KR20220124636A

KR20220124636A - Ant2 유전자 발현을 억제하는 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220124636A
Application number: KR1020220025401A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 장지영
Original assignee: (주) 바이오인프라생명과학
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2022-09-14

Abstract

본 발명은 ANT2 유전자 발현을 억제하는 벡터 및 이의 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 ANT2 유전자 발현을 억제하는 shRNA를 이용한 바이러스 벡터가 정상 세포에 감염/도입되지 않고 독성이 없는 반면, 항암제 내성 유무에 관계없이 폐암 세포주에서 ANT2 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 비바이러스 벡터에 비하여 ANT2 유전자 발현 억제 효과가 우수한 것을 확인하였는바, 폐암의 예방 및 치료에 폭 넓게 사용 가능할 것으로 기대된다.

Description

ANT2 유전자 발현을 억제하는 벡터 및 이의 용도{Vector for inhibiting the expression of Adenine nucleotide translocase 2 and use thereof}

본 발명은 ANT2 유전자 발현을 억제하는 벡터 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비정상적이고 비제어적이며 무질서한 세포증식의 산물로서, 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤성, 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor)으로 분류한다. 특히, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 유전적 질환(genetic disease)이라고 할 수 있다.

현재까지 악성종양인 암을 치료하는 방법에는 외과적인 수술, 방사선 치료, 화학요법, 유전자 치료 등이 있다. 구체적으로, 외과적 수술은 질병 조직을 대부분 제거 하는 방법으로서, 특정 부위, 예를 들면 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데는 매우 효과적이지만, 척추와 같은 부위에 있는 종양을 치료하거나 분산성 종양을 치료하기에는 부적절하다.

방사선 치료는 급성염증성 질환, 양성 또는 악성 종양, 내분비기능장애, 및 알레르기성 질환 등에 사용되며, 일반적으로는 급속히 분열하는 세포로 구성된 악성종양에 효과적으로 사용되고 있다. 다만, 정상조직의 기능 약화 또는 상실; 치료 후 치료부위에 피부질환 발생 우려; 및 장기의 발육이 진행되는 소아의 경우 지능발달 지연 또는 골 발육 장애 등 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

화학요법은 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 유방, 정소 등의 암을 치료하는데 널리 이용되고 있다. 다만, 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 중요한 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 불안감을 증가시킬 수 있다. 이처럼, 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 치료에 있어서 중요한 문제로 부각되고 있다.

또한, 유전자 치료(gene therapy)는 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜서 유전자 결함을 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여, 인체 세포의 유전적 변형으로 인한 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성질병 및 자가면역질환 등을 치료하거나 예방하는 방법이다. 구체적으로는, 치료 유전자(therapeutic gene)를 체내의 원하는 장기로 전달함으로써 세포 내에서 치료용 또는 정상 단백질이 발현 될 수 있도록 유도하여 상기 질병들을 치료하는 방법이다. 이러한 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료법에 비하여 우수한 선택성을 가질 수 있으며 다른 치료법으로 조절하기 어려운 질병의 치료를 개선함으로써 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포에 전달하여 높은 효율로 발현할 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다.

유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로써, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달하고, 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로서, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 표적 유전자 전달체로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀, 플라스미드, 및 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다. 또한, 유전자 치료의 전략 중 종양세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법 및 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다.

따라서, 본 발명자들은 암을 효과적으로 치료하기 위하여, ANT2 유전자 발현을 억제하는 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 폐암을 예방 및 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

국내 등록특허 제10-1620623호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, ANT2 유전자 발현을 억제하는 shRNA를 이용한 바이러스 벡터가 정상 폐 세포에 영향을 주지 않으면서, 항암제 내성 유무에 관계없이 폐암 세포주에서 암 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, 비바이러스 벡터보다 암 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 shRNA(short-hairpin RNA) 발현용 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암효능을 증진시키는 항암보조제로서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는, 항암보조제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 shRNA(short-hairpin RNA) 발현용 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암효능을 증진시키는 항암보조제로서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는, 항암보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 폐암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 폐암 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐암에 대한 항암제의 항암 효능을 향상 또는 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암보조제가 폐암에 대한 항암제의 항암 효능을 향상 또는 증진시키는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 폐암에 대한 항암제의 항암 효능을 향상 또는 증진시키는 약제를 생산하기 위한 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 shRNA는 ANT2(Adenine nucleotide translocase 2) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서 상기 벡터는 비바이러스 벡터 대비 ANT2 유전자의 발현 억제 효과가 증가된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 폐암은 비소세포폐암 또는 약제 내성 폐암인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 약제는 제피티닙(gefitinib)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 ANT2 유전자 발현을 억제하는 shRNA를 이용한 바이러스 벡터가 정상 세포에 감염/도입되지 않고 독성이 없는 반면, 항암제 내성 유무에 관계없이 폐암 세포주에서 ANT2 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 비바이러스 벡터에 비하여 ANT2 유전자 발현 억제 효과가 우수한 것을 확인하였는바, 폐암의 예방 및 치료에 폭 넓게 사용 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 ANT2 mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 AAV5 바이러스 벡터 감염/도입 후, 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 비바이러스 벡터 도입 후, 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 AAV5 바이러스 벡터 감염/도입 후, ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 비바이러스 벡터 도입 후, ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 정상 폐 세포주인 wi-38, 폐암 세포주인 A549, 및 제피티닙(gefitinib) 내성이 있는 폐암 세포주인 A549/GR에서 ANT2 mRNA 발현 수준을 분석하여, 정상 폐 세포주에 비하여 폐암 세포주에서 ANT2 mRNA의 증가된 발현을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 wi-38, A549, 및 A549/GR 세포주에서 AAV5 바이러스 감염도/도입도를 확인한 결과, wi-38 세포주를 제외한 폐암 세포주에 바이러스가 효과적으로 감염/도입되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 wi-38, A549, A549/GR 세포주에 높은 입자수의 AAV5 바이러스를 감염/도입해도 세포 독성을 일으키지 않는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 wi-38, A549, A549/GR 세포주에 비바이러스 벡터를 도입한 후, 세포 독성이 크게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 wi-38, A549, A549/GR 세포주에 AAV5 바이러스를 감염/도입한 후 ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석하여, 폐암 세포주에서 ANT2 mRNA 발현이 40 내지 50% 감소됨을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 wi-38, A549, A549/GR 세포주에 비바이러스 벡터를 도입한 후 ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석하여, 바이러스에 의한 ANT2 발현 억제 효과보다 현저히 낮은 억제 효과를 확인하였다(실시예 6 참조).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 shRNA(short-hairpin RNA) 발현용 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 제공한다.

본 명세서에 있어서, 상기 shRNA는 ANT2(Adenine nucleotide translocase 2) 유전자의 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 벡터는 비바이러스 벡터 대비 ANT2 유전자의 발현 억제 효과가 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “ANT2(Adenine nucleotide translocase 2)”는 산화적 인산화에서 ADP/ATP 비율을 조절하여 미토콘드리아 막 전위를 유지하는 역할을 하는 유전자이다. 상기 ANT2 유전자를 억제하면 세포자멸사를 유도하고, 종양의 성장을 억제한다. 또한, 상기 ANT2 유전자는 대부분의 암, 예를 들어 위암, 폐암, 간암, 난소암 등에서 과발현된다. 상기 ANT2는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 ANT2 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 ANT2 유전자 또는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로, 구체적으로 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상기 복합체는 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여, 이를 분해시킨다.

본 명세서에 있어서, "재조합 벡터(recombinant vector)"는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 아데노부속바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 재조합 벡터는 ANT2 mRNA를 타겟팅하는 shRNA 분자를 코딩하는 염기 서열을 포함한다. 상기 shRNA 분자를 코딩하는 염기 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서 shRNA-코딩 염기 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는(operatively linked) 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서, “작동적으로 연결되는”는 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 명세서에 있어서, shRNA를 코딩하는 염기 서열에 결합된 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하나, 구체적으로 동물세포, 더 구체적으로는 포유동물 세포에서 작동하여 shRNA-코딩 염기 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 전사체(transcript)를 전사하는 RNA polymerase III(pol III) 프로모터 중에서 선택하는 것이 좋으며, 대부분의 shRNA의 센스 사슬(sense strand)의 5' 말단은 G 또는 C 로 끝나므로 G 또는 C의 전사를 효율적으로 개시할 수 있는 프로모터를 선택하는 것이 좋다. 상기 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예를 들어, U6 프로모터, T7 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 유도성(inducible) 프로모터, 암세포 특이적 프로모터(예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터), 또는 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV)는 파르보바이러스(parvovirus)에 속하는 단일 가닥의 DNA 바이러스이다. 단독으로 복제를 할 수 없으며, 아데노바이러스나 백시니아(vaccinia), 혹은 헤르페스바이러스(herpesvirus) 등의 헬퍼(helper) 바이러스와 함께 감염되었을 때 복제, 증식할 수 있는 결함 바이러스이다. 헬퍼(helper) 바이러스가 없을 때 아데노부속 바이러스 게놈은 사람 세포의 19번 염색체의 특정 부위 내로 삽입되어 잠복 상태로 남아 있다가 헬퍼(helper) 바이러스가 감염되면 복제, 증식이 가능하게 된다. 상기 아데노부속바이러스는 분열 혹은 미분열 세포 모두 감염이 가능하다. 또한, 상기 아데노부속바이러스는 AAV5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 AAV의 조직 친화성은 세포 표면의 수용체에 의해 결정된다. AAV 서브 타입 중 AAV5(Adeno-associated virus serotype 5)는 AAV5 수용체인 PDGFR(Platelet-derived growth factor receptors)를 이용하여 세포에 도입된다. 상기 PDGFR은 PDGFR-alpha 또는 PDGFR-beta일 수 있다. 상기 PDGFR-alpha는 폐암 세포에서 발현이 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 AAV5의 세포 내 도입은 PDGFR-alpha의 발현 수준에 비례할 수 있으며, PDGFR-alpha 발현이 되지 않거나 거의 없는 세포로는 도입되지 않는다. 상기 세포는 폐암 세포일 수 있으며, 상기 AAV5의 표적 기관은 폐일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 벡터를 유효성분으로 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, “폐암(lung　cancer)”이란, 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 폐 자체에서 발생하는 원발성 폐암의 종류는 암세포의 크기와 형태를 기준으로 비소세포폐암과 소세포폐암으로 구분한다. 본 명세서에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암 또는 약제 내성 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “비소세포폐암(non　small　cell　lung　cancer; NSCLC)”은 암세포의 크기가 작지 않은 폐암을 의미한다. 폐암의 80-85%를 차지하며, 편평상피세포암, 샘암(선암), 대세포암, 샘편평세포암, 육종 모양암,　카르시노이드종양, 침샘형암, 미분류암 등을 포함한다.

본 명세서에 있어서, “약제 내성 폐암”은 약제 내성 세포가 폐의 암세포의 대부분을 차지하게 되는 경우를 의미한다. 이는 약제 내성을 가진 세포가 선별적으로 살아 남아 증식을 거듭하면서, 대부분의 암 덩어리가 약제 내성을 가지게 되면서 진행된다. 상기 약제는 제피티닙, 페메트렉시드, 시스플라틴, 또는 파클리탁셀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물 내의 상기 본 발명의 벡터의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에칠렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

상기 항암보조제는 항암제의 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 항암보조제는 항암제와 동시적 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여할 시에는 항암보조제 투입 후 항암제를 투입할 수 있고, 항암제 투입 후 항암보조제를 투입할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항암효능을 증진시킬 수 있도록 투여방식은 변경될 수 있다.

상기 항암제는 제피티닙, 페메트렉시드, 시스플라틴, 또는 파클리탁셀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 세포주

wi-38, A549, A549/GR 세포주를 사용하였다. wi-38 세포주는 인간 정상 폐 섬유아세포로서, 임신 3개월된 태아의 폐조직에서 추출한 섬유아세포로 구성된 2배체 인간 세포주이다. A549 세포주는 인간 폐암 세포주로서, 선암성 인간 폐포 기저 상피세포이다. A549/GR 세포주는 항암제인 제피니팁(gefitinib)에 대해 내성을 가지는 세포주이다. 구체적으로, A549 세포주는 제피니팁의 IC₅₀(μM, mean ± S.D.) 값이 4.4 ± 0.4이지만, A549/GR 세포주의 경우 제피니팁의 IC₅₀값이 34.3 ± 6.2로 제피니팁에 내성을 가진다.

2. pSilencer H1_ATN2 shRNA 벡터(비바이러스성 벡터) 제작

미국 국립생명공학정보센터(Nationanl Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수한 ANT2 mRNA 염기서열은 Genebank Accession No. NM_001152.4이다. 이 염기서열을 siRNA 예측 프로그램(http://www.ambion.com/technical, resources/siRNA target finder)에 대입하여 적합한 ANT2 siRNA 후보 염기서열을 확보하였고, 여러 후보 염기서열 가운데 ANT2 mRNA의 두 번째 엑손에 해당하는 염기서열인 5' GCAGAUCACUGCAGAUAAG 3'에 결합하는 siRNA를 제작하여 ANT2 siRNA에 의한 ANT2 mRNA의 감소(silencing) 효과를 세포 수준에서(in vitro) 확인하였다. 이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다.

이 결과를 토대로 shRNA를 제작하기 위하여 하기 표 1과 같은 염기서열의 올리고머 두 가닥을 합성하고, 상기 두 가닥의 올리고머를 결합(annealing) 시킨 후, pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion사)의 MCS(multi-cloning site)내 BamH I과 Hind III 부위에 클로닝하여 제작하였다. 이 때 siRNA 발현유도의 효율을 증가시키도록 TT를 첨가하였다. 또한, ANT2 shRNA의 효과를 확인하기 위해 진행한 모든 실험에는 ANT2 발현을 차단하지 못하면서, 세포 내 특정 mRNA의 발현에는 영향을 끼치지 않는 스크램블(scrambled) shRNA를 음성 대조군으로 Ambion사에서 구입하여 사용하였다.

상기 벡터로부터 발현이 되는 shRNA의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.

올리고머 1	5'GCAGATCACTGCAGATAAGTT3' 5'TTCAAGAGA3'(loop) 5'AACTTATCTGCAGTTCAGATCTGC 3'(서열번호 1)
올리고머 2	3'CGTCTAGTGACGTCTATTCAA5' 3'AAGTTCTCT3'(loop) 3'TTGAATAGACGTCAAGTCTAGACG 5'(서열번호 2)

ANT2 shRNA sense sequence	5'-GCAGAUCACUGCAGAUAAG(dTdT)-3'(서열번호 3)
ANT2 shRNA loop sequence	5'-UUCAAGAGA-3'(서열번호 4)
ANT2 shRNA anti-sense sequence	5'-CUUAUCUGCAGUGAUCUGC(dTdT)-3'(서열번호 5)

3. AAV5_ANT2 shRNA 벡터(바이러스성 벡터) 제작

ANT2 shRNA의 염기서열(고마바이오텍, 한국)을 SIRION 바이오텍(독일)에 제공하여, AAV5_ANT2 shRNA 벡터 제작 및 바이러스 파티클 생산을 진행하였다(AAV_220200346_20200806). 이후, LMO(Living Modified Organism) 수입신고를 진행하면서, 국내로 입수하였다(LMI 20-4339). 이를 통해, shRNA 서열를 포함하는 AAV5(Adeno associated virus serotype 5)_ANT2 shRNA(Adenine nucleotide translocase 2 short hairpin RNA) 벡터(pAAV-U6-shRNA-ANT2-EF1a-Neo)를 제작하였다. 상기 shRNA 서열은 상기 표 2에 나타내었다. 또한, ANT2(Adenine nucleotide translocase 2, Genbank accession number NM_001152.4) mRNA에서 벡터가 타겟으로 하는 서열은 하기 표 3에 나타내었다. 음성대조군은 AAV5_scramble shRNA 벡터(pAAV-U6-scramble-shRNA-EF1a-Neo)로 하였다.

Locus	타겟 서열(5'-3')
ANT2 Target sequence	5' GCAGAUCACUGCAGAUAAG 3'(서열번호 6)

4. 바이러스 감염도/도입도(infectivity/transduction)의 측정 방법

바이러스 감염도/도입도는 세포 내 바이러스 DNA copy 수를 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 Ct 값으로 판단하였다. 구체적으로, 세포 내 바이러스 감염 정도를 확인하기 위해 wi-38, A549, A549/GR 세포주를 1x10⁶ 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포에 바이러스를 MOI 10,000을 기준으로 최대 100배까지 처리 후, 세포에서 DNA를 추출하였다. 그 후, 바이러스의 ITR(inverted terminal repeats)과 WPRE(Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)를 증폭하는 프라이머를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하였다. 이는 독립적으로 3번 분석하여 평균 Ct 값을 구하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머		서열
ITR	정방향	5'-GGA ACC CCT AGT GAT GGA GTT-3'(서열번호 7)
ITR	역방향	5'-CGG CCT CAG TGA GCG A-3'(서열번호 8)
WPRE	정방향	5'-TTG GAT GCT CGC CTG GGT TG-3'(서열번호 9)
WPRE	역방향	5'-AGG AAG GTC CGC TGG ATC GA-3'(서열번호 10)

5. ANT2 mRNA 발현 수준 및 변화 측정 방법

세포 내 ANT2 mRNA 발현 수준 및 변화를 확인하기 위해서, 세포에서 total RNA를 분리하고 RT-qPCR kit(Promega)을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 증폭법(RT-qPCR; real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. 이후, 역전사 반응으로부터 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 ANT2의 프라이머와 SYBR mixture를 이용하여 중합효소 증폭법을 수행하였다(35cycle; 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분). 독립적인 실험을 3회 반복하여 평균값을 계산하고 동일한 양의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위해서 house keeping 유전자인 GAPDH의 발현 양으로 결과값을 보정하였다. 프라이머 서열은 하기 표 5에 나타내었다.

프라이머		서열
ANT2	정방향	5′ACG TGT CTG TGC AGG GTA TT-3′(서열번호 11)
ANT2	역방향	5′GTG TCA AAT GGA TAG GAA G-3′(서열번호 12)
GAPDH	정방향	5′CCC TTC ATT GAC CTC AAC TA-3′(서열번호 13)
GAPDH	역방향	5′ACG ATA CCA AAG TTG TCA TG-3′(서열번호 14)

6. 세포 생존율 측정 방법

세포 생존율을 측정하기 위해서, 세포의 대사 혹은 세포 내에 존재하는 효소들의 활성과 관련된 약물을 세포에 처리하였다. 그 후, 세포 독성 및 세포 수의 변화를 확인하는 CCK 8 어세이(Cell Counting Kit 8, Sigma aldrich)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 세포 생존율을 측정하였다.

[실시예]

실시예 1. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 ANT2 발현 수준 확인

ANT2(Adenine nucleotide translocase 2)는 암세포의 생존, 증식, 및 전이에 있어서 중요한 기능을 가지고 있는 유전자이다. 따라서, 본 발명자들은 정상 폐 세포주인 wi-38, 폐암 세포주인 A549, 및 제피티닙(gefitinib) 내성이 있는 폐암 세포주인 A549/GR에서 ANT2 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 정상 폐 세포주인 wi-38의 경우 ANT2 mRNA 발현이 거의 되지 않는 수준이었다(Ct 값>35). 한편, 폐암 세포주인 A549의 경우, wi-38의 10배정도로 일정 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. 제피티닙 내성이 있는 폐암 세포주인 A549/GR의 경우, A549의 3배 정도로 발현되는 것을 확인하였다.

따라서, 정상 폐 세포주에 비하여 폐암 세포주에서 ANT2 mRNA의 증가된 발현을 확인하였다.

실시예 2. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 바이러스 감염도/도입도(infectivity/transduction) 확인

세 종류의 세포주(wi-38, A549, A549/GR)의 AAV5 바이러스 감염도/도입도를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

표 6에 나타난 바와 같이, 정상 폐 세포주인 wi-38의 경우, 일반적으로 사용되는 바이러스 입자 수(1x10⁶ 세포/웰 기준, MOI 10,000)의 100배를 사용을 하여도 세포 내로 AAV5가 도입이 되지 않는 것을 확인하였다. 반면, 폐암 세포주인 A549 및 제피티닙 내성이 있는 폐암 세포주인 A549/GR은 효과적으로 바이러스가 세포 내로 도입된다는 것을 확인하였다. 또한, 일반적으로 사용되는 바이러스 입자 수의 10배, 및 100배를 사용을 하여도, 두 세포주(A549, A549/GR) 간의 바이러스 감염도/도입도는 의미 있는 차이가 없음을 확인하였다.

이는 정상 폐항암제 내성이 있는 폐암 환자를 대상으로 AAV5-ANT2 shRNA를 이용한 치료가 가능한 것을 의미한다.

세포주 wi-38	Negative control		AAV5_sc shRNA MOI=10,000		AAV5_sc shRNA MOI=100,000		AAV5_sc shRNA MOI=1,000,000
1x10^6	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE
wi-38	-	-	-	-	-	-	-	-
A549	-	-	-	-	-	-	-	-
세포주 A549	Negative control		AAV5_sc shRNA MOI=10,000		AAV5_sc shRNA MOI=100,000		AAV5_sc shRNA MOI=1,000,000
1x10^6	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE
wi-38	-	-	26~27	26~27	25~26	25~26	25~26	25~26
A549	-	-	26~27	26~27	25~26	25~26	25~26	25~26
세포주 A549/GR	Negative control		AAV5_sc shRNA MOI=10,000		AAV5_sc shRNA MOI=100,000		AAV5_sc shRNA MOI=1,000,000
1x10^6	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE	ITR	WPRE
wi-38	-	-	26~27	26~27	25~26	25~26	25~26	25~26
A549	-	-	26~27	26~27	25~26	25~26	25~26	25~26

* Ct 값이 35 이상인 것은 -로 표기함.

실시예 3. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 바이러스 벡터 감염/도입에 의한 세포 생존율 확인

세 종류의 세포주(wi-38, A549, A549/GR)에 AAV5 바이러스 벡터를 감염/도입한 후 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 일반적으로 사용되는 바이러스 입자 수의 100배까지 사용하여도, 각 세포주 모두 바이러스 벡터의 감염/도입에 의한 세포 생존율에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.

이는 정상 폐 세포주, 및 폐암 세포주에 높은 입자 수의 바이러스(AAV5)를 처리하여도 세포 독성이 유도되지 않으며 안전하다는 것을 의미한다.

실시예 4. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 비바이러스 벡터 도입에 의한 세포 생존율 확인

세 종류의 세포주(wi-38, A549, A549/GR)에 비바이러스 벡터를 도입한 후, 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 비바이러스 벡터 도입을 위해 일반적으로 사용되는 시약(1x10⁶ 세포/웰 기준, 비바이러스 벡터 1μg, Lipofectamin2000 5ul)을 사용한 후, 세포 독성을 확인하였다. 또한, 비바이러스벡터 도입율을 증가시키기 위해서 시약의 사용량을 2배, 및 4배로 사용할 경우, 세포 독성이 크게 유도됨을 확인하였다.

실시예 5. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 바이러스 벡터에 의한 ANT2 발현 억제 효과 확인

세 종류의 세포주(wi-38, A549, A549/GR)에 AAV5 바이러스 벡터를 감염/도입한 후, ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 정상 폐 세포주인 wi-38은 ANT2 mRNA를 거의 발현하지 않았으며, 발현 억제효과 또한 확인할 수 없었다. 반면에, 폐암 세포주인 A549 및 A549/GR에 AAV5_ANT2 shRNA를 감염/도입한 후, ANT2 mRNA 발현이 40 내지 50% 감소됨을 확인하였다.

이는 본 발명의 shRNA를 포함하는 바이러스 벡터는 폐암의 예방 및 치료 효과가 우수하다는 것을 의미한다.

실시예 6. 정상 폐 세포주와 폐암 세포주의 비바이러스 벡터 도입에 의한 ANT2 발현 억제 효과 확인

세 종류의 세포주(wi-38, A549, A549/GR)에 비바이러스 벡터를 도입한 후, ANT2 mRNA 발현 억제 수준을 분석하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 정상 폐 세포주인 wi-38은 ANT2 mRNA를 거의 발현하지 않았으며, 발현 억제 효과 또한 관찰할 수 없었다. 반면에, 폐암 세포주인 A549와 A549/GR에 pSilencer H1_ANT2 shRNA를 도입한 후 ANT2 mRNA 발현이 30% 정도 감소됨을 확인하였다.

즉, 바이러스에 의한 ANT2 발현 억제 효과보다는 현저히 낮은 억제 효과를 확인하였다. 또한, 비바이러스벡터 도입율을 증가시키기 위해서 시약(reagent) 사용량을 2배, 4배로 늘리는 경우, ANT2 발현 억제 효과가 증가하지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 shRNA를 이용한 바이러스 벡터가 정상 세포에 감염/도입되지 않고 독성이 없는 반면, 항암제 내성 유무에 관계없이 폐암 세포주에서 ANT2 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 비바이러스 벡터에 비하여 ANT2 유전자 발현 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다. 이를 통하여 본 발명의 shRNA 또는 벡터를 폐암의 예방 또는 치료용 조성물로 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioInfra Life Science Inc <120> Vector for inhibiting the expression of Adenine nucleotide translocase 2 and use thereof <130> MP21-047P1 <150> KR 10-2021-0027848 <151> 2021-03-03 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer 1 <400> 1 gcagatcact gcagataagt tttcaagaga aacttatctg cagttcagat ctgc 54 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer 2 <400> 2 gcagatctga actgcagata agtttctctt gaaaacttat ctgcagtgat ctgc 54 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2 shRNA sense sequence <400> 3 gcagaucacu gcagauaag 19 <210> 4 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2 shRNA loop sequence <400> 4 uucaagaga 9 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2 shRNA anti-sense sequence <400> 5 cuuaucugca gugaucugc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2 target sequence <400> 6 gcagaucacu gcagauaag 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR_F <400> 7 ggaaccccta gtgatggagt t 21 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR_R <400> 8 cggcctcagt gagcga 16 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE_F <400> 9 ttggatgctc gcctgggttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE_R <400> 10 aggaaggtcc gctggatcga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2_F <400> 11 acgtgtctgt gcagggtatt 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANT2_R <400> 12 gtgtcaaatg gataggaag 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 13 cccttcattg acctcaacta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 14 acgataccaa agttgtcatg 20

Claims

서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 shRNA(short-hairpin RNA) 발현용 재조합 아데노부속바이러스 벡터.
제1항에 있어서,
상기 shRNA는 ANT2(Adenine nucleotide translocase 2) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
제1항에 있어서,
상기 벡터는 비바이러스 벡터 대비 ANT2 유전자의 발현 억제 효과가 증가된 것을 특징으로 하는, 벡터.
제1항의 벡터를 유효성분으로 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 약제 내성 폐암인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 약제는 제피티닙(gefitinib)인 것을 특징으로 하는, 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암효능을 증진시키는 항암보조제로서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
제7항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 약제 내성 폐암인 것을 특징으로 하는, 항암보조제.