KR20140119023A - 의료 요법을 개선하는 방법 - Google Patents

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KR20140119023A
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aging
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cancer
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주디스 캄피시
마르코 디마리아
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버크 인스티튜트 포 리서치 온 에이징
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

본원에서는 대상체에게 투여되는 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여함으로써 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 의료 요법에 의해 유도되는 세포 노화를 포함하는 생물학적 반응을 억제시키는 항-노화 세포 제제를 투여하는 방법을 제공한다.

Description

의료 요법을 개선하는 방법{METHODS FOR IMPROVING MEDICAL THERAPIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2011년 12월 13일 출원된 미국 가출원 번호 제61,570,166호, 및 2012년 8월 23일 출원된 미국 가출원 번호 제61/692,680호의 이점을 주장하며, 상기 출원들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 서면 사본을 대신하여 텍스트 포맷으로 제공되고, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 파일명은 200201_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 30 KB이고, 2012년 12월 13일 작성된 것이며, EFS-Web을 통해 전자 제출되었다.
정부 권익에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여하는 보조금 번호: G025901, AG09909, 및 AG017242 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 가진다.
배경
기술 분야
본원에서는 질환, 예컨대, 암, HIV/AIDS, 및 자가면역 질환을 치료하는 데 사용되는 다양한 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 본 방법에서 사용되는 제제로는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 포함한다.
관련 분야에 대한 설명
다양한 질환, 그 중에서도 특히 암 치료를 위해 세포독성 및 유전자독성 요법이 매년 수 십만 여명의 환자에게 투여된다. 암은 매우 다양한 질환을 포함하고, 전세계적으로 대략 개체 4명당 1명이 암을 앓고 있다. 미국에서, 암은 사망 의 주된 원인 중 두번째 원인이 되며, 전체 사망의 23%를 차지한다. 진단된 모든 암에 대한 상대적인 5년 생존율은 대략 68%이지만, 치료법 및 그의 성공률은 암 종류마다 다르다. 비록 암 세포를 표적하기 위해 화학요법 및 방사선요법이 디자인되기는 하였지만, 상기 요법은 암 요법의 유익한 효과가 현저히 손상될 수 있는 정도까지 정상 세포 및 조직에 악영향을 줄 수 있다.
HIV 감염으로 AIDS가 발병된 남성 및 여성에게 투여되는 고도로 활성인 항-레트로바이러스 요법은 수명을 연장하고, 감염된 대상체의 일반적인 건강 상태를 개선하는데 데 기여한다. 그러나, 이 요법 또한 정상 세포 생리에 악영향을 줄 수 있다.
간단한 요약
간략하면, 본원에서는 의료 요법에 의해 유도될 수 있는, 세포 노화를 비롯한, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여함으로써 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 본원에서는 하기 실시양태를 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에서는 대상체에게 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법은 대상체에게 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제제가 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 의료 요법은 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시킨다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 대상체에게 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제제가 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여되고, 상기 제제는 (a) 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 제제; 및 (b) 노화 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 저해하는 제제로부터 선택되는 것인, 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 의료 요법의 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일이 경과하였을 때 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 의료 요법 투여 이전에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 제제는 의료 요법의 투여 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 대상체에게 투여된다. 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제제는 투여되는 의료 요법의 적어도 일부와 동시에 투여된다. 상기 및 본원에 기술된 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 노화 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 저해한다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산이다. 특정 실시양태에서, 의료 요법은 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시킨다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 의료 요법으로는 방사선, 화학요법, 항바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암에 걸리거나, 암이 완화(remission) 중이거나, 암이 재발될 위험에 있거나, 또는 암이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법은 항암 요법을 포함한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함하고, 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 액상 종양을 포함한다. 상기 및 본원에 기술된 방법의 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 및 본원에 기술된 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법은 대상체가 암에 걸린 상태이고, 줄기 세포 이식을 받았거나, 받을 예정에 있을 때에 사용될 수 있으며, 의료 요법은 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법, 또는 그의 조합이다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포 이식은 자가 또는 동종이형 줄기 세포 이식이다.
상기 및 본원에 기술된 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 항-바이러스 요법은 HIV/AIDS 관리 요법이며, 한 실시양태에서, HIV/AIDS 관리 요법은 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함한다. 상기 및 본원에 기술된 방법의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 대상체는 심혈관 질환을 앓고 있거나, 심혈관 질환이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법은 안지오텐신이다. 상기 및 본원에 기술된 방법의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 대상체는 당뇨병을 앓고 있는 대상체이고, 의료 요법은 인슐린이다.
한 실시양태에서, (a) 대상체에게 대상체의 하나 이상의 세포에서 노화를 유도하는 의료 요법을 투여하는 단계; 및 이어서, (b) 대상체에게 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는, 항-노화 세포 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 의료 요법의 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 또는 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 제제는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산이다. 특정 실시양태에서, 의료 요법은 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 의료 요법은 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 암에 걸리거나, 암이 완화 중이거나, 암이 재발될 위험에 있거나, 또는 암이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법은 항암 요법을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함하고, 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 및 본원에 기술된 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법은 대상체가 암에 걸린 상태이고, 줄기 세포 이식을 받았거나, 받을 예정에 있을 때에 사용될 수 있으며, 의료 요법은 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법, 또는 그의 조합이다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포 이식은 자가 또는 동종이형 줄기 세포 이식이다.
상기 및 본원에 기술된 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 항-바이러스 요법은 HIV/AIDS 관리 요법이며, 한 실시양태에서, HIV/AIDS 관리 요법은 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함한다. 상기 및 본원에 기술된 방법의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 대상체는 심혈관 질환을 앓고 있거나, 심혈관 질환이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법은 안지오텐신이다. 상기 및 본원에 기술된 방법의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 대상체는 당뇨병을 앓고 있는 대상체이고, 의료 요법은 인슐린이다.
또 다른 실시양태에서, 의료 요법의 효과를 증진시키기 위한, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제의 용도로서, 제제는 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여되는 것이 적합한 것인 용도를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 의료 요법 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째에 투여되는 것이 적합하다. 한 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제제는 의료 요법의 투여 이전에 투여된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 제제는 의료 요법의 투여 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제제는 투여되는 의료 요법의 적어도 일부와 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 노화 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 억제한다. 특정 실시양태에서, 제제는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산이다. 추가의 또 다른 특정 실시양태에서, 의료 요법은 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 의료 요법은 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 의료 요법은 항암 요법이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 암은 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하고, 특정 실시양태에서는 전이성 암이다. 추가의 다른 실시양태에서, 항-바이러스 요법은 HIV/AIDS 관리 요법이다. 또 다른 실시양태에서, HIV/AIDS 관리 요법은 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 의료 요법은 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법, 또는 그의 조합이고, 이는 줄기 세포 이식을 투여하기 이전 또는 그 이후에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 줄기 세포 이식은 (a) 자가 줄기 세포 이식, 및 (b) 동종이형 줄기 세포 이식으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 제제는 의료 요법이 안지오텐신일 때, 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 의료 요법이 인슐린일 때, 당뇨병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
본원에서는 또한 의료 요법의 효과를 증진시키기 위한 항-노화 세포 제제의 용도로서, 의료 요법은 하나 이상의 세포의 노화를 유도하고, 여기서, 제제는 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 것인 용도를 제공한다.
하기 설명에서, 다양한 실시양태의 철저한 이해를 위해 특정의 구체적인 설명을 기술한다. 그러나, 당업자는 본 발명은 이러한 상세 설명 없이도 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 경우에, 실시양태의 불필요한 모호한 설명을 피하기 위해 주지된 구조는 상세하게 제시 또는 설명하지 않았다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 하기 특허청구범위 전역에 걸쳐 "포함하다(comprise)"라는 단어 및 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"과 같은 그의 파생어는 개방적이며 포괄적인 의미로, 즉, "~을 포함하나, 이에 한정되지 않는다"라는 의미로 해석되어야 한다. 또한, "포함하는(comprising)"이라는 용어 (및 예컨대, "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "가지는" 또는 "포함하는(including)"이라는 용어)는 예를 들어, 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 물질의 조성물, 조성물, 방법, 또는 공정 등의 실시양태가 기술된 특성으로 "구성되거나," 또는 "본질적으로 구성될 수 있다"는 것을 배제시키고자 하지 않는다. 본원에서 제공하는 표제는 단지 편의 목적을 위한 것이며, 주장하는 실시양태의 범주 또는 의미를 해석하는 것은 아니다.
본 명세서 전역에 걸쳐 "한 실시양태" 또는 "실시양태"라고 언급하는 것은 실시양태와 관련하여 기술된 특정의 특성, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전역에 걸쳐 여러 곳에서 "한 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"라는 어구가 나타나는 데, 이들 모두가 반드시 동일의 실시양태를 언급하는 것일 필요는 없다. 추가로, 특정의 특성, 구조, 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, "하나("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 내용상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "비-인간 동물"이라고 언급하는 것은 하나 이상의 비-인간 동물, 또는 복수 개의 상기 동물을 언급하는 것일 수 있고, "한 세포" 또는 "그 세포"라고 언급하는 것은 하나 이상의 세포 및 당업자에게 공지된, 그의 등가물 (예컨대, 복수 개의 세포) 등을 언급하는 것을 포함한다. 방법의 단계를 기술하거나, 주장할 때, 상기 단계는 특정의 발생 순서로 기술되고, 제2 단계 "이전" (즉, 전에) 존재하는 (또는 수행되는) 제1 단계라고 기술되는 것은 제2 단계가 제1 단계 "이후"에 존재하는 (또는 수행되는) 것을 언급하는 것으로 재작성된다면, 같은 의미를 가지는 것이다. 수치 또는 수치 범위를 언급할 때, "약"이라는 용어는 언급되는 수치 또는 수치 범위가 실험상 변동 범위내 (또는 통계학상 실험 오차 범위내)의 근사치를 의미하며, 따라서, 상기 수치 또는 수치 범위는 언급된 수치 또는 수치 범위의 1% 내지 15%로 달라질 수 있다. "또는"이라는 용어는 내용상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 일반적으로 그는 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다는 것에도 또한 주의하여야 한다. 예를 들어, 적어도 하나의 화합물, 또는 적어도 하나의 조성물을 언급할 때, "적어도 하나의"라는 용어는 "하나 이상의"라는 용어와 같은 의미를 가지며, 그러한 것으로 이해된다.
도 1A 및 1B는 방사선이 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 지속적인 노화 세포를 유도하고, GCV로 처리하면 노화 세포가 고갈되고, 수개의 SASP (노화 관련 분비 표현형) 바이오마커의 수준이 감소하게 된다는 것을 보여주는 것이다. 트랜스제닉 p16-3MR 마우스에 모의 방사선 조사하거나 (Ctrl), 방사선 조사하고 (IR) (7 Gy 전신 X선), 3개월 동안 하우징한 후, 본원에 기술된 바와 같이, 비히클 또는 GCV로 처리하였다. 다양한 조직을 단리시키고 (제시된 본 결과는 폐 조직에 대한 것임), 생체발광 (A), 및 p16INK4a, mRFP, IL-6 및 MMP-3 단백질을 코딩하는 mRNA의 존재비에 대해 측정하였다. 결과는 Ctrl 수준을 1로 설정한 후, 임의 단위 (AU)로 제시하였다.
도 2A-2C는 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 방사선 조사에 의해 유도된 노화 세포가 원발성 및 전이성 종양 성장을 촉진한다는 것을 보여주는 것이다. 트랜스제닉 p16-3MR 마우스에 모의 방사선 조사하거나 (Ctrl), 방사선 조사하였다 (IR). 3개월 후, 방사선을 조사받은 마우스를 비히클 (IR) 또는 GCV (IR+GCV)로 처리한 후, 상기 마우스의 꼬리 정맥에 fLUC을 발현하는 B16 흑색종 세포를 주사하였다. 15일 경과 후, B16 흑색종 세포의 생체발광을 측정하였다.
도 3은 도 2A-2C의 마우스로부터의 B16 흑색종 세포의 전신 발광 측정값을 보여주는 것이다. 방사선을 조사받은 마우스는 15-16일째에 빈사 상태였고, 이를 희생시켰다.
도 4A-4C는 노화 세포를 제거하면 전이 발생이 억제된다는 것을 보여주는 것이다. 도 2의 p16-3MR 트랜스제닉 마우스를 추가로 3일 동안 진행시켰다 (즉, 18일째). GCV로 처리된 (노화 세포가 제거된) 방사선을 조사받은 마우스에서는 결국 폐에서 원발성 종양이 발생하였다 (A). 그러나, 폐에 원발성 종양이 존재함에도 불구하고, 지방 및 간 조직은 상대적으로 전이는 없는 상태 그대로 유지되었다 (C). 대조적으로, GCV로 처리하지 않은 (노화 세포를 보유하는) 방사선을 조사받은 마우스는 간 및 지방 조직에 전이성 종양을 나타내었다 (B).
도 5A-5B는 독소루비신 처리가 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 지속적인 노화 세포를 유도한다는 것을 보여주는 것이다. 트랜스제닉 p16-3MR 마우스를 비히클 (Ctrl)로 모의 처리하거나, 또는 10 mg/kg의 독소루비신 (DOXO)으로 처리하였다. 다양한 조직 (간, 심장, 폐, 신장, 및 비장)을 단리시키고, (액틴으로 정규화된) mRFP (A) 및 p16INK4a (B)를 코딩하는 mRNA의 존재비에 대해 측정하였다.
도 6은 독소루비신이 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 지속적인 노화 세포를 유도하고, GCV로 처리하면 노화 세포가 고갈되고, SASP 바이오마커인 p16INK4 및 mRFP의 수준이 감소하게 된다는 것을 보여주는 것이다. 피부 생검을 단리시키고, (액틴으로 정규화된) p16INK4 및 mRFP의 존재비에 대해 측정하였다. 결과는 Ctrl 수준을 1로 설정한 후, 임의 단위 (AU)로 제시하였다.
도 7은 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 독소루비신 처리에 의해 유도된 노화 세포가 원발성 종양 성장을 촉진하였다는 것을 보여주는 것이다. 트랜스제닉 p16-3MR 마우스를 비히클로 처리하거나 (Ctrl), 또는 독소루비신 (10 mg/kg)으로 처리하였다. 7일 후, 독소루비신으로 처리된 마우스를 비히클 (DOXO) 또는 GCV (DOXO + GCV)로 모의 처리한 후, fLUC을 발현하는 B16 흑색종 세포를 피하로 주사하였다. 12일 후, B16 흑색종 세포의 생체발광을 측정하였다.
도 8은 독소루비신으로 처리된 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 노화 세포를 제거하면 종양 크기가 축소된다는 것을 보여주는 것이다. 트랜스제닉 p16-3MR 마우스를 비히클로 처리하거나 (Ctrl), 또는 독소루비신 (10 mg/kg)으로 처리하였다. 7일 후, 독소루비신으로 처리된 마우스를 비히클 (DOXO) 또는 GCV (DOXO + GCV)로 모의 처리한 후, 이어서, fLUC을 발현하는 B16 흑색종 세포를 피하 주사하였다. 12일 후, 원발성 종양의 직경을 측정하였다.
도 9는 노화 세포를 제거하면, 노화 세포가 제거, 또는 감소되지 않은 마우스와 비교하였을 때, K-Ras 유도성 폐 종양의 다발성이 억제된다는 것을 보여주는 것이다.
도 10A-10D는 p16Ink4a 프로모터-FKBP-카스파제-IRES-GFP 핵산 구축물을 포함하는 pBLUESCRIPT II KS 벡터의 핵산 서열 (서열 번호 1)인, 노화 세포에서 선택적으로 발현된 예시적인 트랜스진의 목록을 제공하는 것이다.
도 11A-11F는 다양한 벡터 성분 및 구축물 성분이 표지되어 있는, 도 10의 핵산 서열 목록을 제공하는 것이다.
도 12A-12E는 코르티코스테론 및 코르티솔이 SASP를 부분적으로 억제한다는 것을 보여주는 것이다. (A) 10 Gy으로 X-조사된 노화 (Sen (XRA)) HCA2 섬유아세포를 명시된 농도의 코르티코스테론 또는 최고 농도의 DMSO (비히클 대조군)를 함유하는, 배지 + 10% 혈청 중에서 인큐베이션시켰다. 방사선 조사 직후 세포에 코르티코스테론 또는 DMSO를 제공하고, 6일 후 분석하였다. 세포를 세척하고, 코르티코스테론을 함유하지 않는 무혈청 중에서 인큐베이션시켜 조절된 배지를 생성하였다. 노화 전 (Pre) 및 대조군 또는 코르티코스테론으로 처리된 Sen (XRA) 세포로부터의 조절된 배지를 ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다. (B) 세포를 처리하고, 조절된 배지를 생성하고, (A)에 기술된 바와 같이 분석하되, 단, 코르티솔은 명시된 농도로 사용하였다. (C) 조절된 배지를 (A)에 기술된 바와 같이 DMSO, 코르티코스테론 (50 nM), 또는 코르티솔 (100 nM)로 처리된 노화 전 (PRE) 또는 노화 (XRA) 세포로부터 수집하였다. 조절된 배지를 항체 검정법에 의해 분석하였다. PRE 및 XRA DMSO 세포로부터의 평균 신호를 기준선으로서 사용하였다. 기준선보다 높은 신호는 회백색 (우측 스케일 상의 +1 참조)이고; 기준선보다 낮은 신호는 PRE DMSO에 의해 예시되는 바와 같이, 암회색 (우측 스케일 상의 +1 참조)이다. 색상 강도는 평균값으로부터의 로그2배만큼의 변화를 나타낸다. 샘플 사이의 계층적 클러스터링이 계통수로 제시되어 있다 (좌측). *인자는 코르티솔에 의해 유의적으로 (P < 0.05) 억제된 것을 나타내는 것이다. ‡인자는 코르티코스테론에 의해 유의적으로 (P < 0.05) 억제된 것을 나타내는 것이다. (D) 세포를 RAS- 또는 MKK6을 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 선별 후, 6일 동안 세포에 DMSO-, 500 nM 코르티코스테론 (C1) 및 100 nM 코르티솔 (C2)을 제공하였다. 앞서 기술된 바와 같이 조절된 배지를 생성하고, ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다. *인자는 DMSO 처리로부터 유의적인 차이를 보이는 것이다 (P < 0.05). (E) 세포를 X-방사선 조사 (XRA, 화살표 표시) 이전 또는 이후 명시된 간격 동안 (a-d, 하부 패널에 굵은선으로 표시) 500 nM 코르티코스테론으로 처리하였다. 조절된 배지를 제조하고, ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다 (상부 패널). *인자는 DMSO 처리로부터 유의적인 차이를 보이는 것이다 (P < 0.05).
도 13A-13G는 글루코코르티코이드가 SASP에 미치는 효과는 글루코코르티코이드 수용체 (GR)에 의존한다는 것을 보여주는 것이다. (A1) 도 12의 범례에 기술되어 있는 바와 같이, DMSO, 500 nM 코르티코스테론 (C1) 또는 100 nM 코르티솔 (C2)로 처리된 노화 전 (Pre) 또는 노화 (Sen (XRA)) HCA2 세포로부터 mRNA를 추출하였다. (A2) 도 12에 기술되어 있는 바와 같이, DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리된 노화 전 (모의) 또는 노화 X-조사된 HCA2 세포로부터 mRNA를 추출하였다. IL-5, IL-6, IL-8, MMP-3, IL-1α, MCP-2, MCP-3, 및 GM-CSF에 대한 전사체를 (튜불린으로 정규화된) 정량적 PCR에 의해 정량화하였다. *인자는 DMSO 처리로부터 유의적인 차이를 보이는 것이다 (P < 0.05). (B) 앞서 기술된 바와 같이, DMSO, 500 nM 코르티코스테론 (C1), 또는 100 nM 코르티솔 (C2)로 처리된 Pre 및 Sen (XRA) 세포로부터 mRNA를 추출하고, GR에 대한 전사체를 (튜불린으로 정규화된) PCR에 의해 정량화하였다. 비록 GR mRNA 수준이 노화 세포에서는 약간 상승하는 경향이 있는 것으로 나타났지만, 그러한 증가는 통계학상 유의적이지 않았다. (C) 앞서 기술된 바와 같이, DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리된 Pre 및 Sen (XRA) 세포를 X-방사선 조사 후 1, 4, 및 7일째 GR에 대하여 면역염색시켰다. (D) GFP (대조군) 또는 GR에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 세포를 감염시키고 선별하였다. 선별 후 7일째, mRNA를 추출하고, GR에 대한 전사체를 (튜불린으로 정규화된) PCR에 의해 정량화하였다. (E) (D)에 기술된 shGFP 및 shGR을 발현하는 세포로부터 전체 세포 용해물을 제조하고, 웨스턴 블롯팅에 의해 GR 및 액틴 (대조군)에 대해 분석하였다. (F) shGFP- 또는 shGR을 발현하는 렌티바이러스로 감염된 세포에 X-조사하고, 이후 즉시 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리하였다. 7일 후, 조절된 배지를 수집하고, ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다. (G) 세포를 (F)에 기술된 바와 같이 처리하되, 단, RU-486을 명시된 용량으로 첨가하였다. 조절된 배지를 수집하고, ELISA에 의해 IL-6 분비에 대해 분석하였다.
도 14A-14C는 글루코코르티코이드가 IL-1α 발현을 억제한다는 것을 보여주는 것이다. (A) 노화 전 (Pre) HCA2 세포를 24시간 동안 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리하거나, X-방사선 조사에 의해 노화를 유도하고 (Sen (XRA)), 이후 즉시 DMSO, 코르티코스테론, 또는 코르티솔을 제공하였다. mRNA를 추출하고, 명시된 시간 간격을 두고, 그 시간이 경과한 후, IL-1α에 대한 전사체를 (튜불린으로 정규화된) PCR에 의해 정량화하였다. (B) (A)에 기술된 세포로부터 추출된 mRNA를 사용하여 (튜불린으로 정규화된) IL-6에 대한 전사체를 정량화하였다. (C) (A)에 기술된 바와 같이 제조된 Pre 및 Sen (XRA) 세포를 IL-1α에 대해 면역염색하였다. 방사선 조사 후 7일째 Sen (XRA) 세포를 면역염색하였다.
도 15A-15F는 글루코코르티코이드가 IL-1α/NF-κB 경로를 손상시키고, 종양 세포 침습을 유도할 수 있는 SASP의 능력을 억제한다는 것을 보여주는 것이다. (A) 전체 HCA2 세포 용해물을 재조합 IL-1α 단백질 (rIL-1α)의 부재 (좌측 패널) 또는 존재 (우측 패널)하에서 DMSO, 500 nM 코르티코스테론 (C1), 또는 100 nM 코르티솔 (C2)로 처리된 노화 전 (Pre) 세포, 또는 노화 세포 (Sen (XRA))로부터 제조하고, 용해물을 웨스턴 블롯팅에 의해 IRAK1, IκBα, RelA, 및 액틴 (대조군)에 대해 분석하였다. (B) 방사선 조사 후, Sen (XRA) 세포에 DMSO, 50 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔을 제공하였다. 6일 후, 무혈청 배지 중 글루코코르티코이드의 존재하에서 재조합 IL-1α 단백질을 명시된 용량으로 세포에 제공하였다. 24시간 후 조절된 배지를 수집하고, ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다. (C) 상기 기술된 바와 같이 DMSO, 500 nM 코르티코스테론 (C1) 또는 100 nM 코르티솔 (C2)로 처리된 Pre 세포 및 Sen (XRA) 세포로부터 핵 추출물을 제조하고, NF-κB DNA 결합 활성에 대해 분석하였다. (D) NF-κB-루시퍼라제 수용체 구축물을 보유하는 렌티바이러스로 세포를 감염시키고, 그에 방사선 조사하고, 노화시켰다. 방사선 조사 투여 직후, 명시된 바와 같이, 0.5 μM RU-486 또는 2.5 ng mL-1 IL-1α와 같이 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 세포를 처리하였다. 방사선 조사 후 7일째, 세포를 트립신으로 처리하고, 계수하고, 용해시키고, 세포 개수로 정규화된 루시퍼라제 활성에 대해 검정하였다. (E) 도 12에 기술된 바와 같이 코르티코스테론 (C1) 또는 코르티솔 (C2)로 처리된 노화 전 (Pre) 또는 노화 (Sen (XRA)) 세포로부터 조절된 배지를 제조하였다. 이어서, 실험 방법에 기술된 바와 같이, T47D 인간 유방암 세포의 기저막으로의 침습을 자극시킬 수 있는 능력에 대해 조절된 배지를 검정하였다. (F) 재조합 IL-1α 단백질 (rIL-1α)의 부재 (좌측 패널) 또는 존재 (우측 패널)하에서 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리된, Pre 세포, 및 Sen (XRA) 처리 세포로부터 핵 추출물을 제조하고, NF-κB DNA 결합 활성에 대해 분석하였다.
도 16A는 X-방사선 조사에 의해 노화가 유도되고 (10 Gy; Sen (XRA)), 방사선 조사 후 즉시, 7일 동안 명시된 농도의 코르티코스테론, 또는 최고 농도의 DMSO (비히클 대조군)로 처리된 IMR-90 섬유아세포를 보여주는 것이다. 노화 전 (Pre) 및 대조군 및 글루코코르티코이드로 처리된 Sen (XRA) 세포로부터의 조절된 배지를 ELISA에 의해 IL-6에 대해 분석하였다. 도 16B는 7일 동안 DMSO, 500 nM 코르티코스테론 (C1), 또는 100 nM 코르티솔 (C2)로 처리된 Sen (XRA) HCA2 세포를 보여주는 것이다. SA-Bgal을 발현하는 노화 전 (Pre) 및 Sen (XRA) 세포의 비율(%)을 점수화하였다 (상부 패널). 각 조건에 상응하는 대표적인 필드 또한 제시되어 있다 (하부 패널). 도 16C는 (B)에 기술된 바와 같은 Pre 및 Sen (XRA) HCA2 세포에 24시간 동안 BrdU를 제공하고, 그를 고정하고, 핵 BrdU 염색에 대해 면역염색한 후, BrdU 양성 세포의 비율(%)에 대해 분석한 결과를 보여주는 것이다. 도 16D는 (B)에 기술된 바와 같은 Pre 및 Sen (XRA) 세포를 53BP1에 대해 면역염색한 것에 관한 결과를 보여주는 것이다. 셀 프로파일러(CELL PROFILER) 소프트웨어를 사용하여 53BP1 핵 병소가 > 2인 세포의 비율(%)을 측정하였다. 각 조건당 200개 이상의 세포를 분석하였다. 도 16E에는 셀 프로파일러 소프트웨어를 사용하여 측정된, (D)로부터의 53BP1 병소의 평균 개수를 보여주는 것이다.
도 17A는 미네랄코르티코이드 수용체에 대해 면역염색된 노화 전 (A) 또는 Sen (Xra) HCA2 세포를 보여주는 것이다. 방사선 조사 직후, Sen (XRA) 세포에 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔을 제공하고, 이후 1 또는 7일째에 면역염색하였다. 도 17B는 RU486의 존재 또는 부재 (-)하에서 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리되고, GR에 대해 면역염색된 Sen (XRA) HCA2 세포를 보여주는 것이다.
도 18은 24시간 동안 DMSO, 500 nM 코르티코스테론, 또는 100 nM 코르티솔로 처리된 Pre HCA2 세포, 및 X-방사선 조사 직후를 출발로 하여 7일 동안 상기 화합물로 처리된 (XRA) HCA2 세포로부터 mRNA를 추출하였다. mRNA 추출물을 (튜불린으로 정규화된) 정량적 PCR에 의해 정량화하였다. DMSO로 처리된 Pre 세포에서 IκBα mRNA의 수준을 임의로 값 1로 지정하였다.
도 19는 아피게닌 처리가 SASP를 부분적으로 억제한다는 것을 보여주는 것이다. (모의 방사선 조사되고, DMSO 처리된) 대조군, DMSO 처리된 (DMSO) 또는 아피게닌 처리된 노화 (Api) 세포로부터의 조절된 배지를 다중 ELISA에 의해 SASP 발현에 대해 분석하였다. 결과는 대조군 (모의 방사선 조사되고, DMSO 처리된) 세포에 대한 차이 배수로 제시되어 있고, 여기서, 수직축은 로그 스케일이다.
상세한 설명
본원에서는 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 의료 요법, 예컨대, 암 화학요법, 방사선 치료법, 호르몬 요법, 및 다양한 항-바이러스 요법은, 이상 대사, 증식, 수복 능력 및/또는 다른 생리학적 및 생물학적 특성에 기인하여 상기 요법에 대해 감수성이 더 클 것으로 가정된, 질환을 유발하는 이상(aberrant) 또는 비정상적인 세포를 표적화하도록 의도되고 디자인된 것이다. 그러나, 상기 의료 요법, 특히 전신에 투여되는 것은 정상 세포에도 작용함에 따라, 세포 노화 유도를 비롯한, 세포 손상, 세포독성, 및/또는 유전자독성 효과를 일으킨다. 손상된 정상 세포 및 조직의 의료 요법에 대한 생물학적 반응은 예를 들어, 의료 요법에 대한 저항성을 촉진하고/거나, 기저 질환을 악화시킴으로써 기저 질환을 치료하는 요법의 효과를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용은 생물학적 반응을 손상시키는 것을 억제하는 제제를 투여하여 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공함으로써 의료업계에 기여한다.
한 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하고, 본원에 기술된 방법에 유용한 제제로는 (a) 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴 (사멸, 소거, 제거)하거나, 또는 그러한 세포의 선택적 파괴, 사멸, 소거, 또는 제거를 촉진하고/거나, (b) 노화 세포에 의한 하나 이상의 노화 세포-관련 분자 (예컨대, 비제한적인 일례로, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 프로테아제)의 생산 및 분비를 억제하는, (본원에서 항-노화 세포 제제로 명명되는) 제제를 포함한다. 본원에 예시되어 있는 바와 같이, 암 요법에의 노출에 기인하여 동물에서 세포 노화가 확립된 이후에도, 항-노화 세포 제제에 의해 노화 세포를 제거한 결과, 종양 진행을 저해하는 요법의 효능은 증진되었고, 전이성 질환은 유의적으로 감소되었다. 또한 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 생물학적 손상 반응이 세포 노화의 유도를 포함할 때, 노화 세포에 의한 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 저해하는 제제는 종양 세포 침습을 억제한다.
의료 요법의 효과를 증진시키는 방법
의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여된 억제제는 그러한 생물학적 손상 반응을 억제시킴으로써 의료 요법의 효과 (즉, 효능)를 증진 (즉, 개선)시킨다. 상기 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하면, 상기 제제가 투여되지 않은 경우에 관찰되는 이익과 비교하여 의료 요법의 치료학적 및/또는 예방학적 이익은 개선 또는 증가하게 된다. 특정 실시양태에서, 의료 요법의 효과를 증진시키는 것은 의료 요법의 유해한 생물학적 및 생리학적 효과를 억제하는 것을 포함한다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 의료 요법의 효과 증진을 필요로 하는 대상체에게 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제 (즉, 감소, 저하, 예방, 저해, 약화)시킬 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진하는 방법을 제공한다. 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 의료 요법의 투여 이전 또는 그 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 의료 요법과 함께 동시에 투여될 수 있다. 상기 제제는 일례로는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산을 포함한다.
의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응으로는 치료받는 대상체의 요법에의 노출시에 유도되는 것인, 대상체의 세포, 조직 관련 및/또는 전신 반응을 포함한다. 본원에 기술된, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응으로는 세포 노화, DNA 손상 반응 (본원 및 당업계에서 DDR로도 명명된다), 암을 앓는 대상체에서의 종양 촉진 반응, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 경우에, 의료 요법이 세포 노화를 유도할 때, 대상체에서 노화 세포의 비율은 증가하게 된다. 환언하면, 대상체에서 노화 세포의 개수는 의료 요법을 받지 않은 대상체에 존재하는 것보다 더 많다.
생물학적 손상 반응을 억제하는데 유용한 제제로는 생물학적 손상 반응을 둔화 또는 감소 (억제)시키는 방식으로 노화 세포의 활성 또는 생리학적 성질을 변경하는 제제를 포함한다. 생물학적 손상 반응을 억제 (즉, 통계학상 또는 임상적으로 유의적인 방식으로 감소 또는 저해)시키는 제제로는 세포 손상인, 의료 요법에 대한 반응으로 세포에 의해 발현 및/또는 상향 조절되는 폴리펩티드 (예를 들어, 노화 세포-관련 폴리펩티드)의 발현 및/또는 분비를 저해 또는 감소시키는 것을 포함한다. 따라서, 상기 제제로는 세포 신호전달 경로를 저해, 방해, 또는 파괴하는 것, 또는 폴리펩티드의 전사 또는 번역 또는 수송을 저해 또는 감소시키거나, 또는 일부 경우에는 그를 방해하는 것을 포함한다.
유도된 생물학적 손상 반응으로 세포 노화의 유도 및 확립을 포함하는 경우, 유용한 제제로는 노화 세포를 파괴하거나, 또는 파괴 (또는 소거, 사멸, 또는 제거)를 촉진함으로써 손상 반응을 억제하는 항-노화 세포 제제를 포함한다. 따라서, 구체적인 실시양태에서, 대상체의 하나 이상의 세포의 노화를 유도하는 것인 의료 요법을 대상체에게 투여하는 단계; 및 이어서, 대상체에게 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 것인 항-노화 세포 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 항-노화 세포 제제를 변경 (예컨대, 차단 또는 저해)시키거나, 또는 일부 경우에, 제제가 생물학적 손상 반응을 억제할 수 있도록 노화 세포의 생리학적 성질을 변경하는 제제 또한 유용하다. 특정 실시양태에서, 제제는 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 저해시킨다.
본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 노화 세포-관련 폴리펩티드의 생산 및 분비를 감소시키는 것이 생물학적 손상 반응을 억제할 수 있으며, 암과 관련해서는 그를 통해 종양 진행 및/또는 전이를 감소시킬 수 있다. 노화 세포-관련 폴리펩티드는 본원에서 더욱 상세하게 기술되어 있는, 노화 세포의 노화 관련 분비 표현형 (SASP)의 성분 또는 분자인 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는데 유용한 제제로는 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴 (사멸, 소거, 제거)하거나, 또는 하나 이상의 노화 세포의 선택적 파괴, 사멸, 소거, 또는 제거를 촉진하는, (본원에서 항-노화 세포 제제로 명명되는) 제제를 포함한다. 시험관내 세포 연구를 통해, 노화는 SASP가 확립되기 전까지의 시간으로 입증되는 바와 같이, 방사선 조사에 노출된 후 대략 3 내지 10일 사이에 확립되는 것으로 밝혀졌다 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., PLoS Biol. 6:2853-68 (2008)]; [Rodier et al., Nature Cell Biol . 11:973-70 (2009)]; [Laberge et al., Aging Cell 11(4):569-578 (2012). doi: 10.1111/j. 1474-9726.2012.00818.x. Epub 2012 Apr 17)]). 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 유용한 제제로는, 일단 세포 및 조직의 의료 요법에의 노출에 의해 유도된 생물학적 손상 반응 (예컨대, 세포 노화)을 억제, 저해, 제거, 또는 감소시킬 수 있는 것을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는상기 제제는 의료 요법을 투여한 이후에 투여된다.
본원에 기술된 방법에서 유용한 제제로는 또한 노화 세포-관련 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 저해하기 위해 노화 세포-관련 분자에 특이적으로 결합하여 그와 상호작용하는 제제를 포함한다. 별법으로, 제제는 노화 세포-관련 분자의 동족 리간드 (예컨대, 세포 수용체 또는 다른 세포 표면 폴리펩티드, 신호전달 분자, 분비된 분자)에 결합하여, 그를 통해 노화 세포-관련 분자의 그의 동족 리간드에의 결합을 차단하거나, 저해할 수 있다. 이어서, 이러한 저해 또는 차단은 다르게는 상기 제제의 부재하에서 발생되는 생물학적으로 손상된 활성을 억제시킬 수 있다.
본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, SASP의 특징이 되는 노화 세포-관련 분자의 폴리펩티드의 생산 및/또는 분비를 감소시키고/거나, (노화 관련 분비 표현형을 특징으로 하는) 노화 세포 집단을 감소시키는 것이 놀랍게도 치료학적 (또는 예방학적) 결과 (예컨대, 종양 진행 및/또는 전이 감소)를 개선시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 암 요법 (예컨대, 방사선 조사, 화학요법)인 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 암 요법, 예컨대, 방사선 및 화학요법 약물에 의해 유도되는 생물학적 손상 반응으로는 세포 노화를 포함한다. 노화 세포 존재는 종양 진행을 촉진하는 데, 이는 종양 성장 촉진 및 크기 증가, 전이 촉진, 및 분화 변경을 포함할 수 있다. 본원에 예시된 바와 같이, 노화 세포 파괴시, 종양 진행은 현저하게 저해되고, 이로써, 종양의 크기는 축소되고, 전이성 성장은 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다.
암 요법 (예컨대, 방사선 또는 화학요법)을 포함하는 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응으로는 노화 세포-관련 분자의 발현을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 유용한 제제로는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자, 예컨대, 하나 이상의 노화 세포-관련 폴리펩티드 (예컨대, 비제한적인 일례로, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 프로테아제)의 생산 및 분비 저하를 촉진하는 제제를 포함한다. 당업계 및 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 노화 세포의 표현형, 예컨대, 노화 관련 분비 표현형 (SASP)으로도 지칭되는 표현형은 예를 들어, 다수의 시토카인 (예컨대, 염증성 시토카인), 성장 인자, 세포외 기질 성분 (ECM) 및 ECM-분해 효소, 및 프로테아제의 분비를 특징으로 한다. 특정 경우에서, 예컨대, 암을 앓는 대상체에서, 상기 인자의 분비는 예를 들어, 바람직하지 못한 염증성 반응에 대한 원인이 됨으로써 유해할 수 있다.
하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 생산 및 분비 저하를 촉진하는 제제는 생물학적 손상 반응을 유도하는 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 생산 및 분비 저하를 촉진하거나, 그의 생산 및 분비를 저하시키는 제제는 방사선요법 또는 화학요법 투여 후 즉시 또는 곧 (예컨대, 24, 48, 또는 72시간 이내) 투여될 수 있다. 일례로, 제제로는 글루코코르티코이드, 예컨대, 코르티코스테론 및 코르티솔, 프레드니손, 안드로스테론; 플라보노이드 (예컨대, 아피게닌, 루테올린, 나린게닌); 톨라자미드; 클로르프로파미드; 글리클라지드; 피나스테리드; 노르게스트렐-(-)-D; 에스트라디올-17-베타; 미녹시딜; 벤포티아민; 칼시페롤; 노스카핀, 및 프로부콜을 포함한다.
본 개시내용에서 제공되는 바와 같이, 글루코코르티코이드는 SASP를 포함하는 인자 전부는 아니지만, 일부 (예컨대, IL-6, IL-1α 신호전달)를 억제하였다(예컨대, 노화 성장 정지). 기초 지식으로서, 글루코코르티코이드는 코르티솔, 코르티코스테론, 덱사메타손 및 관련 유사체를 포함하는 스테로이드 호르몬 부류이며, 이들 모두는 대사 및 면역 기능에 대하여 매우 다양한 조직 특이 효과를 가진다 (예컨대, 문헌 [Gross and Cidlowski, 2008, Trends Endocrinol . Metabl. 19:331-339]; [Zanchi et al., 2010, J. Cell . Physiol . 224:311-315] 참조). (예컨대, [Schlossmacher et al., 2011, J. Endocrinol . 211: 17-25] 참조). 글루코코르티코이드는 각각 면역 세포 아폽토시스를 유도함으로써, 또는 항-염증성 시토카인을 활성화하거나, 또는 염증유발성 시토카인을 코딩하는 유전자를 억제함으로써 염증을 억제하는 것으로 여겨진다. 후자의 활성은 다중 이소폼으로 및 번역후 번형된 상태로 존재하며, 편재적으로 발현된 글루코코르티코이드 수용체 (GR)에 의해 매개된다 (예컨대, 문헌 [Zanchi et al., 2010, J. Cell . Physiol. 224:311-315]; [Oakley and Cidlowski, 2011, J. Biol . Chem. 286:3177-3184] 참조). 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 글루코코르티코이드 (예컨대, 코르티코스테론 및 코르티솔)는 SASP가 유해하다고 판단되는 조건에서는 임상적으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 상세하게 기술되는 바와 같이, DNA 손상 방사선 및 화학요법은 생체내에서 SASP를 유도할 수 있는데 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol . 6:2853-2868]), 이는 전신에 유해한 영향을 미칠 수 있고, 그뿐만 아니라, 항암 요법에 의해서 근절되지 않은 종양 세포의 재성장을 자극시킬 수 있는 능력을 가질 수 있다. 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 생산 및 분비 저하를 촉진하거나, 그의 생산 및 분비를 저하시키는 상기와 같은 제제의 용도는 본원에 기술된, 생물학적 손상 반응을 억제하는 방법에서 유용하다.
또 다른 특정 실시양태에서, 방사선요법 또는 화학요법의 유해한 부작용 발생 감소, 저해, 또는 예방, 또는 그러한 부작용의 중증도 감소를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 제제, 예컨대, 하나 이상의 노화 관련 분자 (예컨대, SASP 인자 또는 성분)의 발현, 생산, 및/또는 분비를 저해하는 제제를 투여함으로써, 방사선요법 또는 화학요법의 (특정의 구체적인 실시양태에서는 생물학적 손상 반응과 관련이 있거나, 또는 그의 결과일 수 있는) 유해한 부작용 발생을 감소, 저해, 또는 예방하거나, 또는 그러한 부작용의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일례로, 유해한 부작용으로는 구역, 구토, 말초 신경병증, 피로감, 빈혈, 탈모, 동통, 감염, 점막염, 체액 잔류, 설사, 변비, 손톱 또는 피부상의 문제, 구강, 잇몸, 또는 목구멍상의 문제, 또는 방사선요법 또는 화학요법에 의해 유발된 부작용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (예컨대, 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute) 웹 사이트 참조).
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 제제로는 대상체에서 정상 세포의 노화를 예방하는 (즉, 그의 발생 가능성을 감소시키는) 것을 포함한다. 상기 제제는 생물학적 손상 반응을 억제 또는 저해하거나, 또는 일부 방식으로 그를 방해할 수 있는 상기 제제로는 세포 신호전달 경로를 저해, 방해, 또는 파괴하는 것, 또는 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 저해 또는 감소시키거나, 또는 일부 방식으로 그를 방해하거나, 또는 손상 반응에 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 다른 노화 세포-관련 분자의 생산을 방해하는 것을 포함한다. 일례로, 유용한 제제로는 일부 방식으로 IL-1α 감소를 촉진하는 것으로서, SASP의 상류 조절인자인 것인 제제를 포함한다. IL-1α는 전사 인자 핵 인자-카파 B (NF-κB)를 활성화시킴으로써 SASP를 확립하고, 유지시킨다 (예컨대, 문헌 [Orjalo et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 106: 17031-36 (2009)]; [Freund et al., EMBO J. 30: 1536-48 (2011)] 참조). 추가의 일례로, (a) p53 활성 및 PI3K/AKT 경로를 조절하는 WNT16B; (b) p53의 양성 상류 조절인자인 p16; (c) pRB의 양성 상류 조절인자인 ARF; (d) p53의 하류 이펙터인 p21; (e) 온코진 경로, 예를 들어, RAS-RAF-MEK 경로에 유사분열촉진 신호를 전달하는 하나 이상의 인자; (f) 안드로겐 수용체 경로를 자극하는 하나 이상의 인자의 발현 및/또는 활성을 저해하는 제제; 또는 노화 관련 신호전달 경로를 자극시킬 수 있는, 반응성 산소 종의 생산을 저해하는 제제 또한 유용하다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 의료 요법 이전 (전), 이후 (후), 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, (세포 노화를 비롯한) 생물학적 손상 반응이 발생하였을 때, 제제는 의료 요법 투여 이후, 예를 들어, 대상체가 의료 요법을 받은 후, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 30, 60 또는 적어도 90일, 또는 적어도 3-10일, 10-30일, 30-60일 또는 적어도 60-90일의 시간이 경과한 후에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 제제는 의료 요법 투여 후 2-10일 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일) 사이에 투여된다. 의료 요법을 투여한 후 투여하는 데 유용한 제제로는 비제한적인 일례로, 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 그의 선택적 파괴를 촉진하는 제제 (예컨대, 항-노화 세포 제제)를 포함한다. 다른 제제로는, 노화 세포-관련 분자의 활성을 차단 또는 저해하거나, 또는 노화 세포-관련 분자의 발현 및/또는 분비를 저해하여 상기 분자의 활성으로부터 초래되는 생물학적 손상을 감소시키는 것을 포함한다. 1회 초과의 주기로 의료 요법을 투여하는 것을 포함하는 의료 요법 방식과 관련하여, 제제는 각 주기 후인 것을 비롯한, 1회 이상의 주기로 요법을 투여한 후 (그 이후) 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포 또는 조직의 의료 요법에의 노출시 세포에서 손상 반응이 개시되지 못하도록 방해 또는 저해할 수 있는 제제, 또는 손상 반응을 약화시킬 수 있는 (즉, 그의 중증도를 감소시킬 수 있는) 제제를 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 의료 요법의 투여 이전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 예를 들어, 상기 요법의 투여 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 투여된다. 1회 초과의 주기로 의료 요법을 투여하는 것을 포함하는 의료 요법 방식과 관련하여, 제제는 각 주기 전인 것을 비롯한, 1회 이상의 주기로 요법을 투여하기 전 (그 이전) 투여될 수 있다.
동시 투여란 제제를 의료 요법 투여 1-24시간 이내에 투여하는 것을 의미한다. 동시 요법은 의료 요법 투여과 제제 투여가 중첩되는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 의료 요법 중 일부와 동시에 투여된다. 일례로, 제제 투여는 의료 요법 투여 1-24시간 이내에 투여될 수 있고, 제제는 의료 요법 과정이 완료된 이후에 계속해서 투여된다. 일례로, 제제는 의료 요법 투여 1-24시간 이내에 1차 투여되고, 제제는 추가로 1-10, 2-10, 3-10, 4-10, 5-10, 6-10, 7-10, 8-10, 9-10일 동안, 또는 10일보다 더 긴 기간 동안 (즉, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9일 또는 10일) 동안 계속해서 투여된다. 환언하면, 전달하고자 하는 제제 총량 중 적어도 일부인 제제 일부를 의료 요법 투여과 동시에 (1-24시간 이내) 투여한다. 특정 실시양태에서, 제제는 (예컨대, 세포의 SASP에 의해 예시되는) 세포 노화가 확립되는 동안 장기간 동안에 걸쳐 투여될 수 있다. 상기 치료 요법은 제제를 투여하지 않는 경우에 발생되는 생물학적 손상을 유의적으로 감소시키는 방식으로 노화 세포의 분비 표현형을 변경시킬 수 있다. 1회 초과의 주기로 의료 요법을 투여하는 것을 포함하는 의료 요법 방식과 관련하여, 제제는 각 주기의 의료 요법 투여과 함께 동시에 투여하는 것을 비롯한, 1회 이상의 주기로 요법을 투여함과 동시에 투여될 수 있다.
본원에서는 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 적어도 2종의 제제 (즉, 2개 이상의 제제)를 투여함으로써 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법 또한 고려된다. 편의상, 적어도 2종의 제제는 본원에서 제1 제제 및 제2 제제로 명명되며, 이는 함께 부가 방식으로 또는 시너지 방식으로 생물학적 손상 반응을 억제할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 적어도의 제제가 투여될 때, (편의상 제1 제제로 명명되는) 적어도 1종의 제제는 의료 요법에 노출되었을 때, 세포가 손상 반응을 개시하지 못하도록 방해 또는 저해할 수 있거나, 세포 및 조직에 의한 손상 반응을 약화 (즉, 그의 중증도를 감소)시킬 수 있는 제제이다. 상기 제제로는 본원에 기술된 바와 같은, 대상체에서 정상 세포의 노화를 예방하는 (즉, 그의 발생 가능성을 감소시키는) 것을 포함한다. 따라서, 상기 제제는 의료 요법 투여 이전에 투여된다. (본원에서 편의상 제2 제제로 명명되는) 적어도 1종의 추가의 제제는 의료 요법에의 노출에 대한 결과로서 나타나는 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 하나 이상의 노화 세포의 선택적 파괴, 사멸, 소거, 또는 제거를 촉진하는 항-노화 세포 제제이다. 제2 제제는 생물학적 손상 반응을 유도할 수 있는 의료 요법 투여 이후에 투여된다.
적어도 2종의 제제를 투여하는 것을 포함하는 요법은 대상체가 수회 주기로 생물학상 손상 요법인 의료 요법을 투여하는 것을 필요로 할 때에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 의료 요법은 암 요법, 예컨대, 방사선 또는 화학요법, 또는 방사선 및 화학요법이 조합이다. 제1 제제는 의료 요법 투여 이전 제제가 생물학적 손상 반응을 억제할 수 있도록 하는 데 충분한 시간 이전에, 예를 들어, 상기 요법을 투여하기 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 투여된다. 제2 제제는 대상체가 의료 요법을 받은 후, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 30, 60일, 또는 적어도 90일의 시간이 경과한 후, 예를 들어, 세포 노화가 유도되고, 확립된 이후에 투여된다. 제1 및 제2 제제들이 각각 투여되는 시점은 요법 종류 및 각 주기의 요법 사이의 시간 간격에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 의료 요법 주기 사이의 시간 간격 (이는 또한 갭으로도 불림)에 따라, 제1 제제는 의료 요법 투여 이전 적어도 1일, 적어도 2-6일, 또는 적어도 1주 전에 투여되고, 제2 제제는 대상체가 의료 요법을 받은 후 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일의 시간이 경과한 후 투여된다.
생물학적 손상 반응
의료 요법에 의해 유도될 수 있는 (즉, 활성화, 촉진, 또는 자극받게 되는) 생물학적 손상 반응으로는 치료받는 대상체의 요법에의 노출시에 유도되는 것인, 대상체의 세포, 조직 관련 및/또는 전신 반응을 포함한다. 본원에 기술된, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응으로는 세포 노화, DNA 손상 반응 (본원 및 당업계에서 DDR로도 명명된다), 종양 촉진 반응, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
노화 유도 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응은 에피게놈 파괴 또는 게놈 손상을 유발할 수 있다. 부식된 텔로머라제는 지속적인 DDR을 발생시키고, 이는 노화 성장 정지를 개시하고, 유지시킨다. 많은 노화 세포는 또한 비텔로머 부위에 게놈 손상을 보유하며, 이는 노화 성장 정지에 필요한 지속적인 DDR 신호전달을 발생시킬 수 있다. 생물학적 손상 반응은 검출가능한 DDR 신호전달의 부재하의 세포 노화를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Rodier et al., J. Cell Biol. 192:547-56 (2011)], 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌 참조). 추가로, 보통은 노화 성장 정지를 강화하는 시클린-의존성 키나제 저해제 (CDKis), 특히, p21WAF1 및 p16INK4a의 이소성 발현은 뚜렷한 DDR 없이도 노화를 유발할 수 있다.
특정 실시양태에서, 정상 세포 및/또는 세포 이외의 의료 요법은 의료 요법에 의해 상해를 입거나, 손상된 것 (예컨대, 종양 세포)을 표적화하는 것으로 한다. 예를 들어, 영향을 받은 정상 세포는 의료 요법의 표적(들)인 세포 및 조직 주변의, 그에 인접한, 또는 그를 포함하는 미세환경을 포함한다. 예를 들어, 암 치료와 관련하여, 방사선 또는 화학요법을 포함하는 의료 요법은 종양 세포를 표적화하지만; (고형 또는 액상일 수 있는) 상기 종양 주변 또는 그에 인접한 미세환경의 양성 세포는 상기 요법에의 노출시 의료 요법 유도성 손상 반응을 보일 수 있다.
세포 노화는 안정적이고, 본질적으로 영구적인 세포 증식의 정지이며, 이는 유전자 발현에 광범위한 변화를 동반한다. 정상 세포 및 종양 세포, 둘 모두의 많은 종류의 세포는 스트레스에 대한 반응으로 노화된다. 당업계에 기술되어 있는 바와 같이, 노화 세포의 표현형, 예컨대, 노화 관련 분비 표현형 (SASP)으로 언급되는 표현형은 예를 들어, 다수의 시토카인 (예컨대, 염증성 시토카인), 성장 인자, 세포외 기질 성분 (ECM) 및 ECM-분해 효소, 및 프로테아제 분비를 특징으로 한다. 증식 정지가 종양 진행으로의 엄청난 장벽을 제기하고 (예컨대, 문헌 [Campisi, Curr . Opin . Genet . Dev. 21:107-12 (2011)]; [Campisi, Trends Cell Biol. 11:S27-31 (2001)]; [Prieur et al., Curr . Opin . Cell Biol. 20: 150-55 (2008)] 참조), 노화 세포에 의해 분비된 분자가 조직 수복을 자극시킬 수 있지만 (예컨대, 문헌 [Adams, Molec . Cell 36:2-14 (2009)]; [Rodier et al., J. Cell Biol. 192:547-56 (2011)] 참조), 노화 세포 또한 염증을 유발할 수 있는 분자를 분비한다 (예컨대, 문헌 [Freund et al., Trends Mol . Med . 16:238-46 (2010)]; [Davalos et al., Cancer Metastasis Rev . 29:273-83 (2010)] 참조). 낮은 수준의 만성 염증은 노화 조직의 특징이며, 사실상, 염증은 암을 비롯한, 모든 주요 연령 관련 병리의 주요 원인이거나, 그의 원인 제공 인자가 된다 (문헌 [Ferrucci et al., 2004, Aging Clin . Exp . Res . 16:240-243]; [Franceschi et al., 2007, Mech. Ageing Dev. 128: 192-105]; [Chung et al., 2009, Ageing Res . Rev . 8:18-30]; [Davalos et al., 2010, Cancer Metastasis Rev. 29:273-283]; [Freund et al., 2010, Trends Molec . Med . 16:238-248]). 따라서, 노화됨에 따라, 및 연령 관련 병리 부위에서 증가하는 노화 세포는 국소 만성 염증 및 조직 리모델링을 자극시킴으로써 노화성 퇴행성 질환 뿐만 아니라, 연령 관련 암, 둘 모두를 자극할 수 있다.
노화 세포는 하기 특징들 중 임의의 하나 이상의 것을 나타낼 수 있다. (1) 노화 성장 정지는 본질적으로 영구적이며, 공지된 생리학적 자극에 의해서는 역전될 수 없다. (2) 노화 세포의 크기는 비대해지고, 종종 비노화 대응물의 크기와 비교하면 2배 초과로 비대해진다. (3) 노화 세포는 노화 관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal)를 발현하는데, 이는 부분적으로는 리소좀 매스(mass)의 증가를 반영한다. (4) 대부분의 노화 세포는 p16INK4a를 발현하는 데, 이는 일반적으로는 휴지 또는 분화가 완료된 세포에 의해서는 발현되지 않는다. (5) 지속적인 DDR 신호전달과 함께 노화되는 세포는 노화를 강화시키는 크로마틴 변형을 포함하는 DNA 세그먼트(DNA-SCARS: DNA segments with chromatin alterations reinforcing 노화)로 명명되는 지속적인 핵 병소를 보유한다. 상기 병소는 활성화된 DDR 단백질을 포함하고, 이는 일과성 손상 병소와는 구별이 된다. DNA-SCARS는 기능부전성 텔로머라제 또는 텔로미어 기능부전 유도성 병소 (TIF)를 포함한다. (6) 노화 세포는 본원에서 노화 세포-관련 분자로 명명되는 분자를 발현하고, 그를 분비할 수 있는데, 이는 특정 경우에 지속적인 DDR 신호전달의 존재하에서 관찰될 수 있다.
노화 세포-관련 분자로는 성장 인자, 프로테아제, 시토카인 (예컨대, 염증성 시토카인), 케모카인, 세포 관련 대사산물, 반응성 산소 종 (예컨대, H2O2), 및 대상체의 기저 질환을 촉진하거나, 악화시킬 수 있는 염증 및/또는 다른 생물학적 효과 또는 반응을 자극하는 다른 분자를 포함한다. 노화 세포-관련 분자로는 당업계에 노화 관련 분비 표현형 (SASP), 노화-메시지 전달 세크리톰, 및 DNA 손상 분비 프로그램 (DDSP)을 포함하는 것으로 기술되어 있는 것을 포함한다. 당업계에 기술되어 있는 바와 같이, 상기와 같은 노화 세포-관련 분자 분류는 공통된 분자를 포함하며, 3가지 별개의 상이한 분자 분류를 기술하고자 하는 것은 아니다. 노화 세포-관련 분자는 특정의 발현 및 분비된 성장 인자, 프로테아제, 시토카인, 및 강력한 자가분비 및 측분비 활성을 가질 수 있는 다른 인자를 포함한다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 노화 세포의 부정적 효과는 적어도 부분적으로는 염증유발성 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 노화 세포의 SASP를 포함하는 프로테아제 분비의 결과인 것으로 여겨진다 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., PLoS Biol . 6:2853-68 (2008)] 참조). SASP를 포함하는 노화 세포-관련 분자는 정상적인 조직 구조 및 기능을 파괴할 수 있고, 전암성 또는 비-침습성 암 세포에서 악성 표현형을 자극시킬 수 있다 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., 상기 문헌 동일]; [Coppe et al., J. Biol . Chem . 281:29568-74 (2006)]; [Coppe et al., PLoS One 5:39188 (2010)]; [Krtolica et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98: 12072-77 (2001)]; [Parrinello et al., J. Cell Sci. 118:485-96 (2005)] 참조). ECM 관련 인자로는 염증성 단백질 및 ECM 리모델링 매개인자를 포함하며, 이는 노화 세포에서 강하게 유도된다 (예컨대, 문헌 [Kuilman et al., Nature Reviews 9:81-94 (2009)] 참조). 의료 요법에 의해 표적화되는 세포, 예컨대, 종양 세포에 대하여 측분비 효과를 가질 수 있는 인자로는 유전자독성 요법인 의료 요법에의 노출 이후 세포에서 발현이 상승되는 세포외 단백질을 포함한다 (예컨대, 문헌 [Sun et al., Nature Medicine, 18: 1359-1368 (2012)]). 또한, 예컨대, 문헌 [Campisi, 2003, Nature Rev . Cancer 3:339-349]; [Coppe et al., 2010, Annu . Rev . Pathol . 5:99-118 Williams, 1957, Evolution 11:398-411]; [Collado et al., 2010, Nature Rev . Cancer 10:51-57]; [Beausejour et al., 2006, Nature 443:404-405]; [Krizhanovsky et al., 2008, Cell 134:657-667]; [Jun et al., 2010, Nature Cell Biol. 12:676-685]; [Parrinello et al., 2005, J. Cell Sci . 118:485-496]; [Acosta et al., 2008, Cell 133: 1006-1018]; [Kuilman et al., 2008, Cell 133: 1019-1031]; [Laberge et al., 2012, Cancer Microenivron . 5:39-44]도 참조할 수 있다.
노화 세포-관련 분자로는 노화 세포의 염증유발성 표현형 (예컨대, SASP)을 구성할 수 있는 분비된 인자를 포함한다. 이러한 인자로는 제한없이 GM-CSF, GROα, GROα,β,γ, IGFBP-7, IL-1α, IL-6, IL-7, IL-8, MCP-1, MCP-2, MIP-1α, MMP-1, MMP-10, MMP-3, 엠피레귤린, ENA-78, 이오탁신-3, GCP-2, GITR, HGF, ICAM-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, IL-13, IL-1β, MCP-4, MIF, MIP-3α, MMP-12, MMP-13, MMP-14, NAP2, 온코스타틴 M, 오스테오프로테그린, PIGF, RANTES, sgp130, TIMP-2, TRAIL-R3, Acrp30, 안지오게닌, Axl, bFGF, BLC, BTC, CTACK, EGF-R, Fas, FGF-7, G-CSF, GDNF, HCC-4, I-309, IFN-γ, IGFBP-1, IGFBP-3, IL-1R1, IL-11, IL-15, IL-2R-α, IL-6R, ITAC, 렙틴, LIF, MMP-2, MSP-a, PAI-1, PAI-2, PDGF-BB, SCF, SDF-1, sTNF RI, sTNF RII, 트롬보포이에틴, TIMP-1, tPA, uPA, uPAR, VEGF, MCP-3, IGF-1, TGF-β3, MIP-1-델타, IL-4, FGF-7, PDGF-BB, IL-16, BMP-4, MDC, MCP-4, IL-10, TIMP-1, Fit-3 리간드, ICAM-1, Axl, CNTF, INF-γ, EGF, BMP-6을 포함한다. 당업계에서는 종종 노화 메시지 전달 세크리톰 (SMS) 인자로 지칭되는 것을 포함하는, 확인된 추가 인자로는 제한없이 IGF1, IGF2, 및 IGF2R, IGFBP3, IDFBP5, IGFBP7, PAl1, TGF-β, WNT2, IL-1α, IL-6, IL-8, 및 CXCR2-결합 케모카인을 포함하며, 그 중 일부는 SASP 폴리펩티드 목록에 포함된다. 세포 관련 분자는 또한 제한없이 문헌 [Sun et al., Nature Medicine , 상기 문헌 동일]에 기술되어 있는 인자를 포함하며, 이는 예를 들어, 유전자 MMP1 , WNT16B, SFRP2 , MMP12 , SPINK1 , MMP10 , ENPP5 , EREG , BMP6 , ANGPTL4 , CSGALNACT , CCL26, AREG , ANGPT1 , CCK , THBD , CXCL14 , NOV , GAL , NPPC , FAM150B , CST1 , GDNF , MUCL1, NPTX2 , TMEM155 , EDN1 , PSG9 , ADAMTS3 , CD24 , PPBP , CXCL3 , MMP3 , CST2 , PSG8, PCOLCE2 , PSG7 , TNFSF15 , C17orf67 , CALCA , FGF18 , IL8 , BMP2 , MATN3 , TFP1 , SERPINI 1, TNFRSF25, 및 IL23A의 생성물을 포함한다. 노화 세포-관련 단백질로는 또한 노화 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질 (또는 수용체)를 포함하며, 이는 이는 비-노화 세포의 세포 표면 상에는 검출가능하게 더 낮은 양으로 존재하거나, 존재하지 않는 단백질을 포함한다.
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제로는 당업자가 억제가 통계학성 또는 임상적으로 유의적인 것으로 인식하는 정도로까지 손상 반응을 감소 또는 저해하는 제제를 포함한다. 생물학적 손상 반응을 억제할 수 있는 제제로는 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 항체, 항원 결합 단편 (즉, 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드), 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산을 포함한다.
노화 세포를 "선택적으로" 파괴하거나, 그의 "선택적인" 파괴를 촉진하는 치료제는 우선적으로 (또는 더 큰 정도로) 노화 세포를 파괴하거나, 또는 그의 파괴를 촉진하거나, 또는 노화 세포의 소거 또는 제거를 촉진하는 제제이다. 다시 말해, 치료제는 비-노화 세포를 파괴하거나, 또는 그의 파괴를 촉진할 수 있는 그의 능력과 비교하여 생물학적으로, 임상적으로, 및/또는 통계학상 유의적인 방식으로 노화 세포를 파괴하거나, 또는 그의 파괴를 촉진한다. 비제한적인 일례로, 치료제는 세포막의 완전성을 파괴함으로써; 세포에서 하나 이상의 대사 과정을 저해함으로써; 노화 세포의 아포프토시스 또는 괴사를 유도하는 신호전달 경로를 증진 또는 자극시킴으로써; 세포 생존에 필요한 유전자 또는 단백질, 각각의 전사 또는 번역을 파괴함으로써; 또는 노화 세포에 결합하여, 예를 들어, 면역 세포에 의한 소거와 같은, 세포의 소거 또는 제거를 촉진함으로써, 또는 그의 임의 조합에 의해 노화 세포를 직접 또는 간접적으로 사멸시킬 수 있다.
또한, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 노화 세포-관련 분자 (예컨대, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포외 기질 성분 (ECM) 및 ECM-분해 효소, 및 프로테아제)의 발현, 분비, 또는 생물학적 활성을 저해하는 제제가 본원에 기술된 방법에 유용하다. 특정 실시양태에서, 제제는 본원에 기술되고, 당업계에 공지된 SASP 인자 (또는 성분) 중 하나 이상의 것의 생산 및 분비를 저해 (감소, 저하, 방해)한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP3, MCP2, IGF1, PDGF-BB, EGF, 및 BMP-4 중 적어도 하나 이상의 임의의 것의 생산 및/또는 분비를 저해 (즉, 감소, 억제, 방해, 차단)하는 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 제제는 IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP3, MCP2, IGF1, PDGF-BB, EGF, 및 BMP-4 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 임의의 것, 또는 그들 모두의 생산 및/또는 분비를 저해한다.
관심의 대상이 되는 제제로는 비-노화 세포보다는 노화 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 효소에 의해 활성화되거나, 또는 활성 형태로 전환되는 전구약물인 것을 포함한다. 관심의 대상이 되는 다른 제제로는 비-노화 세포와 비교하여 노화 세포 상에서 오직, 또는 더 높은 수준으로 존재하는, 세포의 세포 표면 상이 단백질에 결합하는 것이다. 상기 단백질의 예로는 돌연변이체 베타 액틴; 베타-액틴 (ACTB) 단백질; 약물 저항성 관련 단백질 LRP; 주요 볼트 단백질 (MVP); 갑상샘 호르몬 결합 단백질 전구체; 프롤릴 4-히드록실라제, 베타 서브유니트 전구체 (P4HB); A쇄, 인간 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI); 전자-전달-플라보단백질, 베타 폴리펩티드 (ETFP); ATP 신타제, H+ 수송, 미토콘드리아 F 복합체, 알파 서브유니트 전구체; 카텝신 B; 및 무명의 단백질 생성물, GI: 35655, GI: 158257194; 및 GI 158259937 (예컨대, 특허 출원 공개 번호 WO 2009/085216의 표 1 참조 (상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨))을 포함한다. 특정 실시양태에서, 노화 세포에 특이적으로 결합하는 치료제는 비-노화 세포보다 노화 세포에 대하여 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 100, 또는 1,000배 더 큰 친화도를 가지거나, 또는 특정 실시양태에서, 제제는 비-노화 세포에는 검출가능하게 결합하지 않는다. 노화 세포에 특이적으로 결합하는 펩티드로는 PCT 특허 출원 공개 번호 2009/085216에 기술되어 있는 12-아미노산 펩티드를 포함한다. 비-노화 세포보다 노화 세포에 더 높은 수준으로 존재하는 단백질은 전형적으로 세포내 단백질이고, 비-노화 세포의 세포 표면 상에서는 검출불가능한 단백질일 수 있다. 세포 노화를 비롯한 생물학적 손상 반응을 억제하는 다른 제제로는 비-노화 세포에서보다 노화 세포에서 더욱 빈번하게 또는 더 높은 비율로 발생하는 대상 과정에 의해 활성화되는 것을 포함한다.
세포 노화를 비롯한, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제로는 노화에 중요한 유전자 생성물의 분비 및/또는 발현을 직접 또는 간접적으로 저해하거나, 또는 유전자 생성물의 생물학적 활성을 저해하는 제제를 포함한다. 이러한 유전자 생성물의 예로는 하기 표에 제공되어 있으며; 또한, 문헌 [Sun, et al., 상기 문헌 동일]도 참조할 수 있다.
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본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 제제로는 세포 노화를 억제하는 것을 비롯한, 생물학적 손상 반응을 억제하는 소 유기 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제제는 또한 노화 세포를 파괴하거나, 그의 파괴 또는 제거 또는 소거를 촉진하는 소 분자를 포함한다. 관심의 대상이 되는 소 분자 화합물은 활성이 개선된 화합물을 수득하기 위해 무작위로 또는 SAR에 의해 유도체화될 수 있다. 소 유기 분자의 분자량은 전형적으로 105 달톤 미만, 104 달톤 미만, 또는 103 달톤 미만이다.
본원에 기술된 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법에 유용한 제제로는 항체, 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 단편은 완전 항체로부터 제조되는 단편일 수 있다. 항원-결합 단편은 또한 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 유용한 항체 및 항원-결합 단편은 비-노화, 정상 세포와 비교하여 노화 세포에 의해 과도하게 발현되거나, 선택적으로 발현되거나, 또는 오직 노화 세포에서만 발현되는 동족 항원에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 항체는 그의 동족 항원과의 내재화를 통해 노화 세포에 의해 내재화되는 내재화 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있다. 내재화 항체 또는 항원-결합 단편은 세포독성 제제를 노화 세포로 전달하는 데 유용할 수 있다.
항체의 그의 동족 항원에의 결합 특성은 일반적으로 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 투여될 수 있는, 예를 들어, 효소-결합 면역흡수 검정법 (ELISA), 면역침강, 면역블롯팅, 향류 면역전기영동, 방사면역검정법, 도트 블롯 검정법, 저해 또는 경쟁 검정법 등을 비롯한, 면역검출 방법을 사용하여 측정되고 평가될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조). 본원에서 사용되는 바, 항체가 검출가능한 수준으로 항원 면역원과 반응할 경우, 이는 동족 항원에 "면역특이성이거나," "특이적이거나," 또는 "특이적으로 결합하는" 것이라고 할 수 있다. 항체 및 그의 항원 결합 단편의 친화도는 종래 기법, 예를 들어, 문헌 [Scatchard et al., (Ann . N. Y. Acad. Sci . USA 51:660 (1949))]에 기술되어 있는 것을 사용하여, 및 표면 플라스몬 공명 (SPR; 비아코어(BIAcore)™, 바이오센서(Biosensor: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
항체는 당업계에서 통상 투여하고, 본원에 기술되어 있는 방법 및 기법에 따라, 동물을 면역화한 후, 항체를 단리시키거나, 특이 B 세포로부터 클로닝함으로써 제조된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 가변 영역 또는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 항원-결합 단편 또는 펩티드 라이브러리로부터 확인하고 단리시킬 수 있다. 항체, 또는 항원-결합 단편은 재조합적으로 조작되고/거나, 재조합적으로 제조될 수 있다.
항체는 면역글로불린 부류, 예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 또는 IgA에 속하는 것일 수 있고, 동물, 예를 들어, 가금류 (예컨대, 닭), 및 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 다른 설치류, 소, 말, 양, 염소, 낙타, 인간, 또는 다른 영장류를 포함하나, 이에 한정되지 않는 포유동물로부터 수득되거나, 그로부터 유래된 것일 수 있다. 인간 대상체에서의 사용을 위해, 항체 및 항원-결합 단편은 전형적으로 인간, 인간화된 항체이거나, 또는 비-인간 펩티드 및 폴리펩티드 서열에 대한 대상체에 의한 면역 반응을 감소시키기 위해 키메라 항체이다.
항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이특이성 항체, 또는 그로부터 제조되거나, 유래된 항원-결합 단편 (예컨대, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, 및 Fd)인 모노클로날 항체일 수 있다. 항원-결합 단편은 또한 특이 항원에 결합하여 복합체를 형성한다는 점에서 항체와 유사하게 작용하는, 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 구성된 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 Fv 단편, 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자 (scFv 단백질), 및 초가변 영역을 모사하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위를 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항체는 다량체 항체 단편, 예컨대, 미니항체, 항원 특이성이 상이한 제2 Fv와 결합된, 한 항원에 대하여 특이적인 제1 Fv를 포함하는 이특이성 및 이작용성 항체, 및 디아바디 등이다. 유용한 방법은 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Hayden et al., Curr Opin . Immunol. 9:201-12 (1997)]; [Coloma et al., Nat . Biotechnol . 15:159-63 (1997)]; 미국 특허 번호 제5,910,573호; [Holliger et al., Cancer Immunol . Immunother . 45: 128-30 (1997)]; [Drakeman et al., Expert Opin . Investig . Drugs 6:1169-78 (1997)]; [Koelemij et al., J. Immunother . 22:514-24 (1999)]; [Marvin et al., Acta Pharmacol. Sin . 26:649-58 (2005)]; [Das et al., Methods Mol . Med . 109:329-46 (2005)]에 기술되어 있다.
최소 인식 단위 또는 다른 항원 결합 단편은 펩티드 라이브러리로부터 확인할 수 있다. 상기 펩티드는 조합 라이브러리로부터 (예컨대, 국제 특허 출원 번호 PCT/US91/08694 및 PCT/US91/04666 참조), 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 (예컨대, 문헌 [Scott et al., Science 249:386 (1990)]; [Devlin et al., Science 249:404 (1990)]; [Cwirla et al., Science 276: 1696-99 (1997)]; 미국 특허 번호 제5,223,409호; 미국 특허 번호 제5,733,731호; 미국 특허 번호 제5,498,530호; 미국 특허 번호 제5,432,018호; 미국 특허 번호 제5,338,665; 1994호; 미국 특허 번호 제5,922,545호; 국제 출원 공개 번호 WO 96/40987 및 WO 98/15833 참조) 확인 및 단리될 수 있다. 최소 인식 단위 또는 CDR (즉, 중쇄 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR 중 하나 이상의 임의의 것 및/또는 경쇄 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR 중 하나 이상의 임의의 것)인 펩티드는, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 관심의 대상이 되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 펩티드를 서열을 비교하고, 예측하는 데 사용될 수 있는 것인 컴퓨터 모델링 기법에 의해 확인할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Bradley et al., Science 309:1868 (2005)]; [Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005)] 참조).
항체는 일반적으로 당업계의 숙련가에게 공지되어 있는 다양한 기법들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 동물을 면역화시키고/거나, 원하는 특이성의 항체에 대해 스크리닝하는 데 사용되는 면역원으로는 예를 들어, 비-노화 세포보다 더 많은 양으로 노화 세포의 표면 상에 존재하거나, 또는 노화 세포와는 상이한 입체형태를 가지는 노화 세포로부터 단리된 단백질; 및 외막 시료, 노화 세포로부터 단리된 세포 소기관을 비롯한, 노화 세포 추출물을 포함한다. 항체는 또한 인간 면역글로불린 파지 라이브러리로부터, 토끼 면역글로불린 파지 라이브러리로부터, 마우스 면역글로불린 파지 라이브러리로부터, 및/또는 닭 면역글로불린 파지 라이브러리로부터 확인 및 단리될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Winter et al., Annu . Rev . Immunol. 12:433-55 (1994)]; [Burton et al., Adv . Immunol . 57:191-280 (1994)]; 미국 특허 번호 제5,223,409호; [Huse et al., Science 246: 1275-81 (1989)]; [Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52 (1997)] 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌; [Rader et al., J. Biol . Chem . 275: 13668-76 (2000)]; [Popkov et al., J. Mol. Biol . 325:325-35 (2003)]; [Andris-Widhopf et al., J. Immunol . Methods 242: 159-31 (2000)] 참조). 비-인간 종 또는 비-인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리된 항체를 본원에 기술되고, 당업계에 공지된 방법에 따라 유전적으로 조작함으로써 항체 또는 그의 단편을 "인간화"시킬 수 있다.
인간화된 항체를 디자인하는 데 유용한 전략법으로는 일례로 및 제한없이, 키메라 항체의 비-인간 골격 영역에 가장 큰 상동성을 가진 인간 가변 골격 영역을 확인하는 것을 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-25 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988)] 참조). 예를 들어, 컴퓨터 모델링한 후, 이어서, CDR 루프 및 결정기를 공지된 인간 CDR 루프 구조 및 결정기와 비교함으로써 비-인간 가변 영역의 CDR 루프 입체형태 및 구조 결정기를 포함하도록 인간화된 항체를 디자인할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Padlan et al., FASEB 9: 133-39 (1995)]; [Chothia et al., Nature , 342:377-83 (1989)] 참조). 컴퓨터 모델링은 또한 서열 상동성에 의해 선별된 인간 구조 주형을 비-인간 가변 영역과 비교하는 데에도 사용될 수 있다.
제제, 예컨대, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 항체, 및 항원 결합 단편 (즉, 적어도 하나의 항체 V 영역을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드) 또는 노화 세포에 특이적인 다른 제제는 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 제2 제제에 연결될 수 있다 (즉, 컨쥬게이트되거나, 융합되거나, 또는 일부 방식에서는 결합되거나, 또는 부착될 수 있다). 세포독성 모이어티가 제제의 노화 세포에의 결합에 의해 노화 세포로 전달될 때, 상기 모이어티는 노화 세포를 선택적으로 파괴한다. 제제를 재조합적으로 제조할 경우, 세포독성 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 프레임 내에서 제제에, 및 하나 이상의 발현 조절 서열에 연결시킴으로써 제제 및 세포독성 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 상기 제2 제제로는 식물 및 미생물로부터 유래된 독소를 비롯한, 세포독성 분자 뿐만 아니라, 상기 항체, 폴리펩티드, 또는 펩티드에 연결되지 않았을 때에는 노화 세포에 특이적으로 결합하지 않는 소 분자를 포함한다.
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제로는 (당업계에서는 또한 펩티바디로도 지칭되는 (예컨대, 미국 특허 번호 제6,660,843호 참조)) 펩티드-IgFc 융합 폴리펩티드를 포함하는, 펩티드-면역글로불린 (Ig) 불변 영역 융합 폴리펩티드를 포함한다. 펩티드는 임의의 자연적으로 발생된 또는 재조합적으로 제조된 분자일 수 있다. 펩티드-Ig 불변 영역 융합 폴리펩티드, 예컨대, 펩티드-IgFc 융합 폴리펩티드는 관심의 대상이 되는 단백질의 활성을 변경시킬 수 있는 생물학적으로 활성인 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. Fc 폴리펩티드는 또한 뮤테인 Fc 폴리펩티드일 수 있다. 세포의 생물학적 기능, 예컨대, 면역 세포의 면역반응성을 변경하는 펩티드는 조합 라이브러리로부터 (예컨대, 국제 특허 출원 번호 PCT/US91/08694 및 PCT/US91/04666 참조), 및 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 (예컨대, 문헌 [Scott et al., Science 249:386 (1990)]; [Devlin et al., Science 249:404 (1990)]; [Cwirla et al., Science 276: 1696-99 (1997)]; 미국 특허 번호 제5,223,409호; 미국 특허 번호 제5,733,731호; 미국 특허 번호 제5,498,530호; 미국 특허 번호 제5,432,018호; 미국 특허 번호 제5,338,665호; 1994; 미국 특허 번호 제5,922,545호; 국제 출원 공개 번호 WO 96/40987 및 WO 98/15833 참조) 확인 및 단리될 수 있다
특정 실시양태에서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 노화 세포이거나, 또는 질환 미세환경에 존재하고, 생물학적 손상 (즉, 세포 손상) 의료 요법에 의해 노화가 유도될 수 있는 세포의 게놈 또는 mRNA의 일부에 특이적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 관심의 대상이 되는 노화 세포 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적이고 (예컨대, 짧은 간섭 핵산, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 또는 펩티드 핵산), 유전자 및/또는 단백질 발현을 변경하는 데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 세포 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 그에 하이브리드화하는 상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 뉴클레오티드 서열을 이용하여 제조될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 서열 특이성이 아닌 핵산 분자, 예컨대, 압타머 또한 유전자 및/또는 단백질 발현을 변경하는 데 사용될 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 서열 특이적인 방식으로 핵산, 예컨대, mRNA 또는 DNA에 결합한다. 안티센스제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 확인하는 것 및 표적화된 전달을 위한 유전자를 코딩하는 DNA를 확인하는 것은 당업계에 주지되어 있는 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드의 바람직한 특성, 길이, 및 다른 특징은 주지되어 있다. 안티센스 기술을 사용하여 폴리머라제의 결합, 전사 인자, 또는 다른 조절 분자를 이용한 간섭을 통한 유전자 발현을 제어할 수 있다 (문헌 [Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)] 참조).
짧은 간섭 RNA는 노화 세포-관련 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 조절 (저하 또는 저해)하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 따라 소형 핵산 분자, 예컨대, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 사용함으로써 관심의 대상이 되는 세포 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있다. siRNA 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 포함하지만, 이는 단일 가닥 RNA도 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Martinez et al., Cell 110:563-74 (2002)] 참조). siRNA 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공되고, 당업자에게 공지되고, 그에 의해 사용되는 바와 같이, 다른 자연적으로 발생된, 재조합, 또는 합성 단일 가닥 또는 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그 둘 모두의 조합) 및/또는 그의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 도입되어 있는 재조합 벡터에 의해 전달될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 관심의 대상이 되는 제제인 항체, 항원-결합 단편, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 관심의 대상이 되는 폴리펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 또는 펩티드의 발현을 구동하는 하나 이상의 조절 제어 서열과 작동적으로 연결되도록 상기 코딩 서열이 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터일 수 있다. 재조합 벡터 또는 재조합 발현 벡터는 바이러스 재조합 벡터 또는 바이러스 재조합 발현 벡터일 수 있다. 예시적인 바이러스 벡터로는 제한없이, 렌티바이러스 벡터 게놈, 폭스바이러스 벡터 게놈, 백시니아 바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터 게놈, 헤르페스 바이러스 벡터 게놈, 및 알파 바이러스 벡터 게놈을 포함한다. 바이러스 벡터는 생, 약독화, 복제 조절 또는 복제 결핍 벡터일 수 있고, 이는 전형적으로는 비-병원성 (결손), 복제 가능 바이러스 벡터이다. 상기 바이러스 벡터를 디자인하고, 제조하는 방법 및 기법은 당업자에게 주지되어 있고, 그에 의해 통상적으로 투여된다.
본원에 기술된 방법에서 유용한 제제는 본원 및 당업계에 기술된 기법 및 방법에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 특징이 규명될 수 있다. 세포 노화를 억제하는 것을 비롯한, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제는 세포주, 예컨대, 종양 세포주를 사용하는 시험관내 검정법에 의해 확인될 수 있다. 배양된 세포를 의료 요법 및 후보 제제에 동시에 또는 임의 순서로 노출시킬 수 있다. 상기 검정법은 고처리량 스크리닝 포맷을 포함할 수 있는 매트릭스 (또는 어레이)에서 수행될 수 있다. 고처리량 포맷은 전형적으로 합성 또는 천연 생성물 라이브러리로부터 이용가능한, 다수의 후보 제제를 자동 스크리닝하는 것을 포함한다. 스크리닝되는 후보 제제를 예컨대, 미세 유체 공학 기반 장치를 사용하여 고처리량 스크리닝 포맷으로, 또는 96-웰 플레이트 포맷, 또는 다른 규칙적인 2차원 어레이, 예컨대, 384-웰, 48-웰 또는 24-웰 플레이트 포맷, 또는 시험관 어레이로 조직화할 수 있다. 그러므로, 포맷은 자동화되도록 적합화시킬 수 있다. 컴퓨터 또는 다른 프로그램식 제어 장치의 제어하에 있는 자동화 장치가 본원에 기술된 방법 중 하나 이상의 단계에 사용될 수 있다. 제어 장치는 방법의 각 단계의 결과를 모니터링할 수 있고, 그 결과에 대한 반응으로 시험 패러다임을 자동으로 변경시킬 수 있다.
동물 모델은 또한 세포 노화를 억제하는 것을 비롯한, 생물학적 반응을 억제하는 제제를 확인하거나, 그의 특징을 규명하는 데 사용될 수 있다. 일례로, 비-인간 동물, 특히, 노화 세포-특이 프로모터의 제어하에서 발현되는 트랜스진을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 사용될 수 있다. 트랜스진의 노화 세포-특이 프로모터를 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 (예컨대, 검출가능한 표지 또는 세포독성-활성화 분자)를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 (즉, 작동적으로) 연결시킴으로써 동물내 노화 세포를 조절된 방식 및 사용자가 결정한 방식으로 모니터링할 수 있다 (본원 실시예 참조). 예시적인 트랜스진은 (1) (a) 적어도 하나의 검출가능한 표지, (b) 세포독성제, (c) 세포독성-활성화 분자, (d) RNA, 또는 (e) (a), (b), (c) 및 (d)의 임의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 노화 세포-특이 프로모터를 포함하고; 종양을 나타낸다. 예시적인 동물 모델은 (a) FKBP-카스파제 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (p16-FKBP-카스파제 트랜스진)에, 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 p16Ink4a 프로모터 (예컨대, 문헌 [Baker et al., Nature 479:232-36 (2011)] (이는 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조); 또는 (b) 본원에서 3모드 융합 단백질 (3MR)로 명명될 수 있는, 루시퍼라제, 적색 형광 단백질, 및 절두된(truncated) 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (tTK)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (p16-3MR 트랜스진)에 작동적으로 연결된 p16Ink4a 프로모터를 포함하는 트랜스진을 포함한다. 특정 트랜스제닉 동물에서, 루시퍼라제는 레닐라 루시퍼라제이고, 적색 형광 단백질은 단량체 적색 형광 단백질이다.
다수의 세포독성-활성화 분자 중 임의의 것을 노화 세포-특이 프로모터에 작동가능하게 연결시켜 동물 모델에서 사용하기에 적합한 트랜스진을 제조할 수 있다. 세포독성-활성화 분자는 노화 세포-특이 방식으로 발현된 후, 활성화 제제를 트랜스제닉 동물에게 투여하였을 때, 상기 분자가 발현되는 노화 세포의 조절가능한 사멸을 유도할 수 있는 것이다. 세포독성-활성화 분자의 예시적인 일례로는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드 및 FK506 결합 단백질 (FKBP) (또는 그의 변이체)-카스파제 융합 폴리펩티드를 포함한다. 추가의 일례로, 상기 트랜스진에 의해 코딩된 세포독성-활성화 분자는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드 (절두된 TK 폴리펩티드 포함)이고, 상기 활성화 제제는 그가 발현되는 세포에 치명적인 독성 모이어티로 전환되는 전구약물 간시클로비르이다.
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제의 효과는 세포 노화를 억제할 수 있는 상기 제제의 능력이 측정될 수 있는 동물 모델에서 평가될 수 있다. 세포 노화를 억제하는 제제는 그 결과로서 동물 모델에서 종양 증식을 저해할 수 있다. 종양 증식은 종양 크기에 의해 측정될 수 있으며, 이는 종양 동물 모델 분야의 당업자에게 익숙한 다양한 방식으로, 예컨대, 촉진에 의해 또는 종양 부피 또는 면적 측정 (사후에 투여될 수 있다)에 의해, 종양 위치(들) 측정에 의해 (예컨대, 종양 세포가 원발성 종양 부위 (즉, 종양 세포의 최초 전이증식이 이루어진 부위)로부터 전이되었는지 여부를 측정하기 위해 투여) 측정될 수 있다. 종양 세포의 분화를 조사함으로써 치료제가 종양 증식에 미치는 효과 또한 평가할 수 있다.
노화 세포 및 노화 세포-관련 분자는 당업계에 기술된 기법 및 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 조직으로부터 수득된 노화 세포를 비롯한, 노화 세포는 노화 마커, SA-베타 gal (SA-Bgal)을 검출하는 조직화학법 또는 면역조직화학 기법에 의해 분석될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Dimri et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 92: 9363-9367 (1995]). 노화 세포-관련 폴리펩티드인 p16의 존재는 당업계에서 실시되는 다수의 면역화학 방법들 중 어느 하나, 예컨대, 면역블롯팅 분석법에 의해 측정될 수 있다. 세포에서 p16 mRNA를 비롯한, 노화 세포-관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현은 정량적 PCR을 비롯한, 당업계에서 실시되는 다양한 기법에 의해 측정될 수 있다. 노화 세포-관련 폴리펩티드 (예컨대, SASP의 폴리펩티드)의 존재 및 수준은 자동 고처리량 검정법, 예컨대, 당업계에 기술되어 있는 자동 루미넥스(Luminex) 어레이 검정법을 사용하여 측정할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., PLoS Biol 6: 2853-68 (2008)] 참조). DNA 손상 반응을 포함하는 생물학적 손상 반응을 모니터링하기 위해, 예를 들어, 문헌 [Rodier et al., Nature Cell Biol 11: 973-979 (2009)]의 방법에 따라 다양한 DNA 손상 반응에 대한 지표를 검출할 수 있다.
본 개시내용은 또한 노화 세포 및 휴지 (비-노화) 세포를 하나 이상의 시험 제제 (즉, 후보 제제)와 접촉시키는 (즉, 혼합하거나, 조합하거나, 또는 일부 방식으로, 그 둘 사이의 상호작용을 촉진하는) 단계; 노화 세포에 의한, 및 휴지 세포에 의한 SASP의 특징이 되는 하나 이상의 성분의 생산 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 노화 관련 분비 표현형 (SASP)을 선택적으로 저해하는 제제를 확인하고, 그의 특징을 규명하는 시험관내 방법을 제공한다. 본원에 기술된 방법의 각 단계는 각 단계에 적합한 조건하에 적절히 충분한 시간 동안 수행한다. 상기 조건 및 시간에 대해서는 본원 및 실시예에서 제공되는 예시적인 방법에서 논의되며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
예를 들어, SASP 분자, 예컨대, 시토카인 (예컨대, 염증성 시토카인), 성장 인자, 세포외 기질 성분 (ECM) 및 ECM-분해 효소, 및 각각의 노화 세포 및 휴지 세포에 의해 분비되는 프로테아제의 수준을 측정하고 비교한다. 크게 세포 독성을 일으키지 않으면서, 및 휴지 세포에서 SASP를 유도하지 않으면서, SASP 성분 중 하나 이상의 것의 생산을 감소시키는 시험 제제가 노화 관련 분비 표현형을 선택적으로 저해하는 제제이다. 큰 세포 독성이 없는 시험 제제를 선별함으로써, 세포 사멸을 통해 SASP 성분을 저하시킨 화합물을 배제시킬 수 있다. 세포 독성 (또는 세포 생존능)을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 그 방법으로 예를 들어, 세포막 완전성을 평가하는 방법 (트립판 블루 또는 프로피디움 요오다이드), 락테이트 데히드로게나제 검정법, MTT 또는 MTS 검정법, ATP 검정법, 술포로다민 B 검정법, 및 WST 검정법을 포함한다. 특정 실시양태에서, ATP 수준을 검출함으로써 전체 세포 독성 또는 세포 생존능을 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 시험 제제를 선별하는 단계는 노화 관련 분비 표현형을 선택적으로 저해하는 후보 제제로서, 전체 세포 독성 없이 및 휴지 세포에서 SASP를 유도하지 않으면서, SASP 성분 중 하나 이상의 것의 생산을 감소시키는 시험 제제를 선별하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, SASP의 특징이 되는 하나 이상의 노화 관련 성분은 분비된 노화 관련 분자이다. 특정 실시양태에서, SASP의 특징이 되는 하나 이상의 분자로는 본원에 기술되고, 당업계에 공지되어 있는 SASP 인자 중 하나 이상의 임의의 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 생물학적 손상 반응을 억제하는 방법에서 사용되는, 관심의 대상이 되는 제제는 IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP3, MCP2, IGF1, PDGF-BB, EGF, 및 BMP-4 중 하나 이상의 임의의 것의 생산 및/또는 분비를 저해 (즉, 감소, 억제, 방해, 차단)하는 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 제제는 IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP3, MCP2, IGF1, PDGF-BB, EGF, 및 BMP-4 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 임의의 것, 또는 그들 모두의 생산 및/또는 분비를 저해한다. 특정 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 제제는 SASP의 특징이 되는 하나 이상의 성분이 IL-6을 포함하는 것인, SASP의 특징이 되는 하나 이상의 성분의 생산 및/또는 분비를 저해한다.
SASP의 특징이 되는 성분의 생산은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, SASP의 특징이 되는 성분은 세포가 배양된 배지에서 측정될 수 있다. 배지는, 세포를 시험 제제로서 처리한 후, 세포를 세척하고, 일정 시간 동안 시험 제제의 부재하에 무혈청 중에서 인큐베이션시켜 조절된 배지로 생성된 것인, 조절된 배지일 수 있다. 노화 세포-관련 분자 (예컨대, SASP의 폴리펩티드)의 존재 및 수준은 자동 고처리량 검정법, 예컨대, 당업계에 기술되어 있는 자동 루미넥스 어레이 검정법을 사용하여 측정할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Coppe et al., PLoS Biol 6: 2853-68 (2008)] 참조). 특정 실시양태에서, SASP의 특징이 되는 성분은 예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, 항체 어레이, 측방 유동 면역검정법, 자기 면역검정법, 방사면역검정법, FACS, 및 서라운드 옵티칼 피버 이뮤노어세이(Surround Optical Fiber Immunoassay: SOFIA)를 비롯한, 면역검정법을 사용하여 측정된다.
특정 실시양태에서, SASP를 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하거나, 그의 특징을 규명하는 방법은 고처리량 스크리닝 방법이다. 합성 또는 천연 생성물 라이브러리로부터 다수의 후보 치료제의 고처리량 스크리닝, 전형적으로 자동 스크리닝이 치료제를 확인하는 데 사용될 수 있다. 제제는 허가받은 또는 전-임상 화합물일 수 있다. 스크리닝되는 후보 치료제를 예컨대, 미세 유체 공학 기반 장치를 사용하여 고처리량 스크리닝 포맷으로, 또는 96-웰 플레이트 포맷, 또는 다른 규칙적인 2차원 어레이, 예컨대, 1,536-웰, 384-웰, 48-웰 또는 24-웰 플레이트 포맷, 또는 시험관 어레이로 조직화할 수 있다. 그러므로, 포맷은 자동화되도록 적합화시킬 수 있다. 컴퓨터 또는 다른 프로그램식 제어 장치의 제어하에 있는 자동화 장치가 본원에 기술된 방법 중 하나 이상의 단계에 사용될 수 있다. 제어 장치는 방법의 각 단계의 결과를 모니터링할 수 있고, 그 결과에 대한 반응으로 시험 패러다임을 자동으로 변경시킬 수 있다. 다양한 스크리닝 포맷이 사용될 수 있다는 것, 예컨대, 상이한 시험 제제가 상이한 베슬 또는 웰에 배치될 수 있거나, 또는 복수 개이 시험 제제가 단일 웰 또는 베슬에 폴링(polled)된다는 것, 또는 그의 조합이 당업자에게는 자명하다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 SASP를 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하는 방법에서 사용되는 노화 세포 및 휴지 (즉, 비-노화) 세포는 섬유아세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 인간 섬유아세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 SASP를 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하는 방법은 동일하거나, 상이한 종으로부터의 하나 이상의 섬유아세포 세포주 및/또는 1차 섬유아세포를 사용하여 방법을 수행 및/또는 반복하는 것을 포함할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 SASP를 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하는 방법은 동일하거나, 상이한 종으로부터의 2, 3, 4개 이상의 섬유아세포 세포주 및/또는 섬유아세포 1차 공급원을 사용하여 수행 및/또는 반복될 수 있다.
섬유아세포 및 종양 세포를 비롯한, 세포의 생존능을 유지하기 위해, 세포를 완충제 및 영양소 (예컨대, 글루코스, 미네랄 (예컨대, 셀레늄))를 함유하고, 또한 세포의 시험관내 배양에 필요하거나, 그에 유익하고, 당업자에게 주지되어 있는 다른 첨가제 또는 보충제 (예컨대, 우태아 혈청 또는 혈청 보충제를 필요로 하지 않는 대체 제제; 트랜스페린; 인슐린; 푸트레신; 프로게스테론)를 함유할 수 있는, (항생제를 포함하거나, 포함하지 않는) 배지를 비롯한, 당업계에서 실시되는 배양물 중 세포를 적절히 유지하기 위한 조건하에 배지 중에서 배양한다 (예를 들어, GIBCO 배지, 인비트로겐 라이프 테크놀롤지스(INVITROGEN Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 참조). 표준 세포 배양 방법 및 실행과 유사하게, 본원에 기술된 세포 배양물을 이산화탄소 (전형적으로 5%), 습도, 및 온도를 조절할 수 있도록, 상기와 같은 사용을 위해 디자인된 조직 배양 인큐베이터에서 유지시킨다. 세포 배양 시스템은 또한 예를 들어, 배지 중 또는 기질 또는 표면 코팅 중에 제공될 수 있는 외인성 (즉, 배양되는 세포 그 스스로는 생산하지 못하는 것인) 세포 성장 인자를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 세포의 성장 특징은 당업자에게는 익숙한 방법인, 배지의 조성 또는 종류를 변경하거나, 하나 이상의 영양소 및/또는 혈청의 양을 조정하는 방법에 의해 최적화될 수 있다. 조직 배양 분야의 당업자는 세포 배양물을 통상적으로 유지하는 데 사용되는 조건 (즉, 배지, 첨가제, 영양소)은 세포의 특별한 조작을 위해, 예컨대, 고처리량 스크리닝을 비롯한, 본원에 기술된 기법을 위해 세포가 적절히 컨플루언트되게(confluency) 하고, 성장 특성을 가지도록 하기 위해서 적절히 조정될 필요가 있을 수 있다는 것 또한 이해할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 SASP를 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하거나, 또는 그의 특징을 규명하는 방법에서 사용되는 노화 세포는 방사선 (예컨대, X-방사선 조사)에의 노출, 화학요법제 (예컨대, 독소루비신), 또는 노화를 유도하는 하나 이상의 단백질, 예컨대, 발암성 단백질 (예컨대, MAPK-6, RAS, MYC, ERK, TRK, WNT)을 발현하는 핵산 구축물에 의한 형질감염에 의해 노화가 유도된다. 특정 실시양태에서, 노화 세포는 MAPK-6 또는 RAS를 발현하는 구축물로 형질감염된 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 종양 침습을 자극할 수 있는 처리된 노화 세포의 능력을 감소/억제 또는 저해할 수 있는 시험 제제의 능력을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 종양 세포 침습은 전이성 표현형의 특징들 중 하나이다. 시험 제제의 효과는 SASP의 유해한 특성을 억제시킬 수 있는 시험 제제의 능력, 종양 침습을 자극할 수 있는 SASP의 능력에 의해 평가될 수 있다. 다양한 종양 침습 검정법이 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 보이든(Boyden) 챔버 검정법 및 그의 변형 방법을 포함한다 (예컨대, 문헌 [Albini et al., 1987, Cancer Res . 47:3239]; [Shaw, 2005, Methods Mol . Biol . 294:97-105]; [Nicolson, 1982, J. Histochem . Cytochem. 30:214-220]; [Rapesh, 1989, Invasion & Metastasis 9: 192-208]).
본원에 기술된 관심의 대상이 되는 제제의 특징을 규명하고, 그 제제를 확인하는 방법이, 본 방법의 단계 (예컨대, 세척 단계, 시약 첨가 단계 등)를 수행하는 데, 및 데이터를 처리하는 데 통상 사용되는 것인 장치, 컴퓨터 (및 컴퓨터 판독가능 매체) 등을 사용할 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 분석 도구, 예컨대, 통계학적 분석 또한 당업자에 의해 통상 사용되는 것이다.
질환 및 의료 요법
질환 및 그의 치료를 필요로 하는 대상체
본원에 기술된 치료 방법을 필요로 하는 대상체 (즉, 환자)는 인간 또는 비-인간 동물이다. 효능이 증진된 의료 요법을 필요로 하는 대상체는 본원에 기술된 질환의 증상 또는 후유증을 보일 수 있거나, 질환이 발병될 위험에 있을 수 있다. 치료될 수 있는 비-인간 동물로는 포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류 (예컨대, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류 (예컨대, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 흰담비, 토끼), 토끼류, 돼지 (예컨대, 돼지, 미니 돼지), 말, 개, 고양이, 소, 및 다른 가축, 농장 동물, 및 동물원 동물을 포함한다.
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 받을 수 있는 대상체로는 암을 앓거나, 암이 발병될 위험에 있는 대상체를 포함한다. 암을 앓는 대상체로는 또한 부분 또는 완전 완화인지와는 상관없이, 완화 (이는 또한 본원에서 암 완화로 불림) 상태에 있는 대상체 또한 포함한다. 완화란 암의 징후 및 증상이 저하되거나, 소멸하는 것을 의미한다. 부분 완화에서는 암이 징후 및 증상 모두가 아닌, 그의 일부가 소멸된다. 완전 완화에서는 암의 모든 징후 및 증상이 소멸되고, 암 세포가 남아 있을 경우, 이는 검출불가능한 상태인 것이다. 부분 또는 완전 완화 상태에 있는 대상체, 및 암 재발 위험이 있는 대상체는 본원에 기술된 방법이 도움이 될 수 있다.
암이 발병될 위험에 있는 환자로는 대상체에서 암이 발병될 가능성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 돌연변이를 가지는 대상체를 포함한다. 일례로, 인간 유전자 BRCA1 및 BRCA2는 종양 억제인자로서 공지된 유전자 부류에 속한다. 이들 유전자의 돌연변이(들)는 유전 유방암 및 난소암과 연관이 있다. BRCA1 돌연변이는 또한 여성에서 결장암, 자궁암, 자궁경부암, 및 췌장암이 발병될 위험을 증가시킬 수 있다. BRCA2에서 특정 돌연변이는 또한 췌장암 뿐만 아니라, 위암, 담낭암 및 담관암, 및 흑색종의 위험을 증가시킨다. 특정의 BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이를 가진 남성 또한 유방암, 및 가능하게는 췌장암, 고환암, 및 조기 발병 전립샘암의 위험이 증가되어 있다. 암이 발병될 위험에 있는 대상체로는 또한 뉴클레오티드 절제 수복에 요구되는 것인 XPD 헬리카제의 돌연변이로부터 유발되는 색소성 건피증을 앓는 대상체를 포함한다.
본원 및 당업계에서 사용되는 바, 암 또는 종양이라는 용어는 전형적으로 비정상적인 세포 증식을 보이는 세포를 특징으로 하는 질환을 포함하는 임상상의 기술적 용어이다. 암이라는 용어는 일반적으로 악성 종양 또는 상기 종양으로부터 유발되는 질환 상태를 기술하는 데 사용된다. 별법으로, 비정상적인 성장은 당업계에서 신생물로 지칭될 수 있다. 예컨대, 조직과 관련하여 종양이라는 용어는 일반적으로 적어도 부분적으로는 과도하고 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 임의의 비정상적인 조직 성장을 의미한다. 종양은 전이성일 수 있고, 원래의 초기 전이증식이 일어난 그의 해부학적 부위를 넘어 대상체 신체 전역의 다른 부위로 확장될 수 있다. 암은 고형 종양을 포함할 수 있거나, 액상 종양 (예컨대, 백혈병)을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 의학 기술 분야에 기술되어 있는 종양 종류들 중 어느 하나를 앓는 대상체에서의 암 요법인 의료 요법의 효과를 증진시키는 데 유용할 수 있다. 암 (종양)의 종류로는 하기를 포함한다: 부신피질 암종, 소아 부신피질 암종, aids-관련 암, 항문암, 충수암, 기저 세포 암종, 소아 기저 세포 암종, 방광암, 소아 방광암, 골암, 뇌 종양, 소아 성상세포종, 소아 뇌간 신경아교종, 소아 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 소아 중추 신경계 배아 종양, 소아 중추 신경계 생식 세포 종양, 소아 두개인두종 뇌 종양, 소아 뇌실막종 뇌 종양, 유방암, 소아 기관지 종양, 카르시노이드 종양, 소아 카르시노이드 종양, 위장관 카르시노이드 종양, 미지의 원발성 암종, 미지의 원발성 소아 암종, 소아 심장(cardiac) (심장(heart)) 종양, 자궁경부암, 소아 자궁경부암, 소아 척색종, 만성 골수증식 장애, 결장암, 결장직장암, 소아 결장직장암, 간외 담관암, 유관 상피내 암종 (dcis), 자궁내막암, 식도암, 소아 식도암, 소아 감각신경아세포종, 안구암, 뼈의 악성 섬유 조직구종, 담낭암, 위(gastric)(위(stomach))암, 소아 위(위)암, 위장관 기질 종양 (gist), 소아 위장관 기질 종양 (gist), 소아 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 임신 융모 종양, 신경아교종, 두부경부암, 소아 두부경부암, 간세포 (간) 암, 하인두암, 신장암, 신세포 신장암, 윌름즈 종양, 소아 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 소아 후두암, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 (all), 급성 골수성 백혈병 (ami), 만성 림프구 백혈병 (ell), 만성 골수원성 백혈병 (cml), 털세포 백혈병, 입술암, 간암 (원발성), 소아 간암 (원발성), 상피내 소엽성 암종 (lcis), 폐암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 림프종, aids 관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 t-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종 (cns), 흑색종, 소아 흑색종, 안구내 (안구) 흑색종, 메르켈 세포 암종, 악성 중피종, 소아 악성 중피종, 잠복 원발성 종양을 동반한 전이성 편평 경부암, NUT 유전자를 수반하는 중간선 관 암종, 입암, 소아 다발성 내분비선종증, 균상식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상 신생물, 골수증식 신생물, 다발성 골수종, 비강암, 코인두암, 소아 코인두암, 신경아세포종, 구강(oral)암, 소아 구강암, 입인두암, 난소암, 소아 난소암, 상피성난소암, 낮은 악성 잠재성 종양 난소암, 췌장암, 소아 췌장암, 췌장 신경내분비 종양 (섬세포 종양), 소아 유두종증, 부신경절종, 부비동암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 하수체 종양, 형질 세포 신생물, 소아 흉막폐장 아세포종, 전립샘암, 직장암, 신우 이행 세포암, 망막아세포종, 침샘암, 소아 침샘암, 유잉 육종 계열 종양, 카포시 육종, 골육종, 횡문근육종, 소아 횡문근육종, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 소아 피부암, 비흑색종 피부암, 소장암, 편평 세포 암종, 소아 편평 세포 암종, 고환암, 소아 고환암, 인후암, 가슴샘종 및 흉선 암종, 소아 가슴샘종 및 흉선 암종, 갑상샘암, 소아 갑상샘암, 요관 이행 세포암 요도암, 자궁내막자궁암, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증.
액상 종양인 암은 당업계에서는 혈액, 골수, 및 림프절에서 발생된 것으로 분류되고, 이는 일반적으로 백혈병 (골수성 및 림프구), 림프종 (예컨대, 호지킨 림프종), 및 흑색종 (다발성 골수종 포함)을 포함한다. 백혈병으로는 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수원성 백혈병 (CML), 및 털세포 백혈병을 포함한다. 고형 종양이고, 인간에서 더욱 빈번하게 발생하는 암으로는 예를 들어, 흑색종, 전립샘암, 고환암, 유방암, 뇌암, 췌장암, 결장암, 갑상샘암, 위암, 폐암, 난소암, 카포시 육종, 피부암 (편평 세포 피부암), 신장암, 두부경부암, 인후암, 코, 입, 인후 등의 습윤 점막내층 상에서 형성되는 편평 암종, 방광암, 골육종 (골암), 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 간암, 및 신장암을 포함한다. 본원에 기술된 방법은 또한 전이성 암의 진행을 예방 (즉, 발생 가능성을 감소시키거나), 저해하거나, 지연시키거나, 또는 저속화시키는, 암 요법인 의료 요법의 효과를 증진시키는 데에도 유용하다.
의료 요법의 효과를 증진시키는 방법은 또한 AIDS가 발병된 환자를 비롯한, HIV 감염 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 당뇨병을 앓고 있고, 인슐린을 받는 대상체, 또는 의료 요법으로서 안지오텐신 투여에 의해 치료가능한 병증을 앓는 환자는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 받음으로써 이익을 얻을 수 있다.
의료 요법
생물학적 손상 반응을 유도하거나, 유발하거나, 또는 촉진하는 의료 요법으로는 유전자독성 (예컨대, DNA 손상) 및 세포독성 요법을 포함한다. 상기 의료 요법의 예로는 암 치료에 사용되는 대부분의 요법, 예컨대, 방사선요법 및 매우 광범위한 화학물질 (즉, 화학요법)을 포함한다. 방사선 및 화학요법은 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 차별적인 특징을 이용함으로써 암 세포 (즉, 종양 세포)를 선택적으로 표적화하는 세포독성제이다. 일례로, 종양 세포의 차별적인 특징 및 특성으로는 높은 증식률, 저산소증, 이상 대사, 효과적인 수복 능력의 감소 및 게놈 불안정을 포함한다.
방사선요법은 종양을 위축시키고, 암 세포의 DNA를 손상시킴으로써 암 세포를 사멸하는 고에너지 방사선을 이용하는 것을 포함한다. 방사선은 X선, 감마선, 및 하전된 입자를 포함한다. 방사선은 신체 외부의 기계 (예컨대, 외부 빔 방사선요법)에 의해, 또는 암 세포 부근의 신체에 배치된 방사성 물질 (즉, 예를 들어, 유방암 및 전립샘암을 치료하는 데 사용될 수 있는, 근접치료로도 불리는 것인 내부 방사선요법)에 의해 전달될 수 있다. 방사선요법은 또한 전신 (예를 들어, 비경구적으로 또는 경구적으로) 투여되는 방사성 물질, 예컨대, (예컨대, 갑상샘암 치료를 위한 경우) 방사성 요오드를 사용하는 전신 방사선요법을 포함한다.
방사선요법은 예를 들어, 종양을 제거함으로써, 또는 암 재발을 예방함으로써, 또는 그 둘 모두에 의해 암을 치유하기 위한 의도로 제공될 수 있다. 그러한 경우, 방사선요법은 단독으로, 또는 수술, 화학요법과 함께, 또는 수술 및 화학요법, 둘 모두와 함께 병용하여 사용될 수 있다. 방사선요법은 또한 예를 들어, 증상을 완화하기 위해 (예컨대, 뇌의 종양을 위축시키기 위해, 척추를 누르거나, 뼈 중에 있는 종양을 위축시키기 위해, 연하 능력을 방해하는 식도 부근의 종양을 위축시키기 위해) 고식적 효과를 발휘할 수 있도록 투여될 수 있다. 암 종류, 종양 위치, 및 특정 대상체에 적절한 (즉, 연령, 일반 건강 상태 등에 따라 다른) 방사성 요법 방식을 당업자는 쉽게 결정할 수 있다. 문헌 [Lawrence et al., editors. Cancer : Principles and Practice of Oncology . 8th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2008]을 참조할 수 있다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 생물학적 손상 반응을 유도할 수 있는 의료 요법으로는 (병용 화학요법을 포함하는) 화학요법을 포함하는데, 이는 화학요법, 화학요법제, 또는 화학요법제 약물로도 언급될 수 있다. 많은 화학요법제는 소 유기 분자로 지칭되는 화합물이다. 화학요법은 암을 치료하는 데 널리 사용된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 화학요법은 또한 공동 작용할 수 있는 협조 방식으로 투여되는 2종 이상의 화학요법제 분자의 병용을 의미할 수 있고, 이는 병용 화학요법으로 지칭될 수 있다. 다수의 화학요법제 약물이 종양학 분야에서 사용되며, 이는 제한 없이, 알킬화제; 항대사산물; 안트라시클린, 식물 알칼로이드; 및 토포이소머라제 저해제를 포함한다. 알킬화제로는 일례로 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드, 메클로에타민, 클로람부실, 이포스파미드를 포함한다. 예시적인 항대사산물로는 뉴클레오시드 길항제, 예컨대, 퓨린 (예를 들어, 아자티오프린, 머캅토퓨린) 및 피리미딘을 포함한다. 뉴클레오시드 길항제의 다른 예로는 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 아라비노실시토신, 카페시타빈, 클로파라빈, 시타라빈, 다카르바진, 플루다라빈, 겜시타빈 및 네라라빈을 포함한다. 빈카 알칼로이드로는 예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신; 탁산 및 그의 유사체 및 유도체; 및 포도필로톡신을 포함한다. 예시적인 토포이소머라제 저해제는 I형 토포이소머라제 저해제, 예컨대, 캄프토테신, 예를 들어, 이리노테칸 및 토포테칸이다. 다른 토포이소머라제 저해제는 II형 토포이소머라제 저해제, 예를 들어, 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 에피포도필로톡신의 반합성적 유도체인 테니포사이드를 포함한다. 화학요법제인 세포독성 항생제로는 제한없이, 독소루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신, 및 미토마이신을 포함한다. 병용 화학요법은 종종 당업자에게 익숙한 두문자 약어로 지칭되며, 이는 상기 및 당업게에 기술되어 있는 2종 이상의 화학요법제 약물을 포함할 수 있다 (예컨대, CHOP, ABVD, BEACOPP, CAV, COPP, EPOCH, MACOP-B, MOPP, R-CHOP, 및 스탠포드 V(Stanford V) 요법).
특정 화학요법 또한 다른 병증, 예컨대, 자가면역 질환을 비롯한 면역 질환 (예를 들어, 강직 척추염, 다발성 경화증, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 및 피부경화증)을 치료하는 데 사용된다.
생물학적으로 손상을 일으키는 다른 의료 요법으로는 항바이러스 요법, 예를 들어, HIV/AIDS를 치료하는 데 사용되는 고활성 항-레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함한다. HAART 요법은 3종 이상의 상이한 약물, 예컨대, 2개의 뉴클레오시드 역전사효소 저해제 (NRTI) 및 프로테아제 저해제 (PI); 2개의 NRTI 및 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제 (NNRTI); 또는 다른 조합을 병용할 수 있다.
생물학적 손상 반응을 유도할 수 있는 다른 의료 요법으로는 또한 일반적으로 유전자독성 요법이 아닌, 호르몬 요법을 포함한다. 일례로, 안지오텐신, 안지오텐신 II (Ang II)는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 혈관 평활근 세포의 미성숙 노화를 유도함으로써 혈관 염증을 촉진하는 것으로 보고되었다 (예컨대, 문헌 [Kunieda et al.. Circulation 114:953-60 (2006)] 참조). 안지오텐신은 혈관수축을 유발한 후, 이어서, 혈압을 상승시키는 펩티드 호르몬이다. 육종 환자에게 안지오텐신을 투여하는 것이 혈관을 수축시킴으로써 종양에 항종양 효과를 발휘하는지 여부를 측정하는 임상 연구를 투여하였다. 인슐린은 또한 세포 노화를 유도하는 호르몬으로서 기술되었다.
의료 요법은 또한 질환, 예컨대, 암을 앓는 대상체, 및 줄기 세포 이식 (자가 또는 동종이형)을 받을 예정인 대상체에게 투여되는 고용량 화학요법 또는 고선량 방사선요법을 포함한다. 일례로, 줄기 세포 대체 요법이 무형성 빈혈, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 고환암, 및 백혈병 (급성 골수원성 백혈병 (AML), 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수원성 백혈병 (CML), 요법 관련 골수형성이상 (t-MDS) 및 요법 관련 급성 골수성 백혈병 (t-AML) 포함), 및 골수형성이상 증후군을 치료하는 데 사용되어 왔다.
"의료 요법"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 사용되는 다른 용어, 예컨대, 의학적 치료, 치료(제) 등을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 의료 요법은 질환 또는 장애 치료 또는 예방 (즉, 그의 발병 또는 재발 가능성을 감소시키는 것)을 필요로 하는 대상체에게 투여되는, 단일 활성 성분 또는 구성 성분, 하나 이상의 활성 성분 또는 구성 성분, 또는 다중 활성 성분 또는 구성 성분을 포함한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 화학요법, 예컨대, 암 요법인 의료 요법으로는 단일 화학치료제를 포함할 수 있거나, 또는 2종 이상의 화학요법제 약물의 병용 (이는 또한 병용 화학요법으로 불림)을 포함할 수 있다. 추가의 일례로, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, HAART는 전형적으로 3가지 다른 바이러스제의 병용 또는 칵테일이다.
의료 요법의 효과 평가
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제함으로써, 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 억제제는 의료 요법의 효과 (즉, 효능)를 증진 (즉, 개선)시킨다. 의료 요법의 효과 증진은 상기 제제를 투여하지 않았을 때 관찰되는 이익과 비교하였을 때, 치료학적 및/또는 예방학적 이익을 개선하거나, 증가시킨다. 따라서, 의료 요법의 효과 증진은 의료 요법의 유해한 생물학적 및 생리학적 효과를 약화 (즉, 감소, 저하, 방해, 저해, 억제)시키는 것을 포함할 수 있다. 의료 요법의 효과를 증가시킴으로써 요법에 노출되는 기간은 단축될 수 있고, 그 결과, 생물학적 손상은 저하된다.
생물학적 손상 반응을 억제하는 제제 또한 받은 대상체 (즉, 환자)에게 투여되는 의료 요법의 효과는 의료 및 임상 분야의 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 신체 검사, 임상 증상 평가 및 모니터링, 및 분석적 성능 검사, 및 본원에 기술된 방법을 비롯한 진단 방법 중 하나 또는 임의 조합을 사용하여 대상체의 건강 상태를 모니터링할 수 있다.
제제를 투여받은 대상체의 치료학적 및/또는 예방학적 이익으로는 예를 들어, 질환과 관련된 원치않는 생리적 변화를 예방 또는 저속화 또는 지연 (감퇴)시키고자 하거나, 또는 상기 질환의 확대 또는 중증도를 예방 또는 저속화 또는 지연 (감퇴)시키고자 하는 것을 목표로 하는 경우에 있어서, 임상 결과의 개선을 포함한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 의료 요법의 효과를 증진시키는 것은 치료하고자 하는 질환으로부터 유발되거나, 또는 그와 관련된 증상의 약화, 감퇴, 또는 경감; 증상 발생 저하; 삶의 질 개선; 무질환 상태 연장 (즉, 대상체가 질환 진단의 기초가 되는 증상을 보일 가능성 또는 성향 저하); 질환 정도 감소; 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 질환 상태; 질환 진행 지연 또는 저속화; 질환 상태의 호전 또는 고식; 및 검출가능 여부와 상관없이 (부분 완화든, 또는 완전 완화든 상관없이) 완화; 및/또는 전체 생존기간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유익하거나, 원하는 임상 결과를 포함할 수 있다. 의료 요법의 효과를 증진시킨다는 것은 또한 대상체가 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 받지 않은 경우에 예상되는 생존기간과 비교하였을 때, 생존기간을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
특정 실시양태에서, 의료 요법이 암 요법일 경우, 제제에 의한 요법의 효과 증진은 제제를 투여하지 않았을 때 관찰되는 이익과 비교하였을 때, 치료학적 및/또는 예방학적 이익을 개선하거나, 증가시킨다. 예를 들어, 암 요법인 의료 요법 증진은 종양(들) 크기 축소, 종양 진행 저해, 종양 성장 저해, 종양 전이증식 지연, 및/또는 종양의 전이 저해, 예방, 또는 지연 중 하나 이상의 임의의 것을 포함한다. 요법 효과 증진은 암 (즉, 종양 또는 종양들)의 의료 요법에 대한 저항성 발생을 예방, 저속화, 또는 저하시킴으로써 요법의 추가 주기를 허용하고/거나, 요법 주기 사이의 시간 간격을 단축시킬 수 있도록 하는 것을 포함할 수 있다.
상기 논의된 암 환자에 대한 이익 이외에도, 그에 대한 의료 요법이 고용량의 화학요법 및/또는 고선량의 방사선에 이은 자가 또는 동종이형 줄기 세포 대체 요법을 포함하는 암을 앓는 대상체의 경우, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 받은 대상체에서의 임상 결과 개선은 백혈구 회복에 소요되는 시간 (즉, 일수)으로 평가될 수 있다. 동종이형 줄기 세포 이식을 받은 대상체의 경우, 제제를 받지 않은 대상체와 비교하였을 때, 이식편 대 종양 효과의 개선, 및 이식편 대 숙주 질환의 부재 또는 감소가 고용량 화학요법 또는 고선량 방사선의 효과 증진을 나타내는 것일 수 있다.
의료 요법이 항-바이러스 요법인 경우, 및 암에 대한 방사선 및 화학요법인 것과 유사하게, 생물학적 손상 반응을 억제함으로써 항-바이러스 요법에 대한 저항성 발생은 감소될 수 있거나, 의료 요법의 용량은 감소될 수 있거나, 두 용량의 투여 사이의 시간 간격은 연장될 수 있으며, 이로써, 요법에 노출되는 기간은 단축될 수 있다. 임상 결과 개선은 예를 들어, 감염이 완전 또는 부분적 근절에 소요되는 시간 단축; 무질환 상태 및/또는 전체 생존기간 연장; 면역학적 상태 유지 또는 개선; 또는 바이러스 감염에 의해 유발된 하나 이상의 증상의 중증도 감소 또는 감퇴로 나타난다. HIV로 감염된 사람의 경우, 상기의 임상 결과 이외에도, HAART를 비롯한, 더욱 효과적인 항-바이러스 요법은 T 세포 계수를 안정화하거나 (즉, 감소율을 저하시키거나), 또는 개선하거나; 중증의 면역억제와 관련된 질환, 예컨대, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 기회성 감염 (예컨대, 칸디다증, 크립토콕쿠스성 수막염, 톡소플라즈마증; 콕시디오이데스진균증; 진행성 다발성 백질뇌병증; HIV 관련 뇌병증; 대상포진; 크립토스포리디움증; CMV, 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium), 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인간 유두종 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스에 의해 유발된 감염)의 발병 가능성을 지연시키거나, 또는 감소시킨다.
임상적 이익 및 개선, 또는 당뇨병을 앓으며, 의료 요법으로서 인슐린을 받고, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 받은 대상체는 글루코스 수준의 안정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 반응을 억제하는 제제를 받은 환자에서 인슐린 투약 사이의 시간 간격 연장, 또는 적절한 글루코스 수준을 유지시키는 데 필요한 인슐린 용량의 감량이 인슐린의 개선된 효과를 나타낸다.
제약 조성물
본원에서는 또한 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제 중 하나 이상의 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은, 추가로 생리학상 허용되는 부형제 (제약상 허용되는 또는 적합한 부형제 또는 담체) (즉, 활성 성분의 활성을 방해하지 않는 비-독성 물질)를 추가로 포함하는, 멸균 수용액 또는 비-수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 본원에 기술된 부형제는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 유효량 또는 치료학상 유효량이란, 원하는 치료 효과를 가져오는 데 효과적인, 단일 용량으로서 또는 일련의 용량의 일부로서 대상체에게 투여되는, 제제 또는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물의 양이다.
대상체는 일반적으로 당업계의 숙련가에게 친숙하고, 본원에 기술되어 있는 검정법으로서, 치료 또는 예방하고자 하는 병증에 적합한 검정법을 사용함으로써 치료 효과에 대해 모니터링될 수 있다. 대상체에게 투여되는 제제 수준은 생물학적 체액 중, 예를 들어, 혈액, 혈액 분획 (예컨대, 혈청) 중, 및/또는 뇨 중, 및/또는 대상체로부터의 다른 생물학적 샘플 중 제제의 수준을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 당업계에서 실시되는, 임의의 제제 검출 방법을 사용하여 치료 요법 과정 동안 제제의 수준을 측정할 수 있다.
의료 요법의 효과를 증진시키기 위한, 본원에 기술된 제제의 용량은 대상체의 병증에 따라, 즉, 질환 병기, 질환에 의해 유발된 증상의 중증도, 일반 건강 상태 뿐만 아니라, 연령, 성별, 및 체중, 및 의료업계의 당업자에게 자명한 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 제약 조성물은 의료업계의 당업자에 의해 측정되는 바와 같이, 치료하고자 하는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 용량 및 적합한 투여 지속 기간 및 빈도는 환자의 상태, 환자 질환의 종류 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태, 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 제제의 최적 용량은 실험 모델 및/또는 임상 시험을 사용하여 결정될 수 있다. 최적 용량은 대상체의 체질량, 체중, 또는 혈액량에 따라 달라질 수 있다. 보통은 효과적인 요법을 제공하는 데 충분한 최소 용량으로 사용되는 것이 바람직하다. 본원에 기술된 제제 (예방학적 이익을 위해 투여되는 경우도 포함)에 대한 임상전 및 임상 연구의 디자인 및 투여는 관련 업계의 당업자의 기술 범위 내에 충분히 포함되어 있다. 제제의 최적 용량은 대상체의 체질량, 체중, 또는 혈액량에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 양은 0.01 mg/kg 내지 1,000 mg/kg (예컨대, 약 0.1 내지 1 mg/kg, 약 1 내지 10 mg/kg, 약 10-50 mg/kg, 약 50-100 mg/kg, 약 100-500 mg/kg, 또는 약 500-1,000 mg/kg) (체중)이다.
제약 조성물은 유효량의 제제를 효과적으로 전달하는 수개의 경로 중 어느 하나에 의해 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 투여 경로로는 예를 들어, 경구, 국부, 비경구, 장내, 직장, 비내, 협측, 설하, 근육내, 경피, 질내, 직장, 또는 두개내 주사에 의한 투여 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 상기 조성물은 고체, 액체, 또는 가스 (에어로졸) 형태일 수 있다.
제약상 허용되는 부형제는 제약업계에 주지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients: A Comprehensive Guide to Uses, Properties, and Safety, 5th Ed., 2006, and in Remington : The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21st Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)]에 기술되어 있다. 예시적인 제약상 허용되는 부형제로는 멸균 염수 및 생리학적 pH의 포스페이트 완충처리된 염수를 포함한다. 보존제, 안정제, 염료, 완충제 등이 제약 조성물에 제공될 수 있다. 추가로, 항산화제 및 현탁화제 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 부형제 종류는 투여 모드 뿐만 아니라, 활성 성분(들)의 화학적 조성에 기초하여 선택된다. 별법으로, 본원에 기술된 조성물은 동결건조물로서 제제화될 수 있거나, 또는 제제는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 리포좀 내로 캡슐화될 수 있다. 제약 조성물은 본원 및 당업계에 기술된 임의의 적절한 투여 방식에 맞게 제제화될 수 있다.
제약 조성물 (예컨대, 구강 투여용 또는 주사에 의한 전달용 제약 조성물)은 액상 형태일 수 있다. 액상 제약 조성물은 예를 들어, 하기: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 식염수, 바람직하게, 생리식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁화 매질로서의 역할을 할 수 있는 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제; 항산화제; 킬레이트화제; 완충제 및 장성 조절용 제제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 앰플, 1회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 투여용 바이알 안에 동봉될 수 있다. 생리식염수를 사용하는 것이 바람직하고, 바람직하게, 주사용 제약 조성물은 멸균성이다.
구강용 제제인 경우, 정제, 분말제, 과립제 또는 캡슐제를 제조하는 데, 본원에 기술된 제제 중 적어도 하나의 것은 단독으로, 또는 적절한 첨가제와 함께 조합하여, 및 원하는 경우, 희석제, 완충화제, 습윤제, 보존제, 착색제, 및 향미제와 함께 사용될 수 있다. 제제는 위 환경의 낮은 pH로부터 제제를 보호하기 위해 완충화제와 함께, 및/또는 장용 코팅제와 함께 제제화될 수 있다. 조성물에 포함된 제제는 구강 전달을 위해 향미제와 함께, 예컨대, 액상, 고형, 또는 반고형 제제로, 및/또는 장용 코팅제와 함께 제제화될 수 있다.
본원에 기술된 제제들 중 어느 하나를 포함하는 조성물은 지효성 또는 저속 방출용으로 제제화될 수 있다. 상기 조성물은 일반적으로 주지된 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 예를 들어, 경구, 직장 또는 피하 삽입에 의해, 또는 원하는 표적 부위에의 삽입에 의해 투여될 수 있다. 지효성 제제는 담체 매트릭스 중에 분산되어 있고/거나, 속도 조절 막으로 둘러싸여진 저장소 내에 함유되어 있는 제제를 함유할 수 있다. 상기 제제 내에서 사용하기 위한 부형제는 생체적합성이고, 이는 또한 생체분해성일 수 있으며; 바람직하게, 제제는 활성 성분을 상대적으로 일정한 수준으로 방출한다. 지효성 제제 내에 함유되어 있는 활성 제제의 양은 삽입 부위, 방출 속도 및 예상 방출 지속 기간, 및 치료 또는 예방하고자 하는 병증의 성질에 따라 달라진다.
본원에 기술된 제제들 중 하나 이상의 것을 단위 용량으로, 일반적으로 구강 또는 주사가능 용량으로 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 단위 용량을 포함하는 용기, 관심의 대상이 되는 병적 이상을 치료하는 데 있어 약물의 사용 및 수반되는 이익이 기술되어 있는 정보 패키지 인서트, 및 임의적으로 조성물 전달 기기 또는 장치를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
P16-3MR 트랜스제닉 마우스 제조
암에서, 암이 발병될 위험에 있는 상태에서, 또는 암 치료 후 유발되는 부작용하에서 노화 세포의 역할을 조사하기 위해, 본 트랜스제닉 마우스에서 노화 세포를 검출할 수 있고, 노화 세포를 선택적으로 제거할 수 있도록 3모드 융합 단백질에 작동적으로 연결된 p16Ink4a 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 생성하였다.
노화 세포에서는 전사적으로 활성을 띠지만, 비-노화 세포에서는 그렇지 않은 프로모터인 p16Ink4a (예컨대, 문헌 [Wang et al., J. Biol . Chem. 276:48655-61 (2001)]; [Baker et al., Nature , 상기 문헌 동일] 참조)를 핵산 구축물로 조작하였다. p16Ink4a 유전자 프로모터의 단편 (예시적인 벡터 및 예시적인 프로모터 서열을 제공하는 도 5 및 6 참조)을 3모드 수용체 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 도입하였다. 3모드 수용체 단백질은 3MR로 명명되며, 이는 레닐라 루시퍼라제 (rLUC), 단량체 적색 형광성 단백질 (mRFP) 및 절두된 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (tTK)로 구성되어 있다 (예컨대, 문헌 [Ray et al., Cancer Res. 64: 1323-30 (2004)] 참조). 따라서, 3MR의 발현은 오직 노화 세포에서만 p16Ink4a 프로모터에 의해 구동된다. 폴리펩티드 서열 및 3개의 단백질 각각에 대한 코딩 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지되어 있고, 이는 공개 데이터베이스, 예컨대, 진뱅크(GenBank)에서 이용가능하다. 검출가능한 마커인 rLUC 및 mRFP를 통해 각각 생체발광 및 형광성에 의해 노화 세포를 검출할 수 있었다. tTK 발현을 통해서는 tTK에 의해 세포독성 모이어티로 전환되는 것인 전구약물 간시클로비르 (GCV)에의 노출에 의해 노화 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있었다. 트랜스진을 동물 내로 도입하는 공지의 방법을 사용하여 C57B16 배경을 가지는 트랜스제닉 시조(founder) 동물을 확립하고, 사육하였다 (예컨대, 문헌 [Baker et al., Nature, 상기 문헌 동일] 참조). 본원에서 트랜스제닉 마우스를 p16-3MR로 명명한다.
실시예 2
노화 세포는 트랜스제닉 P16-3MR 마우스에서 검출되고, 제거될 수 있다.
강력하게 상향조절된 p16-INK4a 종양 억제인자 단백질을 비롯한, 다양한 바이오마커를 사용하여 노화 세포를 검출할 수 있다 (문헌 [Campisi et al., Nature Rev. Molec . Cell Biol. 8:729-40 (2007)]). 상기 바이오마커를 사용하여 본 결과, 이온화 방사선 또는 DNA-손상 화학요법에의 노출 후, 마우스 및 인간에서는 정상 및 종양 세포, 둘 모두 노화되는 것으로 나타났다 (문헌 [Coppe et al., PLoS Biol. 6:2853-68 (2008)]; [Schmitt et al., Cell 109:335-46 (2002)]; [te Poele et al., Canc . Res . 62: 1876-83 (2002)]; [Le et al., Aging Cell 9:398-409 (2010)]). 예를 들어, 게노톡신 (예컨대, 이온화 방사선, DNA 손상 화학물질), 에피게놈 독소 (예컨대, 히스톤 변형 또는 DNA 메틸화를 교란하는 화합물), 강력한 유사분열촉진 신호 (예컨대, 활성화된 온코진, 수준이 상승된 성장 인자, 특정 호르몬)에 노출되었을 때에는 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에 노화 세포가 축적된다. 그러나, 본원에서 언급된 바와 같이, p16-3MR 트랜스제닉 마우스의 한가지 이점은 상기 마우스가 tTK를 발현하는 바, 간시클로비르 (GCV)는 tTK에 의해 세포독성으로 전환되기 때문에, 전구약물 간시클로비르(GCV)를 투여함으로써 노화 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다는 점이다. 따라서, 방사선에 노출된 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서의 노화 세포의 제거를 GCV 처리 후 조사하였다.
간략하면, p16-3MR 트랜스제닉 마우스 군을 전신 이온화 방사선 (7 Gy X선)에 노출시키고, p16-3MR 트랜스제닉 마우스 대조군에 모의 조사하였다. 3개월 후, 마우스를 GCV (25 mg/kg) 또는 비히클로만 처리한 후, 2주 이상의 시간이 경과한 후, rLUC 기질을 투여한 후에 조직의 생체발광을 조사하였다.
여러 조직에서, 방사선을 조사받은 마우스 (IR)는 방사선을 조사받지 않은 마우스 (Ctrl)보다 2배 초과로 더 큰 생체발광을 보였는데, 이는 rLUC가 방사선 노출 후 3개월 경과시에도 발현되고, 따라서, 노화 세포의 존재는 지속된다는 것을 시사하는 것이다 (폐 조직에서의 생체발광 결과를 보여주는 도 1A 참조). 또한, GCV로 처리된 마우스는 방사선을 조사받지 않은 마우스와 유사한 수준의 rLUC 발현을 보였는데, 이는 GCV가 노화 세포를 제거하였다는 것을 시사하는 것이다 (도 1A).
문헌에 공지되어 있는 바와 같이, 노화 세포 또한 대개는 노화 관련 분비 표현형 (SASP)으로 지칭되는, 염증을 유발할 수 있는 분자를 분비하는데 (문헌 [Freund et al., Trends Mol . Med . 16:238-46 (2010)]), 이는 만성일 경우, 암을 비롯한, 다양한 병리를 자극하게 될 것이다 (문헌 [Davalos et al., Cancer Metastasis Rev. 29:273-83 (2010)]). 예를 들어, IL-6 (인터루킨-6) 및 MMP-3 (매트릭스 메탈로프로테이나제-3)은 SASP의 2가지 중요한 성분이다. 그러므로, p16INK4a (p16), IL-6 및 MMP-3을 비롯한, SASP와 관련된 다양한 바이오마커의 RNA 발현 수준을 조사하였다. 또한, mRFP 수용체의 수준도 측정하였다. 도 1B는 GCV가 p16INK4a (p16), IL-6, MMP-3 및 mRFP 발현 수준을 방사선을 조사받지 않은 대조군 마우스에서 발견되는 수준으로 복귀시켰다는 것을 보여주는 것이다. 추가로, GCV는 특히 야생형 비-트랜스제닉 C57B16 마우스에 제공되었을 때에는 발현 수준에 대해 어떤 검출가능한 효과도 미치지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 3
세포 노화는 암 및 전이의 가능성을 증가시킨다
종양 형성 또는 성장 및 전이의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하기 위해, 노화 세포가 고갈된 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 및 (자연적으로 발생되거나, 유도된) 노화 세포를 가지는 종양 생착을 모니터링하였다.
간략하면, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이, 모의 방사선 조사 또는 방사선 조사 후 대략 3개월 경과하였을 때, 반딧불이 루시퍼라제 (fLUC, 생체발광에 의해 그가 검출될 수 있도록 하기 위한 것)를 발현하는, p16-3MR 트랜스제닉 마우스 (C57B16 배경)와 동계인 고도로 침습성 세포주인 것인 106개의 B16 마우스 흑색종 세포를 p16-3MR 트랜스제닉 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 방사선을 조사받은 마우스를 7일 동안 매일 GCV (25 mg/kg) 또는 비히클로만 처리한 후, 이어서, 마지막 GCV 투약 후 3일째, B16 마우스 흑색종 세포를 상기 마우스에 주사하였다. B16 마우스 흑색종 세포는 먼저 폐에서 주사 후 대략 2주 경과하였을 때 원발성 종양을 형성하며 전이증식하고, 이어서, 원위부 조직으로 전이하여 예를 들어, 췌장, 간, 및 내장 지방에서 속발성 종양을 형성하였다. 생체발광 마커인 fLUC 및 rLUC는 효소가 다른 기질을 사용하기 때문에 구별이 된다.
도 2에 제시된 바와 같이, 모의 방사선을 조사받은 마우스와 비교하였을 때, 종양 진행은 방사선을 조사받은 마우스에서 더욱더 빠르게 일어났다. 주사 후 15일 경과하였을 때, 모의 조사된 (Ctrl) 마우스에서는 상대적으로 작은 폐 결절 일부가 보였다 (도 2A 참조). 대조적으로, 방사선을 조사받은 마우스에서는 유의적으로 더 많은 원발성 종양이 보였고, 추가로, 동물은 다수의 전이성 종양을 보유하였으며 (도 2B 참조) - 상기 동물은 주사 후 15일 내지 16일째에 빈사 상태였다. 놀랍게도, GCV 처리 후, 노화 세포가 제거된 방사선을 조사받은 마우스는 훨씬 더 작은 원발성 종양 및 다수의 감소된 전이를 보였다 (도 2C 참조). fLUC 생체발광을 측정함으로써 주사 후 ~15-18일째에 마우스에서 B16 마우스 흑색종 세포를 검출할 수 있었다. 방사선을 조사받은 마우스는 주사 후 15-16일째에 빈사 상태였고, 이를 희생시켰다. 주사 후 15일째, GCV 처리 후 노화 세포가 제거된 방사선을 조사받은 마우스 및 모의 조사된 (Ctrl) 마우스, 둘 모두 발광에 의해 검출된 바와 같이, 상대적으로 낮은 수준의 B16 세포를 가졌다 (도 3 참조). 방사선을 조사받은 마우스는 발광에 의해 검출된 바와 같이, 유의적으로 더 많은 B16 세포를 가졌다 (도 3 참조). 18일째, GCV 처리 후 노화 세포가 제거된 방사선을 조사받은 마우스는 여전히 모의 조사된 대조군 (Ctrl) 마우스와 같이, 상대적으로 낮은 수준의 B16 세포를 보였다 (도 3 참조).
주사 후 18일째, 큰 원발성 폐 종양인 B16 흑색종 세포는 GCV 처리를 받은 방사선을 조사받은 마우스에서 뚜렷이 나타났다 (도 4A 참조). 그러나, 폐에는 종양이 존재함에도 불구하고, 원위부 기관에는 전이는 거의 없는 상태 그대로 유지되었다 (도 4A 참조; 또한 간 및 지방 조직을 보여주는 도 4C 참조). 이는, 15일 째에 이미 제시된, 간 및 지방이 다발성 전이성 종양을 보유하는, GCV 처리되지 않은 방사선을 조사받은 마우스와 현저한 대조를 이루었다 (도 4B 참조). 또한, 대조군 마우스, 방사선 조사된 마우스, 및 방사선 조사+GCV 처리된 마우스에서 발광성 전이성 결절 또한 계수하여 하기 표 2에 제시되어 있는 바와 같은 결과를 얻었다. 지방 조직에서는 결절을 계수하기가 어렵기 때문에, 전이성 세포를 지방의 전체 면적의 추정치(%)로 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00002
노화 세포 축적이 화학요법제인 독소루비신으로 유도된 때에는 유사한 결과가 관찰되었다. p16-3MR 마우스를 사용하였을 때, 독소루비신 (10 mg/kg) 처리는 방사선 효과와 유사하게, 조직에서 지속적인 노화 세포 존재를 유도하였다. 다양한 조직 (간, 심장, 폐, 신장, 및 비장)을 단리시키고, 노화 세포에 대한 마커로서 mRFP 및 p16INK4a를 코딩하는 mRNA의 존재비에 대해 측정하였다 (각각 도 5A및 5B 참조). 독소루비신으로 처리된 마우스는 일관되게 모든 조직에서 비처리된 대조군 마우스와 비교하여 더 높은 수준으로 mRFP 및 p16INK4a를 발현하였다.
또한, 방사선 효과와 유사하게, 독소루비신 처리는 피하로 주사된 B16 흑색종 세포의 성장을 자극시켰다. 또한, 방사선 처리된 마우스와 유사하게, (p16-3MR 마우스에서 노화 세포를 제거하는) GCV는 독소루비신으로 전처리된 마우스에서 B16 흑색종 종양의 크기를 실질적으로 축소시켰다. 간략하면, p16-3MR 트랜스제닉 마우스를 비히클 (ctrl) 또는 10 mg/kg 독소루비신으로 처리하였다. 독소루비신 처리 후 7일째, 마우스를 7일 동안 매일 GCV (25 mg/kg)로 또는 비히클로만 처리하였다. 마지막 GCV 처리 후 3일째, 4 x 105개의 B16 마우스 흑색종 세포를 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에 피하로 주사하고, 분석을 위해 12일 경과 후 마우스를 희생시켰다.
피부 생검을 수집하고, 노화 세포 바이오마커 (p16INK4a 및 mRFP mRNA)의 존재비에 대해 측정하였다. 도 6에 제시되어 있는 바와 같이, p16INK4a 및 mRFP 발현에 의해 측정되는 바, 독소루비신으로 처리된 마우스로부터의 피부 생검은 비처리된 대조군 마우스로부터의 피부 생검과 비교하여 노화 증가를 보였다. 대조적으로, GCV 처리에 의해 노화 세포가 제거된, 독소루비신으로 처리된 마우스는 낮은 수준의 p16INK4a 및 mRFP 발현을 보였다.
종양 성장은 비히클로 처리된 마우스 또는 대조군 마우스와 비교하여 독소루비신으로 처리된 마우스에서 증가되어 있었다 (도 7 참조). 대조적으로, GCV 처리 후, 노화 세포가 제거된, 독소루비신으로 처리된 마우스는 훨씬 더 작은 원발성 종양을 보였다 (도 7 참조). 종양 직경 또한 측정하고, GCV 처리에 의해 노화 세포가 제거된 독소루비신으로 처리된 마우스는 크기가 더 작은 종양을 가졌고, 독소루비신으로 처리된 마우스는 크기가 증가된 종양을 가졌다는 것 또한 확인하였다 (도 8 참조).
종합적으로, 방사선 또는 독소루비신에 의해 유도된 노화 세포 집단 증가는 현저하게 확대된 원발성 종양 크기 및 전이 (오직 방사선만)와 상관 관계가 있었지만, 이는 GCV로 처리된 마우스에서 노화 세포가 고갈된 때에는 대개 폐기되었다. 다시 말해, 상기 결과는 노화를 유발하는 스트레스에의 노출 이후 노화 세포의 지속적인 존재가 원발성 종양의 성장을 촉진시킬 수 있고, 이는 전이 발생을 진행시킬 것이라는 것을 보여준다. 따라서, 노화 세포 제거 또는 고갈이 종양 형성 또는 전이의 위험 또는 가능성을 지연, 예방, 또는 감소시킬 수 있다.
실시예 4
노화 세포 제거는 K-RAS 매개 종양발생의 가능성을 감소시킨다
K-Ras 매개 폐 종양 형성 또는 성장 및 전이의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하기 위해, (자연적으로 발생되거나, 유도된) 노화 세포가 고갈되거나, 노화 세포를 가지는 INK-ATTAC 트랜스제닉 마우스에서 모니터링하였다.
간략하면, INK-ATTAC (카스파제의 표적화된 활성화를 통한 p16Ink4a 아폽토시스: p16Ink4a apoptosis through targeted activation of caspase) 트랜스제닉 마우스는 p16Ink4a 프로모터의 제어하에 있는 FK506-결합 단백질 (FKBP)-카스파제 8 (Casp8) 융합 폴리펩티드를 가진다 (트랜스진에 대한 벡터 서열을 제공하는 도 10, 및 프로모터 서열을 포함하는 트랜스진의 성분에 대한 서열을 제공하는 도 11 참조). 막 결합된 미리스토일화된 FKBP-Casp8 융합 단백질의 이량체화를 유도하는 합성 약물인 AP20187의 존재하에, 특별히 p16Ink4a 프로모터를 통해 FKBP-Casp8 융합 단백질을 발현하는 노화 세포는 프로그램화된 세포 사멸 (아폽토시스)을 겪게 된다 (예컨대, 문헌 [Baker, Nature , 상기 문헌 동일], 상기 문헌의 도 1 참조). 2개의 시조 계통 (INK-ATTAC3 및 INK-ATTAC5)을 각각 K- rasLA1 종양 모델과 교배시켰다. K- rasLA1 마우스는 M.I.T.의 타일러 잭스(Tyler Jacks)에 의해 최초로 개발되었다 (문헌 [Johnson, L. et al., Nature 410: 1111-16 (2001] 참조). 마우스는 자발적인 재조합 이벤트를 통해 침묵 K-ras 온코진을 활성화시킨다. 광범위한 종양 부하량의 결과로서 K- rasLA1 마우스의 사멸/희생 평균 연령은 약 300일이다. 가장 빈번한 기관 부위는 폐이고, 6주령때부터 과다형성/형성이상에서부터 인간 비-소세포 폐암과 유사한 암종에 이르기까지 다양한 등급의 종양이 존재한다. 흉부 림프절, 신장 및 다른 내장 기관으로의 전이는 낮은 빈도로 발생한다. 다른 기관 부위로는 흉선 (흉선 림프종) 및 피부 (유두종)를 포함한다. 상대 계통 (K-rasLA2)은 그 시점에 100%로 활성화된 대립유전자 (K-RasG12D)로 재조합되는 대립유전자를 보유한다.
2개의 INK-ATTAC:K-RasLA1을 제조하였다 (INK-ATTAC 계통 3에 대한 것 하나 및 계통 5에 대한 것 하나). 3주령을 시작으로, 각 코호트의 절반을 2 mg AP20187/g (체중)으로 처리하고, 나머지 절반을 비히클 (PBS)로 처리하였다. 처리 후 21일째, 마우스를 희생시키고, 폐 중의 종양 다발성을 측정하였다. AP20187 처리 후 노화 세포가 고갈되어 있는 INK-ATTAC3:K-RasLA1 및 INK-ATTAC5:K-RasLA1 트랜스제닉 마우스에서 종양 개수가 유의적으로 감소되어 있는 것으로 관찰되었다 (도 9 참조). 또한, p16-양성 세포의 존재 또는 부재하에서 종양 유도 이후의 전이 및 전체 생존기간을 모니터링하는 것으로 하였다.
실시예 5
노화 세포 제거는 유방암 또는 피부 발암의 가능성을 감소시킨다
유방암의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하기 위해, HER2의 독시시클린-매개 발현을 사용하여, 실시예 4의 것과 유사한 실험을 수행할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Yeh et al., J. Clin . Investig . 121:866-79 (2011)] 참조; 또한, 문헌 [Gunther et al., FASEB 16:283-92 (2002)] 참조). 예를 들어, 시조 INK-ATTAC 계통을 각각 트랜스제닉 마우스 MMTV-HER2 또는 이트랜스제닉(bi-transgenic) 마우스 MMTV-rtT:TetO-HER2 유전자 배경에서 교배시켰으며, 여기서, 노화 세포 축적을 유도하는 데 사용된 노화 유도 인자 (예컨대, 방사선 또는 화학요법) 이후의 유방 종양 형성을 유도하는 데 독시시클린을 사용할 수 있었다.
별법으로, INK-ATTAC 트랜스제닉 마우스를 노화 유도 인자 (예컨대, 방사선 또는 화학요법)로 처리한 후, 피부 발암의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하기 위해, 발암원으로 처리하였다 (예컨대, 문헌 [Slaga et al., J. Investig . Dermatol . Symp . Proc. 1:151-6 (1996)] 참조).
실시예 6
노화 세포 감소는 노화 유도 화학요법으로부터의 부작용의 가능성을 감소시킨다
예를 들어, 이미 발병된 암을 치료하는 데 사용되는 방사선 또는 화학요법으로부터 유발되는 부작용의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하고자 하였다. 상기 부작용으로는 종양 형성 또는 성장 및 전이의 복귀 또는 재발을 포함할 수 있다. (자연적으로 발생되거나, 유도된) 노화 세포가 고갈되거나, 노화 세포를 가지는 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 부작용을 모니터링하였다.
간략하면, 살아있는 동물에서 생체발광에 의해 종양 및 전이를 검출할 수 있도록 하기 위해 반딧불이 루시퍼라제 (fLUC)를 발현하도록 종양 세포주를 조작하였다. 특히, B16-fLUC 마우스 흑색종 세포주 및 MMTV-PymT:fLUC 유방암종 세포주를 생성하였다. 종양 세포를 마우스 내로 주사하고 (즉, B16은 꼬리 정맥 내로 주사; 및 MMTV-PymT는 유방 지방 패드 내로 주사), 1 내지 4주간의 기간 동안 소형 원발성 종양이 형성될 수 있도록 하였다. 이어서, 10 mg/kg의 독소루비신 또는 비히클만 1주간 2 내지 4회에 걸쳐 투여하였다. 마지막 독소루비신 투여 후 3일째, GCV를 25 mg/kg으로 매일 5x로 복강내로 투여하거나, 비히클만을 투여하였다. 4개의 상이한 마우스 처리군으로 (1) 독소루비신 비투여 (비히클), GCV 비처리 (비히클); (2) 독소루비신, GCV 비처리; (3) 독소루비신 비투여, GCV; 및 (4) 독소루비신, GCV를 포함하였다. (rLUC 기질 투여 후) 조직의 생체발광을 조사하여 종양 형성을 모니터링하고, 마우스 생존 또한 모니터링하였다. 또한, 식량 소비량, 식수 소비량, 체질량, 자발적 활동 및 거동, 자발적 운동, 산소 소비량, 및 이산화탄소 생산량을 모니터링하기 위해 5-8일 동안에 걸쳐 마우스를 대사 케이지에서 하우징할 수도 있었다.
실시예 7
노화 세포 감소는 노화 유도 방사선요법으로부터의 부작용의 가능성을 감소시킨다
예를 들어, 이미 발병된 암을 치료하는 데 사용되는 방사선 또는 화학요법으로부터 유발되는 부작용의 가능성의 원인이 되거나, 그를 유도하거나, 그를 증가시키는 데 있어 노화의 역할을 조사하고자 하였다. 상기 부작용으로는 종양 형성 또는 성장 및 전이의 복귀 또는 재발을 포함할 수 있다. (자연적으로 발생되거나, 유도된) 노화 세포가 고갈되거나, 노화 세포를 가지는 p16-3MR 트랜스제닉 마우스에서 부작용을 모니터링하였다.
간략하면, 살아있는 동물에서 생체발광에 의해 종양 및 전이를 검출할 수 있도록 하기 위해 반딧불이 루시퍼라제 (fLUC)를 발현하도록 종양 세포주를 조작하였다. 특히, B16-fLUC 마우스 흑색종 세포주 및 MMTV-PymT:fLUC 유방암종 세포주를 생성하였다. 종양 세포를 마우스 내로 주사하고 (즉, B16은 꼬리 정맥 내로 주사; 및 MMTV-PymT는 유방 지방 패드 내로 주사), 1 내지 4주간의 기간 동안 소형 원발성 종양이 형성될 수 있도록 하였다. 이어서, 동물군을 비-치사 이온화 방사선 (IR)에 노출시키거나, 또는 허위 조사하였다. 마지막 방사선 조사 노출 후 3일째, GCV를 25 mg/kg으로 매일 5x로 복강내로 투여하거나, 비히클만을 투여하였다. 4개의 상이한 마우스 처리군으로 (1) IR 비처리 (허위 방사선 조사), GCV 비처리; (2) IR, GCV 비처리; (3) IR 비처리, GCV; 및 (4) IR, GCV를 포함하였다. (rLUC 기질 투여 후) 조직의 생체발광을 조사하여 종양 형성을 모니터링하고, 마우스 생존 또한 모니터링하였다. 또한, 식량 소비량, 식수 소비량, 체질량, 자발적 활동 및 거동, 자발적 운동, 산소 소비량, 및 이산화탄소 생산량을 모니터링하기 위해 5-8일 동안에 걸쳐 마우스를 대사 케이지에서 하우징할 수도 있었다.
실시예 8
노화 관련 분비 표현형 (SASP)의 성분을 선택적으로 억제하는 화합물에 대한 스크리닝 및 그에 대한 특징 규명
노화 관련 분비 표현형 (SASP)을 잠재적으로 억제하는 소 분자를 확인하기 위해, 하기에 추가로 상세하게 기술되는 바와 같은, 휴지 또는 노화 상태인 정상 인간 섬유아세포, 및 인간용으로 허가받은 화합물 라이브러리를 이용하는 스크리닝 전략법이 개발되었다.
실험 방법:
세포 배양물 및 시약
HCA2 인간 신생아 포피, IMR-90 인간 태아 폐 섬유아세포 및 T47D 인간 유방암 세포를 입수하고, 앞서 기술된 바와 같이 3% O2 및 10% CO2에서 배양하였다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]; [Coppe et al., 2010, PLoS ONE 5:e9188]). 기술된 바와 같이 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]), X-방사선 조사 (10 Gy) 또는 발암성 RAS 또는 MAP 키나제 키나제 6 (MKK6)의 렌티바이러스 발현에 의해 세포 노화를 유도하였다. 노화 전 및 노화 세포의 24-h BrdU 표식 지수는 각각 >75% 및 <10%였고 (문헌 [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]); <10% 및 >70%는 각각 노화-관련 베타-갈락토시다제 활성에 대해 양성인 것으로 염색되었다 (문헌 [Dimri et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9363-9367]) (바이오비전(Biovision) 노화 검출용 키트). HEK293FT 패키징 세포 (인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 렌티바이러스를 생성하였다. 시그마-알드리치(시그마-Aldrich)로부터 코르티코스테론, 코르티솔 및 RU-486을 입수하였다.
바이러스 벡터 및 감염
발암성 RAS 및 MKK6을 코딩하는 렌티바이러스는 기술되어 있다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]). GFP (대조군) 및 GR에 대한 shRNA를 코딩하는 렌티바이러스를 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems)로부터 구입하였다. 렌티바이러스 NF-κB 수용체-루시퍼라제 구축물을 SA 바이오사이언시즈(SA Biosciences)로부터 구입하였다. 렌티바이러스를 기술된 바와 같이 제조하고 사용하였다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]). 감염의 부작용을 제한하기 위해, 세포 90%를 감염시키도록 바이러스 역가를 조정하고, 이어서 배양물을 3일 동안 1 ㎍/ml 퓨로마이신 중에서 선별하였다.
초기 약물 스크리닝
바이오멕 FX(Biomek FX) (베크만 쿨터(Beckman Coulter: 미국 캘리포니아주))가 장착된 자동 액체 처리 장치를 사용하여 96-웰 포맷으로 초기 약물 스크린을 수행하였다. 노화 세포를 X-방사선 조사 후 24시간째에 96-웰 플레이트에 웰당 7,500개의 세포로 플레이팅하였다. 노화 세포를 플레이팅한 후 6일째, 노화 전 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 7,500개의 세포로 플레이팅하였다. 노화 전 세포를 플레이팅한 후 24시간째, 노화 전 세포 및 노화 세포, 둘 모두를 세척하고, 노화 전 세포의 세포 증식을 정지시키기 위해 48시간 동안 저혈청 (0.2%) 중에서 인큐베이션시켰다. DMSO 중 1,120가지의 생체이용성 화합물을 포함하는 프레스트윅 케미컬 라이브러리(Prestwick Chemical Library)로부터의 약물을 0.2% 혈청을 함유하는 배지 중 2.5 μM로 세포에 제공하였다. 화합물 첨가 후 48시간째, 각 웰 중의 배지를 제거하고, ELISA에 의해 검정하여 IL-6 수준을 정량화하기 위해 냉동시켰다. 배지 제거 후, 웰에 남아 있는 세포를 용해시키고, ATP 수준을 측정하여 (ATP라이트 1-단계 검정(ATPlite 1-step assay), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer: 미국 매사추세츠주)) 독성을 통해 IL-6을 저하시킨 (세포 사멸) 화합물은 배제시켰다. 각 플레이트의 실험 웰을 각각 ELISA 및 ATP 검정에 대한 플레이트 평균 또는 동일 플레이트 DMSO 대조군으로 정규화하였다.
글루코코르티코이드를 이용한 후속 처리
SASP 조절인자로서의 글루코코르티코이드를 입증하기 위해, (달리 명시되지 않는 한) 방사선 조사 후 15분 이내에 글루코코르티코이드를 첨가하였다. MKK6 또는 RAS 과다발현에 의해 노화가 유도된 세포의 경우, 감염 후 16시간째에 글루코코르티코이드 처리를 개시하였다. 이틀에 한번씩 글루코코르티코이드를 새 배지에 재첨가하였다. 방사선 조사 또는 선별 후 6일째, 24시간 동안 세포를 글루코코르티코이드를 포함하거나, 포함하지 않는 무혈청 DMEM에 제공하고; 조절된 배지를 수집하고, ELISA를 위해 냉동시켰다.
실시간 정량적 PCR
96-웰 플레이트 중 세포 (7,500개/웰)를 용해시키고, 셀-투-Ct(Cell-To-Ct) 키트 (앰비온(Ambion))을 사용하여 역전사시켰다. 로슈 유니버살 프로브라이브러리(Roche Universal ProbeLibrary) (UPL) 및 하기 프라이머-프로브 조합을 이용하여 정량적 PCR을 수행하였다: 튜불린-A (프로브 58; F:5'-CTT CGT CTC CGC CAT CAG-3' (서열 번호 25), R:5'-TTG CCA ATC TGG ACA CCA-3' (서열 번호 26)); IL-6 (프로브 45; F:5'-GCC CAG CTA TGA ACT CCT TCT-3' (서열 번호 27), R:5'-GAA GGC AGC AGG CAA CAC-3' (서열 번호 28)); IL-8 (프로브 72; F:5'-AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC-3' (서열 번호 29), R:5'-ATG GTT CCT TCC GGT GGT-3' (서열 번호 30)); MMP-3 (프로브 36; F:5'-CAA AAC ATA TTT CTT TGT AGA GGA CAA-3' (서열 번호 31), R: 5'-TTC AGC TAT TTG CTT GGG AAA-3' (서열 번호 32)); GR (프로브 34; F: 5'-GAA AGC CAC GCT CCC TTC-3' (서열 번호 33), R: 5'-AGA CTT AGG TGA AAC TGG AAT TGC T-3' (서열 번호 34)); IL-1α (프로브 6; F: 5'-GGT TGA GTT TAA GCC AAT CCA-3' (서열 번호 35), R: 5'-TGC TGA CCT AGG CTT GAT GA-3' (서열 번호 36)); IκBα (프로브 86; F: 5'-GGT GCT GAT GTC AAT GCT CA-3' (서열 번호 37), R: 5'-ACA CCA GGT CAG GAT TTT GC-3' (서열 번호 38)).
웨스턴 블롯팅
세포를 RIPA 완충제 중에서 용해시켰다. 용해물을 초음파처리한 후 (10 sec), 원심분리하였다. 샘플을 70℃에서 10 min 동안 인큐베이션시키고, 4-15% 구배 트리스-글리신 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (인비트로겐) 상에 로딩하고, 전기영동에 의해 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 옮겨 놓고, 실온에서 1시간 동안 TBST 5% 밀크 중에서 차단하고, 4℃에서 밤새도록 차단 완충제 중 1차 항체로 프로빙하였다. 막을 TBST 중에서 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 웨스턴(Western) 검출 기질 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 블롯을 발색시켰다.
면역형광
8-웰 챔버 슬라이드에서 세포를 배양하고, 4℃에서 10 min 동안 4% 포름알데히드 (시그마(Sigma)) 중에서 고정시키고, 4℃에서 10 min 동안 PBS-0.5% 트리톤(Triton) 중에서 투과시켰다. 슬라이드를 4% 염소 혈청 (인비트로겐) 중에서 30 min 동안 차단시켰다. 1차 항체를 차단 완충제 중에 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 실온에서 30 min 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 슬로우-페이드 골드(slow-fade gold) (몰레큘러 프로브스(Molecular Probes))에 탑재시켰다. 스폿파이어(spotfire) 소프트웨어 (다이그노스틱스 인스트루먼츠(Diagnostics Instruments))와 함께 올림푸스(Olympus) BX20 형광 현미경을 이용하여 영상을 획득하고, 포토샵(Photoshop) CS (어도비(Adobe))로 프로세싱하였다.
항체
1차 항체 및 희석률은 항-GR (SC-8992, 산타 크루즈(Santa Cruz); 1:500), 항-액틴 (ab6276, 에이빔(Abeam); 1:50,000), 항-MCR (SC-11412, 산타 크루즈; 1:500), 항-IRAK1 (SC-5288, 산타 크루즈; 1:500), 항-IκBα (#9247, 셀 시그날링(Cell Signaling); 1:500), 항-RelA (SC-109, 산타 크루즈; 1:500), 및 항-53BP1 (A300-272A, 베틸(Bethyl); 1:500). 웨스턴 분석에 사용된 2차 항체는 염소 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이트 (#170-5047, 바이오래드(BioRad); 1:5,000), 및 염소 항-토끼 IgG HRP 컨쥬게이트 (#166-2408, 바이오래드; 1:5,000)였다. 면역염색에 사용된 2차 항체는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-토끼 IgG (#A11008, 인비트로겐; 1:750)였다.
NF -κB 결합 활성 및 트랜스활성화 검정
핵 추출용 키트 (액티브 모티프(Active Motif))를 이용하여 핵 추출물을 제조하고, 트랜스AM(TransAM) NF-κB p65 키트 (액티브 모티프)를 사용하여 NF-κB DNA 결합을 측정하였다. 트랜스활성화 검정을 위해, NF-κB 수용체-루시퍼라제 렌티바이러스로 감염된 세포를 완충제 (프로메가(Promega)) 중에서 용해시키고, 문헌 [Freund et al., 2011, EMBO J. 30:1536-1548]에 기술되어 있는 바와 같이, 루시퍼라제 활성을 세포 개수로 정규화시켰다.
항체 어레이
배양물을 세척하고, 24시간 동안 무혈청 DMEM 중에서 인큐베이션시키고, DMEM을 사용하여 조절된 배지를 등가인 세포 개수로 희석시켰다. 제조사의 설명서에 따라 레이바이오테크(Raybiotech) (AAH-CYT-G1000-8)로부터의 항체 어레이를 사용하였다. 진픽스 4200A 프로페셔널(GenePix 4200A Professional) 마이크로 어레이를 사용하여 어레이를 스캐닝하였다. LI-COR 오딧세이(Odyssey) 소프트웨어를 사용하여 신호 강도를 정량화하고, 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]), 각 샘플에 대한 양성 대조군에 대해 정규화한 후, 모든 샘플간에 걸쳐 정규화하였다.
ELISA
조절된 배지를 여과시키고, -80℃에서 보관하였다. 매 실험마다 세포 개수를 측정하였다. 퍼킨엘머로부터의 키트 (IL-6 AL223F) 및 방법을 사용하여 ELISA를 투여하였다. 데이터를 정규화하고, pg/ml/세포/24h로 표시하였다.
침습 검정
T47D 인간 유방암 세포 (120,000개의 세포/웰)를 트랜스웰(Transwells) (BD 바이오사이언시즈)의 상부 챔버내 마트리겔(Matrigel) 층 맨 위에 플레이팅하였다. 하부 챔버는, 10 d 동안 코르티코스테론 또는 코르티솔로 처리된 노화 전 또는 노화 HCA2 섬유아세포로부터의 조절된 배지를 포함하였다. 18 h 후, (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Coppe et al., 2010, PLoS ONE 5:e9188]) 상부 챔버 필터의 아래쪽으로 이동한 세포를 염색하고, 계수하였다.
통계학적 분석
모든 그래프상의 오차 바는 3회 이상의 독립 측정치의 표준 편차를 나타낸다. 항체 어레이의 경우, 신호 분포 사이의 통계학적 유의도는 조건당 3개의 조절된 배지를 이용하고, 양측 스튜던츠 t 검정을 사용하며, 등분산 가정하에 평가하였다.
글루코코르티코이드는 노화 관련 분비 표현형의 성분을 선택적으로 억제한다
잠재적인 SASP 조절인자일 수 있는 소 분자를 확인하기 위해, 휴지 또는 노화 상태인 인간 섬유아세포 (세포주 HCA2)를 함유하는 평행 96-웰 플레이트에 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 스크리닝 전략법을 개발하였다. 시험된 화합물은 연방 의약청(Federal Drug Administration) 허가를 받은 대략 1,120개의 약물로 이루어진 콜렉션인, 프레스트윅 케미컬 라이브러리를 포함하였다. 화합물을 단일 농도 (2.5 μM)로 이중 웰에 첨가하였다. 48시간 후, 각 웰로부터 배지를 제거하고, 세포를 용해시켰다. ELISA를 사용하여, 화합물이 SASP를 억제하였는지 또는 증진시켰는지 여부를 시사하는 것으로서, 주요 SASP 인자인 배지 중의 IL-6 존재를 검출하였다. 세포 용해물을 세포 개수에 대한 대리물로서 ATP에 대해 검정하였다. ATP 검정의 결과를 통해 고도로 독성인 화합물, 또는 세포 개수를 크게 변경시킨 화합물을 소거시킬 수 있었다.
시험된 1,120개의 약물 중 수개는 ATP 수준을 변경하지 않으면서 IL-6 분비를 억제하였다. 이어서, 상기 약물은 세포 독성을 유발하지 않으면서, 또는 노화 성장 정지를 역전시키지 않으면서, SASP를 억제시킬 수 있는 능력을 가진 후보 물질이 되었다. 후보 약물로는 하기: 코르티코스테론, 코르티솔, 프레드니손, 안드로스테론, 톨라자미드, 클로르프로파미드, 글리클라지드, 피나스테리드, 노르게스트렐-(-)-D, 에스트라디올-17-베타, 미녹시딜, 및 벤포티아민을 포함하였다. 상기 후보 물질들 중 글루코코르티코이드 계열의 호르몬, 예컨대, 코르티코스테론이 효능이 가장 강력하였다.
노화 관련 IL-6 분비를 억제시킬 수 있는 코르티코스테론의 능력을 확인하기 위해, 신선한 HCA2 섬유아세포 배양물을 준비하고, X-방사선 조사 (10 Gy)에 의해 노화를 유도하였다. 상기 조건하에서 세포는 24-48시간 이내에 성장 정지되었지만, SASP 성분이 배지 중에서 검출되는 데에는 4-5일이 소요되었다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]; [Coppe et al., 2010, PLoS ONE 5:e9188]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]). 방사선 조사 직후, 다양한 농도의 코르티코스테론을 첨가하고, 6일 동안 약물 중에 세포를 유지시켰다. 6일째, 코르티코스테론을 포함하거나, 포함하지 않는 무혈청 배지 중에서 세포를 인큐베이션시키고, 24 h 후, 조절된 배지를 수집하고, 배지를 ELISA에 의해 IL-6에 대해 검정하였다. 코르티코스테론은 용량에 의존하는 방식으로 IL-6 분비를 저하시켰다 (도 12A). 20 nM일 때, 코르티코스테론은 대략 50%만큼 IL-6 분비를 감소시켰고; 500 nM일 때에는 최대로 (>90% 정도로) 억제하였다. 노화 세포에 의한 IL-6 분비를 억제할 수 있는 코르티코스테론의 능력은 HCA2 세포에 특별한 것은 아니었다. 또 다른 인간 섬유아세포주 (태아 폐로부터 IMR-90)를 사용하였을 때에도 유사하게 감소된 것을 관찰할 수 있었다 (도 16A).
설치류 및 다른 종에서는 코르티코스테론이 주요 GR 리간드이지만; 인간에서 주요 GR 리간드는 밀접한 관계가 있는 글루코코르티코이드 코르티솔이다 (문헌 [Gross and Cidlowski, 2008, Trends Endocrinol. Metab. 19:331-339]; [Zanchi et al., 2010, J. Cell Physiol. 224:311-315]). 그러므로, X-방사선 조사에 의해 노화 유도된 인간 섬유아세포에 의한 IL-6 분비를 억제시킬 수 있는 능력에 대해 코르티솔을 시험하였다. 코르티솔은 용량에 의존하는 방식으로 IL-6 분비를 저하시켰고, 코르티코스테론보다 그 효능은 더 컸다 (도 12B). 코르티솔은 노화-관련 IL-6 분비를 나노몰 농도 이하 (160-800 pM)일 때에는 50%만큼 감소시켰고, 100 nM일 때에는 >90% 감소시켰다.
코르티코스테론 또는 코르티솔이 SASP를 억제하였는지 여부, 또는 그러한 정도를 측정하기 위해, 항체 어레이를 사용하여 120종의 시토카인 및 성장 인자의 상대적 분비량에 관한 정보를 얻었다. 노화 전 및 노화 세포를 500 nM 코르티코스테론 또는 100 nM 코르티솔과 함께 인큐베이션시켰다 (도 12C). 두 글루코코르티코이드 모두 IL-6, IL-8, GM-CSF 및 MCP-2를 비롯한, 수개의 염증유발성 시토카인 및 케모카인의 분비를 강력하게 억제시켰다. 또한, 이들은 또한 수개의 성장 및 혈관신생 인자, 예컨대, VEGF의 분비를 억제시켰다. 글루코코르티코이드 중 어느 것도 SASP의 모든 성분을 억제하지는 못했으며 (도 12C), 따라서, 이는 선택적 SASP 조절인자였다.
노화 관련 IL-6 분비를 억제시킬 수 있는 코르티코스테론 및 코르티솔의 능력은 X-방사선 조사에 의해 노화 유도된 세포로만 한정되지 않았다. 글루코코르티코이드, 둘 모두는 성장 정지, 세포 비대, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-Bgal) 발현 및 강성 SASP를 유도하는 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]) 발암성 RAS 또는 MKK6 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 6)의 과다발현에 의해 노화 유도된 세포에서 효과적이었다 (도 12D).
글루코코르티코이드에 의한 IL-6 분비를 억제하기 위해서는 SASP가 확립되는 장기간 동안 스테로이드가 존재하여야 했다. 동시에 노화도 유발하는 방사선을 조사받은 세포에서는 SASP가 확립되는 데에는 방사선 조사 후 1-2일을 시작으로 3-4일이 소요된다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]). X-방사선 조사에 의한 노화를 유도하기 이전에 세포를 코르티코스테론으로 전처리하거나, 또는 방사선 조사 후 즉시 또는 SASP가 확립된 이후에 (방사선 조사 후 7일째) 오직 24시간 동안만 처리한 경우에는 IL-6 분비에 대해 어떤 영향도 미치지 못했다 (도 12E). 그러나, 방사선 조사 후 7일 동안 계속해서 코르티코스테론에 노출시킨 결과, IL-6 분비는 강력하게 억제되었다 (도 12E).
코르티코스테론 및 코르티솔은 SASP에 영향을 미치는 것과 달리, SA-Bgal을 발현시킨 세포 분획 (도 16B), 또는 비대해진 노화 세포의 형태에는 어떤 영향도 미치지 못했다. 또한, 글루코코르티코이드 중 어느 것도 노화 성장 정지를 역전시키지는 못했다. 따라서, X-방사선 조사에 의해 유도되고, 7일 동안 코르티코스테론 또는 코르티솔로 처리된 세포는 그의 낮은 24 h BrdU 표식 지수를 유지하였다 (도 16C). 추가로, 비록 SASP가 지속적인 DNA 손상 병소로부터 나온 (문헌 [Rodier et al., 2011, J. Cell Sci. 124:68-81]) 구성적 낮은 수준의 DNA 손상 반응 (DDR) 신호전달에 의존하지만 (문헌 [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]), 코르티코스테론 및 코르티솔은 X-방사선 조사에 의해 노화 유도된 세포의 핵 중의 지속적인 DNA 손상 병소 개수에는 어떤 영향도 미치지 못했다 (도 16D; 16E).
이러한 결과는 염증유발성 시토카인 분비를 비롯한, 노화 세포에 의해 분비된 단백질 분비를 선택적으로 감소시키는 화합물에 대한 스크리닝의 가능성을 입증한다. 원형 SASP 단백질 IL-6에 대한 ELISA와 커플링된, 실질적인 세포 손실 또는 획득을 검출하는 이중 세포 ATP 수준 검정을 통해 큰 독성 없이, 잠재적인 SASP 억제 활성을 가지거나, 또는 동일하게 중요한 것으로, 노화 성장 정지를 역전시킬 수 있는 능력을 가진 화합물을 확인할 수 있었다. 종합해 보면, 본 데이터 결과, 코르티코스테론 및 코르티솔은 성장 정지를 비롯한, 다른 중요 노화 표현형에는 영향을 미치지 않으면서, 중요한 SASP 인자의 분비를 저하시켰고, 세포가 이온화 방사선에 의해 노화가 유도되었는지, 또는 발암성 RAS 또는 MAP 키나제 키나제 6 과다발현에 의해 전달된 강력한 유사분열촉진 신호에 의해 노화가 유도되었는지 여부에 따라 효과적인 것으로 나타났다.
글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체를 통해 SASP 의 억제를 매개한다
대부분의 SASP 인자는 mRNA 수준이 풍부할 때 상향조절되기 때문에 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Coppe et al., 2010, PLoS ONE 5:e9188]), 글루코코르티코이드가 3가지 중요한 SASP 인자 (IL-6, IL-8, MMP-3)의 mRNA 수준에 미치는 효과를 측정하였다 (도 13A1). 본원에 기술되어 있는 바와 같이 노화 전 (모의) 세포 또는 DMSO, 500 n 코르티코스테론, 또는 100 nm 코르티솔로 처리된 노화 X-조사된 HCA2 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 3가지 mRNA 모두 코르티코스테론 및 코르티솔에 의해 강력하게 감소되었으며 (도 13A1), 이는 글루코코르티코이드가 전사 수준에 작용한다는 것을 제안한다. 제2 실험에서, SASP 인자인 IL-5, IL-6, IL-8, MMP-3, IL-1α, MCP-2, MCP-3, 및 GM-CSF의 mRNA 수준을 측정하였다 (도 13A2 참조).
글루코코르티코이드는, 리간드 결합시 핵으로 전위되어 다수의 유전자의 전사를 변경시키는 GR 이소폼에 대한 리간드이며; 글루코코르티코이드의 생리학적 효과 대부분은 GR에 의존한다 (문헌 [Gross and Cidlowski, 2008, Trends Endocrinol. Metab. 19:331-339]; [Zanchi et al., 2010, J. Cell Physiol. 224:311-315]; [Oakley and Cidlowski, 2011, J. Biol. Chem. 286:3177-3184]). 노화의 결과로서, 또는 코르티코스테론 또는 코르티솔 첨가의 결과로서 나타나는 GR 발현 수준 변화를 측정하였다 (도 13B). GR mRNA 수준은 노화 전 세포에 비하여 노화 세포에서는 약간 증가한 것으로 나타났고, 글루코코르티코이드 첨가에 의해선 영향을 받지 않았다. GR은 대개 노화 전 세포의 세포질에 존재하며, 세포가 X-방사선 조사에 의해 노화가 유도된 후 최대 7일까지 세포질에 그대로 남아 있었다 (도 13C). 그러나, GR은 코르티코스테론 또는 코르티솔에 대한 반응으로 핵으로 전위되었으며 (도 13C), 이는 상기 두 글루코코르티코이드 모두가 GR을 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다. 대조적으로, 또한 코르티솔에 결합하고, 물리적으로 GR과 상호작용할 수 있는 관련된 미네랄코르티코이드 수용체는 코르티코스테론 또는 코르티솔 첨가 이후에 세포질에 그대로 남아 있었다 (도 17A). 따라서, 코르티코스테론 및 코르티솔은 각각 노화 HCA2 세포에서 GR 핵 국재화를 특이적으로 유도한다.
선택된 SASP 성분의 발현을 억제시킬 수 있는 코르티코스테론 및 코르티솔의 능력이 GR에 의해 매개되었는지 여부를 측정하기 위해, RNA 간섭 (RNAi) 및 GR의 세포를 고갈시키도록 디자인된 짧은 헤어핀 (sh) RNA를 발현하는 렌티바이러스를 사용하였다. 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯팅을 통해 상이한 두 shRNA가 GR mRNA 및 단백질 수준을 감소시켰다는 것을 확인하였다 (도 13D; 13E). GR 고갈은 코르티코스테론 및 코르티솔에 의한 IL-6 분비 억제를 부분적으로 구제하였다 (도 13F). 이러한 부분적 구제는 shRNA에 의한 불완전한 GR 고갈에 기인하는 것일 수 있다 (도 13D; 13E). 상기 결과와 일관되게, 노화 세포를 코르티코스테론 또는 코르티솔로 처리함과 동시에 글루코코르티코이드 길항제 RU-486으로 동시에 처리하였을 때 (문헌 [Cadepond et al., 1997, Annu. Rev. Med. 48: 129-156]; [Lewis-Tuffm et al., 2007, Molec. Cell Biol. 27:2266-2282]), 글루코코르티코이드에 의해 억제된 노화-관련 IL-6 분비는 구제되었다 (도 13G). RU-486은 GR 핵 전위에는 어떤 영향도 미치지 않으면서, 상기 글루코코르티코이드 활성을 차단시켰다 (도 17B).
종합해 보면, 본 결과는 두 코르티코스테론 및 코르티솔 모두가 노화 세포에서 GR 핵 전위를 유도하였고, 이는 NF-κB DNA 결합 및 트랜스활성화 활성을 억제시킴으로써 IL-1α 신호전달을 억제하였다는 것을 나타낸다. 또한, 유전적으로 또는 약리학적으로 (RU-486) GR을 저해시킨 결과, 글루코코르티코이드에 의한 노화-관련 IL-6 분비 억제는 구제되었으며, 이러한 결과는 노화 세포에서 글루코코르티코이드의 억제 효과를 위해서는 GR이 요구된다는 것을 제안한다.
글루코코르티코이드는 SASP 의 상류 조절인자인 IL -1α의 발현을 억제한다
IL-1α는 SASP (노화-관련 IL-6/IL-8 시토카인 네트워크)의 중요한 상류 조절인자라는 것이 앞서 입증되었다 (문헌 [Orjalo et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 17031-17036]). IL-1α는 추가로 IL-1α 전사 자극하는 SASP를 전사 인자 핵 인자-카파 B (NF-κB)를 활성화함으로써 확립 및 유지시키고 (문헌 [Orjalo et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 17031-17036]; [Freund et al., 2011, EMBO J. 30: 1536-1548]), 이를 통해 양성 피드백 루프가 확립된다 (Freund et al., 2010, Trends Molec. Med. 16:238-248]). 이러한 양성 피드백 루프를 통해 NF-κB 활성화는 증가하게 되고, 그 결과, 여러 SASP 인자의 전사도 증가하게 된다. 그러므로, 글루코코르티코이드가 IL-1α 발현을 간섭함으로써 SASP를 억제하는지 여부를 조사하였다.
IL-1α mRNA는 세포가 X-방사선 조사에 의해 노화 유도된 이후에 빠르게 상승하였다 (도 14A). 코르티코스테론 및 코르티솔, 둘 모두, 방사선 조사시에 첨가되었을 때에는 상기와 같은 상승을 지연시켰을 뿐만 아니라, 추후의 IL-6 mRNA 상승도 지연시켰다 (도 14A; 14B). 추가로, 글루코코르티코이드는, 보통 SASP가 완전하게 발생되는 시점인 방사선 조사 후 7일 이상 동안 IL-1α 및 IL-6 mRNA 수준 (대조군의 <10%)을 계속해서 억제하였다 (문헌 [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Rodier et al., 2009, Nature Cell Biol. 11:973-979]).
IL-1α는 형질막 및 핵, 둘 모두로 국재화된다 (문헌 [Werman et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2434-2439]; [Orjalo et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 10731-10736]). IL-1α mRNA 수준 억제와 일관되게, 코르티코스테론 및 코르티솔은 또한, 대조군에서는 강력한 핵 염색으로 시각화되었지만, 글루코코르티코이드-처리된 노화 세포에서는 관찰되지 않은 것과 같이 (도 14C), IL-1α 단백질의 발현을 억제하였다.
글루코코르티코이드는 IL -1α/ NF -κB 경로를 손상시킨다
글루코코르티코이드가 IL-1α 신호전달을 억제함으로써 SASP를 억제하는지 여부를 측정하기 위해, 인터루킨-1 수용체 관련 키나제 1 (IRAK1), 및 NF-κB의 저해제인 IκBα의 존재량을 측정하였다. 상기 두 단백질 모두 IL-1α/IL-1 수용체 (IL-1R) 신호전달의 중요한 성분이며 (문헌 [Perkins, 2007, Nature Rev. Molec. Cell Biol. 8:49-62]; [Gottipati et al., 2008, Cell Signal. 20:269-276]), IL-1R이 IL-1α와 체결되고 나면, 신속하게 분해된다 (문헌 [Perkins, 2007, Nature Rev. Molec. Cell Biol. 8:49-62]; [Gottipati et al., 2008, Cell Signal. 20:269-276]; [Orjalo et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17031-17036]). IRAK1 및 IκBα는 노화 전 세포와 비교하였을 때, 노화 세포에는 훨씬 더 적게 존재하였으며, 이는 노화 세포에서 IL-1R 신호전달이 활성임을 시사하는 것이다 (도 15 A). NF-κB 서브유니트인 RelA의 존재량에는 변함이 없었다. IL-1α 생산 억제 및 IL-1R 신호전달 차단과 일관되게, 코르티코스테론 및 코르티솔은 IRAK1 및 IκBα 단백질을 거의 노화 전 수준으로까지 회복시켰다 (도 15 A). 또한, 글루코코르티코이드는 IκBα mRNA 수준에는 어떤 영향도 미치지 않았는데 (도 18), 이는 글루코코르티코이드가 단백질 수준 감소 및 IL-1α mRNA 수준에 미치는 그의 일관된 효과에 간접적으로 작용하였다는 것을 제안한다.
글루코코르티코이드는 IL-1α/IL-1R 신호전달을 표적화함으로써 SASP 성분, 예컨대, IL-6을 억제한다는 견해와 일관되게, 재조합 IL-1α는 코르티코스테론 및 코르티솔에 의한 IL-6 분비 억제를 구제하였다 (도 15B). GR이 NF-κB 활성을 조절하는 것으로 알려져 있는 바, 이와 관련하여 글루코코르티코이드를 작용시킬 수 있는 한가지 가능한 기전은 NF-κB 활성을 저해시킴으로써 이루어지는 것이다. 상기 모델을 지지하는 것으로, 코르티코스테론 및 코르티솔은 노화 세포에서 NF-κB DNA 결합 및 트랜스활성화 활성, 둘 모두를 유의적으로 저하시켰다 (도 15C; 15D, 15F). 추가로, 노화 세포를 글루코코르티코이드로 처리함과 동시에 RU-486 (글루코코르티코이드 길항제) 또는 재조합 IL-1α로 동시에 처리하였을 때, NF-κB 트랜스활성화 활성은 구제되었다 (도 15D). 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, GR을 통해 작용하는 글루코코르티코이드는 적어도 부분적으로는, IL-1α 발현을 손상시킴으로써 궁극적으로 SASP 성분의 발현 및 분비를 구동하는 IL-1α/NF-κB 양성 피드백 루프의 확립을 방해함으로써 SASP를 억제하는 것으로 나타났다. 그러나, 일단 확립되고 나면, 피드백 루프는 글루코코르티코이드에 의해서는 어떤 영향도 받지 않는 것으로 나타났다. 따라서, SASP가 확립될 수 있도록 허용하는 전사 랜드스케이프는 SASP를 유지시키는 전사 랜드스케이프와는 다를 수 있다.
글루코코르티코이드는 종양 세포 침습을 자극시킬 수 있는 SASP 의 능력을 억제한다
노화 세포는 전암성 또는 악성 세포에서 침습성 암 관련 표현형을 자극시킬 수 있는 인자를 분비한다 (문헌 [Krtolica et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 12072-12077]; [Liu and Hornsby, 2007, Cancer Res. 67:3117-3126]; [Coppe et al., 2008, PLoS Biol. 6:2853-2868]; [Bartholomew et al., 2009, Cancer Res. 69:2878-2886]; [Coppe et al., 2010, PLoS ONE 5:e9188]). 그러므로, 보이든 챔버에서 비-침습성 인간 유방암 세포 (T47D)의 기저막으로의 침습을 자극시킬 수 있는 SASP의 능력을 글루코코르티코이드가 억제했는지 여부를 조사하였다. 노화 전 세포로부터 제조된 조절된 배지는 T47D 세포에 의한 침습을 최소로 자극시킨 반면, 노화 세포로부터의 배지는 예상대로 침습을 4배 정도 더 많은 침습을 자극시켰다 (도 15E). 코르티코스테론 및 코르티솔, 둘 모두 T47D 침습을 자극할 수 있는 노화 세포로부터의 조절된 배지의 능력을 거의 노화 전 수준으로까지 감소시켰다. 따라서, 다중 SASP 인자 분비를 억제하는 것 이외에도, 글루코코르티코이드는 SASP의 중요한 생물학적 특성을 억제하였다.
플라보노이드 아피게닌은 노화 관련 분비 표현형의 선택된 성분을 억제한다
앞서 기술된, 휴지 (비-노화; 모의 조사된) 상태의, 또는 X-방사선 조사에 의해 노화 유도된 HCA2 인간 섬유아세포를 이용하여 화합물 라이브러리로부터 잠재적인 SASP 조절인자를 확인하는 스크리닝 프로토콜을 사용하여, 글루코코르티코이드와 함께, ATP 수준은 변경하지 않으면서, IL-6 분비를 억제할 수 있는 것으로서 플라보노이드 또한 확인하였다. 아피게닌 (4',5,7-트리히드록시플라본)은 일반 과일 및 채소에 존재하는 자연적으로 발생된 식물 플라본이다.
아피게닌이 SASP 전체를 억제하는지 여부, 또는 그러한 정도를 측정하기 위해, 다중 ELISA를 사용하여 50종의 시토카인 및 성장 인자의 상대적 분비량에 관한 정보를 얻었다. IMR90 섬유아세포를 방사선 조사 직후 10 μM 아피게닌 또는 DMSO로 처리하고, 6일 후에 분석하였다. 세포를 세척하고, 아피게닌을 포함하지 않는 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시켜 조절된 배지를 수득하였다. 비-노화, 아피게닌 또는 DMSO 처리되고, 방사선 조사된 IMR90 세포 및 대조군 (모의 조사된, DMSO 처리된) 세포로부터의 조절된 배지를 ELISA에 의해 다양한 SASP 인자에 대해 분석하였다 (도 19). 도 19에 제시되어 있는 바와 같이, 아피게닌은, 예를 들어, TGFA, MCP3, LIF, IFNβ, IL-6, GROA, 및 IL-2를 비롯한, 수개의 염증유발성 시토카인 및 케모카인의 분비를 억제하였다. 2배 미만만큼 억제된 상기 SASP 인자는 유의적으로 억제된 것으로 간주되지 않았다.
상기 기술된 다양한 실시양태는 조합되어 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 정보 시트(Application Data Sheet)에 열거되어 있는 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개 문헌들은 모두 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 실시양태의 측면들은 추가의 실시양태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개 문헌의 개념을 사용하기 위해서는 필요에 따라 변형될 수 있다.
상기 상세한 설명에 비추어 실시양태는 상기와 같이 및 다르게 변형될 수 있다. 일반적으로, 하기 특허청구범위에서 사용되는 용어는 특허청구범위를 명세서 및 특허청구범위에서 개시된 구체적인 실시양태로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 특허청구범위의 자격이 있는 전 범주의 등가물과 함께, 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 본 개시내용으로 한정되지 않는다.
<110> BUCK INSTITUTE FOR AGE RESEARCH <120> METHODS FOR IMPROVING MEDICAL THERAPIES <130> IPA140592-US <150> US 61/570,166 <151> 2011-12-13 <150> US 61/692,680 <151> 2012-08-23 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBLUESCRIPT II KS vector containing a p16Ink4a promoter-FKBP-caspase-IRES-GFP nucleic acid construct <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 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900 tattgaaaac ccgctatata cctggatttt cacagaatat tcattactct ccaaaatggc 960 cttttctagg tgaattttat tttccttaca gacctcaaga agtttacata atttacttaa 1020 acctgaggag agagaacaaa gcctcagaaa atttacatag tttatttaaa ctaaactcag 1080 cttgcttggt agcagcttct aatcccagca gttaaagaga cagaagcagg gccaacctgg 1140 ggtataatat aaggtgagac tctcctttct ttctctctgt ctctgtctgt ctctgtctct 1200 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtctcc tctctctctc tctctctctc 1260 tctctctctc tctctgtctc tctctccctc cccctccctc cctctccccc tcctctctcc 1320 ctccctctcc ctcccccccc cccacacatt tgaattcgtg gagttggtaa atgaggggtc 1380 agttctctgt ctgtctgtag ttttgtgtcc acaggatatg actgacattc tcaccacaca 1440 catacaaagt caaaaatagc tgtggccata taaagaatat ggggagagaa aattattcaa 1500 aatctgcaga aaataatgcc aggcctttaa tcctggcacc caggaggcag aagggagaca 1560 gagttctgag tttatgctga gttccaggag tggaagaaag ggccattgcc tttctggtga 1620 ggactgtctt tttaaatcct cccttctgtc cagtactggt aactctgccc aaagcgtgtt 1680 cttcttcctg cctcacaaga ttgcaaagac gtttttaacg aacaatttaa accggtgcaa 1740 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<223> Flag/Tag/Stop <400> 12 gattacaagg atgacgacga taagtga 27 <210> 13 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR <400> 13 ggatc 5 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiple cloning site (MluI, Pac1, Xho1, Pme1) <400> 14 aacctcgagg aattcacgcg tttaattaac tcgaggttt 39 <210> 15 <211> 1268 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES, GFP <400> 15 tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgata tcgaattccg cccctctccc tccccccccc 60 ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 120 tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 180 tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 240 tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 300 tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 360 tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 420 tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 480 aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 540 agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 600 aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 660 gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 720 ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 780 ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 840 ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 900 ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 960 gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1020 aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1080 tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1140 atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1200 ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1260 cccaacga 1268 <210> 16 <211> 565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit beta-globin PA <400> 16 gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 60 ggacgagctg tacaagtaaa gcggccgcga tctttttccc tctgccaaaa attatgggga 120 catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta ttttcattgc 180 aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga gggcaaatca 240 tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgcca tatgctggct 300 gccatgaaca aaggtggcta taaagaggtc atcagtatat gaaacagccc cctgctgtcc 360 attccttatt ccatagaaaa gccttgactt gaggttagat tttttttata ttttgttttg 420 tgttattttt ttctttaaca tccctaaaat tttccttaca tgttttacta gccagatttt 480 tcctcctctc ctgactactc ccagtcatag ctgtccctct tctcttatga agatccctcg 540 acctgcagcc caagcttggc gtaat 565 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-rev <400> 17 catggtcata gctgtttcct gtgtga 26 <210> 18 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacO <400> 18 aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 60 tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 120 cagtcgggaa acctgtcgtg ccagcggatc cgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 180 cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 240 atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcct 285 <210> 19 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fse1, linker <400> 19 aaacggccgg ccatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgt 58 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 <400> 20 tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaat 37 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-rev <400> 21 catggtcata gctgtttcct gtgtga 26 <210> 22 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacO <400> 22 aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 60 tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 120 cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 180 ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 240 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 300 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 360 aa 362 <210> 23 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ColE1 origin <400> 23 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 60 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 120 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 180 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 240 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 300 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 360 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 420 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 480 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 540 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 600 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 660 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 720 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 780 <210> 24 <211> 986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR <400> 24 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 60 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 120 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 180 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 240 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 300 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 360 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 420 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 480 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 540 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 600 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 660 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 720 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 780 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 840 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 900 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 960 gcgcacattt ccccgaaaag tgccac 986 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin-A forward primer <400> 25 cttcgtctcc gccatcag 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin-A reverse primer <400> 26 ttgccaatct ggacacca 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 27 gcccagctat gaactccttc t 21 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 28 gaaggcagca ggcaacac 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 forward primer <400> 29 agacagcaga gcacacaagc 20 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 reverse primer <400> 30 atggttcctt ccggtggt 18 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 foward primer <400> 31 caaaacatat ttctttgtag aggacaa 27 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 reverse primer <400> 32 ttcagctatt tgcttgggaa a 21 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GR forward primer <400> 33 gaaagccacg ctcccttc 18 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GR reverse primer <400> 34 agacttaggt gaaactggaa ttgct 25 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha forward primer <400> 35 ggttgagttt aagccaatcc a 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha reverse primer <400> 36 tgctgaccta ggcttgatga 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IkappaBalpha forward primer <400> 37 ggtgctgatg tcaatgctca 20 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IkappaBalpha reverese primer <400> 38 acaccaggtc aggatttt 18

Claims (67)

  1. 대상체에게 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제제가 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와 동시에 투여되는 것인, 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제제가 의료 요법의 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제가 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제제가 의료 요법 투여 이전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제제가 의료 요법의 투여 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제제가 투여되는 의료 요법의 적어도 일부와 동시에 투여되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제가 노화 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 억제하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 요법이 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시키는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 요법이 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암에 걸리거나, 암이 완화(remission) 중이거나, 암이 재발될 위험에 있거나, 또는 암이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법이 항암 요법을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 암이 전이성 암인 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 항-바이러스 요법이 HIV/AIDS 관리 요법인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, HIV/AIDS 관리 요법이 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암에 걸린 상태이고, 줄기 세포 이식을 받았거나 받을 예정이며, 의료 요법이 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법, 또는 그의 조합인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 줄기 세포 이식이 (a) 자가 줄기 세포 이식, 및 (b) 동종이형 줄기 세포 이식으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 심혈관 질환을 앓고 있거나, 심혈관 질환이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법이 안지오텐신인 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병을 앓고 있으며, 의료 요법이 인슐린인 것인 방법.
  20. (a) 대상체에게 대상체의 하나 이상의 세포에서 노화를 유도하는 의료 요법을 투여하는 단계; 및 이어서,
    (b) 대상체에게 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는, 항-노화 세포 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 의료 요법의 효과를 증진시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제제가 의료 요법 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 또는 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 제제가 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산인 것인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 요법이 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시키는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 요법이 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함하는 것인 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암에 걸리거나, 암이 완화 중이거나, 암이 재발될 위험에 있거나, 또는 암이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법이 항암 요법을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 암이 전이성 암인 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 항-바이러스 요법이 HIV/AIDS 관리 요법인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, HIV/AIDS 관리 요법이 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는 것인 방법.
  30. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암에 걸린 상태이고, 줄기 세포 이식을 받았거나 받을 예정이며, 의료 요법이 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 줄기 세포 이식이 (a) 자가 줄기 세포 이식, 및 (b) 동종이형 줄기 세포 이식으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 심혈관 질환을 앓고 있거나, 심혈관 질환이 발병될 위험에 있으며, 의료 요법이 안지오텐신인 것인 방법.
  33. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병을 앓고 있으며, 의료 요법이 인슐린인 것인 방법.
  34. 의료 요법의 효과를 증진시키기 위한, 의료 요법에 의해 유도될 수 있는 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제의 용도로서, 여기서 제제가 의료 요법의 투여 이전, 이후, 또는 그와의 동시 투여에 적합한 것인 용도.
  35. 제34항에 있어서, 제제가 의료 요법 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째 투여에 적합한 것인 용도.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제가 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 것인 용도.
  37. 제34항에 있어서, 제제가 의료 요법 투여 이전에 투여되는 것인 용도.
  38. 제37항에 있어서, 제제가 의료 요법의 투여 적어도 1일, 적어도 2-6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4-5주, 적어도 6-8주, 또는 적어도 10-12주 전에 투여되는 것인 용도.
  39. 제34항에 있어서, 제제가 투여되는 의료 요법의 적어도 일부와 동시에 투여되는 것인 용도.
  40. 제34항에 있어서, 생물학적 손상 반응을 억제하는 제제가 노화 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 세포-관련 분자의 발현 또는 분비를 억제하는 것인 용도.
  41. 제34항에 있어서, 제제가 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산인 것인 용도.
  42. 제34항에 있어서, 의료 요법이 대상체에서 노화 세포의 비율을 증가시키는 것인 용도.
  43. 제34항에 있어서, 의료 요법이 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함하는 것인 용도.
  44. 제34항에 있어서, 의료 요법이 항암 요법인 것인 용도.
  45. 제44항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하는 것인 용도.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 암이 전이성 암인 것인 용도.
  47. 제43항에 있어서, 항-바이러스 요법이 HIV/AIDS 관리 요법인 것인 용도.
  48. 제47항에 있어서, HIV/AIDS 관리 요법이 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는 것인 용도.
  49. 제34항에 있어서, 의료 요법이 고용량의 화학요법 또는 고선량의 방사선요법 또는 그의 조합이고, 줄기 세포 이식을 투여하기 이전 또는 그 이후에 투여되는 것인 용도.
  50. 제49항에 있어서, 줄기 세포 이식이 (a) 자가 줄기 세포 이식, 및 (b) 동종이형 줄기 세포 이식으로부터 선택되는 것인 용도.
  51. 제34항에 있어서, 의료 요법이 안지오텐신인, 심혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 용도.
  52. 제1항에 있어서, 의료 요법이 인슐린인, 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 용도.
  53. 의료 요법의 효과를 증진시키기 위한 항-노화 세포 제제의 용도로서, 의료 요법이 하나 이상의 세포의 노화를 유도하고, 제제가 하나 이상의 노화 세포를 선택적으로 파괴하거나, 또는 이의 선택적 파괴를 촉진하는 것인 용도.
  54. 제53항에 있어서, 제제가 의료 요법의 투여 후 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 30일, 적어도 60일, 또는 적어도 90일 째 투여에 적합한 것인 용도.
  55. 제53항에 있어서, 제제가 소 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원-결합 단편, 펩티바디, 재조합 바이러스 벡터, 또는 핵산인 것인 용도.
  56. 제53항에 있어서, 의료 요법이 노화 세포의 비율을 증가시키는 것인 용도.
  57. 제53항에 있어서, 의료 요법이 방사선, 화학요법, 항-바이러스 요법, 또는 호르몬을 포함하는 것인 용도.
  58. 제53항에 있어서, 의료 요법이 암을 치료 또는 예방하기 위한 항암 요법을 포함하는 것인 용도.
  59. 제58항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하는 것인 용도.
  60. 제58항에 있어서, 암이 전이성 암인 것인 용도.
  61. 제57항에 있어서, 항-바이러스 요법이 HIV/AIDS 관리 요법인 것인 용도.
  62. 제61항에 있어서, HIV/AIDS 관리 요법이 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 포함하는 것인 용도.
  63. 제53항에 있어서, 의료 요법이 안지오텐신인, 심혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 용도.
  64. 제53항에 있어서, 의료 요법이 인슐린인, 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 용도.
  65. (a) 노화 세포를 후보 제제와 접촉시키고, 휴지 세포를 후보 제제와 접촉시키는 단계;
    (b) 노화 세포 및 휴지 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 노화 관련 분자의 수준을 측정하는 단계;
    (c) 노화 세포 및 휴지 세포의 생존능을 측정하는 단계; 및
    (d) 노화 세포에 의해 생산된 하나 이상의 노화 관련 분자의 수준을 휴지 세포에 의해 생산된 하나 이상의 노화 관련 분자의 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    노화 세포에 의해 생산된 하나 이상의 노화 관련 분자의 수준 감소를 휴지 세포에 의해 생산된 하나 이상의 노화 관련 분자의 수준 감소와 비교하고, 후보 제제의 존재하에서 노화 세포 및 휴지 세포의 생존능이 감소되지 않으면, 후보 작용제를 노화 관련 분비 표현형을 선택적으로 저해하는 화합물로 확인하는 것인, 노화 관련 분비 표현형 (SASP)을 선택적으로 저해하는 화합물을 확인하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, SASP의 특징이 되는 상기 하나 이상의 성분이 IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP3, IGF1, PDGF-BB, EGF, BMP4, 및 MCP-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 것인 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 방법이 고처리량 스크리닝 (HTS) 포맷으로 투여되는 것인 방법.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140335074A1 (en) 2011-12-13 2014-11-13 Buck Institute For Research On Aging Methods for improving medical therapies
TW201536324A (zh) * 2013-06-19 2015-10-01 Buck Inst For Res On Aging 增加醫藥療法有效性之方法
WO2015066442A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Everon Biosciences, Inc. Molecular targets for selective eradication of senescent cells
US20160279161A1 (en) * 2013-11-14 2016-09-29 Newsouth Innovation Pty Limited Senescence and senescence associated secretory phenotype
US9993472B2 (en) 2014-01-28 2018-06-12 Unity Biotechnology, Inc. Treatment for osteoarthritis in a joint by administering a means for inhibiting MDM2
WO2015116735A1 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and combinations for killing senescent cells and for treating senescence-associated diseases and disorders
US10328058B2 (en) 2014-01-28 2019-06-25 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating atherosclerosis by removing senescent foam cell macrophages from atherosclerotic plaques
US9993535B2 (en) 2014-12-18 2018-06-12 Siwa Corporation Method and composition for treating sarcopenia
US10358502B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 Siwa Corporation Product and method for treating sarcopenia
PT3288637T (pt) 2015-04-28 2022-10-11 Newsouth Innovations Pty Ltd Visar nad+ para tratar comprometimento cognitivo, neuropatias e inatividade induzidos por quimioterapia e radioterapia
WO2017008060A1 (en) * 2015-07-08 2017-01-12 Unity Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating senescence-associated diseases and disorders
KR20230074837A (ko) 2016-02-19 2023-05-31 시와 코퍼레이션 고급 당화 최종 산물(age)에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하고, 전이성 암 세포를 사멸시키고, 암 전이를 예방하기 위한 방법 및 조성물
US20200338056A1 (en) * 2016-03-23 2020-10-29 The Methodist Hospital System Induction of senescence using proton pump inhibitors
JP7444797B2 (ja) 2018-07-11 2024-03-06 ルベド ライフ サイエンシズ， インク． 老化細胞除去組成物及びその使用
CN110484509B (zh) * 2019-08-14 2021-07-02 广东医科大学 一种IL1α启动子驱动荧光蛋白表达的永生化SASP细胞模型
CN110988352B (zh) * 2019-11-11 2023-06-27 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 辅助检测胎盘植入的试剂盒及其应用
EP3970727A1 (en) * 2020-09-16 2022-03-23 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt Means for reducing radiotherapy resistance and adverse effects

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6201020B1 (en) 1998-12-31 2001-03-13 Guilford Pharmaceuticals, Inc. Ortho-diphenol compounds, methods and pharmaceutical compositions for inhibiting parp
US20030147899A1 (en) 1999-01-22 2003-08-07 Dhabhar Firdaus S. Endogenous hormone adjuvant and uses thereof
US20020068704A1 (en) 1999-04-05 2002-06-06 Ziegler Randy H. Compositions and methods for treatment of diabetes
WO2003028443A1 (en) 2001-09-28 2003-04-10 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Screening methods for agents that modulate degenerative disorders associated with bcl-2-and bim
US7838531B2 (en) * 2002-10-18 2010-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Farnesyltransferase inhibitors for treatment of laminopathies, cellular aging and atherosclerosis
US20050113324A1 (en) 2003-01-15 2005-05-26 Bondarev Igor E. Modulation of line-1 reverse transcriptase
EP1618386A2 (en) 2003-05-01 2006-01-25 Kudos Pharmaceuticals Limited Methods and means for the treatment of disorders associated with cellular senescence
EP1641913B1 (en) 2003-06-27 2016-01-06 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
US8614318B2 (en) 2003-11-13 2013-12-24 Abbvie Inc. Apoptosis promoters
US7642260B2 (en) 2003-11-13 2010-01-05 Abbott Laboratories, Inc. Apoptosis promoters
US7973161B2 (en) 2003-11-13 2011-07-05 Abbott Laboratories Apoptosis promoters
US7767684B2 (en) 2003-11-13 2010-08-03 Abbott Laboratories Apoptosis promoters
CN1882549B (zh) 2003-11-20 2011-02-23 詹森药业有限公司 用作聚(adp-核糖)聚合酶抑制剂的7-苯基烷基取代的2-喹啉酮和2-喹喔啉酮
CN1890224B (zh) 2003-12-05 2011-06-08 詹森药业有限公司 用作聚(adp-核糖)聚合酶抑制剂的6-取代的2-喹啉酮和2-喹喔啉酮
GB0411166D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Bionovate Ltd Treatment for asthma and arthritis
AU2005259189B2 (en) 2004-06-30 2011-04-21 Janssen Pharmaceutica N.V. Phthalazine derivatives as PARP inhibitors
GB0418388D0 (en) * 2004-08-18 2004-09-22 Univ Newcastle Cell therapy
US8624027B2 (en) 2005-05-12 2014-01-07 Abbvie Inc. Combination therapy for treating cancer and diagnostic assays for use therein
CA2606147C (en) 2005-05-12 2011-07-05 Abbott Laboratories Apoptosis promoters
CN101588805A (zh) * 2005-05-18 2009-11-25 Alt解决方案公司 为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节
US8106184B2 (en) 2005-11-18 2012-01-31 Cornell University Nicotinoyl riboside compositions and methods of use
EP2311814A1 (en) 2005-12-01 2011-04-20 F. Hoffmann-La Roche AG 2,4,5-triphenyl imidazoline derivatives as inhibitors of the interaction between P53 and MDM2 proteins for use as anticancer agents
US20090202654A1 (en) * 2005-12-14 2009-08-13 Organogenesis, Inc. Skin Care Compositions and Treatments
US20090281129A1 (en) 2006-05-15 2009-11-12 Senex Biotechnology, Inc. Cdki pathway inhibitors and uses thereof
US20100292200A1 (en) 2006-08-11 2010-11-18 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Methods for Modulating Apoptosis in Platelets
MX2009002422A (es) 2006-09-05 2009-03-20 Abbott Lab Inhibidores bcl para tratar exceso de plaquetas.
SG174772A1 (en) 2006-09-11 2011-10-28 Curis Inc Multi-functional small molecules as anti-proliferative agents
JP5160764B2 (ja) 2006-10-13 2013-03-13 全薬工業株式会社 特定の構造の複素環化合物を含む抗鬱剤、脳保護剤、アミロイドβ沈着抑制剤または老化抑制剤
WO2008061208A2 (en) 2006-11-15 2008-05-22 Genentech, Inc. Arylsulfonamide compounds
GEP20115337B (en) 2007-01-10 2011-11-25 St Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Amide substituted indazoles as poly(adp-ribose)polymerase (parp) inhibitors
EP2132570A4 (en) 2007-03-20 2010-04-21 Inst Medical W & E Hall SCREENING METHOD
JP2010522723A (ja) 2007-03-29 2010-07-08 ノバルティス アーゲー 増殖性疾患の処置のための３−イミダゾリル−インドール
TW200918542A (en) 2007-06-20 2009-05-01 Sirtris Pharmaceuticals Inc Sirtuin modulating compounds
US20100310504A1 (en) 2007-09-26 2010-12-09 Lowe Scott W Methods for treating fibrosis by modulating cellular senescence
US20100197711A1 (en) 2007-09-27 2010-08-05 Keith Geoffrey Watson Benzothiazole compounds
WO2009085216A2 (en) * 2007-12-20 2009-07-09 Squicor Compositions and methods for detecting or elimninating senescent cells to diagnose or treat disease
JP2009161494A (ja) * 2008-01-09 2009-07-23 Noevir Co Ltd Ｓｉｒｔ１活性化剤
WO2009105234A2 (en) 2008-02-19 2009-08-27 Combinatorx, Incorporated Methods and compositions for the treatment of disorders associated with defects of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene or protein
KR20110010700A (ko) 2008-05-14 2011-02-07 재단법인서울대학교산학협력재단 라이소포스파티드산 및 아데닐일 시클라아제의 억제제를 유효성분으로 함유하는 세포 노화조절용 조성물
KR101592156B1 (ko) 2008-05-23 2016-02-04 시와 코퍼레이션 재생을 촉진하는 방법, 조성물 및 장치
RU2493828C2 (ru) 2008-07-14 2013-09-27 Отономи, Инк. Модулирующие апоптоз композиции с контролируемым высвобождением и способы лечения заболеваний уха
US20100190807A1 (en) 2008-08-26 2010-07-29 Senex Biotechnology, Inc. CDKI Pathway inhibitors and uses thereof to regulate expression to TAU protein
CN101507729B (zh) 2008-10-23 2010-12-22 昆明诺唯金参生物工程有限责任公司 人参皂苷Compound K在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用
US8557983B2 (en) 2008-12-04 2013-10-15 Abbvie Inc. Apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune and autoimmune diseases
US8563735B2 (en) 2008-12-05 2013-10-22 Abbvie Inc. Bcl-2-selective apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune diseases
US8586754B2 (en) 2008-12-05 2013-11-19 Abbvie Inc. BCL-2-selective apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune diseases
US20130302283A1 (en) 2012-05-14 2013-11-14 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc hUTC MODULATION OF PRO-INFLAMMATORY MEDIATORS OF LUNG AND PULMONARY DISEASES AND DISORDERS
BRPI0918337A2 (pt) 2008-12-19 2017-05-30 Abbott Lab composto, composição farmacêutica, método de tratamento, método para tratar uma doença ou condição causada, exacerbada ou resultante de um excesso de plaquetas ou ativação indesejada de plaquetas em um paciente, método para reduzir a contagem de plaquetas circulantes em um paciente e uso
SG193849A1 (en) 2009-01-19 2013-10-30 Abbott Lab Apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune and autoimmune diseases
KR20130128018A (ko) 2009-04-10 2013-11-25 하이얀 치 새로운 노화 방지 물질 및 그 확인 방법
KR101070324B1 (ko) * 2009-05-22 2011-10-06 대우제약 주식회사 마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물
US8546399B2 (en) 2009-05-26 2013-10-01 Abbvie Inc. Apoptosis inducing agents for the treatment of cancer and immune and autoimmune diseases
WO2010148447A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology A novel regulator of cellular senescence
US8541417B2 (en) 2009-07-30 2013-09-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors
US9409873B2 (en) 2009-11-30 2016-08-09 Senex Biotechnology Inc. CDKI pathway inhibitors and uses thereof
CN102947283B (zh) 2010-03-25 2015-10-07 Abbvie公司 用于治疗癌症和免疫以及自身免疫性疾病的细胞凋亡诱导剂
US9249392B2 (en) * 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
TWI520960B (zh) 2010-05-26 2016-02-11 艾伯維有限公司 用於治療癌症及免疫及自體免疫疾病之細胞凋亡誘導劑
EP2598168A4 (en) 2010-07-28 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT WITH AN IGF-1R INHIBITOR AND AN ACT HEMMER
FR2966040A1 (fr) 2010-10-19 2012-04-20 Brigitte Gourlaouen Composition amincissante et/ou de prevention des processus inflammatoires
UA113500C2 (xx) 2010-10-29 2017-02-10 Одержані екструзією розплаву тверді дисперсії, що містять індукуючий апоптоз засіб
ES2699205T3 (es) 2010-10-29 2019-02-07 Abbvie Inc Dispersiones sólidas que contienen un agente que induce la apoptosis
HUE031267T2 (en) 2010-11-23 2017-06-28 Abbvie Ireland Unlimited Co Methods of treatment using selective BCL-2 inhibitors
US20140328893A1 (en) 2011-10-11 2014-11-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nutlin compounds for use in the treatment of pulmonary hypertension
CN103958508B (zh) 2011-10-14 2019-02-12 艾伯维公司 用于治疗癌症以及免疫与自身免疫性疾病的细胞凋亡诱导剂
AU2012352442A1 (en) 2011-12-12 2014-07-03 Smb Innovation Aps Novel heterocyclic compounds useful in sirtuin binding and modulation
US20140335074A1 (en) 2011-12-13 2014-11-13 Buck Institute For Research On Aging Methods for improving medical therapies
WO2013170174A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Method of diagnosing, treating and determining progression and survival of cancer cells using bcl-2 antagonist of cell death (bad) pathway gene signature
EP2882439B1 (en) 2012-08-13 2018-04-11 AbbVie Inc. Apoptosis-inducing agents
US20150210717A1 (en) 2012-09-13 2015-07-30 Baden-Württemberg Stiftung Gmbh Specific inhibitors of protein p21 as therapeutic agents
US20140275082A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbvie Inc. Apoptosis-inducing agents for the treatment of cancer and immune and autoimmune diseases
RU2015149680A (ru) 2013-04-21 2017-05-24 Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Агенты для подавления активности и/или снижения количества bcl-xl и/или bcl-w
US20160115237A1 (en) 2013-05-24 2016-04-28 The University Of British Columbia Cell senescence markers as diagnostic and therapeutic targets
US9987280B2 (en) 2013-08-09 2018-06-05 City Of Hope SIRT1 inhibitors and stem cell rejuvenation
US20150056195A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compositions and methods for inihibiting tumorigenicity of senescent cancer cells induced by chemotherapy
GB201317286D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Calscience Internat Ltd Composition and Use
WO2015051766A1 (en) 2013-10-12 2015-04-16 Betta Pharmaceuticals Co., Ltd Amids substituted indazole derivativees as ploy (adp-ribose) polymerase inhibitors
WO2015066442A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Everon Biosciences, Inc. Molecular targets for selective eradication of senescent cells
US20150140036A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Novartis Institutes For Biomedical Research, Inc. Low, immune enhancing, dose mtor inhibitors and uses thereof
US20160279161A1 (en) 2013-11-14 2016-09-29 Newsouth Innovation Pty Limited Senescence and senescence associated secretory phenotype

Also Published As

Publication number Publication date
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US20140335074A1 (en) 2014-11-13
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