CN104995208A - 通过调节melk治疗乳腺癌 - Google Patents

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Abstract

提供了用于抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的方法。所述方法包括以有效地抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量向有此需要的受试者施用MELK抑制剂，其中所述乳腺癌细胞是雌激素受体(ER)阴性的。在一些方面，所述方法包括以有效地抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量向有此需要的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂，其中所述乳腺癌细胞为雌激素受体(ER)阴性的。还提供了乳腺癌的治疗方法和鉴定可能从利用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂的治疗中获益的癌症患者的方法。

Description

通过调节MELK治疗乳腺癌
相关申请
本申请要求2013年1月11日递交的美国临时申请号61/751,703的权益，将其通过引用整体并入本文。
联邦政府资助的研究或开发
本发明是在政府的支持下、在由美国国立卫生研究院授予的联邦政府资助号CA134502、P50CA089393-08S1和CA148164-01以及由美国国防部授予的联邦政府资助号BC051565的资助下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
乳腺癌是在组织学、治疗的应答和患者治疗结果方面有高度多样性的异质性疾病。转录谱分析已经可再现地鉴定了至少五个主要“内在”亚型的乳腺癌：正常乳腺样型、乳腺导管A型、乳腺导管B型、HER2/Neu富集型和基底细胞样型乳腺癌(basal-like breast cancer，BBC)(Perou et al.,2000；Sorlie et al.,2001)。这些分子亚型最近已经在基因组水平、表观遗传学水平、转录组水平和蛋白质组水平的人乳腺肿瘤广泛表征中得到确认(Koboldt et al.,2012)。在这些亚型中，基底细胞样型乳腺癌(BBC)与侵袭性表型和不良预后强烈相关(Foulkes et al.2010；Perou 2011)。不像它们对应的乳腺导管亚型细胞，BBC细胞缺乏雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕酮受体(progesterone receptor，PR)的表达，并因此与临床上定义的“三阴性”乳腺癌(“triple-negative”breast cancer，TNBC)在很大程度上重叠，TNBC特征也在于缺乏ER/PR表达(Foulkes et al.2010；Perou 2011)。缺乏这些分子靶标使得BBC或TNBC细胞对于在乳腺导管型乳腺癌的治疗中高度有效的靶向疗法相对地无反应。建立该亚型的分子发病机制和鉴定潜在治疗靶标对于BBC/TNBC仍然是关键挑战。
激酶代表了经常参与肿瘤病理发生的独特基因群。实际上，已经在跨人多个癌症类型的许多激酶中观察到大量的突变、在拷贝数和/或表达水平中的改变。此外，激酶也是药理学上易于处理的，使得抑制激酶活性(如经由小分子)成为用于癌症治疗的高度有效的策略(Zhang et al.,2009)。因此，仍然有以阐明“可施药的(druggable)”靶标用于针对ER/PR表达阴性乳腺癌的有效的长期治疗策略的方式鉴定对于ER/PR表达阴性细胞至关重要的激酶的需要，仍然有鉴定可能从所述治疗策略获益的患者的新方法的需要，以及仍然有用所述有效的长期治疗策略治疗患者的方法的需要。
发明概述
本发明涉及用于抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的方法。所述方法包括向需要其的受试者以有效抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量施用MELK抑制剂，其中所述乳腺癌细胞是雌激素受体(ER)阴性的。在一些方面，所述方法包括向需要其的受试者以有效抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量施用FoxM1抑制剂，其中所述乳腺癌细胞是雌激素受体(ER)阴性的。在一些方面，所述方法包括给需要其的受试者施用有效抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量的MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂，其中所述乳腺癌细胞是雌激素受体(ER)阴性的。
本发明也涉及用于治疗患有乳腺癌的受试者的方法。所述方法包括确定所述受试者的乳腺癌细胞中雌激素受体的表达状态并给具有雌激素受体(ER)阴性乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂。在一些方面，所述方法包括确定所述受试者的乳腺癌细胞中雌激素受体的表达状态并给具有雌激素受体(ER)阴性乳腺癌细胞的受试者施用FoxM1抑制剂。在一些方面，所述方法包括确定所述受试者的乳腺癌细胞中雌激素受体的表达状态并给具有雌激素受体(ER)阴性乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂。
本发明的另一个方面包括鉴定可能从用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂的治疗中获益的患有癌症的受试者的方法。所述方法包括确定所述受试者的乳腺癌细胞中雌激素受体的表达状态和/或确定相对于非乳腺癌细胞而言所述乳腺癌细胞中的MELK表达水平。所述方法也包括鉴定具有雌激素受体阴性乳腺癌细胞和/或相对于非乳腺癌细胞而言在乳腺癌细胞中具有更高MELK表达水平的受试者。在一些方面，受试者具有雌激素受体阴性乳腺癌细胞和/或更高MELK表达水平表明需要用MELK抑制剂治疗所述受试者。在一些方面，受试者具有雌激素受体阴性乳腺癌细胞和/或更高MELK表达水平表明需要用FoxM1抑制剂治疗所述受试者。在一些方面，受试者具有雌激素受体阴性乳腺癌细胞和/或更高MELK表达水平表明需要用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂治疗所述受试者。
附图简要说明
图1显示了鉴定MELK为潜在癌基因的体内遗传筛选。
(A)体内肿瘤发生模型的开发。在左表中描述了所形成的肿瘤数和注射数。注意，在人乳腺上皮细胞(human mammary epithelialcell，HMEC)中，两个癌基因对于细胞实现体内肿瘤发生是必要的。右图的小鼠显示在用PIK3CA(H1047R)转导的HMEC-DD-NeuT细胞中形成的肿瘤。(B)针对促进肿瘤形成的基因的遗传筛选示意图。将肉豆蔻酸化激酶的逆转录病毒池(总共37个池，每个由10-12个独特开放阅读框组成)转导入HMED-DD-ErbB2细胞。然后，将细胞移植入裸鼠的乳腺脂肪垫。收获从12个池的细胞所产生的肿瘤，接着提取基因组DNA。对来自移植前的细胞和来自肿瘤的基因组DNA进行qPCR。相对富集源自CT值的差异。在所鉴定的二十六个基因中，MELK在发展的肿瘤中高度富集。
图2显示在肿瘤的发展过程中特异性富集的二十六种激酶。(A)列出筛选命中的基因和它们在体内肿瘤中的相对富集倍数。富集倍数的阈值设为10。(B)筛选命中的基因和它们的基因描述的列表。
图3显示MELK是乳腺癌中排名前列的过表达基因并具有显著的预后价值。
(A)MELK在乳腺癌中过表达。在正常乳腺(n＝61)和TCGA乳腺癌群组(cohort)(Koboldt et al.,2012)中的侵袭性导管乳腺癌(n＝392)之间分析MELK表达。每个圆圈代表一个个体样品。每组中的黑线表示四分位数间距的中位数。从双尾Student's t检验获得p值。注意，相对于正常乳腺而言恶性乳腺中MELK过表达的p值在总共所测量的20,423个基因中排名第29位。(B)MELK表达与乳腺癌的组织学级别有关。在不同组织学级别的乳腺肿瘤中比较了MELK的表达。每组中的黑线表示四分位数间距的中位数。用单向方差分析(ANOVA)计算p值。注意，MELK表达和疾病级别之间的相关性的p值在总共所测量的12,624个基因中排第3位(Hatzis群组)和第8位(Desmedt群组)，以及在总共所测量的19,574个基因中排第7位(Bittner群组)。(C)在三个独立乳腺癌患者群组中总存活率的Kaplan-Meier分析。将样品分成两个组，即具有高MELK表达的那些样品(上面的60％)和具有低MELK表达的那些样品(下面的40％)。从对数秩(Log-rank)检验获得p值，使用GraphPad Prism版本计算风险比(hazard ratio，HR)。(D)在三个独立乳腺癌患者群组中无转移存活率的Kaplan-Meier分析。样品如(C)中进行分组。显示了对数秩p值和风险比(HR)。(E)在基底细胞样型乳腺癌中MELK的最高表达。将每个群组中的样品使用PAM50(Parker et al.,2009)分类为五个不同的分子亚型。每组中的黑线表示四分位数间距的中位数。***p<0.0001。*p<0.05。(F)MELK的表达与雌激素受体(ER或ESR1)的表达负相关。每个圆圈代表一个个体人乳腺肿瘤样品(n＝295)。通过GraphPad Prism进行相关性分析。从Oncomine(Rhodes et al.,2004)下载所有基因表达数据，并进行了分析。所引用数据组的原始文章列于下表S1中。
图4显示MELK是乳腺癌中排名前列的过表达基因并具有显著的预后价值。
(A)MELK在乳腺肿瘤中比在正常乳腺组织中以更高的水平表达。(B)MELK的表达与疾病的组织学级别正相关。所示p值排名第7位(在总共所测量的19,574个基因中，Bittner群组)和第3位(在总共所测量的12,624个基因中，Hatzis群组)。(C)MELK的表达预测转移。将所示群组中的样品分成高MELK和低MELK的组，其代表递减顺序的MELK表达中上面的60％和下面的40％。显示了具有对数秩p值和风险比(HR)的Kaplan-Meier曲线。(D)高MELK表达预测乳腺癌患者低的总存活率。将样品如(D)中分组为高MELK和低MELK。从对数秩检验获得p值，使用GraphPad Prism计算风险比(HR)。(E)由基因表达谱定义的乳腺癌亚型中的MELK表达。基于PAM50基因标记(Parker et al.,2009)将样品分成亚型。“ns”表示不显著。“****”p<0.0001。(F)MELK的表达与雌激素受体(ER或ESR1)的表达负相关。(G)三阴性乳腺癌表现出比其它亚型更高的MELK表达。基于雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或人表皮生长因子2(HER2)的表达将患者分类为疾病亚型的各组。从Oncomine(Rhodes et al.,2004)下载所有数据，并进行了重新分析。每个图(A、B、E、F)中的黑线表示四分位数间距的中位数。
图5显示MELK的过表达赋予致瘤潜力。
(A)当野生型MELK过表达时，其是致癌的。用空载体、肉豆蔻酸化MELK或野生型MELK转导HMEC-DD-NeuT细胞。然后，将细胞移植入裸鼠的乳腺脂肪垫。在该表中描述了所形成的肿瘤数和注射数。(B)在Rat1-DD-TP53细胞中MELK的过表达。用GFP(作为阴性对照)、或野生型人MELK、或癌基因等位基因p110α(H1047R)稳定转导所述细胞。由莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒的长末端重复驱动这些基因的异位表达。注意，p110α(H1047R)的表达增强Akt的磷酸化。β-微管蛋白作为上样对照。(C)软琼脂中集落形成测定。将所示细胞以4000个细胞/孔的密度接种于12孔板。3周后收获所述板。上图显示集落的代表性的亮视野图像。下图表示集落形成的定量分析，其被显示为每孔的集落总数。EV代表空载体。***p<0.001。(D)MELK的过表达驱动肿瘤形成。将所示细胞移植至无免疫应答的小鼠，并且三周后收获皮下肿瘤。上图和下图分别表示肿瘤的图像和肿瘤重量的定量。***p<0.001。(E)在Rat1-DD-TP53细胞中野生型MELK和无激酶活性MELK的过表达。用pWzl空载体(EV)或携带加Flag标签的MELK的pWzl(其表达由莫洛尼鼠白血病病毒的长末端重复驱动的人MELK)稳定转导细胞。(F)无激酶活性的MELK的过表达没有赋予锚定非依赖性细胞生长。如(C)中完成集落形成测定。左图和右图分别显示所述集落的代表性的亮视野图像和定量分析。***p<0.001。(G)无催化活性的MELK的过表达不诱导肿瘤生长。如(E)中进行皮下异体移植。左图和右图分别显示肿瘤图片和肿瘤重量的定量。***p<0.001。
图6证实MELK对于基底细胞样型乳腺癌细胞的增殖是必要的。
(A)基底细胞样型乳腺癌细胞系具有比乳腺导管癌细胞更高的MELK表达水平。16个建立的基底细胞样型乳腺癌细胞系和20个乳腺导管癌细胞系中的MELK mRNA数据来自Neve数据集(Neve et al.,2006)。每组的黑线代表平均值±SEM。通过Student's t检验计算p值。(B)MELK在基底细胞样型乳腺癌细胞中的蛋白质丰度比在乳腺导管癌细胞中更高。将来自所示细胞的裂解物进行免疫印迹。α-微管蛋白被用作上样对照。(C)在两个基底细胞样型乳腺癌细胞系(MDA-MB-468、BT-549)中条件性敲低MELK抑制了MELK的表达并抑制细胞增殖。免疫印迹的左图表示未处理的细胞或用多西环素(Doxycycline,Dox,100ng/ml)处理三天的细胞中MELK的表达。中间图和右图分别显示所述平板的结晶紫染色和染色的定量。误差条表示标准差。“*”表示p值<0.001。(D)在两个乳腺导管型乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D)中条件性敲低MELK抑制了MELK表达但是对细胞增殖的影响不大。如(C)中安排所述图。*p<0.001。(E)shMELK抗性MELK的表达拯救了由MELK沉默所诱导的表型。用编码GFP的四环素诱导型基因表达载体、或野生型shMELK抗性MELK、或无激酶活性的shMELK抗性MELK稳定转导具有稳定的tet-on-shMELK的MDA-MB-468细胞。注意，将外源性MELK加Flag标签，引起在蛋白质凝胶上MELK的轻微位移。左图、中间图和右图分别显示免疫印迹、结晶紫染色和细胞增殖的定量分析。
图7证实MELK对于基底细胞样型乳腺癌细胞的增殖是必要的。
(A)三阴性乳腺癌细胞系比ER/PR+乳腺癌细胞具有更高水平的MELK。21个建立的三阴性乳腺癌细胞系和14个ER/PR+癌细胞系中的MELK mRNA数据获得自Neve数据集(Neve et al.,2006)。每组的黑线代表平均值±SEM。通过Student's t检验计算p值。(B)两个另外的BBC细胞系中条件性敲低MELK抑制了细胞增殖。左图的免疫印迹表示在暴露于多西环素(100ng/ml)三天的细胞中MELK的表达。右图代表细胞增殖的定量，其中误差条表示标准差。*p<0.05，**p<0.01。(C)shMELK抗性MELK cDNA(MELK-R)的产生。上图，shMELK2靶向的21-mer序列被标为粗体。箭头示出沉默突变。下图，所示shRNA(无规序列(scramble)或shMELK)与编码GFP、或亲本MELK、或MELK-R的质粒进行共转染。收获细胞裂解物用于免疫印迹。注意，MELK-R而非亲本野生型MELK是抗shMELK的。
图8显示MELK对于基底细胞样型乳腺癌细胞的恶性生长是必要的。
(A)MELK的敲低抑制锚定依赖性细胞生长。将所示细胞接种于0.3％琼脂，并不用或用100mg/ml的多西环素进行处理。左图和中间图分别显示集落的结晶紫染色和集落的明视野图像。右图示出12孔板中每孔的克隆数。误差条代表标准差。*p<0.001。(B、C)条件性敲低MELK减弱肿瘤生长。将具有稳定的tet-on-shMELK的MDA-MB-468(B)或MDA-MB-231细胞(C)原位移植入裸鼠的乳腺脂肪垫。从注射的第二天起给予半数小鼠以补充有多西环素的饮用水。柱状图示出处理后七周所测的肿瘤体积或重量。误差条代表标准误差。(D-G)在建立的肿瘤中敲低MELK减弱了肿瘤生长并促发了基底细胞型肿瘤(MDA-MB-468、MDA-MB-231)的消退但乳腺导管肿瘤(T47D、MCF-7)没有。将所示细胞移植入小鼠乳腺脂肪垫。当肿瘤长到200mm3的平均大小时，将小鼠随机分为两组，其中一组接受多西环素。在处理后所示天数测量肿瘤大小。*表示p<0.001。误差条代表标准误差。
图9显示MELK对于基底细胞样型乳腺癌细胞的恶性生长是必要的。
带有乳腺肿瘤的小鼠未处理或用补充有多西环素的水处理四天，所述肿瘤源自带有稳定的tet-shMELK的所示细胞。肿瘤裂解物被用于免疫印迹，其中α-或β-微管蛋白作为上样对照。
图10显示MELK抑制引起细胞死亡和有丝分裂受损。
(A)免疫印迹测定显示由MELK的抑制所诱导的凋亡标记物。所示细胞未处理或用100ng/ml多西环素处理四天。制备细胞裂解物并使用所示抗体进行免疫印迹。(B)MELK的抑制诱导DNA片段化。如(A)中处理具有所示稳定shRNA的MDA-MB-468细胞，接着固定并用DAPI染色。注意，明亮的和颗粒样染色表示DNA片段化。(C)MELK的抑制引起胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。具有shMELK的MDA-MB-468细胞未处理或用100ng/ml多西环素处理4天，其中最后两天用40μM zVad-fmk或载体(vehicle)处理。制备裂解物用于免疫印迹，其中β-微管蛋白作为上样对照。(D)MELK的抑制选择性地在基底细胞样型乳腺癌细胞中诱导细胞死亡。所示细胞未处理或用多西环素处理四天，之后制备裂解物用于免疫印迹。注意，MELK的沉默诱导了BT549中凋亡标记物(裂解的PARP)的出现而MCF7细胞中没有。(E)MELK的抑制诱导具有4n DNA的细胞的累积。具有shMELK的MDA-MB-468细胞未处理或用多西环素处理五天。制备样品用于细胞周期分析和用于免疫印迹。左图显示代表性的细胞周期分布；中间柱状图表示具有4n DNA含量的％细胞的定量；并且右图显示免疫印迹。注意，MELK的敲低诱导具有4n DNA含量的细胞的累积以及有丝分裂标记物的表达。(F)由MELK抑制诱导的胞质分裂缺陷。所述细胞未处理或用多西环素处理四天，接着固定和DAPI染色。用20x物镜获取图像。每个圆圈代表单个随机选择的视野(对于每组计数的细胞总数>500)。该数据示出具有两个或大于两个细胞核的细胞的百分比。黑线表示中位数±SEM。(G)MELK抑制诱导有丝分裂中的多效性缺陷。从用抗β-微管代表(绿色)和DAPI(DNA)染色的细胞获得荧光图像。(H)时间推移(Time-lapse)显微镜分析。具有稳定的shMELK和组蛋白2B-GFP的MDA-MB-468细胞未处理或用多西环素处理三天，然后进行时间推移成像。以小时:分钟的形式给出时间。上图显示对照有丝分裂细胞；中间图示出经历细胞死亡的具有两个细胞核的细胞；在下面的框中，细胞没有进展到后期，以细胞死亡结束。
图11显示MELK抑制引起细胞死亡和有丝分裂受损。
(A)所示细胞未处理或使用于诱导MELK沉默的多西环素处理的明视野图像。(B)具有tet-shMELK的MDA-MB-468细胞的DAPI染色和明视野图像。所述细胞未处理或用多西环素处理4天，并在最后两天期间进一步用zVad-fmk或载体处理。(C)在BT549细胞中条件性敲低MELK诱导了具有4n DNA含量和G2/M阻滞的细胞的累积。不用或用多西环素处理具有tet shMELK的BT549细胞五天。将细胞进行通过FACS的细胞周期分析和免疫印迹。左图、中间图和右图分别显示免疫印迹、代表性细胞周期分布柱状图和具有4n DNA含量的％细胞的定量。黑线表示中位数±SD。(D)DAPI染色显示具有多个细胞核的细胞。具有tet-shMELK的MDA-MB-468细胞未处理或用多西环素(100ng/ml)处理。箭头表示具有两个或更多个细胞核的细胞。
图12显示FoxM1在基底细胞样型乳腺癌中过表达并调节MELK的表达。
(A)MELK的细胞周期依赖性表达。MDA-MB-231细胞未处理(未同步化，As)或用100ng/ml诺考达唑处理18小时。通过抖落(shake-off)收获有丝分裂细胞(M)，其中贴壁细胞富集于G2期(G2)。洗涤有丝分裂细胞的子集以去除诺考达唑，并在孵育4小时后收获贴壁细胞(M+4h)。左图和右图显示细胞周期的FACS分析和免疫印迹。(B)FoxM1在基底细胞样型乳腺癌中高表达。基于PAM50基因标记(Parker et al.,2009)将所示数据集中的样品分组为亚型。***p<0.0001。*p<0.05。(C)FoxM1和MELK表达紧密相关。将MELK的表达针对FoxM1的表达进行作图。每个圆圈代表一个个体人乳腺肿瘤样品(对于TCGA数据集n＝349；对于Bittner数据集n＝338)，其中红色和绿色分别表示基底细胞样型乳腺癌和其它亚型。通过GraphPad Prism进行相关性分析。(D)敲低FoxM1抑制MELK的表达。用对照siRNA或靶向FoxM1的siRNA转染细胞。转染三天后收获裂解物，并进行免疫印迹。奥罗拉(Aurora)激酶A(AURKA)(FoxM1的已知转录靶标(Lefebvre et al.,2010))被用作阳性对照。(E)FoxM1的抑制下调MELK的表达。用载体(0.1％DMSO)或10μM硫链丝菌素(FoxM1的抑制剂(Hegdeet a.,2011))处理MDA-MB-231细胞所示的时间。制备蛋白质裂解物用于免疫印迹。(F)上图：MELK启动子中推定的FoxM1结合位点。所显示的核苷酸序列为MELK启动子中推定的FoxM1结合位点(上)和FoxM1共有结合位点(下)。核苷酸的数字是相对于MELK的转录起始位点(+1)的。下图：MDA-MB-468细胞中MELK启动子的染色质免疫沉淀测定。使用对照兔IgG和抗FoxM1的抗体。针对CDC25B启动子区的引物被用作阳性对照。
图13显示FoxM1在基底细胞样型乳腺癌中过表达并调节MELK的表达。
(A)MELK的细胞周期依赖性表达。MDA-MB-468细胞未处理(未同步化，As)或用100ng/ml诺考达唑处理18小时。通过抖落收获有丝分裂细胞(M)，其中收获贴壁细胞作为富集于G2期(G2)的细胞。洗涤部分有丝分裂细胞以去除诺考达唑，并在孵育4小时后收获贴壁细胞(M+4h)。制备来自所制备的细胞的裂解物并使用所示抗体进行免疫印迹。(B)在由基因表达谱所定义的乳腺癌亚型中FoxM1的表达。基于PAM50基因标记(Parker et al.,2009)将两个所示群组中的样品分组为亚型。“****”表示p值<0.0001。(C)在三阴性乳腺癌中FoxM1的表达显著高于在其它亚型中的表达。基于雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或人表皮生长因子2(HER2)的蛋白质表达将样品分类为亚型。所示p值来自比较三阴性乳腺癌与ER/PR+乳腺癌中的MELK表达。(D)FoxM1和MELK表达紧密相关。将MELK的表达针对FoxM1的表达进行作图。每个圆圈代表一个个体人乳腺肿瘤样品(对于van deVijver数据集n＝295；对于Hatzis数据集n＝508)。通过GraphPad Prism进行相关性分析。(E)硫链丝菌素抑制FoxM1降低了MELK的转录。用载体或硫链丝菌素处理细胞16h，并提取总RNA，接着合成cDNA。使用针对所示基因的引物进行定量PCR。误差条表示标准差。“*”表示p值<0.01。
图14显示MELK在基底细胞样型乳腺癌亚型中高表达。
图15显示在ER阴性乳腺癌细胞中MELK的高表达水平。(A)在模式细胞系中MELK基因表达。(B)定量PCR显示在ER-细胞系中MELK表达提高。
图16显示BT549(ER-，高MELK)乳腺癌细胞依赖于MELK。
图17显示MDA-MB-468(ER-，高MELK)乳腺癌细胞依赖于MELK。
图18显示MDA-MB-231(ER-，高MELK)乳腺癌细胞依赖于MELK。
图19显示MCF7(ER+，低MELK)乳腺癌细胞不依赖于MELK。
图20显示正常乳腺上皮细胞(HMEC)和永生化MCF10A细胞不依赖于MELK。
图21显示，部分拯救表明激酶活性可能对于MELK依赖性TNBC系的增殖是必要的。
发明详述
本发明涉及以下发现：母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MaternalEmbryonic Leucine Zipper Kinase，MELK)已经被鉴定为致癌激酶，其在ER阴性、在基底细胞样型(ER/PR阴性)和在三阴性乳腺癌细胞中、但不在乳腺导管型乳腺癌细胞中对于持续的致瘤潜力是必不可少的。此外，MELK已经被鉴定为对于细胞的有丝分裂进程是关键的，并且被FoxM1转录因子直接调节。本发明也涉及抑制乳腺癌细胞生长或增殖的方法和治疗患有乳腺癌的受试者的方法。本发明还涉及鉴定患有乳腺癌的受试者的方法，所述受试者可能从用MELK抑制剂或FoxM1抑制剂的治疗中获益。
MELK
母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)是AMP激活的蛋白质激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)丝氨酸/苏氨酸激酶家族的非典型成员。MELK已涉及干细胞再生、细胞周期进程和mRNA前体剪接。(GeneID 9833)
FoxM1
哺乳动物Forkhead盒(Fox)转录因子家族包括超过50种哺乳动物蛋白质，其与翼状螺旋DNA结合结构域有同源性。FoxM1转录因子在细胞周期的G1期被诱导表达，并且其在S期和有丝分裂期间继续表达。FoxM1在所有增殖的哺乳动物细胞和肿瘤来源的细胞系中表达，并且其在退出细胞周期的终末分化细胞中停止表达。FoxM1蛋白的转录活性依赖于Ras-MAPK信号传导(Wang et al.2005)。FoxM1调节许多G2特异性基因的表达并且对于染色体稳定性是必不可少的。FoxM1的缺失引起多效性细胞周期缺陷，包括G2期延迟、染色体错误分离(mis-segregation)和胞质分离的经常失败。由FoxM1转录激活cyclin B对于适时进入有丝分裂是必不可少的(Laoukili et al.2005)。
乳腺癌
乳腺癌是在组织学、治疗的应答和患者结果中有高度多样性的异质性疾病。转录谱分析已经可再现地鉴定了至少五个主要“内在”亚型的乳腺癌：正常乳腺样型、乳腺导管A型、乳腺导管B型、HER2/Neu富集型和基底细胞样型乳腺癌(BBC)(Perou et al.,2000；Sorlie et al.,2001)。不像它们对应的乳腺导管亚型细胞，BBC细胞缺乏雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的表达，因此与临床上定义的“三阴性”乳腺癌(TNBC)在很大程度上重叠，TNBC特征也在于缺乏ER/PR表达(Foulkes et al.2010；Perou 2011)。缺乏这些分子靶标使得BBC或TNBC细胞对于在乳腺导管型乳腺癌的治疗中高度有效的靶向疗法相对地无反应。本发明的一个方面鉴定了具有雌激素受体阴性(ER-)的癌细胞的乳腺癌受试者。本发明的另一个方面鉴定了具有孕酮受体阴性(PR-)的癌细胞的乳腺癌受试者。本发明的又一个方面鉴定了具有HER2阴性(HER2-)的癌细胞的乳腺癌受试者。在一些实施方案中，受试者被鉴定为ER-和PR-。在一些实施方案中，受试者被鉴定为ER-、PR-和HER2-。
可以使用免疫组化或免疫印迹方法来确定所述受试者的ER、PR和HER2状态。也可以使用其它方法。可以使用的示例性的ER抗体为1D5抗体，可以使用的示例性的PR抗体为克隆Pgr636，并且可以使用的示例性的HER2测试为HercepTestTM(DAKO North America,Carpinteria,CA)。
抑制剂
如本文所使用的术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”或“抑制”乳腺癌细胞的“生长或增殖”是指减缓、干扰、阻滞或终止所述乳腺癌细胞的生长，并且不必表示所述乳腺癌细胞生长的彻底消除。术语“抑制(inhibit)”和“抑制(inhibiting)”等表示两个状态之间的定量差异，是指在所述两个状态之间有至少统计学上的显著差异。例如“有效抑制乳腺癌细胞生长的量”是指所述细胞生长的速率会至少在统计学上与未处理的细胞显著不同。例如，这样的术语在本文中可以被应用于细胞增殖速率。
术语“MELK抑制剂”或“FoxM1抑制剂”是指能够分别抑制MELK或FoxM1的表达或活性的任何化合物，即，具体地，抑制基因的转录、RNA的成熟、mRNA的翻译、蛋白质的翻译后修饰、蛋白质的酶促活性、其与底物的相互作用等的任何化合物。
抑制剂的非限制性的例子包括RNAi、核酶、反义分子、适体、抗体或任何类型的激动剂。在一些实施方案中，RNA干扰可以被用于抑制MELK或FoxM1或MELK和FoxM1二者的表达或活性。能够介导RNA干扰的分子包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)。如本文所使用的，能够介导RNAi的分子不必局限于只含有RNA的那些分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸、被称为“siNA”分子即“短干扰核酸”。但是，这样的不需要在siNA分子内存在核糖核苷酸以支持RNAi的siNA可以具有连接的接头或其它连接的或结合的基团、部分(moiety)或含有一个或多个具有2′-OH基团的核苷酸的链。任选地，siNA分子可以在大约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置包括核糖核苷酸。
术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指由上述能够介导RNAi的分子所引发的序列特异性翻译后基因沉默过程(Fire etal.,1998,Nature,391,806-11)。细胞中长的双链RNA(double strandedRNA，dsRNA)刺激被称为dicer的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer参与所述长dsRNA加工成为短片段的siRNA(Bernstein et al.,2001,Nature,409,363-6)。源自dicer活性的siRNA通常长大约21-23个核苷酸并包括大约19个碱基对的双链体。
RNAi反应特征也在于含有siRNA的核酸内切酶复合体，通常被称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生于与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir et al.,2001,Nature,411,494-498)。已经在各种系统中研究了siRNA介导的RNAi。最近在果蝇胚胎裂解物中的工作已经显示对于介导有效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求(Elbashir et al.,2001,EMBO J.,20,6877-88)。在RNAi过程中，靶mRNA被诱导降解，接着发生基因表达的序列特异性抑制。术语“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”是指形成双链RNA的核酸，当该siRNA在与基因或靶基因相同的细胞中表达时，该双链RNA能够降低或抑制所述基因或靶基因的表达。“siRNA”因此指由互补链形成的双链RNA。典型地，杂交形成双链分子的siRNA的互补部分具有基本上或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA是指与靶基因具有基本上或完全的同一性并且形成双链siRNA的核酸。该siRNA的序列可以对应于全长靶基因或其亚序列。siRNA被“靶向”基因是因为该siRNA的双链体部分的核苷酸序列与该被靶向基因的核苷酸序列基本上互补。siRNA序列双链体需要具有足够的长度以通过互补碱基配对相互作用使该siRNA和靶RNA在一起。本发明的siRNA可以具有不同的长度。siRNA的长度优选大于或等于十个核苷酸并具有足够的长度以与靶RNA稳定地相互作用；具体为10-30个核苷酸；更具体为10和30个核苷酸之间的任意整数，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。“足够的长度”是指大于或等于10个核苷酸的核苷酸，其长度达到足以在所期望的条件下提供预期的功能。术语“稳定地相互作用”是指小干扰RNA与靶核酸的相互作用(例如通过在生理条件下与靶标中的互补核苷酸形成氢键)。
可以由核酸序列编码siRNA，并且所述核酸序列也可以包括启动子。所述核酸序列也可以包括多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是合成的最小多聚腺苷酸化信号。可以使用合成的寡核苷酸体外构建siRNA的RNA双链体。
在一些实施方案中，抑制剂可以是短发夹RNA(shRNA)序列。术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指具有形成紧密发夹转角(tighthairpin turn)的RNA序列的RNA分子，其可以被用于经由RNA干扰沉默基因的表达。shRNA发夹结构被细胞机制裂解为siRNA，其然后与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。该复合体结合并裂解mRNA，所述mRNA匹配与其结合的siRNA。siRNA的序列可以对应于全长靶基因或其子序列。如上所述，siRNA被“靶向”基因是因为该siRNA的双链体部分的核苷酸序列与被靶向基因的核苷酸序列基本上互补。可以使用重组DNA技术将shRNA克隆入载体。
siRNA可使用合成寡核苷酸或适当的转录酶来体外构建或使用适当的转录酶或表达载体来体内构建。所述siRNA包含通过标准沃尔森-克里克碱基配对相互作用退火在一起形成碱基对的有义RNA链和互补反义RNA链。本发明的siRNA的有义链和反义链可以是形成双链(ds)siRNA的互补单链RNA分子或可包含连接互补碱基对以形成siRNA的发夹结构的编码两个互补部分的DNA多核苷酸。优选地，由ds RNA或由DNA多肽形成的siRNA的双链体区域包含约15-30个碱基对，更优选约19-25个碱基对。所述siRNA双链体区域的长度可以是15与30个核苷酸之间的任意正整数。
来源于ds RNA的本发明的siRNA可包括部分纯化的RNA、大体上纯的RNA、合成RNA或重组产生的RNA以及与天然存在的RNA相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变的改变的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸材料诸如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸处，包括使siRNA抗核酸酶消化的修饰。
本发明的siRNA的一条链或两条链可包括3’突出。如本文中所用，“3’突出”是指从RNA链的3’末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此在一个实施方案中，siRNA可包括长度为1至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选地长度为1至4个核苷酸，特别优选地长度为约2至约4个核苷酸的至少一个3’突出。
siRNA分子的两条链都可包括3’突出，对于每一条链，突出的长度可以相同或不同。优选地，3’突出可存在于siRNA的两条链上，并且长度为2个核苷酸。还可稳定3’突出以抗降解。例如，突出可通过包括嘌呤核苷酸诸如腺苷或鸟苷核苷酸，通过用经修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2’-脱氧胸苷取代3’突出中的尿嘧啶核苷酸来进行稳定化，突出可被耐受并且不影响RNAi降解的效率。具体地，2’-脱氧胸苷中2’羟基的不存在显著增强了3’突出在组织培养基中的核酸酶抗性。
如上所述，siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的部分。发夹结构还可含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。所述环的长度可变化。在一些实施方案中，所述环的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可含有3’或5’突出部分。在一些实施方案中，突出为长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3’或5’突出。
本发明的siRNA可使用本领域普通技术人员已知的许多技术来获得。例如，siRNA可使用适当地保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪来合成。siRNA可被合成为两个分开的互补RNA分子，或合成为具有两个互补区的单个RNA分子。合成RNA分子或合成试剂的商业提供商包括Dharmacon Research(Lafayette,Colo.,USA)、Pierce Chemical(Rockford,Ill.,USA)、Glen Research(Sterling,Va.,USA)、ChemGenes(Ashland,Mass.,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。
递送系统
在一些实施方案中，MELK抑制剂和/或FoxM1抑制剂可使用核酸递送系统诸如载体来递送至细胞。术语“载体”是指任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，所述元件当与适当的控制元件诸如辅助病毒结合时能够复制，并且可将基因序列在细胞之间转移。因此，所述术语包括克隆载体和表达载体，以及复制缺陷型病毒载体。存在许多类型的载体，并且在本领域中是公知的。
当用于指例如细胞、或核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在细胞的天然(非重组)形式中发现的基因，或表达在另外的情况下异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
当用于指核酸的部分时，术语“异源的”表示核酸包含在自然界未以相同的相互关系被发现的两个或更多个子序列。例如，核酸通常通过重组产生，使来自无关基因的两个或更多个序列排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示所述蛋白质包含在自然界中未以相同的相互关系被发现的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
术语“有效地连接的”意指选定的核酸序列(例如编码siRNA构建体)靠近启动子以允许该启动子调控所述选定的核酸序列的表达。一般地，就转录和翻译的方向而言，启动子位于所选定的核酸序列的上游。
术语分子的“变体”是与天然分子的序列大体上相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码所述天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体诸如这些变体可通过使用分子生物学技术，如例如利用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，诸如例如通过使用定点诱变产生的编码所述天然蛋白质的那些序列，以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些序列。一般地，本发明的核苷酸序列变体与天然(内源)核苷酸序列具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％,98％至99％的序列同一性。
术语特定核酸序列的“保守修饰变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任意给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全都编码氨基酸精氨酸。因此，在其中精氨酸由密码子指定的每一个位置上，所述密码子可被改变成所描述的对应密码子的任一个而不改变编码的蛋白质。此类核酸变异是“沉默变异”，其为“保守修饰变异”的一个种类。除其中另外指出外，本文中描述的编码多肽的每一个核酸序列也描述每一个可能的沉默变异。本领域普通技术人员将承认核酸中的每一个密码子(除ATG外，其在一般情况下是甲硫氨酸的唯一密码子)可通过标准技术被修饰来产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一个“沉默变异”隐含在每一个描述的序列中。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“大体上相同的”或“大体同一性”是指这样的两个或更多个序列或子序列，所述序列或子序列是相同的或当在比较窗口或指定的区域上比较和就最大对应性对齐时，具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，即在指定的区域上至少约60％，优选65％、70％、75％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)(如使用下列序列比较算法之一或通过手工比对和目测观察测量的)。当上下文指明时，该定义也类似地指序列的互补序列，诸如与DNA核苷酸互补的RNA核苷酸。优选地，在长度为至少约6-7个氨基酸或25个核苷酸的区域上存在大体同一性。
适合用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其在Altschul等人，1977,Nuc.Acids Res.25:3389-3402中进行了描述。使用BLAST(利用本文中描述的参数)来测定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短的字串来鉴定高分序列对(HSP)，所述高分序列对当与数据库序列中相同长度的字串对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T称为邻近字串(neighborhood word)的分数阈值(Altschul等，如上)。这些初始的邻近字串被用作种子来启动搜索以发现包含有它们的更长的HSP。所述字串命中(hit)沿着每一个序列向两个方向延伸，只要累积比对分数可增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配的残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用记分矩阵来计算累计分数。当出现下面情况时，字串命中在各个方向上的延伸便停止：累积比对分数从其达到的最大值下降了数量X；由于一个或者多个记分为负的残基比对的累积，累积分数达到0或者0以下；或者延伸到了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速率。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认的是字串长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认字串长度为3，期望值(E)为10，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability，P(N))，其表示两个核苷酸或者氨基酸序列间的匹配将偶然发生的概率。例如，在测试核酸与参考核酸的比较中，如果最小合计概率小于大约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于大约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
重组DNA可通过用编码siRNA的DNA组成的表达载体转染(通过用于引入特定细胞的任何方法，例如物理或生物学方法)而容易地导入宿主细胞例如哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞，以产生具有稳定地整合进其基因组或以附加体元件存在的重组DNA的细胞，以便本发明的DNA分子或序列由宿主细胞表达。优选地，通过载体将DNA引入宿主细胞。宿主细胞优选具有真核生物来源，例如植物、哺乳动物、昆虫或真菌来源，但也可使用非真核生物来源的宿主细胞。
将预先选择的DNA或RNA双链体引入宿主细胞的物理方法包括但不限于磷酸钙沉淀、脂转染、DEAE-葡聚糖、微粒轰击、显微注射、电穿孔、免疫脂质体、脂质、阳离子脂质、磷脂或脂质体等。本领域普通技术人员将理解可将任何方法用于将DNA或RNA双链体递送进细胞。
siRNA载体
还可从重组质粒将本发明的siRNA表达为两个单独的互补RNA分子或表达为具有两个互补区的单个RNA分子。
适合用于表达本发明的siRNA的载体、用于将用于表达siRNA的核酸序列插入质粒的方法以及将重组质粒递送至目标细胞的方法的选择在本领域普通技术人员的能力之内。用于构建重组DNA载体和产生DNA的方法可见于例如Sambrook等人中。
本发明的siRNA可以是被克隆进质粒载体中并使用任何合适的启动子表达的多核苷酸序列。用于从质粒表达本发明的siRNA的合适的启动子包括，但不限于H1和U6RNA pol III启动子序列和病毒启动子，包括病毒LTR、腺病毒、SV40和CMV启动子。还可使用对于本领域普通技术人员来说是已知的另外的启动子，包括用于在特定组织或特定细胞内环境中表达siRNA的组织特异性启动子、诱导型启动子或可调控启动子。载体还可包括另外的调控或结构元件，包括但不限于内含子、增强子和多聚腺苷酸化序列。可按需将这些元件包含在DNA中以获得siRNA在细胞中的最佳性能，并且这些元件可以是或可以不是DNA的功能所必需的。任选地，可将可选择标记基因或报告基因与编码siRNA的多核苷酸包含在一起或作为单独的质粒用于递送至靶细胞。还可包含本领域普通技术人员已知的另外的元件。
还可从被克隆进病毒载体的可包含上述元件的多核苷酸序列表达siRNA。用于将基因递送至细胞的合适的病毒载体包括，但不限于能够指导所有病毒体蛋白质的合成，但是不能产生感染性颗粒的复制缺陷型病毒。示例性病毒包括但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。
在一些实施方案中，除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域普通技术人员的能力范围内的分子生物学、免疫学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL，(当前版本)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑，(当前版本))；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:APRACTICAL APPROACH(当前版本)ANTIBODIES,ALABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编辑(当前版本))。DNA Cloning:A Practical Approach，第I和II卷(D.Glover，编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，编辑，当前版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，编辑，当前版本)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins，编辑，当前版本)；Fundamental Virology，第2版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe，编辑)。
诊断/预后标志物
在一些方面，本发明涉及检测一种或多种诊断或预后标志物在样品(来自癌症患者的生物学样品)中的存在的方法。多种本领域普通技术人员已知的筛选方法可用于检测标志物在样品中的存在，包括DNA、RNA和蛋白质检测。下文中描述的技术可用于确定MELK和/或FoxM1在从患者获得的样品中相对于在从非癌症受试者获得的样品中的存在或不存在或量。在一些实施方案中，可测试患者的ER、PR和/或HER2受体状态。在具有ER-、ER-/PR-或ER-/PR-/HER2-状态的患者中MELK和/或FoxM1的鉴定或MELK和/或FoxM1的表达水平可帮助医生确定患者的治疗方案。
在一些实施方案中，标志物可以是相对于对照而言MELK和/或FoxM1的基因拷贝数增加、蛋白质表达增加、mRNA表达的变化等。
以非限制性实例为例，在具有ER-、ER-/PR-或ER-/PR-/HER2-状态的患者中，可表明需要用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂治疗患者。在一些实施方案中，具有MELK、Fox M1或MELK和FoxM1的增加表达的患者可表明需要用MELK抑制剂，FoxM1抑制剂或两者MELK抑制剂和FoxM1抑制剂治疗患者。
治疗方法
在各种实施方案中，本发明提供了用于治疗患有癌症的患者的方法。该方法一般包括抑制剂的施用。一种抑制剂可以是MELK抑制剂。一种抑制剂可以是FoxM1抑制剂。该方法可包括MELK抑制剂和FoxM1抑制剂的施用。
本发明的上下文中，“治疗”，“医治”或“医疗”意指与病症或疾病相关的症状的缓解，或那些病症的进一步进展或恶化的停止，或疾病或病症的防止或预防。例如，在本发明的上下文中，成功的治疗可包括与乳腺癌相关的症状的缓解或疾病诸如乳腺癌的进展的停止。
在一些实施方案中，抑制剂是天然或合成的化合物，特别是植物、细菌、病毒、动物、真核生物、合成或半合成来源的有机的或无机的分子，其能够抑制MELK或FoxM1。抑制FoxM1的化合物的非限制性实例包括硫链丝菌素(thiostrepton)。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的盐”包括从具有碱性氮原子的化合物形成的那些盐，例如优选与有机或无机酸形成的酸加成盐，尤其是药学上可接受的盐。合适的无机酸是例如卤素酸诸如盐酸、硫酸、或磷酸。合适的有机酸是例如羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、丙二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸诸如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷羧酸、金刚烷羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、酞酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘-二磺酸、2-或3-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸或其它有机质子酸，如抗坏血酸。
这些化合物可以单独使用或在组合物中与药学上可接受的载体或赋形剂一起使用。本发明的药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的治疗有效量的化合物。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒的惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂诸如可可脂和栓剂蜡；油诸如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇类如丙二醇；酯诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及根据配制者的判断，其他非毒性的相容性润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于该组合物中。其它合适的药学上可接受的赋形剂描述于"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Pub.Co.,New Jersey,1991(其通过引用并入本文)中。
可通过口服、肠胃外，舌下，通过雾化或吸入喷雾、直肠、脑池内、阴道内、腹膜内、经颊或局部地以含有常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物(根据需要)的剂量单位制剂，向人和其它动物施用所述化合物。局部施用还可以包括使用透皮施用，诸如透皮贴剂或离子电泳装置。如本文中所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、胸骨内注射或输注技术。
配制药剂的方法是本领域熟知的，并公开于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Company,Easton,Pa.，第19版(1995)中。用于本发明的药物组合物可以以无菌、无热原的液体溶液或悬浮液，包衣胶囊，栓剂，冻干粉末，透皮贴剂形式或本领域中已知的其他形式存在。
注射制剂，例如无菌注射水性或油性悬浮液可以根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，诸如1,3-丙二醇或1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液、U.S.P和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，任何温和的不挥发性油都可以使用，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸诸如油酸也可用于注射剂的制备。可注射制剂可以这样进行灭菌，例如通过经过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入以无菌固体组合物的形式存在的灭菌剂，可在使用之前将所述灭菌剂溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长药效，通常期望减慢来自皮下或肌肉注射的药物的吸收。这可通过使用具有弱水溶性的晶体或无定形物质的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率继而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，胃肠外施用的药物形式的延迟吸收可通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现。可注射的储库形式通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。取决于药物对聚合物的比率和所用的具体聚合物的性质，药物释放的速率可以得到控制。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射制剂也可通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。
用于直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可通过将本发明化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡混合来制备，所述赋形剂或载体在环境温度下是固体但在身体温度下是液体，从而在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或如下试剂混合：a)填充剂或增充剂(extender)如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸(盐)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液迟延剂，例如石蜡，f)吸收促进剂如季铵化合物，g)湿润剂，诸如例如乙酰基醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土，和i)润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可在使用此类赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等在软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。
片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可使用包衣和外壳诸如肠衣壳和药物配制领域中熟知的其它衣壳方法来制备。它们可任选含有遮光剂，并且也可以是它们仅在或优先在肠道的某一部分(任选地以延迟的方式)释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
活性化合物也可与一种或多种如上指出的赋形剂一起存在于微囊形式中。片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可用包衣和壳例如肠包衣，控释包衣和药物配制领域中公知的其它包衣来制备。在这类固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂如蔗糖，乳糖或淀粉混合。如在正常实践中一样，此类剂型还可包含除惰性稀释剂例如压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素外的其它物质。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是它们仅在或优选在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可含有本领域中常用的惰性稀释剂诸如例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、EtOAc、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地、棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
用于本发明的化合物的局部或透皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的载体和如可能需要的任何防腐剂或缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂等也被涵盖在本发明的范围之内。
除了本发明的活性化合物以外，软膏、糊剂、霜剂和凝胶剂还可含有赋形剂诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
本发明的组合物也可以被配制为液体气雾剂或吸入干粉来进行递送。液体气雾剂制剂可主要地被雾化成可以被递送至末端及呼吸性细支气管的颗粒尺寸。
本发明的雾化制剂可使用烟雾形成装置诸如喷嘴、振动多孔板或超声喷雾器(优选地被选择来允许形成具有主要为1至5μm的质量中位平均直径的气雾剂颗粒)来递送。此外，制剂优选具有平衡的克分子渗透压浓度离子强度和氯化物浓度，以及能够将有效剂量的本发明化合物递送至感染部位的最小的可雾化体积。此外，雾化制剂优选不负面削弱气道的功能性，并且不会引起不希望的副作用。
适合用于本发明的气雾剂施用的雾化装置包括，例如，喷嘴、振动多孔板、超声喷雾器和通电干粉吸入器，所述装置能够将本发明的制剂雾化成主要在1至5μm尺寸范围内的气溶胶颗粒。主要地在本申请中意指至少70％，但优选90％以上的所有生成的气溶胶颗粒在1至5μm的范围内。喷射喷雾器通过空气压力将液体溶液破碎成气溶胶液滴来工作。振动多孔板喷雾器通过使用由快速振动多孔板产生的声波真空将溶剂液滴挤出通过多孔板来工作。超声雾化器通过将液体剪切成小的气溶胶液滴的压电晶体来工作。有各种合适的装置可供选择，包括，例如AERONEB和AERODOSE振动多孔板喷雾器(AeroGen,Inc.,Sunnyvale,California)、SIDESTREAM喷雾器(Medic-Aid Ltd.,West Sussex,England)、PARI LC和PARI LC STAR喷射喷雾器(PariRespiratory Equipment,Inc.,Richmond,Virginia)，以及AEROSONIC(DeVilbiss Medizinische Produkte(Deutschland)GmbH,Heiden,Germany)和ULTRAAIRE(Omron Healthcare,Inc.,Vernon Hills,Illinois)超声喷雾器。
本发明的化合物还可被配制用作局部粉末和喷雾剂，其中除了本发明的化合物以外还可含有赋形剂诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规喷射剂诸如氯氟烃。
透皮贴剂具有向身体提供化合物的受控递送的额外优点。此类剂型可通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂还可用于增加化合物通过皮肤的通量。所述速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。本发明的化合物还可以以脂质体的形式施用。如本领域中已知的，脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质物质。脂质体是由分散在含水介质中的单或多层状水合液晶形成的。可使用能够形成脂质体的任何无毒的生理上可接受并且可代谢的脂质。以脂质体形式存在的本发明的组合物，除了本发明的化合物以外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，包括天然的和合成的。形成脂质体的方法在本领域中是已知的。参见，例如Prescott(编辑),"Methods in CellBiology"，第XIV卷，Academic Press,New York,1976,第33页起。
化合物可单独施用或与另一种抑制剂一起施用，可能的联合治疗采取固定组合的形式或将化合物与另一个抑制剂交替施用或彼此独立提供。如上文中所描述的，长期治疗以及在其它治疗方案中用作辅助治疗是同样可能的。其它可能的治疗是在肿瘤消退或甚至化学预防治疗(例如处于风险中的患者中)后维持患者的状态的治疗。
有效量的本发明化合物通常包括足以可检测地抑制乳腺癌细胞的生长或增殖，或通过检测乳腺癌症状的抑制或缓解的任何量。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和具体的施用模式而变化。然而，应当理解，用于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合和正在进行治疗的具体疾病的严重程度。用于给定情形的治疗有效量可通过常规实验来容易地确定，并在普通临床医师的技能和判断范围内。
根据本发明的治疗方法，通过向患者施用一定量(施用量和时间是获得期望的结果所必需的)的抑制剂来减少或预防患者诸如人或低等哺乳动物的乳腺癌细胞的生长。抑制剂化合物的“有效抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量”是指抑制剂适用于任何医学治疗的合理收益/风险比治疗乳腺癌细胞生长的充足量。
然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的总每日用法可由主治医生在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所使用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中公知的类似因素。
待在温血动物例如人中单独地或在联合治疗中施用的MELK抑制剂或FoxM1抑制剂的剂量优选为约0.01mg/kg/天至约1000mg/kg/天，更优选约1mg/kg/天至约100mg/kg/天，优选分成1至3个单次剂量，其可以例如具有相同大小。通常地，儿童接受成人剂量的一半，从而儿童的抑制剂优选剂量范围为每天0.5mg/kg至约500mg/kg，优选分成1至3个单次剂量，其可具有相同大小。
除非另有说明，否则上文中和下文中使用的一般术语优选在本公开内容的上下文中具有下列含义。
下列实施例用于举例说明本发明而不将本发明限定于其范围中。
实施例1:促成体内HMEC的肿瘤发生的致癌激酶的鉴定
利用定义的遗传元件转化原代人细胞是用于鉴定参与致癌转化的特定基因或途径的强大方法(Hahn等人，1999；Zhao等人，2004)。为此目的，开发了类似于人类乳腺癌的发病机制的体内肿瘤发生模型。适用于致癌激酶的研究的基于人类乳腺上皮细胞(HMEC)的转化系统先前已被建立(Zhao等人，2003)。为了进一步优化这个系统，对HMEC进行工程化以表达p53(p53DD)的显性负形式NeuT和PI3KCAH1047R。所得的细胞(称为HMECs-DD-NeuT-PI3KCA)是完全转化的，如通过它们在小鼠中形成常位肿瘤的能力判断的(图1A)。该模型类似于在乳腺癌中是很普遍的ErbB2和PI3KCA的同时激活(Stephens等人，2012)。
随后，利用基于逆转录病毒的激酶文库(Boehm等人，2007)，并筛选可取代致癌的PIK3CA并且与NeuT协同驱动小鼠中肿瘤发生的激酶。用编码354种肉豆蔻酰化人激酶和激酶相关蛋白的全激酶组(kinome-wide)逆转录病毒文库的亚库(Boehm 2007)转染HMEC-DD-NeuT细胞。将10-12个独特激酶ORF的37个亚库引入HMECs-DD-NeuT细胞。随后将感染的细胞注射入裸鼠的腹股沟乳腺脂肪垫，并且对受体小鼠追踪肿瘤形成。37个库中有12个库的激酶诱发肿瘤形成，潜伏期为2-4个月。从收获的肿瘤样本和注射前的感染细胞提取基因组DNA。将定量PCR用于测定肿瘤中每一种激酶在候选库中的相对丰度。总共发现26种激酶在肿瘤发展过程中被特异性富集(图2A，2B)。作为命中出现的几种激酶先前已被暗示为原癌基因或癌相关基因，诸如核因子κ-B激酶亚基ε的抑制剂(IKBKE)(Boehm2007)、在转染过程中重排基因(RET)(Takahashi,1985)酪蛋白激酶1ε(CSNK1E)(Kim 2010)，NIMA相关丝氨酸/苏氨酸激酶6(NEK6)(Nassirpour等人，2010)和polo样激酶1(Plk1)(Liu等人，2006)。
实施例2:MELK在乳腺癌中高度过表达并且强有力地预测不良结果
来自实施例1中描述的遗传筛选的得分最高的命中之一为母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)(图2A)，其是AMPK丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一个非典型成员(Lizcano等人，2004)。虽然关于MELK的准确生物学功能知之甚少，但该激酶通常在多种肿瘤中过表达(Gray等人，2005年)。值得注意的是，当我们分析癌症基因组图谱(TCGA)的乳腺癌数据集组(由392个乳腺浸润性导管癌和61个正常乳房的样品组成的大型组群)(Koboldt等人，2012)中的MELK表达时，MELK转录物的水平在乳腺癌中相较于它们的正常对应物高约8倍(图2)。该差异表达(4.6×10-54)的p值使MELK处于乳腺癌中前1％过表达的基因中(图2A)。MELK在乳腺癌中相对于在正常乳腺中的过表达通过分析两个其它独立的数据集组来进一步确认(图4A；Richardson等人，2006；Ma等人，2009)。
为了深入了解MELK过表达与乳腺癌的潜在相关性，分析MELK表达与疾病状态的相关性。通过分析跨5个独立的大型组群(总共超过1500个患者)的基因表达数据(Desmedt等人，2007；Hatzis等人，2011；Schmidt等人，2008；Wang等人，2005；Table S1)，发现MELK的更高表达与乳腺癌的更高组织学分级强相关联(图2B，4B)；该相关性的p值全都位居总共12,624或更多个测量的基因中的前1％。(也参见图14，15)。
还检查MELK表达以确定MELK表达是否与转移性复发相关。分析3个，独立组群(van't Veer,Wang和Schmidt组群，表S1)，其中就无转移存活随访具有早期乳腺癌的患者，并且所述患者术后未接受辅助全身治疗。在所有3个组群中，高MELK表达与最初经诊断患有淋巴结阴性肿瘤的妇女中的早期转移强相关(所有p值<0.001，危害比>2；图3C，4C)。进一步分析两个组群，其中大部分患者具有高分级和淋巴结阳性乳腺癌，并且几乎所有患者接受新辅助化疗和/或激素治疗(Hatzis,Loi cohorts；下面的表S1)。再次地，MELK的高表达强有力地预测转移复发(两者的p值<0.001，危害比>2；图2C)。因此，无论是化学治疗还是激素治疗，MELK过表达都是乳腺癌转移的强有力预测标志物。分析也表明具有高MELK表达的乳腺癌与高度恶性相关联并且对常规乳腺癌治疗的反应较弱。
分析MELK表达在乳腺癌患者存活中的预测价值。在5个其中就总存活数随访总共1100多个患者的独立大组群(Desmedt等人，2007；Esserman等人，2012；Kao等人，2011；Pawitan等人，2005；van deVijver等人，2002；表S1)中，MELK的高表达与增加的死亡率强相关(所有p值<0.05，危害比>2)(图2D，4D)。综上所述，这些数据表明MELK为强有力的预后指示剂，其鉴定具有更高疾病组织学分级、增加的转移可能性和更低的总体存活率的乳腺癌患者。
表S1
实施例3:MELK在不同亚型的乳腺癌中的过表达
鉴于乳腺癌的异质性，分析如通过基因表达谱确定的不同亚型的乳腺癌中的MELK表达(Perou等人，2000；Sorlie等人，2001)。通过PAM50基因特征表征多个乳腺癌数据集中的样品(Parker等人，2009)。在总共1200多例患者的4个独立的组群中，在这些不同的亚型中观察到惊人相似的MELK表达模式(图3E，4E)。Luminal A和正常样亚型显示最低的MELK表达。具有较低的导管型特异性基因表达的Luminal B肿瘤(Solie等人，2001)和HER2富集肿瘤具有比luminal A或正常样肿瘤更高的MELK表达(P<0.0001)。最后，基底样乳腺癌(BBC)显示在所有亚型中最高的MELK表达(p<0.0001)。这些观察表明了MELK表达与导管型标志物的表达负相关的模式。事实上，发现了MELK的表达和雌激素受体(ER或ESR1)之间的显著反相关(图3F，4F，图14A)。
乳腺癌的替代分类使用ER/PR和HER2的表达。三阴性乳腺癌(TNBC)(缺乏ER/PR和HER2的表达的亚型)很大程度上与基底样乳腺癌重叠(Foulkes等人，2010；Rakha等人，2008)。由于亚型分类如三阴乳腺癌已在门诊中常规地用于诊断和治疗策略的选择，因此检查MELK表达与该替代亚型分类的相关性。在两个独立的组群(表S1)中，样品被分组至基于ER/PR和HER2的表达的亚型中。事实上，MELK的表达水平在TNBC中是最高的，在HER2+乳腺癌中是中等的，在ER/PR+乳腺癌中是最低的(图4G)。综上所述，这些数据表明，MELK在TNBC或BBC中差异过表达。
实施例4：MELK过表达显示强劲的致癌活性
MELK的显著预后价值与其在乳腺癌(尤其是基底样乳腺癌)中的显著过表达一起表明，MELK可能在肿瘤发生中起着至关重要的作用。由于在人癌症中只鉴定了MELK的少数突变，因此假设野生型MELK的过表达对于肿瘤发生是足够的。首先，确认MELK的过表达可促进HMEC-DD-NeuT细胞的肿瘤形成，测试用于初始肿瘤发生筛选的模型系统。对HMEC-DD-NeuT细胞进行再工程化以表达野生型(wt-)或肉豆蔻酰化(myr-)MELK(注：将初始筛选中的激酶肉豆蔻酰化(Boehm等人，2007))。表达空载体的HMEC-DD-NeuT细胞在小鼠中不能形成肿瘤，而WT-或myr-MELK在这些细胞中的过表达在2个月内使肿瘤形成具有100％的外显率(图5A)。
为了确定MELK是否具有不依赖于ErbB2的“独立”转化能力，使用其中单个癌基因足以实现表达p53DD的Rat1细胞(Rat1-DD)的恶性转化的啮齿动物成纤维细胞(Rat1)转化系统(Zhao等人，2004)。最近表明，在NeuT不存在的情况下，致癌性PI3KCA H1047R的表达足以在Rat1-DD中诱导肿瘤形成(Ni等人，2012)。我们工程化表达MELK(Rat1-DD-MELK)或PI3KCA H1047R(Rat1-DD-PI3KCAH1047R)的Rat1-DD细胞作为阳性对照(图3B)。表达空载体的Rat1-DD细胞在软琼脂糖中不能生长成集落或在小鼠中形成肿瘤。引人注目的是，Rat1-DD-MELK细胞表现出与Rat1-DD-PI3KCAH1047R细胞相当的强劲转化活性，如通过体外集落生长和体内肿瘤形成证明的(图2C，2D)。
最后，为了确定MELK的激酶活性是否是是其转化潜力所必需的，将MELK的催化失活形式D150A或T167A(Lizcano等人，2004；Vulsteke等人，2004)引入Rat-DD细胞。与Rat1-DD-MELK细胞不同，Rat1-DD-MELK-D150A和Rat1-DD-MELK-T157A细胞在软琼脂糖或小鼠中都仅显示有限的生长(图3E，3F，3G)。综上所述，这些研究表明，当MELK异常地过表达时其可以是非常强效的致癌驱动者，并且该致癌潜力依赖MELK的激酶活性。
实施例5：MELK在体外和体内对于BBC细胞的致癌潜力是至关重要的
MELK的致癌潜力得到如下假说：MELK可能是BBC(其中发现MELK以最高水平表达(图3E，14)的乳腺癌亚型)的增殖所必需的。对于这些研究，使用一组反映在临床肿瘤中被发现的分子亚型的乳腺癌细胞系(Neve等人，2006)。这些细胞已被广泛表征并且先前已被用于开发亚型特异性疗法。对应于BBC的细胞系显示高MELK表达水平。(图15B)在Neve数据集中，所有23种BBC细胞显示相较于24种导管型细胞有MEKL表达的显著增加(图6A)。当按照激素受体(ER/PR)和HER2的表达将细胞系分组时，所有21个三阴性乳腺癌细胞系以比ER/PR+细胞更高的水平表达MELK(图7A)。这些结果与MELK在人乳腺癌中的表达模式一致(图3E，4E，4F)。MELK的蛋白质丰度在BBC细胞中比在导管型细胞(MCF7和T47D)中高得多，如通过免疫印迹(图4B)确认的。这些细胞系从而提供了优良的平台来评估MELK的细胞功能。
为了检查MELK在这些细胞的增殖中的作用，使用其中只在暴露于多西环素时才诱导shRNA转录(从而靶基因沉默)的条件性基因敲除技术(Wiederschain等人，2009)。在被产生来靶向MELK的多个可诱导的shRNA中，鉴定到4个MELK靶序列，发现针对靶序列的shRNA高效地沉默MELK表达和抑制利用多西环素处理的细胞的细胞生长(图6C，6D，7B，16，17，19)。MELK靶序列和用于产生shRNA的正向和反向引物示于下面的表1中。
表1
shMELK1、shMELK2、MELK sh-413、MELK sh-1591和MELKsh-1805被稳定地引入到基底乳腺癌细胞以及两个导管型细胞系内，并且在诱导shRNA后检查细胞增殖。如所显示的，经由多西环素的MELK敲低的诱导强烈地减弱BBC细胞(包括BT549、MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-436)的生长(图6C，7A，16-18)；相比之下，2个具有显著更低MELK表达的导管型细胞系MCF7和T47D(图6B，19)被保护免于MELK沉默的诱导(图6D，19)。为了确认这些作用是由于MELK的特异性敲低而引起的，通过稳定地引入多西环素诱导性和抗shMELK的MELK(MELK-R)来拯救MELK表达(图6E，左图框；7B)。在表达shMELK的MDA-MB-468细胞中，当MELK表达被拯救时，细胞增殖被恢复至正常水平(图6E，中间和右边的图框)。有趣的是，MELK的抗shRNA但激酶失活的形式MELK-R(T167A)不能恢复细胞增殖(图6E)，表明MELK的激酶活性对BBC细胞的增殖是至关重要的。
还检查了MELK在BBC细胞的致癌生长中的需求。首先，在体外，对照MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞在软琼脂糖中容易长成肉眼可见的集落。相反地，通过多西环素在这些细胞中诱导MELK敲低引起集落形成的几乎完全抑制(图8A，17，18)。随后，检查MELK是否是BBC细胞的体内肿瘤发生所必需的。将具有稳定的shMELK的乳腺癌细胞移植至免疫受损的小鼠的乳腺脂肪垫中，以允许常位肿瘤的形成。在具有建立的肿瘤的小鼠中，多西环素施用诱导了高效MELK抑制(图9)，确认了诱导型shRNA系统在体内的适用性。移植后立即用多西环素治疗小鼠强烈抑制了原位肿瘤的形成(图8B，8C)，这表明MELK是这些BBC细胞在体内生长所需要的。为了进一步检查MELK是否是在体内维持已建立的异种移植肿瘤所需要的，用多西环素处理具有来源于基底样或导管型乳腺癌细胞的异种移植肿瘤的小鼠。令人惊讶地，MELK的下调显著抑制从BBC细胞产生的肿瘤但对导管型癌细胞来源的肿瘤几无作用(图8D-G，图9)。综上所述，这些数据表明，BBC细胞的体外和体内增殖选择性需要MELK。
实施例6：MELK的丢失在BBC细胞中引起缺陷型有丝分裂和细胞死亡
为了理解MELK在BBC细胞中的作用的机制，检查MELK耗尽在各种细胞过程中的影响。在用多西环素处理的细胞中，始终观察到细胞凋亡标志物(包括经切割的胱天蛋白酶3、经切割的PARP和DNA片段化)(图10A，10B，图11)。zVad(泛胱天蛋白酶抑制剂)显著减少MELK敲低诱导的细胞死亡，这表明胱天蛋白酶在MELK耗尽后在执行细胞死亡中的积极作用(图10C，图11B)。值得注意的是，由MELK敲低诱导的细胞死亡仅在BBC细胞中发生但不在导管型肿瘤细胞诸如MCF7中发生(图10D，图11C)，从而为在基底样乳腺癌细胞但非导管型乳腺癌细胞中选择性需要MELK提供了合理解释。
与此同时，研究MELK耗尽对细胞周期的影响。在多西环素处理后细胞中敲低MELK诱导了具有4n DNA含量的细胞的明显积累(图10E，图11D，左和中间图框)，这表明G2/M期阻滞的诱导。与此相一致，暴露于多西环素的细胞具有升高的有丝分裂标志物，诸如细胞周期蛋白B1、Aurora激酶A(图10E，图11D，右图框)。有趣地，多西环素诱导具有2个或更多个细胞核的细胞的百分比有近2倍的增加，如成像细胞中显示的(图10F，图11E)，这表明胞质分裂的失败。此外，具有MELK耗尽的细胞展现多种有丝分裂畸变，诸如单极纺锤体、错误定位的中心体、姊妹染色单体的错误分离和不对称分裂(图10G)。
检查MELK敲低时并发性细胞死亡与有缺陷的有丝分裂的功能关联性。使用延时显微镜，检查表达GFP-组蛋白2B(一种活细胞中的染色体动力学的标志物)的细胞(Kanda等人，1998)。当MELK表达被下调时，具有双细胞核的细胞而非相邻的具有单个细胞核的细胞经历细胞死亡(图10H，中间的图框)。在多西环素存在的另一种情况下，具有明显的中期板的细胞不能朝向后期进展，最终以细胞死亡结束(图10H，底部的图框)。与此相反，对照细胞容易地从中期进展到后期(图10H，上图框)。综上所述，这些数据表明其中BBC细胞依赖于MELK进行正确的有丝分裂；在这些细胞中抑制MELK会导致受损的有丝分裂从而细胞死亡的模型。
实施例7：FoxM1在BBC中过表达并调节MELK表达
检查MELK以确定MILK是否是BBC细胞中的有丝分裂激酶。MELK在有丝分裂细胞中高度积累，其通过诺考达唑诱导的前中期阻滞富集(图12A，图13A)。当被阻滞的细胞被解除了诺考达唑并容易进展到G1期时，MELK蛋白质丰度急剧下降(图12A，图13A)。该表达模式是那些经典有丝分裂因子诸如细胞周期蛋白B1和Aurora激酶所典型的(图12A，图13A)，这表明MELK是有丝分裂激酶。
检查FoxM1(一种进行有丝分裂所必需的多种基因的主调节剂)对MELK的调控(Laoukili等人，2005；Wang等人，2005)。有趣的是，与MELK一样，FoxM1在BBC或TNBC亚型中最高度地表达(图12B，图13B，13C)。此外，在多个大型组群中观察到FoxM1与MELK表达之间极为紧密的相关性(图12C，图13D)。使用siRNA(SEQ ID NO:31)或化学抑制剂(硫链丝菌素)经基因沉默抑制FoxM1降低了MELK的丰度(图12D，12E，图13E)。此外，我们发现，MELK的启动子含有假定的FoxM1结合基序(SEQ ID NO：45，示于图12F中)(Wierstra和Alves，2007)，使用针对FoxM1的抗体的染色质免疫沉淀测定恢复了具有假定的结合位点的MELK启动子区域(图12E，12F)。综上所述，这些研究将FoxM1鉴定为在BBC中被富集并且调控MELK的转录因子，从而提供了MELK在BBC中过表达的潜在机制。
实验方法
质粒
使用保藏在描述的激酶文库中的模板DNA扩增人MELK，并将其克隆进pWZL逆转录病毒载体(Zhao等人，2003)，其中靶基因的表达由莫洛尼鼠白血病病毒的长末端重复驱动。通过Quickchange XL定点诱变(Stratagene)产生MELK突变体(D150A、T167A或具有沉默突变的shMELK抗性MELK)。引物列于下表S2中。为了构建四环素可诱导的基因表达系统，使用表S2中所列的引物扩增GFP或突变的MELK。用AgeI和PacI消化PCR产物，并将其与消化的pLKO-TREX(Wee等人，2008)连接。
为了构建pWzl-H2B-GFP，使用HEK293T细胞的基因组DNA作为模板扩增人组蛋白2B。用于克隆的引物列于表S2中。将利用BamHI和XhoI消化后的PCR产物与消化的pWzl-GFP连接。为了产生靶向人MELK的pLKO-tet-on-shRNA，设计并合成(IDT)寡核苷酸。在退火后，将双链寡核苷酸与用AgeI和EcoRI消化的pLKO载体连接。无规序列、shMELK1、shMELK2的序列列于表S2中。通过用pWzl质粒和包装DNA转染HEK293T细胞来产生逆转录病毒。通常使用1.6μg pWzl DNA,1.2μg pCG-VSVG和1.2μgpCG-gap/pol、12μl Metafectene Pro的脂质(Biontex)；将DNA和脂质分别稀释在300μl PBS中并混合；在15分钟的温育后，将它们添加至一个在1天前接种有300万个HEK293T细胞的6-cm培养皿。在转染后48小时和72小时采集病毒上清液。在将上清液通过0.45μm的膜过滤后，在8μg/ml聚凝胺(Millipore)存在的情况下将其添加至靶细胞。除用2μg pLKO DNA、1.5μg pCMV-dR8.91和0.5μgpMD2-VSVG转染的细胞外，利用相似的方法产生慢病毒。从初始转染后72小时开始用抗生素选择细胞。分别以1.5μg/ml和4μg/ml的终浓度使用嘌呤霉素和杀稻瘟素。
表S2
细胞培养
将人乳腺上皮细胞(HMEC)在5％CO2和37℃下保持在补充有EGF(10ng/ml)、胰岛素(10μg/ml)和氢化可的松(0.5μg/ml)的DMEM/F-12中。将Rat1和HEK293T细胞维持在补充有10％FBS(Invitrogen)的DMEM中。将所有乳腺癌细胞系(MCF7、T47D、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-436、HCC1197、BT549)培养在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中。对于稳定地引入了四环素诱导型基因/shRNA的细胞，使用Tet允许(Tet-approved)的FBS(Clontech)。
细胞增殖测定
通常地，将乳腺癌细胞于1ml培养基中接种在12孔板(1-2x104)中。在第二天，孔中添加110μl含或不含1μg/ml多西环素(达到100ng/ml的终浓度)的培养基，每两天重复该过程。在初始处理后6天，将细胞用甲醛固定，并用结晶紫(0.05％，重量/体积)染色(一种染色质结合型细胞化学染料)。将板充分洗涤，并用平板扫描仪进行成像。为了进行染色的定量，将1ml 10％的乙酸添加至每一个孔中，以提取染料。以750nm作为参照，在590nm测量吸光度。
集落形成测定
除非另有说明，否则通常在12孔板中进行测定。将细胞悬浮于含有0.3％琼脂的培养基中，并将其铺板在一层0.6％琼脂上(对于每个孔，4,000个细胞于800μl培养基中，1ml底部琼脂)。第二天用培养基(不含或含100ng/ml多西环素)添加孔。接种后3周，用甲醛固定集落并成像。使用ImageJ(国立卫生研究院)定量每一个孔中的集落数目。
肿瘤异种移植研究
所有异种移植研究按照来自美国国立卫生研究院动物使用准则并利用由Dana-Farber癌症研究所动物护理和使用委员会批准的方案来进行。所用的受体小鼠是NCR裸鼠(CrTac：NCR-Foxn1nu，Taconic)。将细胞重悬浮于40％的无LDEV的Matrigel-Basement MembraneMatrix(BD Biosciences)，并置于冰上直至注射。为了移植人细胞系，在注射当天用400rads的单次剂量对小鼠进行γ照射。通过吸入异氟烷麻醉来麻醉小鼠，并对其每部位注射150μl细胞(5x106)。利用测径器在两个维度上测量肿瘤。使用下式计算肿瘤体积：V＝0.5×长度×宽度×宽度。所有异种移植数据表示为平均值±SEM。使用双尾Student'st检验进行治疗组间的比较。使用Openoffice或GraphPad Prism 5.0b版进行计算。
为了进行肿瘤发生研究，将5×106个HMEC细胞注射进乳腺脂肪垫，并且皮下注射5×106个Rat1细胞。每周监测肿瘤生长2次。在注射后3周收获Rat1异种移植物。为了研究MELK敲低对肿瘤生长的影响，在注射的第2天将小鼠随机分成组，并且不用或用多西环素(2mg/ml，于饮用水中的5％右旋糖中，每周更换2次)处理小鼠，进行研究的持续时间。每周测量肿瘤两次。为了研究MELK在肿瘤维持中的作用，将具有来源于MDA-MB-231、或MDA-MB-468、或MCF-7、或T47D细胞的原位注射的已建立肿瘤的小鼠随机分成两组，一个组接受饮用水中的多西环素。每周用测径器测量肿瘤2次以监测MELK敲低对肿瘤生长的影响。
延时成像
在配备有完美的对焦系统和加湿孵化室(37℃，5％CO2)的NikonTi机动倒置显微镜上进行延时成像(Nikon Imaging Center,HarvardMedical School)。将稳定表达H2B GFP的细胞预先接种在24孔玻璃底平板中，并且不用或用多西环素(最终100ng/ml)处理。每5分钟利用20X物镜和Hamamatsu ORCA-AG冷却的CCD照相机捕获图像。使用ImageJ(美国国立卫生研究院)分析图像。
免疫荧光分析
将细胞接种在被预先置于24孔板内的No.1.5盖玻片(12mm的圆形)上。在收获后，将细胞用4％甲醛固定10分钟。洗涤后，用0.1％Trition X-100透化细胞10分钟。随后洗涤细胞，并且在用于含有1％牛血清白蛋白的PBS中制备的一抗(抗β微管蛋白，#2128，CellSignaling Technology)温育之前，用1％牛血清封闭所述细胞30分钟。于4℃下温育过夜后，将样品洗涤并在室温用缀合有Alexa 488的二抗(Invitrogen)温育1小时。在充分洗涤后，将样品干燥并用ProLongAntifade试剂(Invitrogen)进行封装。在Nikon影象中心(HarvardMedical School)利用配备有Hamamatsu C8484-03单色照相机的Nikon 80i正立式显微镜获取图像。使用ImageJ分析图像，所述ImageJ包括具有不同颜色和裁剪的合并通道。
免疫印迹
用补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)的RIPA缓冲液(25mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠)裂解细胞。使用BCA试剂盒(Thermo Scientific)分析澄清的裂解物的蛋白质浓度。将等量的蛋白质(10-20μg)在8％或10％SDS-PAGE上进行分离，随后转移至硝酸纤维素或聚偏氟乙烯膜(Amersham)上。用5％的脱脂奶封闭膜，随后在4℃用一抗温育过夜。在洗涤后，在室温用缀合有荧光团的二抗温育膜，进行1小时。随后洗涤膜，用Odyssey红外扫描仪(LI-COR Biosciences)进行扫描。用于本研究的一抗包括抗MELK(Epitomics，#2916)、抗α微管蛋白(Abcam)、抗细胞周期蛋白B1(Millipore)、抗纽蛋白(Sigma)、抗FoxM1(Santa Cruz)、抗β微管蛋白、抗磷酸化Akt(S473)、抗磷酸化Akt(T308)、抗总Akt、抗Flag、抗切割的PARP(Asp214)、抗切割的胱天蛋白酶3、抗AURKA、抗AURKB、抗P27(全部来自Cell Signaling Technology)。所用的次级抗体是缀合有IRDye700的抗-兔IgG和缀合有IRDye800的抗小鼠IgG(Rockland)。
细胞周期分析
通过胰蛋白酶消化来收获细胞，并将其反复吸移成单细胞悬液。离心后，通过逐滴添加70％的乙醇(-20℃)同时涡旋固定细胞。随后用含有50μg/ml不含DNA酶的RNA酶A(Sigma)和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的碘化丙锭(50μg/ml,Sigma)溶液对细胞进行染色。在30分钟的温育后，洗涤样品并将其重悬浮于0.5％BSA中。在DFCI CytometryCore Facility的LSRFortessa(BD Biosciences)上进行分析。通过将FL3-A对FL3-H作图以排除细胞碎片和双联体来门控单细胞。每一样品收集至少10000个单细胞。
染色质免疫沉淀
如先前所描述(Lee等人，2006)进行染色质免疫沉淀。收获后，向细胞培养皿中的培养基中添加16％甲醛(Electron MicroscopySciences)以达到1％的终浓度，并在室温温育10分钟后利用甘氨酸淬灭反应(最终125mM，温育5分钟)。通过刮入冷PBS中来收集细胞，并进行离心。用LB1(50mM HEPES，pH 7.5，140mM氯化钠，1mMEDTA中，10％甘油，0.5％NP-40，0.25％Triton-X-100)裂解细胞沉淀，随后在离心后用LB2(10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5mM EGTA)进行裂解，并且再次地在离心后重悬浮于LB3(10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5mMEGTA，0.1％脱氧胆酸钠，0.5％N-月桂酰肌氨酸)中。利用30秒开和30秒关的脉冲以50％的振幅使用Q800R DNA剪切超声仪(Qsonica)对样品超声处理10分钟。随后用10％Triton-X 100补充样品至1％的终浓度，并在4℃以20,000×g离心10分钟。将澄清的裂解物用于下列免疫沉淀，将50μl的裂解物用作输入。
用封闭溶液(PBS中的0.5％牛血清白蛋白)洗涤缀合有G蛋白的Dynabead(Invitrogen)，并用5μg抗FoxM1(SC-502，Santa CruzBiotechnology)或5μg兔IgG在封闭溶液中温育过夜，并在第二天用封闭溶液洗涤3次。用抗体/磁珠温育细胞裂解物，在4℃旋转过夜。第二天，用磁力表座收集珠粒，并用RIPA缓冲液(50mM HEPES pH7.6，500mM LiCl，1mM EDTA，1％NP-40，0.7％脱氧胆酸钠)洗涤6次。用含50mM NaCl的Tris-EDTA缓冲液进行单次洗涤后，用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,10mM EDTA,1％SDS)重悬浮样品，在65℃温育过夜。同样地，还将50μl输入与150μl洗脱缓冲液水混合，并在65℃温育过夜以进行反向交联。第二天，向样品中添加RNA酶A(最终0.2μg/ml)，随后在37℃温育1小时。随后用蛋白酶K(最终0.2μg/ml)处理样品，并在56℃温育1小时。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA，并用30μl水洗脱。使用Quick-LoadTaq 2X预混合物(NEB)，使用表S2中所列的引物进行PCR。
qRT-PCR分析
利用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从培养的细胞提取总RNA，利用QIAshredder旋转柱进行均匀化和柱上DNA酶消化。使用HighCapacity RNA to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)逆转录2微克的总RNA。使用Power SYBR Green PCR预混合物(Applied Biosystems)在ABI7300实时PCR系统上定量分析cDNA。所使用的引物列于表S2中。循环条件为：95℃，15分钟；40个循环(94℃15秒；55℃30秒以及72℃30秒)。使用默认分析设置生成Ct值。ΔCT被定义为Ct目标基因–Ctβ肌动蛋白。ΔΔCT被定义为ΔCt处理的样品–Ct对照样品。相对定量(RQ)被计算为2-ΔΔCT。利用Student's t检验进行统计分析。
基因表达的分析
从Oncomine(Rhodes等人，2004)下载基因表达数据。临床数据集的信息列于表S1中。在GraphPad Prism中进行分析和制图。在散点图中，每一个点表示一个单独的样本，结果表示为具有四分位距的中位数。
存活分析
检查可获得整体存活或无转移存活数据的乳腺癌患者的独立组群。组群的信息列于表S1中。从Oncomine(Rhodes等人，2004年)下载MELK表达和相关存活的数据。对于每一个组群，基于MELK的表达将患者分为前60％“高MELK”组和后40％“低MELK”组。卡普兰-迈耶曲线以及对数秩(Mantel-Cox)检验和危害比利用GraphPadPrism来进行分析。
统计分析
将双尾Student's t检验和ANOVA(方差分析)分别用于两个组之间和三个组之间的差异比较。在GraphPad Prism中进行存活和相关性分析。
本文提供的定义和公开内容优先于通过引用并入的所有其它参考资料。虽然已结合其优选实施方案在本文中描述了本发明，但本领域技术人员将理解，可进行未明确描述的添加、修改、取代和删除而不脱离如所附权利要求中定义的本发明的精神和范围。因此，前述详细描述旨在被视为说明性的而不是限制性的，并且应当理解，下面的权利要求，包括所有等同物，旨在确定本发明的精神和范围。

Claims (43)

1.一种抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括以有效地抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量向有此需要的受试者施用MELK抑制剂；
其中所述乳腺癌细胞是雌激素受体(ER)阴性的。
2.权利要求1的方法，其中所述MELK抑制剂包含编码siRNA的多核苷酸。
3.权利要求2的方法，其中所述siRNA包含shRNA。
4.权利要求3的方法，其中所述MELK抑制剂包含具有选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的shRNA。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞是孕酮受体(PR)阴性的。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞是人表皮生长因子受体2(HER2)阴性的。
7.一种用于抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的方法，其包括以有效地抑制乳腺癌细胞的生长或增殖的量向有此需要的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂；
其中所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性的。
8.权利要求7的方法，其中所述MELK抑制剂包含编码siRNA的多核苷酸。
9.权利要求8的方法，其中所述siRNA包含shRNA。
10.权利要求9的方法，其中所述MELK抑制剂包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的shRNA。
11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含siRNA。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含具有由SEQ ID NO:29组成的核苷酸序列的siRNA。
13.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂为硫链丝菌素。
14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞是孕酮受体(PR)阴性的。
15.权利要求7-14中任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞是人表皮生长因子受体2(HER2)阴性的。
16.一种用于治疗患有乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括：
测定所述受试者的乳腺癌细胞中的雌激素受体表达状况；
向具有雌激素受体阴性的乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂。
17.权利要求16的方法，所述方法包括测定所述受试者的乳腺癌细胞中的孕酮受体表达状况；和向具有雌激素受体阴性和孕酮受体阴性的受试者施用所述MELK抑制剂。
18.权利要求的16或17方法，所述方法包括测定所述受试者的乳腺癌细胞中的人表皮生长因子受体2表达状况；和向具有人表皮生长因子受体2阴性的乳腺癌细胞的受试者施用所述MELK抑制剂。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述MELK抑制剂包含编码siRNA的多核苷酸。
20.权利要求19的方法，其中所述siRNA包含shRNA。
21.权利要求20的方法，其中所述MELK抑制剂包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的shRNA。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中所述MELK抑制剂干扰FoxM1对MELK 1的启动子区域的结合。
23.一种用于治疗具有乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括：
测定所述受试者的乳腺癌细胞中的雌激素受体表达状况；
向具有雌激素受体阴性的乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂。
24.权利要求23的方法，其包括测定所述受试者的乳腺癌细胞中的孕酮受体表达状况；和向具有雌激素受体阴性的和孕酮受体阴性的乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂。
25.权利要求23或24的方法，所述方法包括测定所述受试者的乳腺癌细胞中的人表皮生长因子受体2表达状况；和向具有人表皮生长因子受体2阴性的乳腺癌细胞的受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂。
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述MELK抑制剂包含编码siRNA的多核苷酸。
27.权利要求26的方法，其中所述siRNA包含shRNA。
28.权利要求27的方法，其中所述MELK抑制剂包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的shRNA。
29.权利要求23-28中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含siRNA。
30.权利要求29的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含具有由SEQID NO:29组成的核苷酸序列的siRNA。
31.权利要求23-28中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂为硫链丝菌素。
32.权利要求23-27和29-31中任一项的方法，其中所述MELK抑制剂干扰FoxM1对MELK 1的启动子区域的结合。
33.一种鉴定可能从利用MELK抑制剂或FoxM1抑制剂的治疗中获益的患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
测定所述受试者的乳腺癌细胞中的雌激素受体表达状况；和/或
测定乳腺癌细胞中相对于非乳腺癌细胞的MELK表达水平；和
鉴定具有雌激素受体阴性的和/或相较于非乳腺癌细胞在乳腺癌细胞中具有更高MELK表达水平的乳腺癌细胞的受试者；
其中具有雌激素受体阴性乳腺癌细胞和/或更高MELK表达水平的受试者表明需要用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂治疗所述受试者。
34.权利要求33的方法，所述方法包括向所述受试者施用MELK抑制剂、FoxM1抑制剂或MELK抑制剂和FoxM1抑制剂。
35.权利要求33或34的方法，其中所述MELK抑制剂包含编码siRNA的多核苷酸。
36.权利要求35的方法，其中所述MELK抑制剂包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的shRNA。
37.权利要求33-25中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含siRNA。
38.权利要求37的方法，其中所述FoxM1抑制剂包含具有由SEQID NO:29组成的核苷酸序列的siRNA。
39.权利要求33-35中任一项的方法，其中所述FoxM1抑制剂为硫链丝菌素。
40.权利要求33-35和37-39中任一项的方法，其中所述MELK抑制剂干扰FoxM1对MELK的启动子区域的结合。
41.权利要求33-39中任一项的方法，所述方法包括测定所述受试者的乳腺癌细胞中的孕酮受体表达状况。
42.一种包含有效量的能够下调MELK的表达的药剂和药学上可接受的载体的组合物，其中所述组合物包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ.ID.NO:4及其组合的MELK靶核苷酸序列的siRNA。
43.权利要求42的组合物，其中所述siRNA包含选自SEQ IDNOS:5-12的核苷酸序列。
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