WO2022191661A1 - C-met 유전자 및 pd-l1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 - Google Patents

C-met 유전자 및 pd-l1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 Download PDF

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Definitions

  • FIG. 3 is a diagram confirming the effect of inhibiting the expression of c-MET and PD-L1 genes by a double-target siRNA (double strand) set capable of simultaneously inhibiting c-MET and PD-L1 of the present invention in various cancer cell lines.
  • FIG. 5 is a diagram confirming the effect of inhibiting the expression of c-MET and PD-L1 genes by the recombinant adenovirus CA104 of the present invention including the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette.
  • the term “repression of expression” means to cause a decrease in expression (to mRNA) or translation (to protein) of a target gene, and preferably, the expression of the target gene becomes undetectable or insignificant. means to exist as
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA refers to a short double-stranded RNA capable of inducing an RNA interference (RNAi) phenomenon through cleavage of a specific mRNA.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto.
  • the hTERT promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the composition may further include an anticancer agent.

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Abstract

본 발명은 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것으로, 센스 가닥은 PD-L1 유전자의 발현을 억제하고 안티센스 가닥은 c-MET 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 본 발명의 이중 표적 핵산 분자는 실제로 다양한 암세포에 siRNA 또는 shRNA로 적용했을 때 모두 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제하였으며, 이를 shRNA로 바이러스에 적용하였을 때도 두 유전자 발현을 모두 현저히 억제하였으므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있고, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어난 효과가 있다.

Description

C-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산
본 발명은 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국(US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 billion을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 billion 정도의 market size를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다 (암 정복의 현주소 Biowave 2004. 6(19)). 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들은 약제 내성이 생기지 않는다는 보고도 있다.
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 RNAi라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi는 21-25개의 뉴클레오타이드 크기의 이중나선 구조를 가진 작은 간섭 리보핵산 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)이 상보적인 서열을 가지는 전사체(mRNA transcript)에 특이적으로 결합하여 해당 전사체를 분해함으로써 특정 단백질의 발현을 억제하는 현상이다. 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 표적 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 표적 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 표적 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). siRNA를 포함하는 RNAi 기술 기반 치료제 시장은 향후 세계 시장규모가 2020년경에 총 12조원 이상을 형성하는 것으로 분석되었으며, 해당 기술을 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대되어 기존의 항체, 화합물 기반 의약품으로 치료하기 어려운 질병을 치료할 수 있는 차세대 유전자 치료기술로 평가되고 있다. 또한 siRNA의 작용 기작은 표적 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 표적 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). 이에, 최근 이 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 화학 합성 의약 개발에서 발생되는 문제의 해결책을 제시하면서 전사체 수준에서 특정 단백질의 발현을 선택적으로 억제하여 각종 질병 치료제, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 진행되고 있다. 또한, siRNA 치료제는 기존 항암제와 달리 표적이 명확하여 부작용이 예측 가능하다는 장점이 있으나, 이러한 표적 특이성은 다양한 유전자의 문제에 의해 발생하는 질병인 종양의 경우, 오히려 이러한 표적 특이성은 치료 효과가 높지 않은 원인이 되기도 한다.
본 발명의 목적은 이중 표적 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 도입한 바이러스를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자를 동시에 억제하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 도입한 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 이를 도입한 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 이를 발현하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 벡터가 도입된 바이러스의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 이를 발현하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 벡터가 도입된 바이러스의 암의 치료 방법을 제공한다.
센스 가닥은 PD-L1 유전자의 발현을 억제하고 안티센스 가닥은 c-MET 유전자의 발현을 억제하도록 설계된 본 발명의 이중 표적 핵산 분자는 실제로 다양한 암세포에 siRNA 또는 shRNA로 적용했을 때 모두 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제하였으며, 이를 shRNA로 바이러스에 적용하였을 때도 두 유전자 발현을 모두 현저히 억제하였으므로, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있고, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트를 포함하는 shRNA를 세포 내에서 발현하기 위한 벡터의 맵을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 아데노바이러스 벡터 CA104의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 c-MET 및 PD-L1을 동시에 억제할 수 있는 이중 표적 siRNA(double strand) 세트에 의한 c-MET 및 PD-L1 유전자의 발현 억제 효과를 다양한 암세포주에서 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 이중 표적 shRNA의 c-MET 및 PD-L1 유전자 발현 발현 억제 효과를 확인한 도이다.
도 5는 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA104에 의한 c-MET 및 PD-L1 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 이중 표적 shRNA를 발현하는 아데노바이러스의 암세포 사멸 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 방향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 유전자 및 c-MET(Homo sapiens MET proto-oncogene) 유전자의 발현을 동시에 억제하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 c-MET 유전자를 억제하는 염기서열과 PD-L1을 억제하는 염기서열은 부분적으로 상보적 결합을 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 c-MET 유전자 발현을 억제할 수 있고, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 PD-L1 유전자 발현을 억제할 수 있어, 본 발명의 핵산 분자는 c-MET 유전자와 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA(small interfering RNA) 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA가 부분적으로 상보적 결합을 이루고 있는 이중 가닥(double strand) siRNA일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 siRNA (c-MET 유전자에 대한 안티센스 가닥) 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 siRNA (PD-L1 유전자에 대한 안티센스 가닥)가 19mer 중 15mer가 상보적으로 결합되어 이중 가닥의 siRNA를 이루도록 제작하였고, 이중 가닥의 siRNA가 각각 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자를 표적화하여 두 유전자의 발현을 동시에 억제함을 확인함으로써 이중 표적 siRNA 세트임을 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있으며, 상기 shRNA는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 shRNA는 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열이 부분적으로 상보적 결합하고 루프 영역에 의해 회문적으로 연결되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 본원발명의 일 실시예에서는 헤어핀 구조의 루프 부분 염기서열 (서열번호 15 또는 서열번호 16)에 따라 TTCAAGAGAG loop shRNA (서열번호 3) 또는 TTGGATCCAA loop shRNA (서열번호 4)로 기재하였다.
본 발명에서 c-MET 및 PD-L1을 표적으로 하는 siRNA는 인간(Homo sapiens)의 c-MET 유전자 또는 PD-L1 유전자의 일부와 상보적인 서열을 가지고, c-MET 유전자 또는 PD-L1 유전자의 mRNA를 분해하거나, 번역을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “siRNA(small interfering RNA)”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 일반적으로 siRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되나, 본 발명의 이중 가닥 siRNA는 센스 RNA 가닥이 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 siRNA (c-MET 유전자에 대한 안티센스 가닥)이고, 안티센스 RNA 가닥이 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 siRNA (PD-L1 유전자에 대한 안티센스 가닥)이므로, 이중 가닥의 siRNA가 각각 동시에 c-MET 유전자 및 PD-L1 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, 단일가닥 RNA에서 부분적으로 회문상의 염기서열을 포함함으로써, 3´영역에 이중가닥 구조를 가지고 헤어핀과 같은 구조를 형성하고, 세포내에서 발현된 후에 세포내에 존재하는 RNase의 일종인 dicer에 의하여 절단되어 siRNA로 변환될 수 있는 RNA를 의미하는데, 상기 이중가닥 구조의 길이는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 10 뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 20 뉴클레오티드 이상이다. 본 발명에 있어서, 상기 shRNA는 발현 카세트에 포함될 수 있으며, 상기 shRNA는 각 유전자에 대한 siRNA 안티센스 가닥 및 센스 가닥으로 이루어진 세트 서열에서 U를 T로 변환한 뒤, 센스 가닥의 3'에 TTGGATCCAA (TTGGATCCAA 루프) 또는 TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG 루프), 안티센스 가닥 및 TT를 순차적으로 연결하여 shRNA를 코딩하는 발현 카세트를 제작하고 이를 세포 내에서 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 이 경우에 발현 카세트는 서열번호 1 및 2의 염기서열에서 U가 T로 변환된 핵산을 포함할 수 있다. 상기에서, 서열번호 1 및 2로 이루어진 19mer의 siRNA 세트는 15mer가 서로 상보적이다. 서열번호 1의 siRNA (Antisense c-MET)가 c-MET의 mRNA에 상보적으로 결합하며, 서열번호 2의 siRNA (Antisense PD-L1)가 PD-L1의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 shRNA를 포함하는 발현 카세트는 서열번호 3 또는 4의 RNA 서열을 DNA 서열로 변환한 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 DNA 서열은 서열번호 5 또는 6을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, PD-L1을 표적으로 하는 염기서열은 c-MET을 표적으로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있고, c-MET을 표적으로 하는 염기서열은 PD-L1을 표적으로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, PD-L1을 표적으로 하는 염기 서열은 c-MET을 표적으로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있고, c-MET을 표적으로 하는 염기 서열은 PD-L1을 표적으로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
PD-L1을 표적으로하는 염기 서열 또는 c-MET을 표적으로 하는 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 발현 카세트는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 염기 서열 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 핵산 분자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 핵산 분자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 발현하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 shRNA 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 shRNA을 암호화하는 염기서열 (DNA 서열)을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있으며, 일 실시예에서는 pE3.1 벡터를 이용하였다.
본 발명에서 c-MET 및 PD-L1에 대한 siRNA를 전달하기에 유용한 비바이러스 벡터로는 통상적으로 유전자 요법에 사용되는 모든 벡터를 포함하며, 예를 들어 진핵세포에서 발현 가능한 다양한 플라스미드 및 리포좀 등이 있다.
본 발명에서 c-MET 및 PD-L1을 표적으로 하는 이중 가닥 siRNA가 전달된 세포에서 적절히 전사되게 하기 위해서는 이를 포함하는 shRNA, 특히, 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 shRNA를 암호화하는 염기서열이 적어도 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하나, 서열번호 7로 기재한 U6 프로모터가 보다 바람직하다. c-MET 및 PD-L1을 표적으로 하는 이중 가닥 siRNA 또는 shRNA의 효율적인 전사를 위하여 필요에 따라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서, 업스트림 활성화 서열, 신호펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 비롯한 조절서열을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에서 c-MET 및 PD-L1에 대한 siRNA 또는 shRNA를 전달하기에 유용한 바이러스 또는 바이러스 벡터로는 바쿨로비리디애(baculoviridiae), 파르보비리디애(parvoviridiae), 피코르노비리디애(picornoviridiae), 헤레페스비리디애(herepesviridiae), 폭스비리디애(poxviridiae), 아데노비리디애(adenoviridiae) 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 바이러스에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 바이러스는 인간 텔로미어 프로모터(hTERT); 및 PD-L1을 표적으로 하는 염기 서열 및 c-MET을 표적으로 하는 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 항종양 아데노 바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 바이러스는 아데노바이러스로서, 상기 아데노바이러스는 hTERT 프로모터와 작동가능하게 연결된 E1A 및 E1B; 및 E3 부위에 서열번호 1 및 서열번호 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 아데노바이러스로서, 상기 염기서열이 발현하는 경우, 서열번호 1 및 서열번호 2가 부분적으로 상보적 결합을 하여 헤어핀 구조를 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 인간 텔로미어 프로모터는 아데노 바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
일 구현예에서, hTERT 프로모터는 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 아데노 바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며; 상기 C1은 E1A (서열번호 9), E1B (서열번호 11) 또는 E1A-E1를 포함하고; 상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; 상기 C3는 E3를 포함하지 않거나 E3를 포함하고; 상기 C4는 L5를 포함하며; 및 상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함할 수 있고, 서열번호 12의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 발현 카세트가 아데노 바이러스의 내재적 유전자의 C3 부위에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, hTERT 프로모터가 아데노 바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 아데노 바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열 (서열번호 10)이 추가로 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 재조합 발현 벡터 또는 본 발명의 바이러스를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항암제는 다코미티닙(dacomitinib), 오시머티닙(osimertinib), 세툭시맙(cetuximab), 파이로티닙(Pyrotinib), 엘코티닙(Lcotinib), 파니투무맙(panitumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 니모투주맙(Nimotuzumab), 마투주맙(matuzumab), 제피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(neratinib), 반데타닙(vandetanib), 네시투무맙(necitumumab), 아파티닙(afatinib), 택솔(Taxol), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine) 및 에토포사이드(Etoposide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 교모세포종, 전립선암, 흑색종 및 비소세포폐암인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본원발명의 핵산을 포함하는 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 이를 발현하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 벡터가 도입된 바이러스의 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 이를 발현하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 벡터가 도입된 바이러스를 이용한 암의 치료 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. c-MET 및 PD-L1 이중 표적 siRNA 제작
c-MET(Homo sapiens MET proto-oncogene) 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1)을 동시에 억제할 수 있는 이중 표적 siRNA(double strand) 세트를 하기 표 1의 서열로 제작하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea). 구체적으로, 서열번호 1 및 2로 이루어진 19mer의 siRNA 세트 1은 15mer가 서로 상보적이며, 하기 표 1의 서열번호 1의 siRNA (Antisense c-MET)가 c-MET의 mRNA에 상보적으로 결합하며, 서열번호 2의 siRNA (Antisense PD-L1)가 PD-L1의 mRNA에 상보적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 siRNA 세트는 c-MET 및 PD-L1 유전자의 발현을 동시에 감소시킨다.
siRNA Sequence(sense)
5'-3' 		서열번호 siRNA Sequence(antisense)
5'-3' 		서열번호 length
(mer) 		상보적 결합 길이
(mer)
c-MET ACCACACAUCUGACUUGGU 1 PD-L1 ACCAAUUCAGCUGUAUGGU 2 19 15
실시예 2. c-MET 및 PD-L1 이중 표적 shRNA 발현 카세트 제작
상기 실시예에서 제작한 siRNA를 세포 내에서 발현할 수 있게 하기 위하여, 이중 표적 siRNA (서열번호 1 및 2) siRNA 이중 가닥의 서열과 루프 서열을 포함하는 shRNA 발현 카세트들 (TTGGATCCAA 루프 shRNA 및 TTCAAGAGAG 루프 shRNA)를 제작하였다. 구체적으로, 5'에서 3' 방향으로 상기 표 1의 siRNA 세트 (서열번호 1 및 2)의 센스 가닥의 3'에 TTGGATCCAA (TTGGATCCAA 루프) 또는 TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG 루프), 안티센스 가닥 및 TT를 연결하여 shRNA를 코딩하는 DNA 서열을 제작하여 표 2에 표시하였다 (siRNA는 대문자로 추가 서열은 소문자로 표시). 제작한 shRNA 발현 카세트들을 각각 pE3.1 벡터 (도 1)의 제한효소 PstⅠ 및 EcoRⅤ 절단 위치에 U6 프로모터 (서열번호 7) 이후에 오도록 배치하여, c-MET 및 PD-L1을 표적으로 하는 이중 표적 siRNA를 포함하는 두 종의 shRNA를 세포 내에서 발현하는 재조합 발현 벡터 (shPDL1&c-MET)를 제작하였다.
서열 (5'→3') 서열번호
antisense c-MET ACCACACAUCUGACUUGGU 1
antisense PD-L1 ACCAAUUCAGCUGUAUGGU 2
TTGGATCCAA loop shRNA ACCACACAUCUGACUUGGUuuggauccaaACCAAUUCAGCUGUAUGGUuu 3
TTCAAGAGAG loop shRNA ACCACACAUCUGACUUGGUuucaagagagACCAAUUCAGCUGUAUGGUuu 4
실시예 3. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스 제작
hTERT 프로모터 (서열번호 8)-E1A (서열번호 9)-IRES (서열번호 10)-E1B 서열 (서열번호 11) (전체 서열: 서열번호 12)을 아데노바이러스 벡터의 SpeⅠ과 ScaⅠ사이에 삽입한 후, U6 프로모터와 상기 실시예에서 제작한 c-MET 및 PD-L1 이중 표적 shRNA 코딩 서열 (서열번호 13 또는 14)을 각각 E3 영역(region)에 SpeⅠ사이에 삽입함으로써 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA를 발현하고, 감염성이 있는 재조합 아데노바이러스를 제작하였다 (c-MET 및 PD-L1 이중 표적 shRNA 코딩 (발현) 아데노바이러스: CA104) (도 2 참조). 아울러, 대조군으로 hTERT만 삽입한 재조합 아데노바이러스도 제작하였다 (CA10G). 그 후, 제작된 아데노바이러스 벡터의 서열을 분석하여, 이상이 없을 경우 PacⅠ제한효소를 이용하여 바이러스 유전체를 선형화하여 293A 세포에 CaCl2 법을 이용하여 형질도입하여 각 바이러스를 생산하였다.
실시예 4. 이중 표적 siRNA의 유전자 발현 억제 효과 확인
12웰 플레이트에 교모세포종 세포주 U-87, 전립선암 세포주 CWR22Rv-1(22Rv-1), 흑색종 세포주 A431 및 비소세포폐암 세포주 HCC827을 각각 분주한 뒤, 세포 밀도가 50%가 될 때까지 10% FBS (Hyclone 사)가 첨가된 RPMI 배지 (Hyclone 사)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 그 후, 상기 세포가 배양된 웰에 상기 실시예 1에서 제작한 이중 표적 siRNA 세트를 웰당 80 pmole씩 3㎕의 리포펙타민(lipofectamine)3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 트랜스펙션하여 c-MET 및 PD-L1을 동시에 낙다운하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 각각 파쇄하여 GeneJET RNA Purification Kit (Invitrogen)로 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR 반응을 통해 cDNA로 역전사 한 뒤, q-PCR 반응을 통해 각각의 siRNA와 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트에 의한 c-MET 및 PD-L1의 mRNA 발현량을 확인하였다. mRNA 발현량을 확인하기 위해, PD-L1 또는 c-MET에 대한 프라이머 세트와 반응 혼합물[10X reaction Buffer 2 ㎕, HQ Buffer 2 ㎕, dNTP 1.6㎕, Primer(F, R, 10 pmole/ul) 각각 1㎕, Template(500 ng) 2㎕, Taq 0.2㎕, DW 10.2㎕, Total vol. 20㎕]을 이용하였다. PCR 조건으로 [95℃에서 2분, 95℃에서 20초로 30 사이클, 60℃에서 10초 및 72℃에서 30-60초, 72℃에서 5분] 낙다운한 세포 파쇄물에서의 c-MET 및 PD-L1의 mRNA를 cDNA로 변환하였다. 또한, 역전사된 cDNA를 주형으로 이용하여, 반응 혼합물을 [Template(RT-PCR product) 6㎕, Taqman probe 3㎕, 10X reaction Buffer 6㎕, HQ Buffer 6㎕, dNTP 4.8㎕, Taq 0.6㎕, DW 10.2㎕, Total vol.60㎕] 준비하고 QS3 장비를 이용하여 qPCR을 수행하였다[95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 로60℃에서 1분당 40사이클]. 모든 반응은 3회씩 반복수행되고 이들의 평균값이 취해졌다. 이렇게 얻은 결과들은 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 mRNA 값에 대해 정규화하였다.
그 결과, U-87 세포주, 22Rv-1 세포주, A431 세포주 및 HCC827 세포주 모두에서 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트에 의해 c-MET 및 PD-L1의 발현이 모두 감소하는 것으로 나타났다 (도 3a 내지 d). 이를 통해, 본 발명의 이중 표적 siRNA가 두 유전자의 발현을 동시에 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 이중 표적 shRNA의 유전자 발현 억제 확인
상기 실시예 2에서 제작한 이중 표적 shRNA의 표적 유전자 c-MET 및 PD-L1에 대한 발현 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, HeLa 세포주 (2X105/well)를 6 웰 플레이트에 분주한 뒤 음성대조군 플라스미드 (pAd1129-shNC) 및 실험군 플라스미드 CA104-shRNA (shPDL1&c-MET) 2 ug를 각각 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)으로 트랜스펙션하여 72시간 동안 인큐베이션하였다. 3일 후, Trizol(Thermo)을 이용하여 세포에서 RNA를 추출하고 Nanodrip을 이용하여 정량하고 순도를 확인하였다. 상기 RNA 400 ng과 DW를 RT 프리믹스 (Intron) 튜브에 넣어 20 ul가 되게 만든 후 PCR 장비를 이용하여 45 ℃에서 1 시간 및 95 ℃에서 5 분 동안 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA 2 ul, 표 3의 양방향 프라이머 5 pmole, 2X SYBR green master mix(Bioline) 10 ul 및 DW를 혼합하여 20 ul가 되도록 혼합물(mixture)을 만들고 PCR 반응을 수행하였다. 반응 조건은 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 2분, 95 ℃에서 5초 및 60 ℃에서 30초로 40 사이클로 수행하였다.
Figure PCTKR2022003454-appb-img-000001
그 결과, 본 발명의 이중 표적 shRNA (shPDL1&c-MET)를 트랜스펙션한 세포에서 PD-L1과 cMET의 발현이 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (도 4).
실시예 6. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스의 유전자 발현 억제 확인
상기 실시예 3에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA104의 표적 유전자 c-MET 및 PD-L1에 대한 발현 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, A431 세포주 (1X105/well)를 12 웰 플레이트에 분주한 뒤 1시간 후에 CA10G 및 CA104을 각각의 웰에 2 또는 5 MOI가 되도록 처리하고 72시간 뒤에 RNA prep kit (Takara, 9767A)를 이용하여 RNA prep을 수행하였다. 그 후, Nanodirp을 이용하여 RNA 정량하고 RT 프리믹스 (intron, 25081)를 이용하여 튜브 당 400 ng/20 ul를 넣고 프리믹스(premix) 내용물과 잘 섞어 준 뒤 PCR 기기를 이용하여 45℃에서 1hr 및 95℃에서 5 분간 반응시켜 cDNA을 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ul를 주형으로 이용하여 실험군에 해당하는 PCR 혼합물 (총 부피, 20 ul)을 만들었다 (주형 2 ul, 정방향 프라이머 0.5 ul (10 pmole/ul), 역방향 프라이머 0.5 ul (10 pmole/ul), 10 ul 2X master mix(Bioline, BIO-94005) 및 7 ul DW). 만든 PCR 혼합물을 볼텍싱하여 잘 섞고 원심분리한 후 qPCR 기기 (Applied Biosystems, QS3)에서 95℃에서 5분, 95℃에서 10초 및 60℃에서 30초를 40사이클 반응시켰다. 결과는 qPCR 기기에 있는 프로그램을 이용하여 분석하였다.
그 결과, A431 세포에서, hTERT 프로모터와 c-MET 및 PD-L1 이중 표적 shRNA를 코딩 및 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA104는 hTERT 프로모터만 포함하는 재조합 아데노바이러스 CA10G에 비해 현저하게 c-MET 및 PD-L1 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났다 (도 5).
실시예 7. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스의 암세포 사멸 효과 확인
상기 실시예 3에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA104의 암세포 사멸 효과를 확인하였다. 구체적으로, Hela 세포주를 96웰 플레이트에 5×103 cells/well로 분주한 뒤, CA10G 및 CA104를 각각 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 및 200 MOI로 처리하여 감염시켰다. 감염 72 시간 후, 세포 사진을 형광현미경을 이용하여 촬영하고 XTT 용액 (roche)을 well 당 50 ul 씩 처리하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 2 시간 후 450 nm 파장의 흡광도를 측정하여 얻은 OD값을 이용하여 0 MOI 대비 바이러스 처리군의 세포 생존률(%)을 계산하여 그래프로 변환하였다.
그 결과, 2 MOI 처리군 및 5 MOI 처리군에서 CA10G 대비 CA104의 암세포 사멸 효과가 현저히 큰 것으로 나타났다 (도 6).

Claims (16)

  1. c-MET(Homo sapiens MET proto-oncogene) 유전자 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 유전자를 동시에 억제하는 핵산 분자로서, c-MET 유전자를 억제하는 염기서열과 PD-L1을 억제하는 염기서열은 부분적으로 상보적 결합을 이루는 것인, 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는, 핵산 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 c-MET 유전자 발현을 억제하는, 핵산 분자.
  4. 제 2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 핵산 분자는 RNA 간섭에 의해 PD-L1 유전자 발현을 억제하는, 핵산 분자.
  5. 제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 siRNA(small interfering RNA) 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 siRNA가 부분적으로 상보적 결합을 이루고 있는 이중 가닥(double strand) siRNA인, 핵산 분자.
  6. 제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열이 부분적으로 상보적 결합하여 헤어핀 구조를 이루는, 핵산 분자.
  7. 제 2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 shRNA(short hairpin RNA)인, 핵산 분자.
  8. 제 7항에 있어서, shRNA는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는, 핵산 분자.
  9. 제 1항의 핵산 분자를 포함하는 발현하는 재조합 발현 벡터.
  10. 제 9항의 재조합 발현 벡터를 도입한 바이러스.
  11. 제 10항에 있어서 상기 바이러스는 아데노바이러스로서, 상기 아데노바이러스는 hTERT 프로모터와 작동가능하게 연결된 E1A 및 E1B; 및 E3 부위에 서열번호 1 및 서열번호 2를 코딩하는 염기서열을 포함하는 아데노바이러스로서, 상기 염기서열이 발현하는 경우, 서열번호 1 및 서열번호 2가 부분적으로 상보적 결합을 하여 헤어핀 구조를 이루는 것인, 아데노바이러스.
  12. 제 1항의 핵산 분자, 제 9항의 재조합 발현 벡터 또는 제 10항의 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 항암제를 추가로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 항암제는 다코미티닙(dacomitinib), 오시머티닙(osimertinib), 세툭시맙(cetuximab), 파이로티닙(Pyrotinib), 엘코티닙(Lcotinib), 파니투무맙(panitumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 니모투주맙(Nimotuzumab), 마투주맙(matuzumab), 제피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(neratinib), 반데타닙(vandetanib), 네시투무맙(necitumumab), 아파티닙(afatinib), 택솔(Taxol), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide), 젬시타빈(gemcitabine) 및 에토포사이드(Etoposide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  15. 제 1항의 핵산 분자, 제 9항의 재조합 발현 벡터 또는 제 10항의 바이러스의 암의 예방 또는 치료 용도.
  16. 제 1항의 핵산 분자, 제 9항의 재조합 발현 벡터 또는 제 10항의 바이러스를 이용한 암의 치료 방법.
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