CN110988352A - 辅助检测胎盘植入的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明将能够检测细胞因子浓度的试剂应用于制备用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其中所述细胞因子包括MMP‑1、MMP‑3、MMP‑9、EGF、VEGF‑A、IGFBP‑1和tPA中的至少1种，用于联合分析计算风险值，其对于胎盘植入的孕妇和正常分娩孕妇具有区分性能，从而提供了一种方便、快捷、精准的辅助分析手段。

Description

辅助检测胎盘植入的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种辅助检测胎盘植入的试剂 盒及其应用。
背景技术
胎盘植入是指胎盘的绒毛侵入部分子宫肌层，胎盘绒毛错综分散植入子宫 肌壁内的一种疾病，是产科少见但是危重的一种并发症，可以导致患者大出血、 休克、子宫穿孔和感染，甚至死亡。胎盘植入近年来报道在全球孕产妇中的发 生率为0.01％到1.1％，其中前置胎盘合并胎盘植入发生率高、临床出血量大、 死亡率高，称之为凶险性胎盘植入，所导致的孕产妇死亡占到孕产妇死亡数的 7％左右。
目前认为，高龄妊娠、剖宫产、多产史、流产史等均是胎盘植入的高危因 素。随着社会的发展与进步，晚婚晚育的妇女逐渐增加。同时随着我国全面二 胎生育政策的放开，高龄孕产妇以及疤痕子宫再生育率显著增加，导致近来我 国孕产妇中胎盘植入的发生率快速升高，造成产后出血等严重妊娠不良结局和 孕产妇死亡风险急剧增加。我国每年孕产妇人数约在1500万左右，胎盘植入的 发生率报道在0.26％到0.80％之间，据此统计发生胎盘植入的孕产妇总数居全 球前列，为控制我国孕产妇死亡率带来了很大威胁。
根据目前重症孕产妇救治指南，妊娠并发胎盘植入的孕产妇应立即转院到 区域医疗中心，以得到充分的监控和及时的抢救。但是，目前临床上缺乏简便 有效的分娩前胎盘植入辅助检测技术，由此引起的处理延迟是导致其严重不良 妊娠结局的关键原因之一。由于胎盘植入在产前缺乏典型的临床表现、体征及 实验室指标，产前诊断困难，最终需要对分娩后的胎盘组织病理染色分析，或 者计算机X射线断层扫描(CT)宫腔内残留胎盘组织来进行该类疾病的确诊。
影像学诊断是目前临床医师在产前能够诊断胎盘植入的重要手段之一。在 临床上可以采用孕晚期孕妇胎盘植入高危因素，结合产前的B超、磁共振成像 诊断，发现子宫肌层分界不清，有侵入性影像学改变时，可以辅助胎盘植入诊 断。但是，此类影像学诊断成本昂贵，对操作人员的技术水平要求较高，而且 具有一定局限性。例如产前超声不能明确胎盘组织植入的深度，而且对于植入 部位较低和子宫后壁的胎盘植入病例假阴性较高；同时造影剂不能在孕妇身上 使用，限制了临床MRI的应用。
胎盘植入的产前血清学检测方法正在进一步的研发中。有报道发现血清甲 胎蛋白(AFP)与胎盘植入有相关性，但是其特异性不高，尚未开发成临床可以 应用的检测试剂盒。目前并没有可供临床应用的、特异性和准确性较高的采用 母体血清中生物标记物辅助检测胎盘植入的检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种检测细胞因子浓度的试剂在制备用于 辅助检测胎盘植入的试剂盒中的应用以及辅助检测胎盘植入的试剂盒，以提高 采用母体血清中生物标记物辅助检测胎盘植入的特异性和准确性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
检测细胞因子浓度的试剂在制备用于辅助检测胎盘植入的试剂盒中的应用， 所述检测细胞因子浓度的试剂包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、 VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的任意1种细胞因子浓度的试剂。
在其中一个实施例中，所述检测细胞因子浓度的试剂包括用于检测MMP-1、 MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的至少3种细胞因子浓度 的试剂。
在其中一个实施例中，所述检测细胞因子浓度的试剂包括检测MMP-1浓度 的试剂、检测EGF浓度的试剂和检测VEGF-A浓度的试剂。
在其中一个实施例中，所述检测细胞因子浓度的试剂包括检测MMP-1浓度 的试剂、检测EGF浓度的试剂、检测VEGF-A浓度的试剂和检测tPA浓度的试 剂。
在其中一个实施例中，所述检测细胞因子浓度的试剂选自免疫组织化学检 测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂和酶联免疫检测试剂中的一种 或多种。
在其中一个实施例中，所述试剂盒用于辅助检测胎盘植入的方法包括以下 步骤：
(1)采用所述试剂盒检测待测样本中的细胞因子的浓度；
(2)计算待测样本中细胞因子浓度与对应的细胞因子的正常浓度的比值；
(3)通过步骤(2)所述的比值计算待测样本的胎盘植入的风险指数；
(4)比较所述风险指数与风险阈值。
一种用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，包括用于检测MMP-1、MMP-3、 MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的任意1种细胞因子浓度的试剂。
在其中一个实施例中，包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、 VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的至少3种细胞因子浓度的试剂。
在其中一个实施例中，包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试 剂和检测VEGF-A浓度的试剂。
在其中一个实施例中，包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试 剂、检测VEGF-A浓度的试剂和检测tPA浓度的试剂。
在其中一个实施例中，，所述检测细胞因子浓度的试剂选自免疫组织化学、 免疫荧光检测、免疫印迹检测和酶联免疫检测试剂中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括细胞因子标准品。
基于上述技术方案，本发明具有以下效果：
本发明将能够检测细胞因子浓度的试剂应用于制备用于辅助检测胎盘植入 的试剂盒，其测定至少3种细胞因子的浓度，用于联合分析计算风险值，在风 险值超过阈值时判定为高风险，其不仅对于胎盘植入的孕妇和正常分娩孕妇具 有中等强度的区分性能，而且能够区分临床上的其它产科并发症，从而提供了 一种方便、快捷、精准的辅助分析手段，有利于提高孕妇胎盘植入风险预测的 准确度。
而且，相对于现有的胎盘植入产前检测技术，该联合检测外周血中细胞因 子浓度的试剂盒检测方法对于检测操作者的技术水平要求较低，且经济成本更 低，更有利于对胎盘植入进行产前筛查的广泛应用。
附图说明
图1为在第一批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指 数；
图2为在第二批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指 数；
图3为在第三批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指 数；
图4为在所有进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指数；
图5为在所有无剖宫产史的孕产妇中检测获得的风险指数；
图6为在所有具有剖宫产史的孕产妇中检测获得的风险指数。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以 下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以用许多不同的形式来实现， 并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内 容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是 为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一、材料与设备
试剂盒(美国伯乐公司)：1)Bio-Plex Pro Human TH17 15-plex Panel，用于检测IL-1b、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、 IL-31、IL-33、IFN-g、sCD40L、TNF-a。2)Pro Human Chemokine 40-plex Panel， 用于检测CCL21、CXCL13、CCL27、CXCL5、CCL11、CCL24、CCL26、CX3CL1、 CXCL6、GM-CSF、CXCL1、CXCL2、CCL1、IFN-gamma、IL-1b、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-8、IL-16、IP-10、I-TAC、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、 MDC、MIF、MIG、MIP-1a、MIP-1deta、mip-3a、MIP-3b、MPIF-1、CXCL16、 CXCL12、CCL17、CCL25、TNF-a。3)PRO HU CANCER1，16-PLEX，1×96， 用于检测sEGFR、FGF-basic、Follistatin、g-csf、sHER-2、HGF、sIL-6Ra、Leptin、 Osteopontin、PDGF、PRCAM-1、Prolactin、SCF、sTIE-2、sVEGFR-1、sVEGFR-2。 4)PRO HU CANCER2，18-plex，1×96，用于检测Angiopoietin-2、sCD40L、 EGF、Endoglin、sFASL、HB-EGF、IGFBP-1、IL-6、IL-8、IL-18、PAL-1、PLGF、 TGF-a、TNF-a、uPA、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D。5)BPLX HU AC PHASE COMPLETE4+5，用于检测A2M、Haptoglobin、CRP、SAP、PCT、Ferritin、 tPA、Fibrinogen、SAA。6)ProHuman Inflammation Panel 1，37-plex，用于检测 APRIL、BAFF、sCD30、sCD163、Chitinase3、gp130、IFN-a2、IFN-B、IFN-Y、 IL-2、SIL-6Ra、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-27、 IL-28A、IL-29、IL-32、IL-34、IL-35、LIGHT、MMP-1、MMP-2、MMP-3、Osteocalcin、 Osteopontin-OPN、Pentraxin-3、STNF-R1、TSLP、TWEAK、STNF-R2。7)Pro Hu MMP Panel 9-plex，用于检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、 MMP-9、MMP-10、MMP-12、MMP-13。8)Pro Hu TIMP 4-plex，用于检测TIMP-1、 TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。9)ProTGF-β3-Plex Panel用于检测TGF-b2、TGF-b1、 TGF-b3。
仪器型号：Bio-Plex 200；涡旋混合仪；适用1.5-2ml离心管的冷冻离心机； 微孔板振荡器(能达到500rpm的转速)；磁性分离板(Hand-Held Magnetic Plate Washer)；2μl-1000μl单道移液器；20μl-300μl多道移液器；多道移液器储液 槽；去离子水、烧杯、试管、吸水纸等。
二、采集外周血样本
征得同意后，在分娩前分别采集疑似病例的非抗凝外周血血清和30-50例正 常分娩孕产妇的非抗凝外周血血清，在室温下凝固30-45分钟，4℃1000g离心 15分钟，然后转移到低温冻存管中。冻存于-80℃超低温冰箱。待样本采集完毕 后，4℃冻融50μl血清，1000g重复离心10分钟，以完全去除血小板和其他沉 淀物。
三、检测7种细胞因子的血清浓度
1、样本稀释：
按照1:4的比例用蒸馏水稀释血清样本，按照说明书在同一块板上检测所有 样本的同一种细胞因子浓度。
2、试剂稀释：
wash buffer(10×→1×)：用ddH2O 9:1稀释。
Beads(50×→1×)：将Beads涡旋30s，每管50×Beads各取出100μL， 加入1×washbuffer至最终体积5mL，混匀。
Detection Antibody(50×→1×)：每管50×Detection Antibody各取出60ul，加入detection antibody diluent至最终体积3mL，混匀。
3、溶解标准品
(1)将标准品取出，2000×g离心10s；
(2)向标准品管中各自加入50μL的Universal Assay Buffer；
(3)轻轻混匀30s；
(4)置于冰上5-10min；
(5)将标准品混合到一管里，加入Universal Assay Buffer，最终获得250μL 混合标准品。
4、标准品的稀释(4倍)
取出试剂盒中提供的PCR 8联管用于稀释标准品；
向第一管中加入200μL的混合标准品做为标准品1；
向管2-8中分别加入150μL的1×Universal Assay Buffer；
从管1中取50μL混合标准品加入管2中，上下吹打10次混匀，尽量 避免气泡的产生；
更换新的枪头，从管2中吸取50μL的稀释标准品转移到管3中，上下 吹打10次混匀。依次转移，完成混合标准品的梯度稀释，；
置于冰上备用。
5、准备微球
(1)涡旋微球30s；
(2)向96孔板中的每孔中加入50μL预混微球。
(3)将96孔板放入磁性分离板中，确保孔板被牢牢卡住。待板静止2min， 让微球沉底。然后将磁板快速倒置，倒出孔板中的液体。此过程中不可将96孔 板从磁性分离板中取出；
(4)向每孔中加入150μL 1×的Wash Buffer，静置30s，然后将磁板倒 置，倒出孔板中的液体；
(5)在倒置的状态下，用纸巾吸附孔板表面的残留液体。
6、微球与样本孵育
(1)每孔中分别加入25μL的Universal Assay Buffer；
(2)向指定的孔中分别加入25μL的标准品或样本；
(3)向空白对照中加入25μL Universal Assay Buffer；
(4)孔板封膜，500rpm室温下震荡孵育30min，于4度静置过夜。第二 天取出，500rpm室温下震荡孵育30min。
7、洗板
(1)将96孔板置于磁性分离板中，静置2min；
(2)轻轻去除封膜，避免液体飞溅；
(3)将孔板中的液体倒置去掉；
(4)向每孔中加入150μL 1×Wash Buffer，静置30s，将孔板中的液体 倒置去掉。重复步骤，共洗3次；
(5)最后一次清洗结束时，用纸巾吸附残留液体。
8、加入检测抗体
(1)向每孔中加入25μL 1×检测抗体混合液；
(2)使用新的封膜密封孔板；
(3)将96孔板从磁性分离板中取出，至于孔板振荡器中500rpm室温震 荡30min。
9、洗板
(1)将96孔板置于磁性分离板中，静置2min；
(2)轻轻去除封膜，避免液体飞溅；
(3)将孔板中的液体倒置去掉；
(4)向每孔中加入150μL 1×Wash Buffer，静置30s，将孔板中的液 体倒置去掉，共洗3次；
(5)最后一次清洗结束时，用纸巾吸附残留液体。
10、加入SA-PE
(1)向每孔中加入50μL SA-PE；
(2)使用新的密封膜密封孔板；
(3)将96孔板从磁性分离板中取出，至于孔板振荡器中500rpm室温震 荡30min。
11、洗板
(1)将96孔板置于磁性分离板中，静置2min；
(2)轻轻去除封膜，避免液体飞溅；
(3)将孔板中的液体倒置去掉；
(4)向每孔中加入150μL 1×Wash Buffer，静置30s，将孔板中的液体 倒置去掉，共洗3次；
(5)最后一次清洗结束时，用纸巾吸附残留液体。
12、上机检测
(1)向每孔中加入120μL Reading Buffer；
(2)使用新的密封膜密封孔板；
(3)将96孔板从磁性分离板中取出，至于孔板振荡器中500rpm室温震 荡5min；
(4)轻轻去除密封膜，放入Bio-Plex 200仪器中读数。
根据上述方法，分别采集分娩后病理确诊患有胎盘植入的孕妇和正常分娩 孕产妇的产前非抗凝外周血血清，进行110种已知的相关细胞因子的浓度检测。 采用非线性回归的方式拟合标准曲线，计算出浓度值。结果内容包括标准曲线、 每个孔的荧光强度中位值和根据标准曲线计算出来的浓度。以正常分娩孕产妇 的检测浓度的平均值为参考值，分别计算出各个疑似病例样本的检测值/参考值 的比值。
实验在不同时间段共进行两次，其中：
第一批检测结果如表1、表2所示，其中病例数37，对照数38。结果显示 在110种外周血清常见细胞因子中，MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、 IGFBP-1和tPA的浓度比值在胎盘植入病人中有显著变化。
第二批检测结果如表3所示，其中病例数39，对照数40。结果显示MMP-1、 MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA的浓度比值在病例人群中有 显著变化。
表1第一批检测人群的常见血清细胞因子水平
Figure BDA0002267870110000091
Figure BDA0002267870110000101
Figure BDA0002267870110000111
表2第一批检测人群的7种细胞因子水平
细胞因子 MMP-1 MMP-3 MMP-9 EGF VEGF-A IGFBP-1 tPA
病例/正常 1.92 0.80 1.37 1.43 1.12 0.76 0.80
P值 0.00 0.04 0.02 0.00 0.00 0.01 0.02
表3第二批检测人群的7种细胞因子水平
细胞因子 MMP-1 MMP-3 MMP-9 EGF↑ VEGF-A IGFBP-1 tPA
病例/正常 1.79 0.85 1.41 1.41 3.55 0.80 0.70
P值 0.03 0.05 0.01 0.04 0.01<sup>*</sup> 0.07 0.01
由以上结果可知，与正常孕产妇比较，患有胎盘植入的孕产妇血清中MMP-1、 MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1、tPA这7种细胞因子浓度水平变 化显著且变化稳定，可以用于检测胎盘植入。
实施例2
采用与实施例1相同的方法，在第三批人群中进行检测，分别对分娩前有 出血倾向的孕妇以及正常孕妇于分娩前采集的非抗凝外周血血清，进行7种细 胞因子的浓度检测并计算其浓度比值。其具体检测结果由孕产妇分娩后的病理 组织分析获得，真阳性结果为确诊胎盘植入病例，假阳性结果包括前置胎盘和 子痫前期病例。最终人数为胎盘植入病例数20，前置胎盘病例数20，子痫前期 病例数20，正常对照数20。
表4第三批检测人群的细胞因子水平
Figure BDA0002267870110000121
检测结果显示(表4)，血清7种细胞因子中的3种(MMP-1、EGF、VEGF-A) 可以分别区分胎盘植入和前置胎盘，以及胎盘植入和子痫前期。因此，以此7 种细胞因子血清浓度比值，不仅可以辅助筛查胎盘植入，而且能够区分临床上 的其它产科并发症，从而提供了一种方便、快捷、精准的辅助分析手段，有利 于提高孕妇胎盘植入风险预测的准确度。
实施例3
按照实施例1所述的方法，检测2016年1月-2017年12月的234例正常对 照的疑似胎盘植入病例孕产妇的产前外周血清的浓度，采用5种联合计算方法 计算获得患病风险值，其数值超过阈值时判定为阳性。五种联合计算法用M1、 M2、M3、M4和M5表示，[MMP-1]、[MMP-3]、[MMP-9]、[EGF]、[VEGF-A]、 [IGFBP-1]、和[tPA]分别表示某一个体的血清细胞因子与正常值的浓度比值。联 合方法中的M1和M2为定性法，M3、M4和M5为公式计算的定量法。所有获 得值计为“风险指数”，如果该指数超过风险阈值，则判定为阳性。具体描述如 下：
M1:如果[MMP-1]，[EGF]，[VEGF-A]>1，计算为1分，否则计算为0 分，风险指数为三项总分，在0到3之间。当风险指数大于风险阈值(见表4) 时，判定为阳性。
M2：如果[MMP-1]，[EGF]，[VEGF-A]>1或者[tPA]<1，计算为1分， 否则计算为0分，风险指数为四项总分，在0到4之间。当风险指数大于风险 阈值(见表6)时，判定为阳性。
M3＝EXP(-2.145+0.538×[MMP-1]+0.716×[EGF]+0.273×[VEGF-A]) /{1+EXP(-2.145+0.538×[MMP-1]+0.716×[EGF]+0.273×[VEGF-A]}，风险指数 值在0到100之间。当风险指数大于风险阈值(见表6)时，判定为阳性。
M4＝EXP(-0.898+0.549×[MMP-1]+0.653×[EGF]+0.413×[VEGF-A]-1.506×[tPA])/{1+EXP(-0.898+0.549×[MMP-1]+0.653×[EGF]+0.413×[VEGF-A]-1.506×[tPA])}，风险指数值在0到100之间。当风险指数大于风险阈值(见表6)时， 判定为阳性。
M5＝EXP(-0.092+0.598×[MMP-1]-1.139×[MMP-3]+0.911×[MMP-9]+0.497×[EGF]+0.69×[VEGF-A]-1.354×[IGFBP-1]-1.439×[tPA])/{1+EXP(-0.092+0.598×[MMP-1]-1.139×[MMP-3]+0.911×[MMP-9]+0.497×[EGF]+0.69×[VEGF-A]-1.354×[IGFBP-1]-1.439×[tPA])}，风险指数值在0到100之间。当风险指数大于风险阈 值(见表5)时，判定为阳性。
利用以上5种联合分析方法进行检测计算，获得疑似患病孕产妇的风险指 数，预测其患病风险。与孕产妇产后病理确诊结果进行对照，确定每一种预测 方法的阈值水平，并计算该预测方法的曲线下面积(AUC)值、敏感度和特异 性，以及约登指数，结果如表5所示。
表5五种多重细胞因子联合检测方法的性能比较
方法 AUC(95％CI) 阈值 敏感性 特异性 约登指数
M1 0.7318(0.6677-0.7958) 2 66.67％ 67.15％ 0.3382
M2 0.7847(0.7260-0.8435) 2 92.70％ 46.70％ 0.3940
M3 0.7978(0.7411-0.8546) 0.3477 76.04％ 68.60％ 0.4464
M4 0.8171(0.7631-0.8710) 0.4525 65.63％ 81.75％ 0.4738
M5 0.8112(0.7566-0.8658) 0.5055 70.83％ 77.37％ 0.4820
其结果显示，5种检测法均具有中等强度的AUC值，中到高等级的敏感性， 低到中等级的特异性。其中M4检测法具有最高的AUC值，为0.8171；M2检 测法具有最高的敏感性，为92.70％；M4检测法具有最高的特异性，为81.75％； M5检测法具有最高的约登指数，为0.4820。
同时，图示表明(图1-图6)，在实施例1和实施例2中不同批次检测人群 (第1-3批)中，以及在无剖宫产史和具有剖宫产史人群中，风险指数值在两组 人群中均有显著差异(P<0.0001)，ROC曲线的AUC值在0.76-0.81之间，显示 具有中等强度的区分性能。
其中，具体地，图1：在第一批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测 获得的风险指数(Diagnostic signature)。CON：正常分娩孕产妇，PAS：病理确 诊患有胎盘植入的孕妇。图1中A部分显示风险指数值在两组人群中有显著差 异(P<0.0001)，B部分显示ROC曲线和AUC值显示具有中等强度的区分性能。
图2：在第二批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指数。CON：正常分娩孕产妇，PAS：病理确诊患有胎盘植入的孕妇。图2中A部分 显示风险指数值在两组人群中有显著差异(P<0.0001)，B部分显示ROC曲线和 AUC值显示具有中等强度的区分性能。
图3：在第三批进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指数。NON-PAS：非胎盘植入孕产妇，包括前置胎盘和子痫前期病例，PAS：病理确 诊患有胎盘植入的孕妇。图3中A部分显示风险指数值在两组人群中有显著差 异(P<0.0001)，B部分显示ROC曲线和AUC值显示具有中等强度的区分性能。
图4：在所有进行产前辅助检测胎盘植入的孕产妇中检测获得的风险指数。 CON：正常分娩及非胎盘植入的孕产妇，PAS：病理确诊患有胎盘植入的孕妇。 图4中A部分显示风险指数值在两组人群中有显著差异(P<0.0001)，B部分显 示ROC曲线和AUC值显示具有中等强度的区分性能。
图5：在所有无剖宫产史的孕产妇中检测获得的风险指数。CON：正常分娩 孕产妇，PAS：病理确诊患有胎盘植入的孕妇。图5中A部分显示风险指数值 在两组人群中有显著差异(P<0.0001)，B部分显示ROC曲线和AUC值显示具 有中等强度的区分性能。
图6：在所有具有剖宫产史的孕产妇中检测获得的风险指数。CON：正常分 娩孕产妇，PAS：病理确诊患有胎盘植入的孕妇。图6中A部分显示风险指数 值在两组人群中有显著差异(P<0.0001)，B部分显示ROC曲线和AUC值显示 具有中等强度的区分性能。
实施例4
按照实施例1所述的方法，检测2016年1月-2017年12月的234例产前进 行胎盘植入检测的孕产妇的外周血清的浓度，采用7种单因子预测方法及5种 联合预测方法，分别获得阈值、AUC值、95％CI、灵敏度、特异度、阳性预测 值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及约登指数(表6)。单因子预测中， 曲线下面积最高为EGF(0.72)，灵敏度最高的为EGF和VEGF-A(67％)，特 异度最高的为EGF(71％)，阳性预测值约登指数最高为EGF(64％)。利用联 合预测法，曲线下面积、灵敏度、特异度和约登指数均有提高。利用M3法，灵 敏度可达到76％；利用M4法，其曲线下面积达到0.82，特异度可以达到82％， 阳性预测值达到72％。五种联合检测法约登指数四种在0.4以上，其最高值为 M4和M5法的0.48(表6)。综合预测性能最佳的为M4检测法。
表6检测人群中单因子检测与多重细胞因子联合检测的性能比较方法
Figure BDA0002267870110000151
Figure BDA0002267870110000161
实施例5
按照实施例1所述的方法，检测2016年1月-2017年12月的96确诊胎盘 植入孕产妇的产前外周血清的浓度，采用5种联合计算方法计算获得患病风险 值，其数值超过阈值时判定为阳性。对该96例病例同时进行5种产前预测或者 产期检测技术判定其患病风险，以及采用3种产后的确诊技术判定其是否患病。 比较利用多重血清因子联合辅助检测胎盘植入的5种联合检测法与已有技术的 阳性率、阴性率、操作所需的技术水平和经济成本。
结果显示在目前已知的产前诊断技术中，联合检测法具有最低的技术水平 要求和经济成本，其检测阳性率仅次于最高的剖宫产+产前胎盘影像学预测方法 (表7)。其中剖宫产史加上产前胎盘影像学预测的阳性率为97.50％，而联合检 测法M1到M5的检测阳性率依次为66.67％、92.70％、76.04％、66.67％和70.83％。 因此，采用联合检测法可以有效应用于胎盘植入的产前辅助检测。
由于胎盘植入将导致严重不良妊娠结局，其检出率预期应越高越好，以保 证不漏筛每一位病例。根据临床具体需求，按照检测敏感度最大化和成本最低 化的原则，最为适宜临床应用的为M2检测法。
表7五种多重细胞因子联合检测法与已知的诊断技术比较
Figure BDA0002267870110000162
Figure BDA0002267870110000171
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。

Claims (12)

1.检测细胞因子浓度的试剂在制备用于辅助检测胎盘植入的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的任意1种细胞因子浓度的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的至少3种细胞因子浓度的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试剂和检测VEGF-A浓度的试剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试剂、检测VEGF-A浓度的试剂和检测tPA浓度的试剂。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂选自免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂和酶联免疫检测试剂中的一种或多种。
6.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于辅助检测胎盘植入的方法包括以下步骤：
(1)采用所述试剂盒检测待测样本中的细胞因子的浓度；
(2)计算待测样本中细胞因子浓度与对应的细胞因子的正常浓度的比值；
(3)通过步骤(2)所述的比值计算待测样本的胎盘植入的风险指数；
(4)比较所述风险指数与风险阈值。
7.一种用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的任意1种细胞因子浓度的试剂。
8.根据权利要求6所述的用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，包括用于检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、EGF、VEGF-A、IGFBP-1和tPA中的至少3种细胞因子浓度的试剂。
9.根据权利要求7所述的用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试剂和检测VEGF-A浓度的试剂。
10.根据权利要求7所述的用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，包括检测MMP-1浓度的试剂、检测EGF浓度的试剂、检测VEGF-A浓度的试剂和检测tPA浓度的试剂。
11.根据权利要求6至9任一项所述的用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，所述检测细胞因子浓度的试剂选自免疫组织化学、免疫荧光检测、免疫印迹检测和酶联免疫检测试剂中的一种或多种。
12.根据权利要求6至9任一项所述的用于辅助检测胎盘植入的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞因子标准品。
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