CN103705923B - 抑制肿瘤转移的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制肿瘤转移的方法和试剂。首次揭示Bcl-3与肿瘤(如乳腺癌)的转移密切相关，是一种在肿瘤转移机制中发挥重要作用的因素，从而可以作为药物靶点开发抑制肿瘤转移的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域；更具体地，本发明涉及抑制肿瘤转移的方法和试剂。
背景技术
乳腺癌是女性高发的全球性恶性肿瘤，致死率居高不下。恶性肿瘤有两大特性：1.无限增殖能力；2.原发肿瘤转移至体内其它脏器。乳腺癌的致死率90%是由转移灶引起的。乳腺癌细胞可以转移的身体各个脏器，诸如大股、肺脏、脑等，因此，研究探索以及阐明其转移机制，进而为临床治疗上提供理论依据非常重要。但是现在关于这方面的知识依然比较贫乏。因为转移是实体瘤发展过程中很晚期的一个环节，并且过程非常复杂，包括癌细胞从原发瘤中逃逸，进入循环系统，到达远端组织，着床，而后增殖为次发肿瘤。
Bcl-3(Bcelllymphoma-3)是一个原癌基因，最早在一类B淋巴细胞白血病病人中发现。随后的分子结构分析发现，Bcl-3是NF-κB信号通路中IκB家族成员之一，但是Bcl-3与其他典型IκB家族成员不同，它不阻止NF-κB转录复合物入核行使功能，故属于非典型的IκB蛋白。目前对其功能的研究仍主要与转录因子NF-κB相关联。对于Bcl-3的分子功能报道现在主要集中于以下几个方面：(1)抑制NF-κB转录因子结合DNA；(2)作为辅助因子激活基因转录；(3)调节蛋白稳定性。
Bcl-3不仅能作为转录因子NF-κB的调节因子而且还参与蛋白稳定性的调节，所以能够在很多的生命过程中发挥作用。在免疫系统中，Bcl-3基因敲除小鼠更易患感染性疾病，这与其外周免疫器官发育不健全有关。敲除小鼠的生发中心缺失，在免疫刺激下DC细胞和B细胞的免疫应答减弱。另有报道，敲除Bcl-3基因能够影响T细胞的免疫应答，Bcl-3通过调控GATA-3的表达以调控Th2细胞的分化。此外，Bcl-3能够影响胸腺髓质区上皮细胞的发育，Bcl-3敲除后髓质区发育不良造成T细胞阴性选择缺陷而致自身免疫性疾病。在肿瘤发生中，已知Bcl-3高表达于各种类型的肿瘤中。最早Bcl-3在一种淋巴细胞白血病中通过异位到免疫球蛋白轻链基因α位点而高表达；此后在乳腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌及鼻咽癌中均检测到Bcl-3的表达增高。但这种高表达Bcl-3是如何发生的却是研究的难点生。
转化生长因子β(TGF-β)信号通路可以调控细胞增殖，分化和命运。在肿瘤发生早期，TGF-β通过保持细胞停在G1期而抑制细胞增殖，但在肿瘤晚期却可以促进细胞的迁移与转移，而乳腺癌细胞对该信号尤其敏感，这已经得到广泛的证实。一般认为TGF-β信号的活化需要Smad2/Smad3异二聚体的磷酸化，而后该二聚体与Smad4结合形成三聚体，入核行使转录因子的功能。但Liang等证明，Smad2与Smad3的调控乳腺癌细胞转移过程中可能有不同功能。即Smad3促转移而Smad2抑转移。因而研究Smad3的降解机制可能为临床治疗乳腺癌转移上提供理论支持。但是关于这方面的研究仍然很少。
迄今为止，关于Bcl-3是否调控肿瘤细胞的转移和迁移以及Bcl-3的细胞内信号调节机制，并没有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制肿瘤转移的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备抑制肿瘤转移的组合物。
在一个优选例中，所述的肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂选自：
核酸抑制物(如干扰分子)，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子(如抗体或配体)，其能够在蛋白或基因水平上下调Bcl-3的表达或活性。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂选自：
以Bcl-3基因或其转录本为靶序列、且能够抑制Bcl-3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或
特异性与Bcl-3蛋白结合的结合分子(如能够抑制Bcl-3蛋白活性的抗体或配体)。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述的具有shRNA结构的Bcl-3的下调剂可形成以下结构：
其中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，Seq正向和Seq反向并非完全互补(包括基本上互补的情形)，可以存在一些错配，或者突起。
在另一优选例中，所述的间隔序列长度5-50nt；更佳地，7-30nt。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂是包含所述shRNA结构的表达载体；较佳地，所述表达载体是病毒表达载体；更佳地，为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒表达载体中，还包括与所述shRNA结构操作性连接的启动表达元件，该组成型或诱导型的启动子。
在另一优选例中，所述的病毒载体为四环素诱导表达(tet-on)慢病毒载体，使用四环素类似物(如多西环素(doxycyclin，简称DOX))诱导其表达。
在另一优选例中，所述的病毒载体为pTRIPz慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
调控促乳腺癌转移基因的表达(包括CXCL1、ID1、ID3、SPARC、VCAM1、IL13RA2、EREG、MMP1、MMP2、COX2等，特别是下调ID1或ID3)；
降低乳腺癌细胞对于TGFβ信号的敏感度；抑制TGFβ信号的下游PAI-1、pTHrP、CTGF、IL-11的诱导；降低Angptl4本身的表达及诱导表达水平；抑制ID3与Snail的诱导；降低ID1蛋白水平及被诱导水平；
调控TGFβ信号下游的Smad3，在TGFβ信号刺激下抑制Smad3磷酸化，降低Smad3总蛋白水平；或在TNFα与TGFβ刺激下，降低Smad3的蛋白水平；或
通过RBX1E3连接酶调控Smad3的蛋白稳定性。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤转移的Bcl-3下调剂，所述的Bcl-3下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤转移的组合物，所述的组合物含有：
(1)所述的Bcl-3下调剂(较佳地，为有效量的)；和
(2)药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肿瘤转移的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达或含有Bcl-3的体系；和
(2)检测所述体系中Bcl-3的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低Bcl-3的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肿瘤转移的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达或含有Bcl-3的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中Bcl-3的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有Bcl-3的体系；
如果测试组中Bcl-3的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤转移的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达Bcl-3的细胞，更特别如MDA-MB-231细胞或4175TGL细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对Bcl-3或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肿瘤转移有用的物质。
在本发明的另一方面，提供一种Bcl-3的用途，用于制备检测肿瘤细胞转移能力的试剂。
在一个优选例中，所述的肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌。
在本发明的另一方面，提供一种特异性识Bcl-3的试剂的用途，用于制备检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒。
在一个优选例中，所述的特异性识Bcl-3的试剂选自：
特异性扩增Bcl-3基因的引物；
特异性识别Bcl-3基因的探针；或
特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体。
较佳的，所述的特异性扩增Bcl-3基因的引物具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列。
较佳的，所述的特异性结合Bcl-3蛋白的抗体是购自SantaCruz的Anti-Bcl-3。
在本发明的另一方面，提供一种检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性识别Bcl-3的试剂。
在本发明的另一方面，提供一种抑制肿瘤转移的方法，所述方法包括：下调所述哺乳动物体内Bcl-3的表达或活性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、Bcl-3杂合(Bcl-3H)或敲除(Bcl-3KO)MMTV小鼠原发肿瘤发生情况。
图1B、Bcl-3杂合(Bcl-3H)或敲除(Bcl-3KO)MMTV小鼠肺部转移灶(左图)及其统计结果(右图)。
图1C、Bcl-3杂合(Bcl-3H)与敲除(Bcl-3KO)MMTV-pyvt雌性小鼠3.5月大的肺脏的H&E染色图。
图2A、蛋白免疫印迹方法检测Bcl-3在乳腺癌细胞系中的表达情况。
图2B、来源于MDA-MB-231细胞系的一系列细胞系SCP4、SCP20、SCP2、SCP25、SCP46、1833、SCP6、MDA-MB-231、SCP26、4173、4175的Bcl-3的表达量。
图2C、来源于MCF-10A细胞的四个细胞系MCF10A、MCF10AT、MCF-10CA1b、MCF-10CA1a的Bcl-3的表达量。
图2D、pTRIPz诱导型慢病毒载体示意图。
图2E、以多西环素(终浓度1ug/ml)诱导转化了pTRIPzshRNA(V3THS_407972)的MDA-MB-231或4175TGL细胞表达，以Actin作为内参。
图3A、以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))把Bcl-3敲低、并给予DOX(＋DOX)后，MDA-MB-231细胞形态。
图3B、Transwell实验检测以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))并给予DOX(＋DOX)敲低Bcl-3之后，MDA-MB-231细胞的转移能力。
图3C、MCF-7细胞系中，以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))并给予DOX(＋DOX)敲低Bcl-3，进行划痕实验。
图3D、4175TGL细胞系中，以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))并给予DOX(＋DOX)敲低Bcl-3，进行划痕实验。
图3E、小鼠乳腺癌细胞系4T1中，敲低Bcl-3，细胞形态。
图3F、小鼠乳腺癌细胞系4T1中，敲低Bcl-3，细胞迁移能力。
图4A、将2×105个4175TGL(LM2)细胞打入裸鼠体内，之后将小鼠分成两组，每组5只小鼠，一组喂正常水(对照组(-Doxy))，一组喂含有多西环素(终浓度2ug/ml)的水以敲低Bcl-3(＋Doxy)。7周后处死小鼠，观察小鼠肺部形成转移灶数目。
图4B、两组小鼠的肺部H&E染色代表图。
图4C、以活体成像的方法统计小鼠体内的肿瘤情况。
图5A、在MCF-7、MDA-MB-231、4175TGL中，分别转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒后，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低后，各基因表达情况，Actin作为内参。
图5B、在MDA-MB-231、4175TGL中，将Bcl-3敲低，CXCL1、ID1、ID3、SPARC、VCAM1、IL13RA2、EREG、MMP1、MMP2、COX2等表达情况，GAPDH作为内参。
图5C-E、随着Bcl-3的下调，MDA-MB-231、4175TGL细胞中ID1与ID3的mRNA与蛋白水平。
图5F、将NF-κB相关的载体按照图示不同组合转染Bcl-3KOTSC细胞系，48小时后，提取RNA，Real-TimePCR检测相关基因表达。
图6A、在MDA-MB-231细胞系中，外源施加TGFβ刺激，在Bcl-3敲低(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒，将Bcl-3敲低)后，con-focal荧光显微镜下观察。
图6B、在TGFβ信号刺激下，缺失Bcl-3的细胞(＋DOX)与存在Bcl-3的细胞(-DOX)的移动情况。
图6C、敲低Bcl-3表达后，TGFβ信号的下游PAI-1、pTHrP、CTGF、IL-11等的诱导情况，以GAPDH作为内参。
图6D、在敲低Bcl-3表达后Angptl4表达水平，GAPDH作为内参。
图6E、敲低Bcl-3后，ID3与Snail的诱导情况，以GAPDH作为内参。
图7A、MDA-MB-231中，敲低Bcl-3的细胞内Smad2的磷酸化与总蛋白水平。
图7B-C、4175TGL中，敲低Bcl-3的细胞内Smad2的磷酸化与总蛋白水平。
图7C、MCF-7中，敲低Bcl-3的细胞内Smad2的磷酸化与总蛋白水平。
图7D、MDA-MB-231中，敲低Bcl-3，荧光素酶活性变化。
图7E、MCF-7中，敲低Bcl-3，荧光素酶活性变化。
图8A、当Bcl-3在4T1中敲低后，外源施加TGFβ信号后，Smad3蛋白水平，GAPDH作为内参。
图8B、MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞体系中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，GAPDH作为内参。
图8C、MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞体系中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，GAPDH作为内参。
图8D、4175TGLBcl-3敲低细胞系，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，GAPDH作为内参。
图8E、MCF-7Bcl-3敲低细胞系，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，GAPDH作为内参。
图9A、MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系，在含有DOX的培养基中诱导Bcl-3降低后，TGFβ刺激0小时与12小时，同时在培养体系中分别加入对照DMSO与MG132处理12小时，收蛋白，免疫印迹检测Smad3，GAPDH作为内参。
图9B、MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系，分别在不含DOX与含有DOX的培养基中培养以敲低Bcl-3，而后分别加入蛋白合成抑制剂CHX，处理0，2，4，6小时，而后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Smad3，GAPDH作为内参。
图9C、MDA-MB-231三个不同Bcl-3敲低处理的细胞系在含有DOX的培养基中培养，分别转入等量Flag-Smad3+HA-Ub，48小时后，分别加入TGFβ处理6小时与0小时，在收样前4小时加入MG132处理。而后用RIPA蛋白收样，在蛋白溶液里加入1uganti-flag单抗用以IP实验，4℃混摇1小时后，加入20ul蛋白-G琼脂糖珠，混摇过夜。而后RIPA洗珠四次后，加入上样缓冲液煮沸，蛋白免疫印迹实验检测flag与HA。
图9D、在MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系，在含有DOX的培养基中诱导Bcl-3降低后，转入对照siRNAoligo与RBX1siRNAoligo以敲低RBX1，而后分解加入TGFβ处理0小时与20小时，收蛋白，蛋白印迹实验。GAPDH作为内参。
图10、Bcl-3调控乳腺癌转移的模式的示意图。
图11A、在高转移性结肠癌细胞系LOVO中，应用慢病毒DOX诱导shRNA1敲低Bcl-3，观察敲低效果。
图11B、Bcl-3敲低后，迁移能力的变化。左图为显微图，右图为细胞数统计结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示Bcl-3与肿瘤(如乳腺癌)的转移密切相关。在肿瘤细胞中敲低Bcl-3基因后，Bcl-3敲低细胞肿瘤转移能力显著降低，因此可知Bcl-3蛋白是一种在肿瘤转移机制中发挥重要作用的因素，从而可以作为药物靶点开发抑制肿瘤转移的药物。
Bcl-3及其用途
本发明涉及的Bcl-3蛋白包括全长的Bcl-3蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的Bcl-3蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NP_005169.2所示的序列基本上相同。所述的Bcl-3基因的核苷酸序列可以与GenBank登录号：MM_005178.4所示的序列或该序列的简并序列基本上相同。
本发明人的研究发现，在乳腺癌体外细胞系，动物移植模型与自发模型中，Bcl-3均促进肿瘤细胞的转移，而降低其表达后大大抑制了转移能力。首先通过遗传模型，本发明人确认Bcl-3的缺失可以大大降低乳腺癌的肺脏转移灶数。体外实验证实诱导型系统效果显著，随着诱导时间增长，Bcl-3蛋白表达降低。Bcl-3降低后能够有效的抑制乳腺癌癌细胞的体外迁移能力；动物体内实验，将高转肺脏的LM2乳腺癌细胞系通过尾静脉注射入裸鼠体内。一组正常水饲养，一组喂多西环素(四环素类似物，shRNA诱导剂)水，发现诱导组转移灶数大大减少。Minn等报道有9个基因可以调控LM2细胞系肺转。本发明人发现，Bcl-3缺失后，9个基因中大部分都下调，特别是作为TGFβ信号下游的ID1与ID3。然后在TGFβ信号刺激下，本发明人发现没有Bcl-3，Smad2的磷酸化活化和总蛋白水平不受影响，但是Smad3的磷酸化受到抑制，而且总蛋白水平迅速下调，而本发明人的研究也证明Smad3是由泛素化引起的蛋白酶体所降解。综上所述Bcl-3在稳定和活化Smad3分子中有重要作用，由此而促进乳腺癌细胞的转移和迁移。而其下调剂则可以降低其表达水平，可应用于抑制肿瘤细胞的转移和迁移。
通过上述的研究工作可知，Bcl-3是一个新的、对肿瘤转移有抑制作用的药物靶点。针对Bcl-3的各种治疗手段可以作为抑制肿瘤转移的新颖和有效的手段。
Bcl-3的下调剂及其用途
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备抑制(哺乳动物)肿瘤转移的组合物。所述的肿瘤转移优选地是乳腺癌等其中Bcl-3高表达的肿瘤。
如本文所用，所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂是指任何可降低Bcl-3蛋白的活性、降低Bcl-3基因或蛋白的稳定性、下调Bcl-3蛋白的表达、减少Bcl-3蛋白有效作用时间、或抑制Bcl-3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Bcl-3有用的物质，从而可用于预防或治疗肿瘤转移。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调Bcl-3蛋白或其编码基因的表达。
作为本发明的一种选择方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种特异性与Bcl-3结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用Bcl-3蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达Bcl-3或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier，N.Y.，1981)。
在得知了所针对的下调对象(Bcl-3)后，可以设计出合适的siRNA或shRNA等干扰分子，这些干扰分子都可应用于本发明中。
作为本发明的一种选择方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种Bcl-3特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
作为本发明的一种优选方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种“小发夹RNA(SmallhairpinRNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转录物的双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(ShortHairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
本发明中，所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%，较佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互补性。
在筛选有效的shRNA序列时，可通过比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种shRNA序列，并将它们分别组装入慢病毒载体进行验证，结果两种干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的序列，它们被制成shRNA构建物后，进一步地在细胞、动物水平实验，结果证明对于体内试验而言抑制效率非常高。
作为本发明特别优选的实施方式，在RNAi实验中，本发明人采用了诱导型慢病毒载体，在其中包含有所述的shRNA结构(Seq正向-X-Seq反向)。较佳地，所述的病毒载体为四环素诱导表达(tet-on)慢病毒载体，使用四环素类似物(如多西环素(doxycyclin，简称DOX))诱导其表达。该系统优点是：a.感染效率高，可以感染90%以上的细胞。b.诱导性表达，只在含有四环素环境中才能表达shRNA。这就具有良好的可控性。
本发明的核酸抑制物如shRNA或siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA或shRNA(或含有shRNA的构建物或表达载体)等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%，较佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互补性。
组合物
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt%；较佳的0.00001-20wt%；更佳的，0.0001-10wt%)的所述的Bcl-3的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肿瘤转移。任何前述的Bcl-3的下调剂均可用于组合物的制备。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述Bcl-3基因或蛋白的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将Bcl-3的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Bcl-3的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的Bcl-3下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的Bcl-3的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的Bcl-3的下调剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
药物筛选
在得知了Bcl-3与肿瘤转移的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制Bcl-3的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗肿瘤转移真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤转移的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达Bcl-3的体系；和检测所述体系中Bcl-3的表达或活性；若所述候选物质可抑制Bcl-3的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肿瘤转移的潜在物质。所述的表达Bcl-3的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达Bcl-3的细胞；或可以是重组表达Bcl-3的细胞。所述的表达Bcl-3的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Bcl-3的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Bcl-3的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤转移真正有用的物质。
本发明对于Bcl-3蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肿瘤转移的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制Bcl-3的表达和活性，进而抑制肿瘤转移有用的物质。
检测试剂或试剂盒
基于本发明人的上述新发现，可以将Bcl-3作为检测肿瘤转移能力的标志物：(i)进行肿瘤细胞转移性的鉴别诊断；(ii)评估相关人群的肿瘤治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肿瘤转移风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由Bcl-3基因表达异常而潜在高转移风险的人群，从而可进行更有针对性地诊断或治疗。
因此，本发明提供了Bcl-3基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)肿瘤细胞转移能力的试剂或试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测Bcl-3的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测Bcl-3的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增Bcl-3的引物；或特异性识别Bcl-3的探针来确定Bcl-3的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体来确定Bcl-3蛋白的表达情况。
针对Bcl-3的引物或特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与Bcl-3基因上特定位点发生特异性结合，而不与Bcl-3基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
利用特异性结合Bcl-3蛋白的抗体来检测分析物中Bcl-3蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
本发明还提供了用于在分析物中检测Bcl-3的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增Bcl-3基因的引物；特异性识别Bcl-3基因的探针；或特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料与方法
细胞系，转染与病毒感染
人源乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7购自ATCC，4175TGL(又称为LM2)获自美国MemorialSloan-Kettering肿瘤研究中心。鼠源乳腺癌细胞系4T1购自中科院细胞库。细胞系在含有10%(v/v)FBS的DMEM培养基中培养。
细胞转染使用Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂。
为敲除人源Bcl-3，构建了pTRIPzshRNA载体系统，pTRIPz空载体购自Openbiosystem，该载体为tet-on(四环素诱导表达)慢病毒载体，使用四环素类似物多西环素(doxycyclin，简称DOX)诱导其表达；除非另外说明，DOX终浓度1ug/ml。shRNA序列分别为V3THS_407972(CTTGGTTGGATTTCTTTTGTAA(SEQIDNO:1))和V3THS_356488(ACCGGGAGCTCGACATCTACAA(SEQIDNO:2))，针对tGFP的shRNA序列为GCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTAC(SEQIDNO:5)作为对照。
pTRIPzshRNA(V3THS_407972)载体构建(相应于shRNA1)
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stabl3细菌(购自Invitrogene)。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
合成序列为：
L1:CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGCTTGGTTGGATTTCTTTTGTAATAGTGAAGCCACAGATGTATTACAAAAGAAATCCAACCAAATGCCTACTGCCTCGGAGAATTC(SEQIDNO:6)，
L2:GAGCTCACGACAACTGTCACTCGCGAACCAACCTAAAGAAAACATTATCACTTCGGTGTCTACATAATGTTTTCTTTAGGTTGGTTCGACGGATGACGGAGCCTCTTAAG(SEQIDNO:7)。
pTRIPzshRNA(V3THS_356488)载体构建方法(相应于shRNA2)
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stabl3细菌。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
合成序列为：
L1:CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGACCGGGAGCTCGACATCTACAATAGTGAAGCCACAGATGTATTGTAGATGTCGAGCTCCCGGCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC(SEQIDNO:8)；
L2:GAGCTCACGACAACTGTCACTCGCTGGCCCTCGAGCTGTAGATGTTATCACTTCGGTGTCTACATAACATCTACAGCTCGAGGGCCGACGGATGACGGAGCCTCTTAAG(SEQIDNO:9)。
pTRIpzshRNA(tGFP)载体构建方法(相应于shRNAcontrol)
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stabl3细菌。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
L1:GATCCGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACTCAAGAGGTAGGTGCCGAAGTGGTAGAAGCCGTAGCTTTTTTG(SEQIDNO:10)；
L2:AATTCAAAAAAGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCTCTTGAGTAGGTGCCGAAGTGGTAGAAGCCGTAGCG(SEQIDNO:11)。
病毒包装过程为将构建好的pTRIPzshRNA载体与psPAX2(购自Addgene)和pMD2G(购自Addgene)三种载体按质量比3:2:1转入lenti-X细胞系(Clontech)，48小时后收细胞培养液即为病毒液，取1ml病毒液，加入终浓度4mg/ml的Polybrene孵育靶细胞过夜，然后用1ug/ml的Puromycin筛选，即得稳转细胞系。
Bcl-3KO的TSC细胞的构建
取Bcl-3knockout14.5天大胚胎小鼠(购自美国Jackson实验室，编号003127)胸腺细胞体外培养，能够持续传代生长细胞即为Bcl-3KO的TSC细胞。
实验动物
雌性裸鼠购自中科院实验动物中心，用于LM2体内转移实验。Bcl-3Knockout(Bcl-3KO)小鼠购自美国Jackson实验室，编号003127。MMTV-pyvt小鼠购自南京大学模式动物研究所，编号J002374。动物饲养于SPF环境。MMTV-pyvt雌性小鼠在3.5月大时处死取肺脏观察。
Bcl-3杂合或敲除(Bcl-3KO)MMTV小鼠：将Bcl-3KO雌性小鼠与MMTV-pyvt雄性小鼠杂交得F1代，将F1代的Bcl-3杂合MMTV雄性小鼠与Bcl-3杂合非MMTV小鼠交配，便得到Bcl-3杂合与敲除的MMTV雌性小鼠。
H&E染色
裸鼠或者MMTV-pyvt小鼠取出的肺脏固定于10%(v/v)中性甲醛，而后石蜡包埋。然后再切为5um厚切片，苏木精染核，伊红染胞浆。脱水，封片。
F-actin染色
铺MDA-MB-231细胞于24孔板，内放一片盖玻片(Fisher)，然后加入2ng/ml的TGF-β刺激或不加过夜。盖玻片由预冷丙酮固定5分钟。然后，用Oregon488鬼笔环肽(Invitrogen，O7466)染色，清理，封片。用con-focal荧光显微镜观察。
免疫印迹实验
细胞系总蛋白用含有1%(w/v)PMSF的RIPA抽提，蛋白浓度由BCAproteinassaykit(Pierce，Cat.23225)检测。每一样品，上30ug样品，用SDS-PAGE电泳分离，胶中蛋白电转至MilliporePVDF膜(ImmobilonP，Millipore，Milford，MA)，封闭后后，杂交一抗与二抗(稀释于5%(w/v)脱脂奶粉)。信号检测使用SuperSignalwestpicoChemiluminescentSubstrate(Pierce，Cat.34080)。使用抗体货号如下，使用方法见说明。
购自SantaCruz：Anti-Bcl-3(sc-185)，anti-c-Myc(sc-764)，anti-cyclinD1(sc-8396)，anti-p27(sc-528)，anti-p21(sc-397)，anti-vimentin(sc-7557)，anti-E-cadherin(sc-7870)，Anti-N-cadherin(sc-31031)，anti-ID1(sc-133104)，和anti-HA(sc-805)。
购自Abcam：Anti-Snail(ab63371)，anti-ID3(ab55269)。
购自CST：Anti-phos-ERK(9101)，anti-phos-AKT(4051,5106)，anti-AKT(4685)，anti-phos-Smad3(9520)，anti-Smad3(9513)，anti-phos-Smad2(3101)，anti-Smad2(3103)。
Anti-GAPDH购自Kangchen(KC-5G4)，anti-Actin购自Sigma。
Smad3泛素化实验
Flag-Smad3(获自美国NCI)和HA-ubiquitin(获自中科院健康所)载体转入MDA-MB-231细胞系，然后加入2ng/mlTGFβ不同时间段刺激，收样前4小时加入蛋白酶体抑制剂MG132(5μg/ml，Sigma)。然后用裂解液(150mMNaCl，50mMTri-HCl，pH8.0，1%NP40，1mMEDTA)裂解细胞，免疫沉淀蛋白样品用anti-Flag抗体(3165，Sigma)，然后加入proteinGplusagrose(sc-2002SantaCruzInc)。最后，样品用免疫印迹方法检测。
Flag-Smad3载体(骨架载体pCMV5F，在其Flag附近的多克隆位点插入Smad3编码序列)构建方法：参见文献Nature.1998Aug27;394(6696):909-13。
表达HA-ubiquitin载体构建方法：参见文献JExpMed.2010Nov22;207(12):2647-62.Epub2010Nov15。
RNA抽提与实时定量PCR
各细胞系RNA用TRIzolReagent(Invitrogen，15596-018)抽提，方法按说明。为获得cDNA，使用TranscriptFirstStrandSynthesisSupermix(TransGenBiotech，AT301)，方法按照说明，取1μgRNA作为模板。所有的实时定量PCR使用7500FastReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)，实验所用试剂为Greenmastermix(DRR420A)。对每一反应，1μl反转录(RT)产物加入10μl2XSybrGreenGene反应PCRMasterMix和1μL设计好的前向引物与后向引物。每一反应三次重复，相对量通过cyclethreshold(Ct)在目的基因与gapdh或者Tubulin(ΔCt)相比较，使用方法为RQ=2-ΔΔCt。Errorbars代表标准差(SD)，统计方法为单尾非配对t-检验。
引物序列如下：
| 名称 | SEQ ID NO: | 序列(5’-3’) |
| Bcl-3F | 3 | GTGCAGATGAGGACGGAGACA |
| Bcl-3R | 4 | GCCGGACCACAGACGGTAAT |
| ANGPTL4F | 12 | TCTCCGTACCCTTCTCCACT |
| ANGPTL4R | 13 | AGTACTGGCCGTTGAGGTTG |
| CTGF-F | 14 | TTGCGAAGCTGACCTGGAAGAGAA |
| CTGF-R | 15 | AGCTCGGTATGTCTTCATGCTGGT |
| PAI-1F | 16 | TCTTTGGTGAAGGGTCTGCT |
| PAI-1R | 17 | CTGGGTTTCTCCTCCTGTTG |
| IL-11F | 18 | ACTGCTGCTGCTGAAGACTC |
| IL-11R | 19 | CCACCCCTGCTCCTGAAATA |
| PTHrP-F | 20 | ACCTCGGAGGTGTCCCCTAAC |
| PTHrP-R | 21 | TCAGACCCAAATCGGACG |
| ID1F | 22 | GGCTGTTACTCACGCCTCAAG |
| ID1R | 23 | CCAACTGAAGGTCCCTGATGTAG |
| CXCL1F | 24 | AGGGAATTCACCCCAAGAAC |
| CXCL1R | 25 | ACTATGGGGGATGCAGGATT |
| EREGF | 26 | GCTCTGCCTGGGTTTCCATC |
| EREGF | 27 | CCACACGTGGATTGTCTTCTGTC |
| vcam1F | 28 | ATGCCTGGGAAGATGGTCG |
| vcam1R | 29 | GACGGAGTCACCAATCTGAGC |
| COX2F | 30 | ACA ACA TTC CTT CCT TC |
| COX2R | 31 | CCTTATTTCCTTTCACACC |
| IL13RA2F | 32 | TTGCCGCCAGTCTATCTTAC |
| IL13RA2R | 33 | TCGGGTTTCATTTGTTGTTT |
| SPARCF | 34 | CAAGAAGCCCTGCCTGATGAGA |
| SPARCR | 35 | GGGGGTGTTGTTCTCATCCAGC |
| ID3F | 36 | TGAGCTTGCTGGACGACATG |
| ID3R | 37 | GATGACGCGCTGTAGGATTTC |
| MMP1F | 38 | GAGCAAACACATCTGACCTACAGGA |
| MMP1R | 39 | TTGTCCCGATGATCTCCCCTGACA |
| MMP2F | 40 | GGCCCTGTCACTCCTGAGAT |
| MMP2R | 41 | GGCATCCAGGTTATGGGGGA |
| hGAPDHF | 42 | TGCACCACCAACTGCTTAGC |
| hGAPDHR | 43 | GGCATGGACTGTGGTCATGAG |
| mID1F | 44 | CCTAGCTGTTCGCTGAAGGC |
| mID1R | 45 | CTCCGACAGACCAAGTACCAC |
| mID3F | 46 | CTGCTACGAGGCGGTGTG13 --> |
| mID3R | 47 | CACCTGGCTAAGCTGAGTGC |
| mTubulinF | 48 | GATCGGTGCTAAGTTCTGGGA |
| mTubulinR | 49 | AGGGACATACTTGCCACCTGT |
Transwell实验
1×105MDA-MB-231细胞用200μl0.1%BSADMEM培养基重悬，然后放8μm-pore24-wellplatetranswell(3422，Corning)的上面，该transwell提前用5ug/mlfibronectin(341631，Merck/Calbiochem)包被，下层加入500μl10%FBSDMEM。18小时后，取出小室，用4%多聚甲醛固定25分钟，水洗三遍，然后结晶紫染色25分钟。水洗三次。染好的细胞在显微镜下随机取5个视野，统计细胞数目，然后采用单尾非配对t-检验进行数理统计。
划痕实验
乳腺癌细胞系铺于6cm培养皿，长至100%满度，用白枪尖随机在单细胞层上划线，每皿划三次。然后细胞培养于2%FCSDMEM培养基中，以防止增殖影响。在实验开始与20小时后，拍摄同一划痕点。
荧光素酶活性实验
将50ngSmad3-promotorfireflyluciferase质粒转染5×104乳腺癌细胞，同时共转20ngRenillaluciferasenormalization对照。然后分时段加入TGFβ刺激。细胞裂解液的荧光素酶活性使用Dual-LuciferaseReporterSystem(Promega)检测。
Smad3-promotorfireflyluciferase质粒获自美国NCI)，Differentiation.2011Sep;82(2):57-65.Epub2011May25。
体内转移模型
对每次转移模型试验，使用6-8周雌性裸鼠，尾静脉注射2×1054175TGL细胞(重悬于PBS)。实验组喂水多西环素浓度2ug/ml。7周后，处死小鼠，收集肺部，数可见转移灶数目，然后H&E染色。
活体成像实验，在打入细胞后，每隔1周，眼眶注射D-luciferin(BD)，1.5mg于100ulPBS，用小动物成像仪(nightOWLIILB983)检测荧光强度。
II.实施例
实施例1、Bcl-3敲除抑制MMTV-pyvt乳腺癌自发模型小鼠的肺转移
MMTV-pyvt是一种乳腺癌自发模型小鼠，该模型特点之一就是在出生三个半月之后会产生肺转移，因而是一个研究乳腺癌全程的好模型。本发明人制备了Bcl-3杂合(Bcl-3H)或敲除(Bcl-3KO)MMTV小鼠，发现Bcl-3敲除的MMTV-pyvt小鼠的原发肿瘤发生的时间与最终大小并没有受到影响(图1A)，但是肺部转移灶的数目却大大降低(图1B)，图1C所示为Bcl-3杂合(Bcl-3H)与敲除(Bcl-3KO)MMTV-pyvt雌性小鼠3.5月大的肺脏的H&E染色图。
实施例2、Bcl-3在细胞系中的表达与敲低(Knock-down)策略
本发明人采用蛋白免疫印迹方法检测了Bcl-3在乳腺癌细胞系中的表达情况。结果发现，在正常乳腺上皮细胞MCF-10A(购自ATCC)与肺转移细胞系BT-20，BT-474(购自ATCC)等细胞株中Bcl-3基本不表达，在转移型MDA-MB-231，特异性肺转移的细胞系4175TGL上均高表达，如图2A，Actin作为内参。
来源于MDA-MB-231细胞系的一系列细胞系SCP4、SCP20、SCP2、SCP25、SCP46、1833、SCP6、MDA-MB-231、SCP26、4173、4175(肺转移能力依次增强，购自中科院健康所)，随着肺转移能力的增强，Bcl-3的表达量也随之增高(图2B)，以GAPDH作为内参。
来源于MCF-10A细胞的四个细胞系MCF10A、MCF10AT、MCF-10CA1b、MCF-10CA1a(肺转移能力依次增强，各细胞均购自由中科院健康所)也发现同样的现象(图2C)，以GAPDH作为内参。
对于Bcl-3的体外knock-down，本发明人使用了Openbiosysytem的pTRIPz诱导型慢病毒载体，如图2D所示，这种方法的好处在于对knock-down的可控性，另外用同一种细胞系，以不加诱导剂为对照组，这样实验大大简便。
以多西环素(终浓度1ug/ml)诱导转化了pTRIPzshRNA(V3THS_407972)的MDA-MB-231或4175TGL细胞表达，可观察到Bcl-3有较好的敲低效果，如图2E，以Actin作为内参。除非另外说明，后续所用的Bcl-3敲低的细胞，均是pTRIPzshRNA转染处理后7天(D)的细胞。
实施例3、Bcl-3敲除抑制恶性乳腺癌细胞体外迁移能力
显微观察发现，利用实施例2的方法以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))把Bcl-3敲低、并给予DOX(＋DOX)后，MDA-MB-231细胞形态发生变化，由梭形向圆形过渡，图3A。对照组(-DOX)也转入pTRIPzshRNA(V3THS_407972)质粒，但未被DOX诱导表达。
进一步地，本发明人通过Transwell实验发现，以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))并给予DOX(＋DOX)敲低Bcl-3之后，MDA-MB-231细胞的转移能力大大降低，如图3B，在400×放大下，每视野的细胞数目显著减少50%以上。
在MCF-7，4175TGL细胞系中，以shRNA(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972))并给予DOX(＋DOX)敲低Bcl-3，通过划痕实验证明，迁移能力降低(图3C-D)。
在小鼠乳腺癌细胞系4T1中，结果发现，敲低Bcl-3，细胞形态发生显著变化(图3E)，迁移能力显著降低(图3F)。
实施例4、Bcl-3敲除抑制4175TGL细胞体内肺转移能力
本发明人选用4175TGL(LM2)细胞，在其中稳转fireflyluciferase(获自Sloan-KetteringInstitute))和pTRIPzshRNA(V3THS_407972)，用作体内转移模型。将该稳转fireflyluciferase和pTRIPzshRNA(V3THS_407972)的4175TGL(LM2)细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内，会在7周内特异性形成肺转移灶，而且该细胞内有荧光素酶，可进行实时观测肺部转移情况。
本发明人将2×105个4175TGL(LM2)细胞打入裸鼠体内，之后将小鼠分成两组，每组5只小鼠，一组喂正常水(对照组(-Doxy))，一组喂含有多西环素(终浓度2ug/ml)的水以敲低Bcl-3(＋Doxy)。7周后处死小鼠，观察小鼠肺部形成转移灶数目。结果如图4A，7周后，Bcl-3敲低组(＋Doxy)肺部形成转移灶数目明显降低(图4A左图中，白点即为转移灶)。
图4B显示了两组小鼠的肺部H&E染色代表图，可见Bcl-3敲低组肺部形成转移灶数目明显降低。
图4C以活体成像的方法统计小鼠体内的肿瘤情况，在Bcl-3敲低处理后6周(42天)进行活体成像，统计结果见图4C右图(纵坐标代表荧光强度，单位photons/second)，得到与前面同样的结论。
上述结果表明，Bcl-3表达降低之后，4175TGL的肺转移能力大大降低。
实施例5、Bcl-3调控多种促乳腺癌转移基因
对于Bcl-3调控乳腺癌转移机制，本发明人首先通过免疫印迹检测了EMT相关基因与磷酸化的ERK与AKT在蛋白水平上的变化。
在MCF-7中，转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒后，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低后，Vimentin，Snail，C-myc下调，E-cadherin上调，如图5A，Actin作为内参。
在MDA-MB-231中，转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒后，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低后，EMT相关基因的表达(包括CyclinD1、p27、AKT、Vimentin、N-cadherin)没有明显变化，但磷酸化的ERK与AKT(phosphoErk1、phosphoAKT)明显下调，也可以解释相关表型，如图5A，Actin作为内参。
在4175TGL中，转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒后，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低后，各基因的表达(包括CyclinD1、AKT、Vimentin、N-cadherin、phosphoErk1、phosphoAKT)都没有变化，如图5A，Actin作为内参。
之后，本发明人利用RT-PCR方法，在MDA-MB-231(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低)或4175TGL(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒，利用DOX诱导，将Bcl-3敲低)中分别检测了高表达特异性调控其肺转的基因：CXCL1、ID1、ID3、SPARC、VCAM1、IL13RA2、EREG、MMP1、MMP2、COX2等，发现大部分基因都明显下调，特别是ID1与ID3最为明显，如图5B，GAPDH作为内参。随着Bcl-3的下调，两种细胞中ID1与ID3的mRNA与蛋白水平都随之下调，如图5C-E，Actin作为内参。
本发明人将NF-κB载体(获自NIHUlrichSiebenlist实验室)按照图5F所示不同组合转染Bcl-3KOTSC细胞系，48小时后，提取RNA，Real-TimePCR检测相关基因表达。图中，pmt2t(空质粒)、pCMV6(空质粒)、Bcl3(指pCMV6-Bcl-3，pCMV6质粒的多克隆位点中插入Bcl3编码基因，以CMV为启动子驱动表达)、p50(指pmt2t-p50，pmt2t质粒的多克隆位点中插入p50编码基因，以CMV为启动子驱动表达)、p52(指pmt2t-p52，pmt2t质粒的多克隆位点中插入p52编码基因，以CMV为启动子驱动表达)。上述pmt2t、pCMV6、pCMV6-Bcl-3、pmt2t-p50、pmt2t-p52可获自美国NIHUlrichSiebenlis实验室。
结果发现，Bcl-3单独可以调控ID3的上调；Bcl-3联合p50与p52可以促进ID1的上调，如图5F，小鼠Tubulin作为内参。
实施例6、Bcl-3调控TGFβ信号介导的乳腺癌转移
鉴于ID1、ID3与TGFβ的紧密联系以及TGFβ信号在乳腺癌转移中的重要作用，本发明人想研究Bcl-3是否介导TGFβ信号。
在MDA-MB-231细胞系中，外源施加TGFβ刺激，在Bcl-3敲低(转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒，将Bcl-3敲低)后，con-focal荧光显微镜下观察发现，其仍然促进了F-actin的极化(-DOX的细胞极化也被促进)，如图6A。证明TGFβ的刺激对该细胞(MDA-MB-231)有效。
con-focal荧光显微镜下观察还发现，在TGFβ信号刺激下，缺失Bcl-3的细胞(＋DOX)移动的快，但仍远远不如存在Bcl-3的细胞(-DOX)，如图6B。这也说明，Bcl-3敲低后，乳腺癌细胞对于TGFβ信号的敏感度降低。
RT-PCR检测发现，敲低Bcl-3表达后，TGFβ信号的下游PAI-1、pTHrP、CTGF、IL-11等的诱导受到抑制，表达下调，如图6C，GAPDH作为内参。
Angptl4是TGFβ调控乳腺癌肺转的最重要的分子，在敲低Bcl-3表达后其本底与诱导表达水平均较低，如图6D，GAPDH作为内参。
敲低Bcl-3后，ID3与Snail的诱导被抑制，而ID1不仅没有被诱导，其蛋白水平反而降低，如图6E，GAPDH作为内参。
上述结果说明，Bcl-3调控TGFβ信号介导的乳腺癌转移。
实施例7、Bcl-3特异性调控TGFβ信号下游的Smad3
TGFβ信号的活化是通过磷酸化的Smad2与Smad3来完成的。本发明人发现Bcl-3通过特异性调控Smad3来介导TGFβ信号。MDA-MB-231中，在TGFβ信号刺激下，敲低Bcl-3的细胞(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒；利用DOX诱导，将Bcl-3敲低)内Smad2的磷酸化与总蛋白水平相较对照组无明显变化，但Smad3的磷酸化受到抑制，而其总蛋白水平则发生明显下调，如图7A，GAPDH作为内参。
在4175TGL与MCF-7中，本发明人也发现了同样的现象，GAPDH作为内参。敲低Bcl-3的细胞(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，在TGFβ信号刺激下，细胞内Smad2的磷酸化与总蛋白水平相较对照组无明显变化，但Smad3的磷酸化受到抑制，而其总蛋白水平则发生明显下调，如图7B-C。
将Bcl-3对照与稳定敲低的MDA-MB-231和MCF-7细胞系(DOX诱导)，铺于24孔板，同时共转Smad3promoter荧光素酶载体获自美国RutgersUniversity)与Renilla载体作为荧光对照；48小时后加入TGFβ刺激24小时或48小时后，收蛋白样品，用双荧光素酶报告基因试剂盒(promega)检测firefly与Renilla荧光强度，做比值。结果发现，Bcl-3敲低后，在TGFβ信号下，Smad3promoterluciferase活性诱导明显受到抑制，如图7D-E。
在小鼠乳腺癌细胞系4T1中，本发明人也发现了Smad3的特异性变化，当Bcl-3在4T1中敲低后，外源施加TGFβ信号后，Smad3蛋白水平迅速下调，如图8A，GAPDH作为内参。
综上可见，Bcl-3特异性调控TGFβ信号下游的Smad3。
实施例8、Smad3在炎性条件下对于Bcl-3的调控更为敏感
肿瘤微环境极其复杂，因而在体外实验中，本发明人使用TNFα来模拟炎性肿瘤微环境。MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞体系中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3。发现在Bcl-3敲低的细胞系里，当联合使用TNFα与TGFβ刺激时，Smad3的蛋白水平相较TGFβ单独处理更容易被降解，GAPDH作为内参。如图8B。
MDA-MB-231Bcl-3敲低细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_356488)病毒质粒)，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞体系中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，可见Bcl-3有很好的敲低效果，Smad2在各组变化不大，Smad3在联合使用TNFα与TGFβ时，下调明显。GAPDH作为内参。如图8C。
4175TGLBcl-3敲低细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，可见Bcl-3有很好的敲低效果，Smad2在各组变化不大，Smad3在联合使用TNFα与TGFβ时，下调明显。GAPDH作为内参。如图8D。
MCF-7Bcl-3敲低细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，通过加入DOX诱导Bcl-3降低，而后在含有和不含有DOX的细胞中分别加入TGFβ，TNFα，TGFβ+TNFα刺激24小时后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Bcl-3，Smad2，Smad3，可见Bcl-3有很好的敲低效果，Smad2在各组变化不大，Smad3在联合使用TNFα与TGFβ时，下调明显。GAPDH作为内参。如图8E。
综上可见，Bcl-3对于Smad3的调控在炎性条件下更为敏感。各不同Bcl-3敲低细胞系均发现这一现象。
实施例9、Smad3被RBX1E3连接酶泛素化而后被蛋白酶体降解
MDA-MB-231细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，在含有DOX的培养基中诱导Bcl-3降低后，TGFβ刺激0小时与12小时，同时在培养体系中分别加入对照DMSO与MG132(终浓度5ug/ml)处理12小时，收蛋白，免疫印迹检测Smad3，发现在加入MG132后，Smad3的降解明显被抑制，说明Smad3的降解必须通过蛋白酶体。如图9A，GAPDH作为内参。
MDA-MB-231细胞系(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)，分别在不含DOX与含有DOX的培养基中培养以敲低Bcl-3，而后分别加入蛋白合成抑制剂CHX(获自美国NIHUlrichSiebenlist)，处理0，2，4，6小时，而后收蛋白，蛋白免疫印迹检测Smad3。结果发现，在DOX组中，CHX处理后，Smad3的蛋白水平相较无DOX组下降迅速，说明Bcl-3对于Smad3的蛋白稳定性有重要作用。如图9B，GAPDH作为内参。
Bcl-3调控Smad3的蛋白稳定性应该通过蛋白酶体，即泛素化修饰降解。下面实验即证实Smad3该修饰，在MDA-MB-231(细胞内转染pTRIPzshRNA(V3THS_407972)病毒质粒)含有与不含DOX的细胞中转入Flag-Smad3后，通过检测Flag，本发明人发现这种knock-down系统影响了Flag-Smad3载体的转染效率，因而为继续该实验。
本发明人采用了MDA-MB-231三个细胞系(以转入pTRIpz-shRNA(tGFP)的为对照，以转入pTRIpz-V3THS_407972的为shRNA1，以转入pTRIpz-V3THS_356488的为shRNA2)，均在含有DOX的培养基中培养。在该三细胞系中均转入等量Flag-Smad3+HA-Ub，48小时后，分别加入TGFβ处理6小时与0小时，在收样前4小时加入MG132(终浓度5ug/ml)处理。而后用RIPA蛋白收样，在蛋白溶液里加入1uganti-flag单抗用以IP实验，4℃混摇1小时后，加入20ul蛋白-G琼脂糖珠，混摇过夜。而后RIPA洗珠四次后，加入上样缓冲液煮沸，蛋白免疫印迹实验检测flag与HA。如图9C所示，在Bcl-3敲除的两个细胞系里，在本底情况下，Flag的泛素化修饰均远远高于对照组，TGFβ处理后，这种现象更加明显。其中，Flag-Smad3获自美国NCIYingE.Zhang博士http://ccr.cancer.gov/staff/staff.asp?profileid=5634；HA-Ub获自中科院健康所。
Bcl-3调控Smad3的泛素化修饰必定是通过某种E3连接酶，本发明人在MDA-MB-231(转入pTRIpz-V3THS_407972)细胞系，在含有DOX的培养基中诱导Bcl-3降低后，转入对照siRNAoligo与RBX1siRNAoligosiRNAoligo(序列为：UCCAUAAUGUGGUUCCUGC(SEQIDNO:50)TT)以敲低RBX1，而后分解加入TGFβ处理0小时与20小时，收蛋白，蛋白印迹实验。图9D中所示，在RBX1敲低后，Smad3的蛋白降解被逆转，说明Bcl-3调控Smad3的蛋白稳定性通过RBX1E3连接酶，GAPDH作为内参。
综上，本发明人总结了Bcl-3调控乳腺癌转移的模式，如图10A，Bcl-3调控乳腺癌转移分为三方面：在原发灶，在TGFβ信号下，可以保证ID1，ID3，Snail，ANGPTL4的诱导与蛋白q稳定，促进EMT，进入循环系统。而后当癌细胞到达肺部后，又通过ID1，ID3与ANGPTL4来保证细胞着陆，增殖与血管生成。
静息状态下，Bcl-3在核内通过某种机制抑制RBX1(ROC1)，如图10B。在外源时间TGFβ信号下，由于RBX1被抑制，所以Smad3正常入核并行使转录因子功能。当Bcl-3缺失后，RBX1被释放，在TGFβ信号下，入核的Smad3被ROC1施加泛素尾，而后出核被蛋白酶体所降解。
以上实验均为乳腺癌转移方面实验，此外，发明人又在高转移性结肠癌细胞系LOVO(购自ATCC)上做了相关性实验。运用前述Bcl-3敲低的方法(慢病毒DOX诱导，shRNA1)，将LOVO细胞中的Bcl-3敲低，如图11A所示，有敲低效果。而后按前述Transwell方法检测Bcl-3对细胞migration能力的影响，图11B所示，发现Bcl-3敲低后，其迁移能力大大降低，说明Bcl-3除了在乳腺癌细胞中调控转移外，在结肠癌中也有类似功能。因此提示，Bcl-3调控恶性肿瘤转移有广谱性。
实施例10、检测试剂盒
一种检测肿瘤的试剂盒，该试剂盒中含有：
容器1，以及装于该容器中的SEQIDNO:3所述序列的引物1；
容器2，以及装于该容器中的SEQIDNO:4所述序列的引物2；
以及，其它一些容器，其中分别装有dNTP，DNA聚合酶。
以及，说明检测方法的适用说明书。
实施例11、药物筛选
细胞模型：MDA-MB-231，其中表达Bcl-3蛋白。
测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；
对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。
如果与对照组相比，测试组中的Bcl-3蛋白的表达显著下降50%以上，则说明该候选物质是潜在的抑制肿瘤转移的物质。
采用上述方法，将前述制备的shRNA1(候选物质1)，以及shRNA2(等量混合)的siRNA(候选物质2)病毒表达载体作为候选物质，转染所述细胞模型。结果发现，候选物质1和2是抑制肿瘤转移的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备抑制肿瘤转移的组合物，所述的肿瘤是乳腺癌；所述的Bcl-3的下调剂是shRNA，所述的shRNA结构如下：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：
调控促乳腺癌转移基因的表达；
降低乳腺癌细胞对于TGFβ信号的敏感度；抑制TGFβ信号的下游PAI-1、pTHrP、CTGF、IL-11的诱导；降低Angptl4本身的表达及诱导表达水平；抑制ID3与Snail的诱导；降低ID1蛋白水平及被诱导水平；
调控TGFβ信号下游的Smad3，在TGFβ信号刺激下抑制Smad3磷酸化，降低Smad3总蛋白水平；或在TNFα与TGFβ刺激下，降低Smad3的蛋白水平；或
通过RBX1E3连接酶调控Smad3的蛋白稳定性。
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