KR101682083B1 - MELK 발현을 억제하는 신규 MELK shRNA 및 이의 용도 - Google Patents

MELK 발현을 억제하는 신규 MELK shRNA 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 특정 서열을 가지는 MELK shRNA 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 기존에 알려진 MELK shRNA 보다 유전자 발현 억제 효과가 우수하고 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 억제하므로, 상기 조성물은 암을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

MELK 발현을 억제하는 신규 MELK shRNA 및 이의 용도{Novel MELK shRNA suppressing MELK expression, and use thereof}
본 발명은 MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) 발현을 억제하는 신규한 염기서열을 가지는 shRNA 및 상기 shRNA를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase)는 포유류의 배아 발달에 관여하는 snf1/AMPK 페밀리에 속하고(Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug 215(4):344-51), 아데노신 모노포스페이트에 의해 활성화되는 세린/쓰레오닌 카이나제(serine/threonine kinase)이다. MELK는 아프리카 발톱개구리(Xenopus)의 수정란에서 처음 발견되었으며 세포 주기(cell cycle)의 유사분열 단계에서 그 양이나 활성화가 최대화되는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 척추동물세포에서도 확인되었다(Blot J. et al., Dev. Biol. 2002, 241(2):327-338; Davezac N. et al., Oncogene, 2002, 21:7630-7641). MELK에 의해 인산화되는 단백질로는 세포 주기에 관여하는 CDC25가 알려져 있으며(Dmitry V. et al., Nat. Cell Biol., 2003, 5:545-551), 상기 단백질은 전사 단백질인 ZPR9을 인산화시켜 세포 주기를 조절하는 것으로 알려져 있다(Hyun-A Seoung et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:9655-9662). 최근 유방암 환자나 교아세포암 환자의 조직에서 MELK의 발현이 증가하는 것으로 확인되었으며 MELK의 발현을 억제하는 것 자체만으로도 암세포의 성장이 저해되는 것으로 밝혀졌다.(Ichiro Nakano et al., J. Neurosci. Res., 2008, 86:48-60; Haiyoung Jung et al., J. Biol. Chem., 2008, 283:34541-34553).
종양 세포주에서 MELK는 세포주기 조절자로써 기능하는 것으로 알려져 있고, 다양한 암에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, MELK는 줄기세포 재생, 세포주기 및 pre-mRNA 스플라이싱 등에 관여하고, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(NM_014791, NP_055606 ). 상기 유전자는 줄기 세포 재생(Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3):413-27), 세포-주기 진행(Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2):327-38; Seong HA et al., iochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604) 및 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)(Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10):8642-8647)에 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 추가로, 23,040 유전자를 포함하는 게놈 와이드 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일의 분석을 통해서, MELK가 최근에 유방암에서 상향 조절되는 것으로 나타났다(Lin ML et al., 유방 암 Res. 2007; 9 (1):R17, WO2006/016525, WO2008/023841). 또한, MELK는 여러 종류의 암 세포, 예를 들면, 폐, 방광, 림프종 및 자궁경부암 세포에서 상향 조절된다(WO2004/031413, WO2007/013665, 및 WO2006/085684). 즉, MELK는 정상적인 생체 기관(심장, 간, 폐 및 신장)에서는 발현되지 않고, 유방암 및 세포주의 과반수에서 현저하게 높은 수준으로 과발현되었음을 증명하였다(WO2006/016525). 더욱이, siRNA에 의한 MELK 발현저해는 인간 유방암 세포의 성장을 현저히 저해하는 것으로 나타났다. 아울러, MELK는 뇌암에서 과발현되고 이러한 과발현은 암환자의 예후에 부정적인 영향을 미친다. 따라서 MELK의 발현을 억제할 수 있다면 뇌암의 치료를 가능할게 할 수 있을 것으로 여겨진다.
과거에 사용된 암 억제제 또는 항암제의 대부분은 화학요법제로서 암의 증상과 증후를 일시적으로 제어하여 수명을 연장시켜 주는 기능을 해 왔다. 이에 반해, 최근 암 억제제는 특정 암세포에 존재하는 단백질 또는 유전자를 표적으로 하여 정상세포에 대한 암 억제제의 부작용을 최소화시키기 위한 방향으로 개발되고 있다. 그럼에도, 다양한 유형의 암 발생 메커니즘으로 인하여 효율적인 항암제가 부족하고, 항암제에 대한 내성 역시 해결되지 못하고 있는 실정이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으며, MELK의 유전자 발현을 억제하는 shRNA들이 디자인되었다. 그러나, 기존에 보고된 shRNA는 MELK 단백질 발현에 대한 억제 효과가 너무 미미하다는 것이 밝혀졌다.
이에, 본 발명자들은 기존에 보고된 shRNA 보다 MELK 단백질 발현 억제 효과가 뛰어난 shRNA를 발굴하고자 노력한 결과, 신규한 특정 서열을 가지는 shRNA가 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 감소시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 2 내지 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) 발현을 억제하는 shRNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 shRNA를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 shRNA 및 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2 내지 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 MELK 발현을 억제하는 shRNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 shRNA를 포함하는 벡터를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 shRNA 및 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 신규한 특정 서열을 가지는 MELK shRNA는 기존에 알려진 MELK shRNA 보다 유전자 발현 억제 효과가 우수하고 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 억제하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 뇌암, 신경암, 유방암, 위암, 대장암 등의 다양한 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 MELK 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 Hela 세포에 결핍(knockdown)시킨 후 MELK항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 한 결과이다.
도 3은 A498 세포, A549 세포 또는 SK-OV-3 세포에서 신규한 5번, 9번, 12번 shRNA로 결핍한 후 MELK항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과이다.
도 4는 A498 세포, A549 세포 또는 SK-OV-3 세포에서 기존 shRNA(MELK1, MELK2, MELK3)를 결핍 한 후 MELK항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2 내지 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) 발현을 억제하는 shRNA를 제공한다. 상기 MELK는 서열번호 1로 기재된다.
상기 shRNA(short hairpin RNA)는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가지는데, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 shRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer).
또한, 본 발명은 상기 서열번호 2 내지 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) 발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 선형 DNA(linear DNA), 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스 벡터로 구성된다.
상기 플라스미드(Plasmid)는 세균의 세포 내에 복제되어 독자적으로 증식할 수 있는 염색체 이외의 DNA 분자를 총칭하는 말로서 고리 모양을 띤다. 플라스미드는 세균의 생존에 필수적이지는 않으며, 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있으므로 이런 성질을 이용하여 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 자른 뒤 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.
상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 아데노바이러스(Adenoviridae)는 90~100nm의 중형 크기의 바이러스로서 외피는 없고 정이십면체로 되어 있으며, 이중나선 형태의 DNA를 가지고 있다. 아데노바이러스는 어린이가 걸린 상부 호흡기 질환 중 5~10%의 원인이며, 어른들도 감염되기도 한다.
상기 아데노부속 바이러스는 파르보바이러스(parvovirus)에 속하는 단일 가닥의 DNA 바이러스로서 단독으로 복제를 할 수 없으며 아데노바이러스나 백시니아(vaccinia), 혹은 헤르페스바이러스(herpesvirus) 등의 헬퍼(helper) 바이러스와 함께 감염되었을 때 복제, 증식할 수 있는 결함 바이러스이다. 헬퍼(helper) 바이러스가 없을 때 아데노부속 바이러스 게놈은 사람 세포의 19번 염색체의 특정 부위 내로 삽입되어 잠복 상태로 남아 있다가 헬퍼(helper) 바이러스가 감염되면 복제, 증식이 가능하게 된다. 아데노부속 바이러스 게놈은 4681 bp의 DNA로, 양 끝에 145 bp의 ITR을 갖는데, 이는 복제와 포장 그리고 rescue에 요구되는 최소 염기 서열이다. ITR 내부에는 2개의 ORF이 있는데, 이는 복제에 요구되는 rep, 그리고 구조 단백질을 코딩하는 cap 유전자이다. 아데노부속 바이러스는 사람 세포에 잠복 감염이 가능하여, 염색체내로의 삽입이 세포 성장에 어떠한 변화도 야기하지 않으며, 다양한 세포에 효율적으로 감염할 수 있고, 아데노바이러스처럼 면역 반응을 유도하지 않는다. 최초의 재조합 아데노부속 바이러스 벡터는 cap 유전자를 제거하고 외래 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있고, 보다 바람직하게는 rep 유전자와 cap 유전자가 모두 외래유전자로 대치된 형태일 수 있다.
상기 레트로 바이러스(retrovirus)는 감염된 세포에서 RNA 게놈이 DNA로 전환되어 숙주세포의 염색체내로 삽입되는 일련의 바이러스 군으로, 현재까지 Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)에 기초한 레트로바이러스 벡터가 각종 유전자 치료를 위한 임상 시험에 가장 널리 사용된다. 레트로바이러스 입자는 2가닥의 RNA를 포함하는 단백질 core가 지질 외막에 의해 돌러 싸인 형태를 하고 있다. 레트로바이러스는 외막 단백질이 세포 표면의 특정 수용체와 결합함으로써 시작되는데, 동물 세포에 감염할 수 있는 ecotropic 외막의 경우 그 수용체는 cationic amino acid transporter이며, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 MoMLV amphotropic 외막의 수용체는 phosphate transporter (Ram-1)로 알려져 있다. 바이러스와 세포막간의 융합 혹은 세포흡수작용에 의해 바이러스는 세포내로 도입되고 바이러스의 RNA는 역전사과정에 의해 DNA로 전환되어 핵으로 이동한다. 대부분의 레트로바이러스는 상기 DNA가 핵속으로 들어가기 위해 유사 분열과 그에 따른 핵막의 파괴를 필요로 하며, 핵내에서 DNA는 염색체내로 삽입되어 provirus를 형성한다. 삽입된 provirus에서 전사된 RNA로부터 gag, pol, env 유전자 산물이 합성되고 이들은 게놈 크기의 바이러스 RNA만을 포장하여 바이러스 입자를 생산하게 된다.
상기 렌티바이러스(Lentivirus)벡터는 레트로바이러스의 일종으로서 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 특성으로 인하여 유전자 전달 벡터로 개발되고 있으며, 대표적인 예가 HIV인데, 이는 gag, pol, env 외에도 6개의 accessary 유전자을 더 포함한다. 몇몇 accessary 유전자를 제거한 HIV 벡터의 경우 VSV 외막 단백질로 pseudotyping 되었을 때 동물시험에서 뇌, 간, 근육 세포등 광범위한 세포로 감염할 수 있고, 6개월 이상 지속적인 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, MELK 서열(서열번호 1)(도 1 참조)을 인비트로젠(Invitrogen)에 입력하여 서열 후보군(sequence candidate)을 제공받고(표 1 참조), 각각의 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 프라이머를 제작하였다(표 3 참조). 100 pmole/ul 농도인 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 애닐링(annealing) 시킨후 AgeI과 EcoRI으로 절단된 pLKO.1 벡터에 annealing된 프라이머를 삽입하였다. 293T 세포에 상기 세 개의 벡터를 형질감염시켜 렌티바이러스를 수득하였다. 수득된 배지를 자궁경부암 세포(HeLa), 신장암 세포(A498), 폐암세포(A549) 또는 난소암 세포(SK-OV-3)에 각각 감염시키기고 퓨로마이신으로 생존세포를 선별한 후 세포 용해물(cell lysate)을 모아서 웨스턴블랏을 통하여 MELK 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 또한, 기존의 MELK shRNA(MELK1, MELK2, MELK3)보다 본 발명의 MELK shRNA 유전자가 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 MELK shRNA는 기존에 알려진 MELK shRNA 보다 유전자 발현 억제 효과가 우수하고 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 억제하므로, 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 shRNA 및 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암 (NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 MELK shRNA는 기존에 알려진 MELK shRNA보다 유전자 발현 억제 효과가 우수하고 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 억제하므로, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“치료”는 종양 세포 형성의 예방, 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제, 및 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1 × 105 - 1 × 1015 PFU/㎖의 재조합 바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010 PFU를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 shRNA 및 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 암은 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 MELK shRNA는 기존에 알려진 MELK shRNA 보다 유전자 발현 억제 효과가 우수하고 여러 암세포에서 MELK의 발현을 효율적으로 억제하므로, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 MELK shRNA를 유효성분으로 건강기능식품이 암 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 암 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 암 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> MELK shRNA 제작
<1-1> MELK 및 프라이머 서열 분석
MELK shRNA 제작을 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, MELK 서열(서열번호 1)을 Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)를 통해서 제공받았다(Accession number BC014039)(도 1). 상기 서열을 인비트로젠 홈페이지(invitrogen homepage ; https://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)에 입력하여 결핍(knockdown)이 가능할 것으로 예상되는 서열번호 2 내지 16으로 기재되는 15개의 서열 후보군(sequcence cadidate)을 제공받았다(표 1). 이 후, 논문을 조사하여 현재 MELK1 결핍에 사용되는 shRNA의 서열을 조사하였다(표 2).
No 시작
(Start)		 서열(Sequence) 영역(Region)
1 (서열번호 2) 210 GGTCAAACTTGCCTGCCATAT ORF
2 (서열번호 3) 2376 GCTCTTAACTATGTCTCTTTG 3-UTR
3 (서열번호 4) 870 GCAGGTGGACCCAAAGAAA ORF
4 (서열번호 5) 923 GGATCATGCAAGATTACAACT ORF
5 (서열번호 6) 1656 GGAATTGGATCTCAACCAAGC ORF
6 (서열번호 7) 1662 GGATCTCAACCAAGCACATAT ORF
7 (서열번호 8) 2118 GGATGAGTGTGGGTGTGATAC 3-UTR
8 (서열번호 9) 723 GGGCATACTGTTATATGTT ORF
9 (서열번호 10) 2279 GCCCATCTGTCATTATGTTAC 3-UTR
10 (서열번호 11) 831 GCTCTCTCCCAGTAGCATTCT ORF
11 (서열번호 12) 2129 GGTGTGATACAGCCTACATAA 3-UTR
12 (서열번호 13) 719 GCATGGGCATACTGTTATATG ORF
13 (서열번호 14) 1074 CCTCACGGCTACCTATCTT ORF
14 (서열번호 15) 1032 GCAAACAATGGAGGATTTA ORF
15 (서열번호 16) 1123 CCAGTTCGTTTAAGGCTTT ORF
기존 서열(Sequence)
MELK1 AACCCAAGGGTAACAAGGA
MELK2 CAGGCAAACAATGGAGGAT
MELK3 AAAAACCCGATGTGGTGGGTA
<1-2> MELK 결핍용 shRNA 제작 및 확인
상기 [표 1]의 서열을 가지는 shRNA를 만들기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 각각의 shRNA 제작에 필요한 서열번호 16 내지 46으로 기재되는 정방향(Forward) 및 역방향(Reverse) 프라이머를 각각 1개씩 주문하여 공급받았다(Macrogen)(표 3). 100 pmole/㎕ 농도인 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 애닐링(annealing) 시켰다. 기존 MELK shRNA 제작을 위한 프라이머 서열을 [표 4]에 나타냈다.
한편, 애드진(Addgene)으로부터 구입한 pLKO.1 벡터를 AgeI과 EcoRI으로 절단한 후, 애닐링(annealing)된 프라이머를 라이게이즈(ligase)를 이용해서 pLKO.1 벡터로 클로닝(cloning) 하였다.
pCMV-VSV-G(0.7 ㎍), pCMV-dR8.2(1.3 ㎍) 또는 MELK shRNA가 클로닝된 pLKO.1 벡터(2 ㎍)를 이용하여 293T 세포에 상기 세 개의 벡터를 형질감염(transfection)시키고 수일 후에 색깔(노란색)이 변한 배지로부터 렌티바이러스(lentivirus)를 수득하였다. 수득된 배지는 4℃에 보관 하여 즉시 사용하거나 또는 장기 사용을 위해 -70℃에 냉동 보관하였다.
번호 프라이머 명칭 서열(Sequence)
1 sihMELKF210
(서열번호 17)		 5'-CCG GGG TCA AAC TTG CCT GCC ATA TGC TAG
CAT ATG GCA GGC AAG TTT GAC CTT TTT G-3'
sihMELKR210
(서열번호 18)		 5'-AAT TCA AAA AGG TCA AAC TTG CCT GCC ATA
TGC TAG CAT ATG GCA GGC AAG TTT GAC C-3'
2 sihMELKF2376UTR
(서열번호 19)		 5'-CCG GGC TCT TAA CTA TGT CTC TTT GGC TAG
CCA AAG AGA CAT AGT TAA GAG CTT TTT G-3'
sihMELKR2376UTR
(서열번호 20)		 5'-AAT TCA AAA AGC TCT TAA CTA TGT CTC TTT
GGC TAG CCA AAG AGA CAT AGT TAA GAG C-3'
3 sihMELK_F870
(서열번호 21)		 5'-CCG GGC AGG TGG ACC CAA AGA AAG CTA GCT
TTC TTT GGG TCC ACC TGC TTT TTG-3' (
sihMELK_R870
(서열번호 22)		 5'-AAT TCA AAA AGC AGG TGG ACC CAA AGA AAG
CTA GCT TTC TTT GGG TCC ACC TGC-3'
4 sihMELKF923
(서열번호 23)		 5'-CCG GGG ATC ATG CAA GAT TAC AAC TGC TAG
CAG TTG TAA TCT TGC ATG ATC CTT TTT G-3'
sihMELKR923
(서열번호 24)		 5'-AAT TCA AAA AGG ATC ATG CAA GAT TAC AAC
TGC TAG CAG TTG TAA TCT TGC ATG ATC C-3'
5 sihMELKF1656
(서열번호 25)		 5'-CCG GGG AAT TGG ATC TCA ACC AAG CGC TAG
CGC TTG GTT GAG ATC CAA TTC CTT TTT G-3'
sihMELKR1656
(서열번호 26)		 5'-AAT TCA AAA AGG AAT TGG ATC TCA ACC AAG
CGC TAG CGC TTG GTT GAG ATC CAA TTC C-3'
6 sihMELKF1662
(서열번호 27)		 5'-CCG GGG ATC TCA ACC AAG CAC ATA TGC TAG
CAT ATG TGC TTG GTT GAG ATC CTT TTT G-3'
sihMELKR1662
(서열번호 28)		 5'-AAT TCA AAA AGG ATC TCA ACC AAG CAC ATA
TGC TAG CAT ATG TGC TTG GTT GAG ATC C-3'
7 sihMELKF2118UTR
(서열번호 29)		 5'-CCG GGG ATG AGT GTG GGT GTG ATA CGC TAG
CGT ATC ACA CCC ACA CTC ATC CTT TTT G-3'
sihMELKR2118UTR
(서열번호 30)		 5'-AAT TCA AAA AGG ATG AGT GTG GGT GTG ATA
CGC TAG CGT ATC ACA CCC ACA CTC ATC C-3'
8 sihMELK_F723
(서열번호 31)		 5'-CCG GGG GCA TAC TGT TAT ATG TTG CTA GCA
ACA TAT AAC AGT ATG CCC TTT TTG-3'
sihMELK_R723
(서열번호 32)		 5'-AAT TCA AAA AGG GCA TAC TGT TAT ATG TTG
CTA GCA ACA TAT AAC AGT ATG CCC-3'
9 sihMELKF2279UTR
(서열번호 33)		 5'-CCG GGC CCA TCT GTC ATT ATG TTA CGC TAG
CGT AAC ATA ATG ACA GAT GGG CTT TTT G-3'
sihMELKR2279UTR
(서열번호 34)		 5'-AAT TCA AAA AGC CCA TCT GTC ATT ATG TTA
CGC TAG CGT AAC ATA ATG ACA GAT GGG C-3'
10 sihMELKF831
(서열번호 35)		 5'-CCG GGC TCT CTC CCA GTA GCA TTC TGC TAG
CAG AAT GCT ACT GGG AGA GAG CTT TTT G-3'
sihMELKR831
(서열번호 36)		 5'-AAT TCA AAA AGC TCT CTC CCA GTA GCA TTC
TGC TAG CAG AAT GCT ACT GGG AGA GAG C-3'
11 sihMELKF2129UTR
(서열번호 37)		 5'-CCG GGG TGT GAT ACA GCC TAC ATA AGC TAG
CTT ATG TAG GCT GTA TCA CAC CTT TTT G-3'
sihMELKR2129UTR
(서열번호 38)		 5'-AAT TCA AAA AGG TGT GAT ACA GCC TAC ATA
AGC TAG CTT ATG TAG GCT GTA TCA CAC C-3'
12 sihMELKF719
(서열번호 39)		 5'-CCG GGC ATG GGC ATA CTG TTA TAT GGC TAG
CCA TAT AAC AGT ATG CCC ATG CTT TTT G-3'
sihMELKR719
(서열번호 40)		 5'-AAT TCA AAA AGC ATG GGC ATA CTG TTA TAT
GGC TAG CCA TAT AAC AGT ATG CCC ATG C-3'
13 sihMELK_F1074
(서열번호 41)		 5'-CCG GCC TCA CGG CTA CCT ATC TTG CTA GCA
AGA TAG GTA GCC GTG AGG TTT TTG-3'
sihMELK_R1074
(서열번호 42)		 5'-AAT TCA AAA ACC TCA CGG CTA CCT ATC TTG
CTA GCA AGA TAG GTA GCC GTG AGG-3'
14 sihMELK_F1032
(서열번호 43)		 5'-CCG GGC AAA CAA TGG AGG ATT TAG CTA GCT
AAA TCC TCC ATT GTT TGC TTT TTG-3'
sihMELK_R1032
(서열번호 44)		 5'-AAT TCA AAA AGC AAA CAA TGG AGG ATT TAG
CTA GCT AAA TCC TCC ATT GTT TGC-3'
15 sihMELK_F1123
(서열번호 45)		 5'-CCG GCC AGT TCG TTT AAG GCT TTG CTA GCA
AAG CCT TAA ACG AAC TGG TTT TTG-3'
sihMELK_R1123
(서열번호 46)		 5'-AAT TCA AAA ACC AGT TCG TTT AAG GCT TTG
CTA GCA AAG CCT TAA ACG AAC TGG-3'
프라이머 명칭 기존 MELK shRNA 제조를 위한 프리이머 서열
MELK1 MELK1_F 5'-CCGG AACCCAAGGGTAACAAGGA GCTAGC tccttgttacccttgggtt TTTTTG-3'
MELK1_R 5'-AATTCAAAAA AACCCAAGGGTAACAAGGA GCTAGC tccttgttacccttgggtt-3'
MELK2 MELK2_F 5'-CCGG CAGGCAAACAATGGAGGAT GCTAGC atcctccattgtttgcctg TTTTTG-3'
MELK2_R 5'-AATTCAAAAA CAGGCAAACAATGGAGGAT GCTAGC atcctccattgtttgcctg-3'
MELK3 MELK3_F 5'-CCGG AAAAACCCGATGTGGTGGGTA GCTAGC tacccaccacatcgggttttt TTTTTG-3'
MELK3_R 5'-AATTCAAAAA AAAAACCCGATGTGGTGGGTA GCTAGC tacccaccacatcgggttttt-3'
< 실험예 1> 본 발명의 렌티바이러스를 이용하여 MELK 발현 억제 확인
상기 MELK shRNA가 클로닝된 벡터로부터 얻은 렌티바이러스가 작동되는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 수득된 렌티바이러스를 자궁경부암 Hela 세포, 신장 암 A498 세포, 폐암 A549 세포 또는 난소암 SK-OV-3 세포에 각각 감염(infection)시켰다. 각 세포의 배지(medium)에 바이러스 수프(virus soup)의 200 ㎕를 넣었다. 다음날, 퓨로마이신(puromycin) (2 ㎍/㎖)으로 바이러스가 들어간 세포(생존세포)를 선별하기 위하여 3일 동안 배양하였다. 3일 후에 세포 용해물(cell lysate)을 모아서 전기영동 및 웨스턴블랏을 수행하였다. MELK 항체를 이용하여 MELK 단백질 발현이 억제되었는지 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 각각 15개의 렌티바이러스를 HeLa 세포에 감염시켰을 때 대조군(Gli)과 비교하여 MELK 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 기존에 MELK 억제제로 알려진 MELK1 및 MELK2에 비해서도 본 발명의 shRNA는 MELK 단백질을 현저히 억제함을 확인하였다(도 2). 또한, 5번(서열번호 6), 9번(서열번호 10), 12번(서열번호 13) 렌티바이러스를 각각의 A498 세포, A549 세포 또는 SK-OV-3 세포에 감염시켰을 때 대조군(Gli1 및 Gli2)에 비해 MELK 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 도 4는 기존 MELK shRNA(MELK1, MELK2, MELK3)을 A498 세포, A549 세포 또는 SK-OV-3 세포에 감염시켜 MELK 단백질 발현 억제 정도를 측정한 결과인데, A498 세포, A549 세포 또는 SK-OV-3 세포에서는 대조군과 비교하여 거의 차이가 없었으므로, 기존 MELK shRNA는 억제효과가 미비함을 확인하였다(도 4).
이는 기존에 알려진 MELK shRNA 보다 본 발명의 MELK shRNA 유전자가 발현 억제 효과가 우수함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 shRNA는 MELK 단백질을 현저히 억제함을 확인하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel MELK shRNA suppressing MELK expression, and use thereof <130> 14P-10-029 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2501 <212> DNA <213> MELK maternal embryonic leucine zipper kinase Homo sapiens, mRNA <400> 1 cgaaaagatt cttaggaacg ccgtaccagc cgcgtctctc aggacagcag gcccctgtcc 60 ttctgtcggg cgccgctcag ccgtgccctc cgcccctcag gttctttttc taattccaaa 120 taaacttgca agaggactat gaaagattat gatgaacttc tcaaatatta tgaattacat 180 gaaactattg ggacaggtgg ctttgcaaag gtcaaacttg cctgccatat ccttactgga 240 gagatggtag ctataaaaat catggataaa aacacactag ggagtgattt gccccggatc 300 aaaacggaga ttgaggcctt gaagaacctg agacatcagc atatatgtca actctaccat 360 gtgctagaga cagccaacaa aatattcatg gttcttgagt actgccctgg aggagagctg 420 tttgactata taatttccca ggatcgcctg tcagaagagg agacccgggt tgtcttccgt 480 cagatagtat ctgctgttgc ttatgtgcac agccagggct atgctcacag ggacctcaag 540 ccagaaaatt tgctgtttga tgaatatcat aaattaaagc tgattgactt tggtctctgt 600 gcaaaaccca agggtaacaa ggattaccat ctacagacat gctgtgggag tctggcttat 660 gcagcacctg agttaataca aggcaaatca tatcttggat cagaggcaga tgtttggagc 720 atgggcatac tgttatatgt tcttatgtgt ggatttctac catttgatga tgataatgta 780 atggctttat acaagaagat tatgagagga aaatatgatg ttcccaagtg gctctctccc 840 agtagcattc tgcttcttca acaaatgctg caggtggacc caaagaaacg gatttctatg 900 aaaaatctat tgaaccatcc ctggatcatg caagattaca actatcctgt tgagtggcaa 960 agcaagaatc cttttattca cctcgatgat gattgcgtaa cagaactttc tgtacatcac 1020 agaaacaaca ggcaaacaat ggaggattta atttcactgt ggcagtatga tcacctcacg 1080 gctacctatc ttctgcttct agccaagaag gctcggggaa aaccagttcg tttaaggctt 1140 tcttctttct cctgtggaca agccagtgct accccattca cagacatcaa gtcaaataat 1200 tggagtctgg aagatgtgac cgcaagtgat aaaaattatg tggcgggatt aatagactat 1260 gattggtgtg aagatgattt atcaacaggt gctgctactc cccgaacatc acagtttacc 1320 aagtactgga cagaatcaaa tggggtggaa tctaaatcat taactccagc cttatgcaga 1380 acacctgcaa ataaattaaa gaacaaagaa aatgtatata ctcctaagtc tgctgtaaag 1440 aatgaagagt actttatgtt tcctgagcca aagactccag ttaataagaa ccagcataag 1500 agagaaatac tcactacgcc aaatcgttac actacaccct caaaagctag aaaccagtgc 1560 ctgaaagaaa ctccaattaa aataccagta aattcaacag gaacagacaa gttaatgaca 1620 ggtgtcatta gccctgagag gcggtgccgc tcagtggaat tggatctcaa ccaagcacat 1680 atggaggaga ctccaaaaag aaagggagcc aaagtgtttg ggagccttga aagggggttg 1740 gataaggtta tcactgtgct caccaggagc aaaaggaagg gttctgccag agacgggccc 1800 agaagactaa agcttcacta taatgtgact acaactagat tagtgaatcc agatcaactg 1860 ttgaatgaaa taatgtctat tcttccaaag aagcatgttg actttgtaca aaagggttat 1920 acactgaagt gtcaaacaca gtcagatttt gggaaagtga caatgcaatt tgaattagaa 1980 gtgtgccagc ttcaaaaacc cgatgtggtg ggtatcagga ggcagcggct taagggcgat 2040 gcctgggttt acaaaagatt agtggaagac atcctatcta gctgcaaggt ataattgatg 2100 gattcttcca tcctgccgga tgagtgtggg tgtgatacag cctacataaa gactgttatg 2160 atcgctttga ttttaaagtt cattggaact accaacttgt ttctaaagag ctatcttaag 2220 accaatatct ctttgttttt aaacaaaaga tattattttg tgtatgaatc taaatcaagc 2280 ccatctgtca ttatgttact gtctttttta atcatgtggt tttgtatatt aataattgtt 2340 gactttctta gattcacttc catatgtgaa tgtaagctct taactatgtc tctttgtaat 2400 gtgtaatttc tttctgaaat aaaaccattt gtgaatataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2501 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-210 <400> 2 ggtcaaactt gcctgccata t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-2376 <400> 3 gctcttaact atgtctcttt g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> MELK shRNA-870 <400> 4 gcaggtggac ccaaagaaa 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-923 <400> 5 ggatcatgca agattacaac t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-1656 <400> 6 ggaattggat ctcaaccaag c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-1662 <400> 7 ggatctcaac caagcacata t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-2118 <400> 8 ggatgagtgt gggtgtgata c 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> MELK shRNA-723 <400> 9 gggcatactg ttatatgtt 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-2279 <400> 10 gcccatctgt cattatgtta c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-831 <400> 11 gctctctccc agtagcattc t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-2129 <400> 12 ggtgtgatac agcctacata a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> MELK shRNA-719 <400> 13 gcatgggcat actgttatat g 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> MELK shRNA-1074 <400> 14 cctcacggct acctatctt 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> MELK shRNA-1032 <400> 15 gcaaacaatg gaggattta 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> MELK shRNA-1123 <400> 16 ccagttcgtt taaggcttt 19 <210> 17 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF210 <400> 17 ccggggtcaa acttgcctgc catatgctag catatggcag gcaagtttga cctttttg 58 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR210 <400> 18 aattcaaaaa ggtcaaactt gcctgccata tgctagcata tggcaggcaa gtttgacc 58 <210> 19 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF2376UTR <400> 19 ccgggctctt aactatgtct ctttggctag ccaaagagac atagttaaga gctttttg 58 <210> 20 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR2376UTR <400> 20 aattcaaaaa gctcttaact atgtctcttt ggctagccaa agagacatag ttaagagc 58 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_F870 <400> 21 ccgggcaggt ggacccaaag aaagctagct ttctttgggt ccacctgctt tttg 54 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_R870 <400> 22 aattcaaaaa gcaggtggac ccaaagaaag ctagctttct ttgggtccac ctgc 54 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF923 <400> 23 ccggggatca tgcaagatta caactgctag cagttgtaat cttgcatgat cctttttg 58 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR923 <400> 24 aattcaaaaa ggatcatgca agattacaac tgctagcagt tgtaatcttg catgatcc 58 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF1656 <400> 25 ccggggaatt ggatctcaac caagcgctag cgcttggttg agatccaatt cctttttg 58 <210> 26 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR1656 <400> 26 aattcaaaaa ggaattggat ctcaaccaag cgctagcgct tggttgagat ccaattcc 58 <210> 27 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF1662 <400> 27 ccggggatct caaccaagca catatgctag catatgtgct tggttgagat cctttttg 58 <210> 28 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR1662 <400> 28 aattcaaaaa ggatctcaac caagcacata tgctagcata tgtgcttggt tgagatcc 58 <210> 29 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF2118UTR <400> 29 ccggggatga gtgtgggtgt gatacgctag cgtatcacac ccacactcat cctttttg 58 <210> 30 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR2118UTR <400> 30 aattcaaaaa ggatgagtgt gggtgtgata cgctagcgta tcacacccac actcatcc 58 <210> 31 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_F723 <400> 31 ccgggggcat actgttatat gttgctagca acatataaca gtatgccctt tttg 54 <210> 32 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_R723 <400> 32 aattcaaaaa gggcatactg ttatatgttg ctagcaacat ataacagtat gccc 54 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF2279UTR <400> 33 ccgggcccat ctgtcattat gttacgctag cgtaacataa tgacagatgg gctttttg 58 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR2279UTR <400> 34 aattcaaaaa gcccatctgt cattatgtta cgctagcgta acataatgac agatgggc 58 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF831 <400> 35 ccgggctctc tcccagtagc attctgctag cagaatgcta ctgggagaga gctttttg 58 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR831 <400> 36 aattcaaaaa gctctctccc agtagcattc tgctagcaga atgctactgg gagagagc 58 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF2129UTR <400> 37 ccggggtgtg atacagccta cataagctag cttatgtagg ctgtatcaca cctttttg 58 <210> 38 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR2129UTR <400> 38 aattcaaaaa ggtgtgatac agcctacata agctagctta tgtaggctgt atcacacc 58 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKF719 <400> 39 ccgggcatgg gcatactgtt atatggctag ccatataaca gtatgcccat gctttttg 58 <210> 40 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELKR719 <400> 40 aattcaaaaa gcatgggcat actgttatat ggctagccat ataacagtat gcccatgc 58 <210> 41 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_F1074 <400> 41 ccggcctcac ggctacctat cttgctagca agataggtag ccgtgaggtt tttg 54 <210> 42 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_R1074 <400> 42 aattcaaaaa cctcacggct acctatcttg ctagcaagat aggtagccgt gagg 54 <210> 43 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_F1032 <400> 43 ccgggcaaac aatggaggat ttagctagct aaatcctcca ttgtttgctt tttg 54 <210> 44 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_R1032 <400> 44 aattcaaaaa gcaaacaatg gaggatttag ctagctaaat cctccattgt ttgc 54 <210> 45 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_F1123 <400> 45 ccggccagtt cgtttaaggc tttgctagca aagccttaaa cgaactggtt tttg 54 <210> 46 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sihMELK_R1123 <400> 46 aattcaaaaa ccagttcgtt taaggctttg ctagcaaagc cttaaacgaa ctgg 54

Claims (9)

  1. 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 MELK(Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase) 발현을 억제하는 shRNA.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MELK는 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 shRNA.
  3. 제 1항의 shRNA를 포함하는 벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA(linear DNA), 플라스미드 DNA(plasmid DNA) 및 재조합 바이러스 벡터(recombinant virus vector)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제 1항의 shRNA 또는 제 3항의 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 암은 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암 (NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1항의 shRNA 또는 제 3항의 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암 (NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품.




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