ink4a启动子控制下的FK506结合蛋白(FKBP)-半胱天冬酶8(Casp8)融合多肽(参见图10，其提供了转基因的载体序列，以及图11，其提供了转基因组分的序列，包括启动子序列)。在AP20187(一种诱导膜结合的肉豆蔻酰化的FKBP-Casp8融合蛋白二聚化的合成药物)存在下，通过p16Ink4a启动子特异性表达FKBP-Casp8融合蛋白的衰老细胞经历了程序性细胞死亡(细胞凋亡)(参见，例如Baker,Nature,同上,其中的图1)。用K-rasLA1肿瘤模型分别繁殖两种创始细胞系(INK-ATTAC3和INK-ATTAC5)。K-rasLA1小鼠由Tyler Jacks和M.I.T.首次开发(参见Johnson,L.et al.,Nature410:1111-16(2001)。小鼠通过自发性重组事件激活沉默K-ras癌基因。K-rasLA1小鼠由于大量的肿瘤负荷而死亡/处死的平均年龄为约300天。最常见的器官位点为肺，并且从增生/发育不良至癌的不同等级的肿瘤早在6周龄时已存在，类似于人非小细胞性肺癌。转移至胸淋巴结、肾和其他内脏器官以低频率发生。其他器官位点包括胸腺(胸腺淋巴瘤)和皮肤(乳头状瘤)。伴侣菌株(K-rasLA2)在100％的时间携带与活化的等位基因(K-RasG12D)重组的等位基因。
制备了两只INK-ATTAC:K-RasLA1(一株用于INK-ATTAC系3，另一株用于系5)。从3周龄开始，每个群体的一半用2mg AP20187/g体重处理，而剩下的一半用媒介物(PBS)处理。处理后21天，将小鼠处死，并测量肺中的肿瘤多样性。发现以AP20187处理后清除了衰老细胞的INK-ATTAC3:K-RasLA1和INK-ATTAC5:K-RasLA1转基因小鼠中的肿瘤数明显减少(参见图9)。另外，在p16阳性细胞存在或不存在下诱导肿瘤后将会监测转移和总体存活。
实施例5
衰老细胞清除减少了乳腺癌或皮肤癌的可能性
可使用多西环素介导的HER2表达进行类似于实施例4中的那些的实验(参见，例如Yeh et al.,J.Clin.Investig.121:866-79(2011)；也参见Gunther et al.,FASEB16:283-92(2002))，以检测衰老在帮助、诱导或增加乳腺癌可能性中的作用。例如，创始INK-ATTAC系繁殖到转基因小鼠MMTV-HER2或双转基因小鼠MMTV-rtT:TetO-HER2遗传背景上，其中多西环素可在将衰老诱导因子(例如，辐照或化疗)用于诱导衰老细胞积累后，用于诱导乳腺肿瘤形成。
可选地，可用衰老诱导因子(例如，辐照或化疗)和随后的致癌物质处理INK-ATTAC转基因小鼠，以检测衰老在帮助、诱导或增加皮肤癌发生可能性中的作用(参见，例如Slaga et al.,J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.1:151-6(1996))。
实施例6
衰老细胞减少降低了来自衰老诱导性化疗的副作用的可能性
检测了衰老在帮助、诱导或增加例如用于治疗已发展的癌症的辐照或化疗产生副作用的可能性中的作用。此类副作用可包括肿瘤形成或生长和转移回复或复发。在去除了衰老细胞或具有衰老细胞(天然发展的或诱导的)的p16-3MR转基因小鼠中监测了副作用。
简而言之，改造肿瘤细胞系来表达萤火虫荧光素酶(fLUC)，以使得能够通过活体动物中的生物发光检测它们的肿瘤和转移。具体而言，制备了B16-fLUC小鼠黑素瘤细胞系和MMTV-PymT:fLUC乳腺癌细胞系。将肿瘤细胞注入小鼠(即，B16注入尾静脉；并且MMTV-PymT注入乳房脂肪垫)，并在1-4周的时段内允许形成小的原发性肿瘤。然后在1周的时段内给予10mg/kg的阿霉素或仅媒介物2-4次。最后的阿霉素给药后3天，经腹腔内每天5x给予25mg/kg的GCV，或仅给予媒介物。小鼠的4个不同的处理组包括(1)无阿霉素(媒介物)、无GCV(媒介物)；(2)阿霉素、无GCV；(3)无阿霉素、GCV；和(4)阿霉素、GCV。检测了组织中的生物发光(在给予rLUC底物后)，以监测肿瘤形成，并且还监测了小鼠存活。另外，可将小鼠关养在代谢笼中5-8天，以监测摄食、水消耗、身体质量、自发活动和行为、自发运动、氧消耗和二氧化碳产生。
实施例7
衰老细胞减少降低了来自衰老诱导性放疗的副作用的可能性
检测了衰老在帮助、诱导或增加例如用于治疗已发展的癌症的辐照或化疗产生副作用的可能性中的作用。此类副作用可包括肿瘤形成或生长和转移回复或复发。在去除了衰老细胞或具有衰老细胞(天然发展的或诱导的)的p16-3MR转基因小鼠中监测了副作用。
简而言之，改造肿瘤细胞系来表达萤火虫荧光素酶(fLUC)，以使得能够通过活体动物中的生物发光检测它们的肿瘤和转移。具体而言，制备了B16-fLUC小鼠黑素瘤细胞系和MMTV-PymT:fLUC乳腺癌细胞系。将肿瘤细胞注入小鼠(即，B16注入尾静脉；并且MMTV-PymT注入乳房脂肪垫)，并在1-4周的时段内允许形成小的原发性肿瘤。然后使动物组暴露于非致死性电离辐射(IR)或假辐射。最后的辐照暴露后3天，经腹腔内每天5x给予25mg/kg的GCV，或仅给予媒介物。小鼠的4个不同的处理组包括(1)无IR(假辐照)、无GCV；(2)IR、无GCV；(3)无IR、GCV；和(4)IR、GCV。检测了组织中的生物发光(在给予rLUC底物后)，以监测肿瘤形成，并且还监测了小鼠存活。另外，可将小鼠关养在代谢笼中5-8天，以监测摄食、水消耗、身体质量、自发活动和行为、自发运动、氧消耗和二氧化碳产生。
实施例8
选择性抑制衰老相关分泌表型(SASP)的组分的化合物的筛选和定征
为了鉴定潜在地抑制衰老相关分泌表型(SASP)的小分子，开发了使用静止期或衰老的正常人纤维母细胞和批准用于人应用的化合物库的筛选策略，如下文所进一步详细描述。
实验方案
细胞培养物和试剂
获得了HCA2人新生儿包皮、IMR-90人新生儿肺纤维母细胞和T47D人乳腺癌细胞，并按先前所述培养在3％O2和10％CO2中(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979；Coppe et al.,2010,PLoS ONE5:e9188)。通过X-辐照(10Gy)或慢病毒表达致癌性RAS或MAP激酶激酶6(MKK6)细胞诱导衰老，如同所述(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。衰老前的和衰老细胞分别具有>75％和<10％的24-h BrdU标记指数(Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979)；分别针对衰老相关β-半乳糖苷酶活性的<10％和>70％的阳性染色(Dimri et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9363-9367)(Biovision衰老检测试剂盒)。使用HEK293FT包装细胞(Invitrogen)产生慢病毒。皮质酮、皮质醇和RU-486获自Sigma-Aldrich。
病毒载体和感染
描述了编码致癌性RAS和MKK6的慢病毒(Coppe et al.,2008,PLoSBiol.6:2853-2868；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。编码针对GFP的shRNA(对照)和GR的慢病毒购自Open Biosystems。慢病毒NF-κB报告子-荧光素酶构建体购自SA Biosciences。制备了慢病毒并按所述使用(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。为了限制感染的副作用，将病毒滴度调整为感染90％的细胞，随后在1μg/ml嘌呤霉素中对培养物选择3天。
初始药物筛选
以96孔格式，使用自动化液体处理以Biomek FX(Beckman Coulter,CA)，进行初始药物筛选。X射线辐照后，在96孔板中，以每孔7,500个细胞的密度将衰老细胞培养24小时。后接种衰老细胞6天，在96孔板中，以每孔7,500个细胞的密度接种衰老前细胞。衰老前接种后24小时，用低(0.2％)血清洗涤衰老前和衰老细胞，并孵育48小时，以停止衰老前细胞的细胞增殖。将含有于DMSO中的1120种生物可利用的化合物的来自Prestwick Chemical Library的药物，以2.5μM于含0.2％血清的培养基的量给予至细胞。加入化合物后48小时，去除每孔中的培养基并冷冻，用于通过ELISA检测，以定量IL-6水平。将去除培养基后保留在孔中的细胞溶解，并测量ATP水平(ATPlite1步检测，Perkin Elmer,MA)，以排除通过毒性(细胞死亡)降低IL-6的化合物。将每个板中的实验孔标准化为板均值或相同板DMSO对照，以分别用于ELISA和ATP检测。
随后以糖皮质激素处理
为了验证糖皮质激素作为SASP调节物，辐照后在15min内加入它们(除非另有说明)。对于通过MKK6或RAS过表达诱导至衰老的细胞，糖皮质激素处理在感染后16小时开始。每两天重新加入糖皮质激素至新鲜培养基中。辐照或选择后6天，给予细胞有或无糖皮质激素的无血清DMEM24小时；收集条件培养基并冷冻用于ELISA。
实时定量PCR
将96孔板中的细胞(7,500/孔)溶解并使用Cells-To-Ct试剂盒(Ambion)进行逆转录。使用Roche Universal ProbeLibrary(UPL)和下述引物-探针组合进行定量PCR：微管蛋白-A(探针58；F:5’-CTT CGT CTC CGC CATCAG-3’(SEQ ID NO:25),R:5’-TTG CCA ATC TGG ACA CCA-3’(SEQID NO:26))；IL-6(探针45；F:5’-GCC CAG CTA TGA ACT CCT TCT-3’(SEQ ID NO:27),R:5’-GAA GGC AGC AGG CAA CAC-3’(SEQ IDNO:28))；IL-8(探针72；F:5’-AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC-3’(SEQID NO:29),R:5’-ATG GTT CCT TCC GGT GGT-3’(SEQ ID NO:30))；MMP-3(探针36；F:5’-CAA AAC ATA TTT CTT TGT AGA GGA CAA-3’(SEQ ID NO:31),R:5’-TTC AGC TAT TTG CTT GGG AAA-3’(SEQ IDNO:32))；GR(探针34；F:5’-GAA AGC CAC GCT CCC TTC-3’(SEQ IDNO:33),R:5’-AGA CTT AGG TGA AAC TGG AAT TGC T-3’(SEQ IDNO:34))；IL-1α(探针6；F:5’-GGT TGA GTT TAA GCC AAT CCA-3’(SEQ ID NO:35),R:5’-TGC TGA CCT AGG CTT GAT GA-3’(SEQ IDNO:36))；IκBα(探针86；F:5’-GGT GCT GAT GTC AAT GCT CA-3’(SEQID NO:37),R:5’-ACA CCA GGT CAG GAT TTT GC-3’(SEQ IDNO:38))。
蛋白质印迹
在RIPA缓冲液中溶解细胞。对溶解产物进行声处理(10sec)，然后离心。将样品在70℃孵育10min，上样至4-15％梯度tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，并通过电泳分离。将蛋白转移至PVDF膜，于室温下封闭在TBST5％牛奶中1小时，并于4℃在封闭缓冲液中用第一抗体探测过夜。在TBST中洗涤膜，并在室温下用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体孵育1小时。使用蛋白质印迹检测底物(GE Healthcare)发展印迹。
免疫荧光
将细胞培养在8孔腔室玻片中，于4℃在4％甲醛(Sigma)中固定10min，并于4℃在PBS-0.5％Triton中通透10min。将薄片在4％山羊血清(Invitrogen)中封闭30min。将第一抗体稀释于封闭缓冲液中，并在室温下与细胞孵育1小时。洗涤细胞，于室温下与第二抗体孵育30min，洗涤，并用slow-fade gold(Molecular Probes)封片。使用Olympus BX20荧光显微镜以spotfire软件(Diagnostics Instruments)捕获图像，并用Photoshop CS(Adobe)处理。
抗体
第一抗体和稀释剂为：抗GR(SC-8992,Santa Cruz；1:500)、抗肌动蛋白(ab6276,Abcam；1:50000)、抗MCR(SC-11412,Santa Cruz；1:500)、抗IRAK1(SC-5288,Santa Cruz；1:500)、抗IκBα(#9247,Cell Singaling；1:500)、抗RelA(SC-109,Santa Cruz；1:500)和抗53BP1(A300-272A,Bethyl；1:500)。用于蛋白印迹分析的第二抗体为：山羊抗小鼠IgG HRP缀合物(#170-5047,BioRad；1:5000)，和山羊抗兔IgG HRP缀合物(#166-2408,BioRad；1:5000)。用于免疫染色的第二抗体为Alexa Fluor488山羊抗兔IgG(#A11008,Invitrogen；1:750)。
NF-κB结合活性和反式激活检测
使用细胞核提取物(Active Motif)制备细胞核提取物，并使用TransAMNF-κB p65试剂盒(Active Motif)确定NF-κB DNA结合。对于反式激活检测，将感染了NF-κB报告子-荧光素酶慢病毒的细胞溶于缓冲液(Promega)中，并将荧光素酶活性标准化为细胞数，如同所述(Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。
抗体检测
洗涤培养物，并在无血清DMEM中孵育24小时，并使用DMEM将条件培养基稀释为等量细胞数。根据厂商说明书使用购自Raybiotech(AAH-CYT-G1000-8)的抗体阵列。使用GenePix4200A专业微阵列扫描仪扫描阵列。使用LI-COR Odyssey软件定量信号强度，并标准化为每个样品的阳性对照，然后将其在所有样品间标准化，如先前所述(Freund etal.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。
ELISA
过滤条件培养基并保存在-80℃。测定每个实验的细胞数。使用购自PerkinElmer(IL-6AL223F)的试剂盒和方案进行ELISA。将数据标准化并表示为pg/ml/细胞/24h。
侵入性检测
将T47D人乳腺癌细胞(120,000细胞/孔)接种于Transwell(BDBiosciences)上层小室中的基质胶层的顶上。下层小室含有来自用皮质酮或皮质醇处理10d的衰老前的或衰老的HCA2纤维母细胞的条件培养基。18h后，对迁移至上层小室过滤器的下面的细胞染色并计数，如同所述(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Coppe et al.,2010,PLoS ONE5:e9188)。
统计分析
所有图上的误差条表示至少3个独立测的量标准偏差。对于抗体阵列，使用双尾学生t检验评估信号分布间的统计显著性，并假定每个条件的3个条件培养基样品的变异相同。
糖皮质激素抑制衰老相关分泌表型的选定组分
为了确定可能为潜在的SASP调节物的小分子，开发了需要给予化合物至含有静止期的或衰老的人纤维母细胞(株系HCA2)的平行的96孔板中的筛选策略。检测的化合物包括Prestwick化合物库，其收集了约1,120中美国药品管理局批准的药物。化合物以单一浓度(2.5μM)加入一式双份孔中。48小时后，去除来自每个孔的培养基，并溶解细胞。将ELISA用于检测培养基中IL-6(一种主要的SASP因子)的存在作为化合物是否抑制或增强SASP的指示。分析了细胞溶解产物的ATP作为细胞数的替代。ATP检测的结果允许消除高毒的化合物或极大改变细胞数的化合物。
在所检测的1,120种药物中，几种抑制了IL-6分泌，而未改变ATP水平。这些药物是具有抑制SASP而不造成细胞毒性或逆转衰老生长停滞的能力的候选物。这些候选药物包括如下：皮质酮、皮质醇、强的松、雄甾酮、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列齐特、非那雄胺、炔诺孕酮-(-)-D、雌二醇-17-β、米诺地尔和苯磷硫胺。在这些候选物中，糖皮质激素家族的激素如皮质酮是最有效的。
为了确认皮质酮抑制衰老相关IL-6分泌的能力，制备了新鲜的HCA2纤维母细胞培养物，并通过X射线辐照(10Gy)诱导衰老。在这些条件下，细胞在24-48小时内经历了生长停滞，但需要4-5天后才能在培养基中检测到SASP组分(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979；Coppe et al.,2010,PLoS ONE 5:e9188；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。辐照后立即加入不同浓度的皮质酮，并将细胞在药物中保持6天。在第6天，在有或无皮质酮的无血清培养基中孵育细胞，24h后收集条件培养基，并通过ELISA分析培养基的IL-6。皮质酮以剂量依赖性方式降低IL-6分泌(图12A)。在20nM时，皮质酮减少IL-6分泌的约50％；在500nM时得到了最大抑制(>90％)。皮质酮抑制衰老细胞分泌IL-6的能力不是HCA2细胞所特有的。使用另一人纤维母细胞株系(来自肽肺的IMR-90)观察到了类似的减少(图16A)。
皮质酮是啮齿类和其他物种中的主要GR配体；然而，在人中，主要的GR配体是紧密相关的糖皮质激素皮质醇(Gross and Cidlowski,2008,Trends Endocrinol.Metab.19:331-339；Zanchi et al.,2010,J.Cell Physiol.224:311-315)。因此，测试了皮质醇抑制通过X射线辐照诱导至衰老的人纤维母细胞分泌IL-6的能力。皮质醇以剂量依赖性方式减少了IL-6分泌，并且比皮质酮更为有效(图12B)。皮质醇在亚nM浓度(160-800pM)下减少了衰老相关IL-6分泌的50％，并且在100nM下减少了>90％。
为了确定皮质酮或皮质醇是否抑制全部SASP或其抑制程度，将抗体阵列用于探测120种细胞因子和生长因子的相对分泌。用500nM皮质酮或100nM皮质醇(图12C)孵育衰老前的和衰老细胞。两种糖皮质激素均强力抑制几种促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，包括IL-6、IL-8、GM-CSF和MCP-2。另外，它们抑制几种生长和血管生成因子如VEGF的分泌。没有糖皮质激素抑制SASP的所有组分(图12C)，并因此为选择性SASP调节物。
皮质酮和皮质醇抑制衰老相关IL-6分泌的能力不限于X射线辐照诱导至衰老的细胞。两种糖皮质激素在致癌性RAS或MKK6(有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶6)的过表达诱导至衰老的细胞中有效(图12D)，其诱导生长停滞、细胞扩增、衰老相关的半乳糖苷酶(SA-Bgal)表达和强SASP(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)。
抑制糖皮质激素分泌IL-6需要存在类固醇较长时间，其间SASP被确立。在辐照(其同时诱导衰老)的细胞中，SASP确立花费3-4天，在辐照后1-2天开始(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979)。在通过X射线辐照诱导衰老之前以皮质酮预处理细胞，或在辐照后立即处理仅24小时，或在确立SASP后(辐照后7天)，对IL-6分泌没有影响(图12E)。然而，辐照后连续暴露于皮质酮7天强力抑制IL-6分泌(图12E)。
与它们对SASP的影响相反，皮质酮和皮质醇对表达SA-Bgal的细胞部分(图16B)或增大的衰老形态无影响。此外，糖皮质激素均未逆转衰老生长停滞。因此，通过X射线辐照使得衰老并用皮质酮或皮质醇处理7天的细胞保持了它们的低24h BrdU标记指数(图16C)。此外，尽管SASP取决于起源于持续性DNA损伤灶(Rodier et al.,2011,J.Cell Sci.124:68-81)的构成型低水平DNA损伤应答(DDR)信号转导(Rodier et al.,2009,Nature Cell Biol.11:973-979)，皮质酮和皮质醇对通过X射线辐照诱导至衰老的细胞的核中的持续性DNA损伤灶的数目无影响(图16D；16E)。
这些结果表明筛选选择性减少衰老细胞分泌的蛋白的分泌(包括促炎性细胞因子的分泌)的化合物是可行的。检测细胞ATP水平以检测大量的细胞损失或获得与针对原型SASP蛋白IL-6的ELISA的偶联的对偶法(dual approach)，允许鉴定具有潜在的SASP抑制活性，但无总体毒性，或者同样重要地，逆转衰老生长停滞的能力的化合物。总之，数据表明皮质酮和皮质醇减少主要SASP因子的分泌，而不影响其他主要衰老表型，包括生长停滞，并且是有效的，无论细胞是通过电离辐射诱导至衰老，或是通过致癌性RAS或MAP激酶激酶6过表达递送强致有丝分裂信号。
糖皮质激素通过糖皮质激素受体介导SASP的抑制
因为大多数SASP因子在mRNA丰度水平下均上调(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Coppe et al.,2010,PLoS ONE5:e9188)，测定了糖皮质激素对3种重要的SASP因子(IL-6、IL-8、MMP-3)的mRNA水平的影响(图13A1)。从衰老前的(模拟)或本文所述的以DMSO、500n皮质酮或100nm皮质醇处理的、衰老的、X射线辐照的HCA2细胞重提取mRNA。所有3种mRNA均被皮质酮和皮质醇强烈减少(图13A1)，表明糖皮质激素在转录水平下起作用。在第二个实验中，测定了SASP因子IL-5、IL-6、IL-8、MMP-3、IL-1α、MCP-2,、MCP-3和GM-CSF的mRNA水平(参见图13A2)。
糖皮质激素是GR亚型的配体，其在配体结合后，移位至细胞核，在细胞核中它们改变多种基因的转录；糖皮质激素的大多数生理效应取决于GR(Gross and Cidlowski,2008,Trends Endocrinol.Metab.19:331-339；Zanchi et al.,2010,J.Cell Physiol.224:311-315；Oakley and Cidlowski,2011,J.Biol.Chem.286:3177-3184)。测量了衰老或加入皮质酮或皮质醇引起的GR表达水平改变(图13B)。相对于衰老前细胞，衰老细胞中的GR mRNA水平似乎轻微增加，并且不受糖皮质激素加入的影响。GR在衰老前细胞大量存在于细胞质中，并且直到通过X射线将细胞辐照诱导至衰老后7天仍保持细胞质状态(图13C)。然而，GR响应皮质酮或皮质醇而移位至细胞核中(图13C)，表明这两种糖皮质激素均能激活GR。相反，相关的盐皮质激素受体(其也结合皮质醇并能与GR发生物理相互作用)在皮质酮或皮质醇加入后保持细胞质状态(图17A)。因此，皮质酮和皮质醇在衰老的HCA2细胞中各自特异性诱导GR核定位。
为了确定皮质酮和皮质醇抑制所选SASP组分表达的能力是否由GR介导，使用了RNA干扰(RNAi)和表达设计旨在去除GR细胞的短发卡(sh)RNA的慢病毒。定量PCR和蛋白质印迹证实两种不同的shRNA减少了GR mRNA和蛋白水平(图13D；13E)。GR去除部分地解除了皮质酮和皮质醇对IL-6分泌的抑制(图13F)。该部分的解除可能是因为shRNA不完全的GR去除(图13D；13E)。与这些结果一致，用皮质酮或皮质醇加糖皮质激素拮抗剂RU-486(Cadepond et al.,1997,Annu.Rev.Med.48:129-156；Lewis-Tuffin et al.,2007,Molec.Cell Biol.27:2266-2282)共治疗衰老细胞，解除了糖皮质激素抑制的衰老相关IL-6分泌(图13G)。RU-486封闭了该糖皮质激素活性，而未影响GR核移位(图17B)。
总之，这些结果表明两种皮质酮和皮质醇均诱导衰老细胞中的GR核移位，其通过抑制NF-κB DNA结合和反式激活活性抑制IL-1α信号转导。此外，因为GR的基因或药物抑制(RU-486)解除了糖皮质激素分泌的衰老相关IL-6的抑制，结果表明GR为衰老细胞中糖皮质激素的抑制效应所需。
糖皮质激素抑制IL-1α(上游SASP调节物)的表达
先前已证明IL-1α是SASP(衰老相关的IL-6/IL-8细胞因子网络)的至关重要的上游调节物(Orjalo et al.,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:17031-17036)。IL-1α通过激活转录因子核因子-κB(NF-κB)建立并维持SASP(Orjalo et al.,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:17031-17036；Freund et al.,2011,EMBO J.30:1536-1548)，其还刺激IL-1α转录，从而建立正反馈回路(Freund et al.,2010,Trends Molec.Med.16:238-248)。该正反馈回路引起增加的NF-κB激活，以及因此的几种SASP因子的转录。因此，检测了糖皮质激素是否通过干扰IL-1α表达抑制SASP。
在通过X射线辐照将细胞诱导至衰老后，IL-1αmRNA快速上升(图14A)。当同时加入辐照时，皮质酮和皮质醇延迟该上升，以及随后的IL-6mRNA上升(图14A；14B)。此外，在辐照后糖皮质激素继续抑制IL-1α和IL-6mRNA水平(<10％的对照)至少7天，此时SASP通常完全发展(Coppe et al.,2008,PLoS Biol.6:2853-2868；Rodier et al.,2009,Nature CellBiol.11:973-979)。
IL-1α定位至质膜和核(Werman et al.,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2434-2439；Orjalo et al.,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:10731-10736)。与IL-1αmRNA水平的抑制一致，皮质酮和皮质醇还抑制IL-1蛋白的表达，其在对照中，但非糖皮质激素处理的衰老细胞中可见为强细胞核染色(图14C)。
糖皮质激素损害IL-1α/NF-κB通路
为确定糖皮质激素是否通过抑制IL-1α信号转导而抑制SASP，测量了白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)和IκBα(NF-κB的一种抑制剂)的丰度。这两种蛋白均是IL-1α/IL-1受体(IL-1R)信号转导的关键组分(Perkins,2007,Nature Rev.Molec.Cell Biol.8:49-62；Gottipati et al.,2008,CellSignal.20:269-276)，并在IL-1R被IL-1α占用后快速降解(Perkins,2007,Nature Rev.Molec.Cell Biol.8:49-62；Gottipati et al.,2008,Cell Signal.20:269-276；Orjalo et al.,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:17031-17036)。相比衰老前细胞，衰老细胞中的IRAK1和IκBα的丰度要小的多，表明在衰老细胞中存在活跃的IL-1R信号转导(图15A)。RelA(一种NF-κB亚基)的丰度未改变。与IL-1α产生抑制和IL-1R信号转导封阻一致，皮质酮和皮质醇将IRAK1和IκBα蛋白修复至接近衰老前的水平(图15A)。此外，糖皮质激素对IκBαmRNA水平无影响(图18)，表明它们间接作用来减少蛋白水平，并且与它们对IL-1αmRNA水平的影响一致。
重组IL-1α解除了皮质酮和皮质醇对IL-6分泌的抑制(图15B)，这与糖皮质激素通过靶向IL-1α/IL-1R信号转导抑制SASP组分如IL-6的想法一致。因为已知GR能调节NF-κB活性，糖皮质激素可能用以发生作用的一种潜在的机制为通过抑制NF-κB活性。支持该模型的是，皮质酮和皮质醇显著降低了衰老细胞的NF-κB DNA结合和反式激活活性(图15C；15D,15F)。此外，用糖皮质激素加RU-486(糖皮质激素拮抗剂)或重组IL-1α共处理衰老细胞解除了NF-κB反式激活活性(图15D)。不希望受到理论的束缚，通过GR起作用的糖皮质激素似乎至少部分通过阻止最终通过损害IL-1α表达驱动SASP组分的表达和分泌的IL-1α/NF-κB正反馈环路的建立，抑制SASP。然而，一旦建立，反馈环路似乎不受糖皮质激素影响。因此，允许建立SASP的转录图谱可不同于维持其的转录图谱。
糖皮质激素抑制SASP刺激肿瘤细胞侵入的能力
衰老细胞分泌能在恶化前或恶性细胞中刺激侵入性癌症相关表型的因子(Krtolica et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:12072-12077；Liuand Hornsby,2007,Cancer Res.67:3117-3126；Coppe et al.,2008,PloS Biol.6:2853-2868；Bartholomew et al.,2009,Cancer Res.69:2878-2886；Coppe etal.,2010,PloS ONE5:e9188)。因此，研究了糖皮质激素是否抑制SASP刺激非侵入性人乳腺癌细胞(T47D)侵入博伊登室中的基膜的能力。从衰老前细胞制备的条件培养基刺激T47D细胞的最小侵入，然而来自衰老细胞的培养基刺激4倍多的侵入(图15E)，与预期的一样。皮质酮和皮质醇均将衰老的条件培养基刺激T47D侵入性的能力降低至接近衰老前的水平。因此，除了抑制多种SASP因子的分泌，糖皮质激素还抑制SASP重要的生物性质。
黄酮类芹黄素抑制衰老相关分泌表型的所选组分
使用先前描述的从使用静止期(非衰老；模拟辐照的)或通过X射线辐照诱导至衰老的HCA2人纤维母细胞的化合物文库鉴定潜在的SASP调节物的筛选方案，还鉴定了黄酮类以及糖皮质激素，其能抑制IL-6分泌而不改变ATP水平。芹黄素(4’,5,7-三羟基黄酮)是一种天然存在的植物黄酮，其存在于常见的水果和蔬菜中。
为了确定芹黄素是否抑制全部SASP或其抑制程度，使用多重ELISA来探寻50种细胞因子和生长因子的相对分泌。辐照后理解用10μM芹黄素或DMSO处理IMR90纤维母细胞，并在6天后进行分析。洗涤细胞并孵育在无芹黄素的无血清培养基中，已产生条件培养基。通过ELISA分析了来自非衰老的芹黄素或DMSO处理的辐照IMR90细胞和对照(模拟辐照的、DMSO处理的)细胞的条件培养基的各种SASP因子(图19)。如图19中所示，芹黄素抑制几种促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，包括，例如TGFA、MCP3、LIF、IFNβ、IL-6、GROA和IL-2。被抑制小于2倍的那些SASP因子不被认为受到显著抑制。
可将上述的各种实施方案组合以提供其他的实施方案。本说明书所引用的和/或申请数据表中列出的所有的美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文中。如果必需采用不同专利、申请和出版物的概念来提供其他的实施方案，可对实施方案的方面进行修改。
可以根据以上详细描述对实施方案进行这些和其他的改变。一般而言，在所附的权利要求中，所用的术语不应当理解为将权利要求限制于本说明书和所述权利要求所公开的具体实施方案，而应当理解为包括所有可能的实施方案，以及此类权利要求所享有的等同物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开的限制。

Claims (67)

1.增加个体中的医疗治疗效力的方法，包括将抑制由所述医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂给予所述个体，其中所述试剂在给予医疗治疗之前、之后或同时给药。
2.如权利要求1所述的方法，其中在给予所述医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少30天、至少60天或至少90天，将所述试剂给予所述个体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抑制生物损伤应答的试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞，或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。
4.如权利要求1所述的方法，其中在给予所述医疗治疗之前，将所述试剂给予所述个体。
5.如权利要求4所述的方法，其中在给予所述医疗治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周，将所述试剂给予所述个体。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂与给予的医疗治疗的至少一部分同时给予。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抑制生物损伤应答的试剂抑制衰老细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌。
8.如权利要求1-7中任一项所述的所述的方法，其中所述试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症、癌症在缓解、存在发展癌症复发的风险，或存在发展癌症的风险，并且其中所述医疗治疗包括抗癌症治疗。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤或液体肿瘤。
13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症，并已接受过或将接受干细胞移植，并且其中所述医疗治疗为高剂量化疗或高剂量放疗或其组合。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述干细胞移植选自(a)自体干细胞移植和(b)异体干细胞移植。
18.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述个体患有心血管疾病或存在发展心血管疾病的风险，并且其中所述医疗治疗为血管紧张素。
19.如权利要求中1-10任一项所述的方法，其中所述个体患有糖尿病，并且其中所述医疗治疗为胰岛素。
20.增加个体中的医疗治疗效力的方法，包括：
(a)向所述个体给予所述医疗治疗，所述医疗治疗诱导个体的一种或多种细胞衰老；然后
(b)向所述个体给予抗衰老细胞试剂，所述试剂选择性破坏所述一种或多种衰老细胞，或促进所述一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。
21.如权利要求20所述的方法，其中在给予所述医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少10天、至少30天、至少60天或至少90天，将所述试剂给予所述个体。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症、癌症在缓解、存在发展癌症复发的风险，或存在发展癌症的风险，并且其中所述医疗治疗包括抗癌症治疗。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤或液体肿瘤。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。
30.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症，并且已接受过或将接受干细胞移植，并且其中所述医疗治疗包括高剂量化疗或高剂量放疗或其组合。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述干细胞移植选自(a)自体干细胞移植，和(b)异体干细胞移植。
32.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述个体患有心血管疾病，或存在发展心血管疾病的风险，并且其中所述医疗治疗为血管紧张素。
33.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述个体患有糖尿病，并且其中所述医疗治疗为胰岛素。
34.抑制由医疗治疗诱导的生物损伤应答的试剂在增加医疗治疗效力中的用途，其中所述试剂适于在给予所述医疗治疗之前、之后或同时给药。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述试剂适于在给予所述医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少30天、至少60天或至少90天给药。
36.如权利要求34或权利要求35所述的用途，其中所述抑制生物损伤应答的试剂选择性破坏一种或多种衰老细胞，或促进一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。
37.如权利要求34所述的用途，其中在给予医疗治疗之前给予所述试剂。
38.如权利要求37所述的用途，其中在给予所述医疗治疗之前至少1天、至少2-6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4-5周、至少6-8周或至少10-12周，给予所述试剂。
39.如权利要求34所述的用途，其中所述试剂与给予的医疗治疗的至少一部分同时给予。
40.如权利要求34所述的用途，其中所述抑制生物损伤应答的试剂抑制衰老细胞产生的一种或多种衰老细胞相关分子的表达或分泌。
41.如权利要求34中任一项所述的用途，其中所述试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。
42.如权利要求34所述的用途，其中所述医疗治疗增加个体中的衰老细胞比例。
43.如权利要求34所述的用途，其中所述医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。
44.如权利要求34所述的用途，其中所述医疗治疗为抗癌症治疗。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述癌症包括实体瘤或液体肿瘤。
46.如权利要求44或权利要求45所述的用途，其中所述癌症为转移性癌症。
47.如权利要求43所述的用途，其中所述抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。
49.如权利要求34所述的用途，其中所述医疗治疗为高剂量化疗或高剂量放疗或其组合，其在给予干细胞移植之前或之后给予。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述干细胞移植选自(a)自体干细胞移植和(b)异体干细胞移植。
51.如权利要求34所述的用途，用于治疗或预防心血管疾病，其中所述医疗治疗为血管紧张素。
52.如权利要求1所述的用途，用于治疗或预防糖尿病，其中所述医疗治疗为胰岛素。
53.抗衰老细胞试剂在增加医疗治疗效力中的用途，其中所述医疗治疗诱导一种或多种细胞的衰老，并且其中所述试剂选择性破坏所述一种或多种衰老细胞，或促进所述一种或多种衰老细胞的选择性毁坏。
54.如权利要求53所述的用途，其中所述试剂适于在给予医疗治疗之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或至少10天、至少30天、至少60天或至少90天给药。
55.如权利要求53所述的用途，其中所述试剂为小分子、多肽、肽、抗体、抗原结合片段、肽体、重组病毒载体或核酸。
56.如权利要求53所述的用途，其中所述医疗治疗增加衰老细胞比例。
57.如权利要求53所述的用途，其中所述医疗治疗包括辐照、化疗、抗病毒治疗或激素。
58.如权利要求53所述的用途，其中所述医疗治疗包括治疗或预防癌症的抗癌症治疗。
59.如权利要求58所述的用途，其中所述癌症包括实体瘤或液体肿瘤。
60.如权利要求58所述的用途，其中所述癌症为转移性癌症。
61.如权利要求57所述的用途，其中所述抗病毒治疗为HIV/AIDS管理治疗。
62.如权利要求61所述的用途，其中所述HIV/AIDS管理治疗包括高效抗逆转录病毒治疗(HAART)。
63.如权利要求53所述的用途，用于治疗或预防心血管疾病，其中所述医疗治疗为血管紧张素。
64.如权利要求53所述的用途，用于治疗或预防糖尿病，其中所述医疗治疗为胰岛素。
65.鉴定选择性抑制衰老相关分泌表型(SASP)的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使衰老细胞与候选试剂接触，并使静止期细胞与候选试剂接触；
(b)测定所述衰老细胞和所述静止期细胞产生的一种或多种衰老相关分子的水平；
(c)测定所述衰老细胞和静止期细胞的活力；以及
(d)将所述衰老细胞产生的一种或多种衰老相关分子的水平与所述静止期细胞产生的一种或多种衰老相关分子的水平比较，
其中所述衰老细胞产生的一种或多种衰老相关分子水平的降低与所述静止期细胞活力产生的一种或多种衰老相关分子水平的降低相当，并且其中在所述候选试剂存在下所述衰老细胞和所述静止期细胞的活力未降低，指示选择性抑制衰老相关分泌表型的化合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述SASP特征性的一种或多种组分包括选自IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、IGF1、PDGF-BB、EGF、BMP4和MCP-2的一种或多种组分。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述方法以高通量筛选(HTS)形式进行。
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