JP2015502366A - 薬物療法を改善するための方法 - Google Patents

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Abstract

被験体に施された薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することにより薬物療法の有効性を増強するための方法がここで提供される。特定の実施形態においては、薬物療法により誘導される細胞老化を含む生物学的応答を抑制する抗老化細胞剤を投与する方法が提供される。【選択図】 図８

Description

関連出願との相互参照
本出願は、2011年12月13日に出願された米国特許仮出願第61,570,166号および2012年8月23日に出願された米国特許仮出願第61/692,680号に対する、35 U.S.C.§119(e)の下での利益を主張し、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組込まれるものとする。
配列表に関する陳述
本出願に伴う配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組込まれる。配列表を含むテキストファイル名は、200201_402WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。このテキストファイルは30KBであり、2012年12月13日に作製されたものであり、EFS-Webを介して電子的に提出される。
政府の関心の陳述
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された認可番号AG025901、AG09909およびAG017242の下での政府の支援と共に為された。政府は本発明における特定の権利を有する。
技術分野
癌、HIV/AIDSおよび自己免疫疾患などの疾患を治療するのに用いられる様々な薬物療法(内科的治療)の有効性を増強するための方法が、本明細書で提供される。これらの方法において用いられる薬剤は、生物学的損傷応答を抑制する薬剤を含む。
関連技術の説明
細胞傷害および遺伝毒性療法は、様々な疾患、中でも注目すべきは、癌の治療のために毎年数十万人の患者に施されている。癌は、広範囲の疾患を含み、世界中でほぼ4人のうちの1人が罹る。米国においては、癌は死因の第2位であり、全ての死亡の23%を占める。診断された全ての癌に関する5年相対生存率は約68%であり、治療およびその成功率は癌の種類によって変化する。たとえ、化学療法および放射線療法が癌細胞を標的とするように設計されたとしても、それらの療法は、癌療法の有益な効果を有意に損い得る程度まで、正常な細胞および組織に有害に作用し得る。
HIVに感染し、AIDSを発症した男性および女性に施された高活性抗レトロウイルス療法は、寿命の延長および感染者の全体的な健康の改善に寄与してきた。しかしながら、この療法もまた、同様に正常細胞の生理に有害に作用し得る。
簡単に述べると、薬物療法(内科的治療)により誘導される、細胞老化などの生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することにより、薬物療法の有効性を増強するための方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるのは、以下の実施形態である。
一実施形態においては、被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法であって、被験体に、薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することを含む前記方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態においては、被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法は、被験体に、薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することを含み、該薬剤は、薬物療法の施行の前に、後に、またはそれと同時に投与される。特定の実施形態においては、薬物療法は、被験体における老化細胞の割合を増加させる。別の特定の実施形態においては、被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法であって、被験体に、薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することを含み、該薬剤が薬物療法の施行の前に、後に、またはそれと同時に投与され、前記薬剤が、(a)1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする薬剤；および(b)老化細胞により産生される1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する薬剤から選択される、前記方法が提供される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後に被験体に投与される。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする。別の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の前に被験体に投与される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に被験体に投与される。さらに別の特定の実施形態においては、前記薬剤は、施される薬物療法の少なくとも一部と同時に投与される。上記の、および本明細書に記載の実施形態において、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、老化細胞により産生される1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する。特定の実施形態においては、前記薬剤は、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である。特定の実施形態においては、薬物療法は、被験体における老化細胞の割合を増加させる。別の特定の実施形態においては、薬物療法は、放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む。特定の実施形態においては、被験体は癌を有する、癌の寛解にある、癌の再発を生じる危険性がある、または癌を発症する危険性があり、薬物療法は抗癌療法を含む。より特定の実施形態においては、癌は、固形腫瘍を含み、他の特定の実施形態においては、癌は液性腫瘍を含む。上記の、および本明細書に記載の方法の他の特定の実施形態においては、癌は転移性癌である。別の特定の実施形態においては、上記の、および本明細書に記載の薬物療法の有効性を増強するための方法を、被験体が癌を有し、幹細胞移植を受けたか、または受けるであろう(受ける予定である)場合に用いることができ、その薬物療法は高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せである。特定の実施形態においては、幹細胞移植は、自己または同種異系幹細胞移植である。
上記の、および本明細書に記載の方法の別の特定の実施形態においては、抗ウイルス療法は、HIV/AIDS管理療法であり、一実施形態においては、HIV/AIDS管理療法は、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む。上記の、および本明細書に記載の方法のさらに別の特定の実施形態においては、被験体は、心血管疾患を有するか、または心血管疾患を発症する危険性があり、薬物療法はアンギオテンシンである。上記の、および本明細書に記載の方法のさらに別の特定の実施形態においては、被験体は糖尿病を有し、薬物療法はインスリンである。
一実施形態においては、(a)被験体に、被験体の1つ以上の細胞における老化を誘導する薬物療法を施すこと；および次いで、(b)被験体に、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする抗老化細胞剤を投与することを含む、被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法が提供される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、または少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後に被験体に投与される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である。特定の実施形態においては、薬物療法は、被験体における老化細胞の割合を増加させる。別の特定の実施形態においては、薬物療法は、放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む。特定の実施形態においては、被験体は癌を有する、癌の寛解にある、癌の再発を生じる危険性がある、または癌を発症する危険性があり、薬物療法は抗癌療法を含む。別の特定の実施形態においては、癌は、固形腫瘍を含み、さらに別の特定の実施形態においては、癌は液性腫瘍を含む。他の実施形態においては、癌は転移性癌である。別の特定の実施形態においては、上記の、および本明細書に記載の薬物療法の有効性を増強するための方法を、被験体が癌を有し、幹細胞移植を受けたか、または受けるであろう場合に用いることができ、その薬物療法は高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せである。特定の実施形態においては、幹細胞移植は、自己または同種異系幹細胞移植である。
上記の、および本明細書に記載の方法の別の特定の実施形態においては、抗ウイルス療法は、HIV/AIDS管理療法であり、一実施形態においては、HIV/AIDS管理療法は、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む。上記の、および本明細書に記載の方法のさらに別の特定の実施形態においては、被験体は、心血管疾患を有するか、または心血管疾患を発症する危険性があり、薬物療法はアンギオテンシンである。上記の、および本明細書に記載の方法のさらに別の特定の実施形態においては、被験体は糖尿病を有し、薬物療法はインスリンである。
別の実施形態においては、薬物療法の有効性を増強するための薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤であって、薬物療法の施行の前、後、またはそれと同時の投与にとって好適である前記薬剤の使用が提供される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後の投与にとって好適である。一実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする。別の特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の前に投与される。さらに別の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に投与される。別の特定の実施形態においては、前記薬剤は、施される薬物療法の少なくとも一部と同時に投与される。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、老化細胞により産生される1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する。特定の実施形態においては、前記薬剤は、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である。さらに別の特定の実施形態においては、薬物療法は、被験体における老化細胞の割合を増加させる。一実施形態においては、薬物療法は、放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む。別の実施形態においては、薬物療法は抗癌療法である。さらに別の特定の実施形態においては、癌は、固形腫瘍または液性腫瘍を含み、特定の実施形態においては、転移性癌である。さらに他の実施形態においては、抗ウイルス療法は、HIV/AIDS管理療法である。別の実施形態においては、HIV/AIDS管理療法は、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む。特定の実施形態においては、薬物療法は高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せであり、幹細胞移植の施行の前または後に施される。別の実施形態においては、幹細胞移植は、(a)自己幹細胞移植、および(b)同種異系幹細胞移植から選択される。さらに別の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法がアンギオテンシンである場合に、心血管疾患を治療または予防(防止)するのに有用である。別の実施形態においては、薬物療法がインスリンである場合に、糖尿病を治療または予防するのに有用である。
また、薬物療法が1つ以上の細胞において老化を誘導し、薬剤が1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする、薬物療法の有効性を増強するための抗老化細胞剤の使用も本明細書で提供される。
以下の説明において、特定の詳細は、様々な実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者であれば、本発明をこれらの詳細がなくても実施することができることを理解するであろう。他の例においては、実施形態の説明を不必要に曖昧にすることを回避するために、周知の構造は示されていないか、または詳細に説明されていない。別途文脈が要求しない限り、以下の明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む(comprise)」ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などのその変形は、オープンな包括的な意味で、すなわち、「限定されるものではないが、含む」と解釈されるべきである。さらに、用語「含む(comprising)」(ならびに「含む(comprise)」または「含む(comprises)」または「有する(having)」または「含む(including)」などの関連する用語)は、他の特定の実施形態におけるものを排除することを意図するものではなく、例えば、本明細書に記載の物質の任意の組成物、組成物、方法、またはプロセスなどの実施形態において、記載の特徴「からなって」または「本質的にからなって」もよい。本明細書に提供される表題は、便宜上のものに過ぎず、特許請求される実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
「一実施形態」または「ある実施形態」に対する、本明細書を通じた参照は、その実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。かくして、本明細書を通して様々な場所における語句「一実施形態において」または「ある実施形態において」の出現は、全て同じ実施形態を参照する必要はない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、1つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組合わせることができる。
また、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、「ある非ヒト動物」に対する参照は、1つ以上の非ヒト動物、または複数のそのような動物を指してもよく、「ある細胞」または「その細胞」に対する参照は、1つ以上の細胞および当業者には公知のその等価物(例えば、複数の細胞)に対する参照を含む。方法のステップが記載されるか、または特許請求される場合、およびステップが特定の順序で起こると記載される場合、第2のステップ「より前」(すなわち、前)に起こる(または実施される)第1のステップの記載は、第2のステップが第1のステップに「続いて」起こる(または実施される)ことを記述するように書き直された場合に同じ意味を有する。数または数値範囲を参照する場合の用語「約」は、記載される数または数値範囲が実験的変動性の範囲内(または統計的実験誤差の範囲内)の近似値であり、かくして、数または数値範囲が参照される数または数値範囲の1%〜15%の間で変化してもよいことを意味する。また、用語「または」は、文脈が別途明確に記述しない限り、「および/または」を含む、その意味において一般的に用いられる。用語「少なくとも1つ」は、例えば、少なくとも1つの化合物または少なくとも1つの組成物を参照する場合、用語「1つ以上」と同じ意味および理解を有する。
図1Aおよび1Bは、放射線がp16−3MRトランスジェニックマウスにおいて永続的な老化細胞を誘導し、GCV処置が老化細胞の枯渇およびいくつかのSASP(老化関連分泌表現型)バイオマーカーのレベルの低下を誘導することを示す。トランスジェニックp16-3MRマウスを、モック照射(Ctrl)するか、または照射し(1R)(7Gyの全身X線)、3ヶ月間飼育した後、本明細書に記載のようにビヒクルまたはGCVで処置した。様々な組織を単離し(ここに示される結果は肺組織に関するものである)、p16INK4a、mRFP、IL-6およびMMP-3タンパク質をコードするmRNAの生物発光(A)およびその存在量について測定した。結果を、Ctrlレベルを1に設定した後の任意単位(AU)で示す。 図2A〜2Cは、照射によりp16-3MRトランスジェニックマウス中で誘導された老化細胞が、原発および転移腫瘍増殖を促進することを示す。トランスジェニックp16-3MRマウスをモック照射(Ctrl)するか、または照射した(IR)。3ヶ月後、照射されたマウスをビヒクル(IR)あｍたはGCV(IR+GCV)で処置した後、尾静脈にfLUC発現B16メラノーマ細胞を注射した。15日後、B16メラノーマ細胞の生物発光を測定した。 図2A〜2Cにおけるマウスに由来するB16メラノーマ細胞の全身発光測定値を示す図である。照射されたマウスは15〜16日目に瀕死状態であり、犠牲にした。 図4A〜4Cは、老化細胞の排除が転移の発生を抑制することを示す。図2のp16-3MRトランスジェニックマウスを、さらに3日間(すなわち、18日目)追跡した。GCVで処置された照射マウス(老化細胞が排除された)は、最終的には肺において原発腫瘍を生じた(A)。しかし、肺における原発腫瘍の存在にも拘らず、脂肪および肝臓組織は比較的転移がないままであった(C)。対照的に、GCVで処置されなかった照射マウス(老化細胞を保持する)は、肝臓および脂肪組織において転移腫瘍を示した(B)。 図5A〜5Bは、ドキソルビシンを用いる処置がp16-3MRトランスジェニックマウスにおける永続的な老化細胞を誘導することを示す。トランスジェニックp16-3MRマウスをビヒクルでモック処置(Ctrl)するか、または10mg/kgのドキソルビシン(DOXO)で処置した。様々な組織を単離し(肝臓、心臓、肺、腎臓、および脾臓)、mRFP(A)およびp16INK4a(B)をコードするmRNAの存在量について測定した(アクチンに対して正規化した)。 図6は、ドキソルビシンがp16-3MRトランスジェニックマウスにおける永続的な老化細胞を誘導し、GCV処置が老化細胞の枯渇およびSASPバイオマーカー、p16INK4およびmRFPのレベルの低下を誘導することを示す。皮膚生検を単離し、p16INK4およびmRFPの存在量について測定した(アクチンに対して正規化した)。結果を、Ctrlレベルを1に設定した後の任意単位(AU)で示す。 図7は、ドキソルビシン処置によりp16-3MRトランスジェニックマウスにおいて誘導された老化細胞が原発腫瘍増殖を促進したことを示す。トランスジェニックp16-3MRマウスを、ビヒクル処置(Ctrl)するか、またはドキソルビシン(10mg/kg)で処置した。7日後、ドキソルビシン処置されたマウスを、ビヒクル(DOXO)またはGCV(DOXO+GCV)でモック処置した後、fLUC発現B16メラノーマ細胞を皮下注射した。12日後、B16メラノーマ細胞の生物発光を測定した。 図8は、ドキソルビシン処置されたp16-3MRトランスジェニック細胞における老化細胞のクリアランスが腫瘍サイズを低下させたことを示す。トランスジェニックp16-3MRマウスを、ビヒクル処置(Ctrl)するか、またはドキソルビシン(10mg/kg)で処置した。7日後、ドキソルビシン処置されたマウスを、ビヒクル(DOXO)またはGCV(DOXO+GCV)でモック処置した後、fLUC発現B16メラノーマ細胞を皮下注射した。12日後、原発腫瘍の直径を測定した。 図9は、老化細胞の排除が、老化細胞が消失または減少しなかったマウスと比較して多様なK-Ras誘導肺腫瘍を抑制することを示す。 図10A〜10Dは、老化細胞中で選択的に発現された例示的トランスジーン、p16INK-4aプロモーター-FKBP-キャスパーゼ-IRES-GFP核酸構築物を含有するpBLUESCRIPT II KSベクターの核酸配列(配列番号1)の一覧を提供する。 図１０Ａの続きである。 図１０Ｂの続きである。 図１０Ｃの続きである。 図11A〜11Fは、様々なベクター成分および標識された構築物成分と共に図10の核酸配列の一覧を提供する。 図１１Ａの続きである。 図１１Ｂの続きである。 図１１Ｃの続きである。 図１１Ｄの続きである。 図１１Ｅの続きである。 図12A〜12Eは、コルチコステロンおよびコルチゾールがSASPを部分的に抑制することを示す。(A)10GyをX線照射された老化(Sen(XRA))HCA2線維芽細胞を、示された濃度のコルチコステロンまたは最も高い濃度のDMSO(ビヒクル対照)を含有する10%血清を含む培地中でインキュベートした。細胞に、照射直後にコルチコステロンまたはDMSOを与え、6日後に分析した。細胞を洗浄し、コルチコステロンを含まない無血清培地中でインキュベートして、条件化培地を作製した。老化前(Pre)細胞および対照またはコルチコステロン処置されたSen(XRA)細胞からの条件化培地を、IL-6についてELISAにより分析した。(B)細胞を処置し、条件化培地を作製し、コルチゾールを示された濃度で用いたこと以外は(A)に記載のように分析した。(C)条件化培地を、(A)に記載のようにDMSO、コルチコステロン(50nM)、またはコルチゾール(100nM)で処置された老化前(PRE)または老化(XRA)細胞から採取した。条件化培地を抗体アレイにより分析した。PREおよびXRA DMSO細胞からの平均シグナルを、基準として用いた。基準よりも高いシグナルは明るい灰色(右側のスケール上の+1を参照)であり；基準より低いシグナルはPRE DMSOにより示されるように濃い灰色である(右側のスケール上の-1を参照)。色の強度は、平均値からのlog2倍数変化を表す。サンプル間の階層的クラスター関係を、デンドログラムとして示す(左側)。*コルチゾールにより有意に(P<0.05)抑制された因子。‡コルチコステロンにより有意に抑制される因子(P<0.05)。(D)細胞を、RASまたはMKK6を発現するレンチウイルスに感染させた。選択後、細胞に6日間、DMSO-、500nMコルチコステロン(C1)および100nMコルチゾール(C2)を与えた。条件化培地を以前に記載のように作製し、IL-6についてELISAにより分析した。*DMSO処置と有意に異なる因子(P<0.05)。(E)細胞を、X線照射の前後で(XRA、矢印で示す)、示された間隔(a〜d、下側パネルの太線で示す)にわたって500nMコルチコステロンで処置した。条件化培地を調製し、IL-6についてELISAにより分析した(上側パネル)。*DMSO処置と有意に異なる因子(P<0.05)。 図１２Ａ−Ｂの続きである。 図１２Ｃの続きである。 図13A〜13Gは、SASPに対する糖質コルチコイドの効果が、糖質コルチコイド受容体(GR)に依存することを示す。(A1)図12の凡例に記載されたようにDMSO、500nMコルチコステロン(C1)または100nMコルチゾール(C2)で処置された老化前(Pre)または老化(Sen(XRA))HCA2細胞から、mRNAを抽出した。(A2)図12に示されたようにDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処置された老化前(モック)または老化X線照射HCA2細胞から、mRNAを抽出した。IL-5、IL-6、IL-8、MMP-3、IL-1α、MCP-2、MCP-3およびGM-CSFの転写物を、定量的PCRにより定量した(チューブリンに対して正規化した)。*DMSO処置と有意に異なる因子(P<0.05)。(B)以前に記載のようにDMSO、500nMコルチコステロン（C1)、または100nMコルチゾール(C2)で処置されたPreおよびSen(XRA)細胞から、mRNAを抽出し、GRの転写物をPCRにより定量した(チューブリンに対して正規化した)。GR mRNAレベルは老化細胞においてわずかに上昇したが、その増加は統計的に有意なものではなかった。(C)以前に記載のようにDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処置されたPreおよびSen(XRA)細胞を、X線照射の1、4および7日後にGRについて免疫染色した。(D)細胞を、GFP(対照)またはGRに対するshRNAを発現するレンチウイルスに感染させ、選択した。選択の7日後、mRNAを抽出し、GRの転写物をPCRにより定量した(チューブリンに対して正規化した)。(E)全細胞溶解物を、(D)に記載のshGFPおよびshGRを発現する細胞から調製し、GRおよびアクチン(対照)についてウェスタンブロッティングにより分析した。(F)shGFPまたはshGRを発現するレンチウイルスに感染させた細胞をX線照射し、その直後にDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処置した。条件化培地を7日後に採取し、IL-6についてELISAにより分析した。(G)示された用量でRU-486を添加したことを除いて、(F)に記載のように細胞を処置した。条件化培地を採取し、IL-6分泌についてELISAにより分析した。 図１３Ａ１の続きである。 図１３Ａ２の続きである。 図１３Ｂの続きである。 図１３Ｃ−Ｅの続きである。 図14A〜14Cは、糖質コルチコイドがIL-1α発現を抑制することを示す。(A)老化前(Pre)HCA2細胞を、DMSO、500nMコルチコステロン、もしくは100nMコルチゾールで24時間処置したか、またはX線照射により老化を誘導し(Sen(XRA))、その直後にDMSO、コルチコステロン、もしくはコルチゾールを与えた。示された間隔の後にmRNAを抽出し、IL-1αの転写物をPCRにより定量した(チューブリンに対して正規化した)。(B)(A)に記載の細胞から抽出されたmRNAを用いて、IL-6の転写物を定量した(チューブリンに対して正規化した)。(C)(A)に記載のように調製された、PreおよびSen(XRA)細胞を、IL-1αについて免疫染色した。Sen(XRA)細胞を、照射後7日間、免疫染色した。 図１４Ａ−Ｂの続きである。 図15A〜15Fは、糖質コルチコイドはIL-1α/NF-κB経路を損傷し、腫瘍細胞侵襲を誘導するSASPの能力を抑制することを示す。(A)全HCA2細胞溶解物を、組換えIL-1αタンパク質(rIL-1α)の非存在下(左パネル)または存在下(右パネル)で、DMSO、500nMコルチコステロン(C1)、または100nMコルチゾール(C2)で処置された老化前(Pre)細胞、または老化細胞(Sen(XRA))から調製した。溶解物を、IRAK1、IκBα、RelAおよびアクチン(対照)についてウェスタンブロッティングにより分析した。(B)照射後、Sen(XRA)細胞に、DMSO、50nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールを与えた。6日後、細胞に、無細胞培地中の糖質コルチコイドの存在下で、示された用量の組換えIL-1αタンパク質を与えた。条件化培地を24時間後に採取し、IL-6についてELISAにより分析した。(C)上記のようにDMSO、500nMコルチコステロン(C1)または100nMコルチゾール(C2)で処置されたPre細胞およびSen(XRA)細胞から、核抽出物を調製し、NF-κB DNA結合活性について分析した。(D)細胞を、NF-κB-ルシフェラーゼリポーター構築物を担持するレンチウイルスに感染させ、照射し、老化させた。照射の直後、細胞を、示されるように、DMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールと、0.5μMのRU-486または2.5nm/mLのIL-1αとで処置した。照射の7日後、細胞をトリプシン処理し、計数し、溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイし、これを細胞数に対して正規化した。(E)図12に記載のようにコルチコステロン(C1)またはコルチゾール(C2)で処置された老化前(Pre)または老化(Sen(XRA))細胞からの条件化培地を調製した。次いで、条件化培地を、実験手順に記載のように、基底膜に侵襲するようにT47Dヒト乳癌細胞を刺激する能力についてアッセイした。(F)組換えIL-1αタンパク質(rIL-1α)の非存在下(左パネル)または存在下(右パネル)でDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処置されたPre細胞、およびSen(XRA)処置細胞から、核抽出物を調製し、NF-κB DNA結合活性について分析した。 図１５Ａの続きである。 図１５Ｂ−Ｃの続きである。 図１５Ｄ−Ｅの続きである。 図16Aは、X線照射(10Gy; Sen(XRA))により老化を誘導され、示された濃度のコルチコステロンまたは最も高い濃度のDMSO(ビヒクル対照)で7日間、照射の直後に処置されたIMR-90線維芽細胞を示す。老化前(Pre)ならびに対照および糖質コルチコイド処置されたSen(XRA)細胞からの条件化培地を、IL-6についてELISAにより分析した。図16Bは、DMSO、500nMコルチコステロン(C1)、または100nMコルチゾール(C2)で7日間処置されたSen(XRA)HCA2細胞を示す。SA-Bga1を発現する老化前(Pre)およびSen(XRA)細胞のパーセンテージをスコア化した(上側パネル)。それぞれの条件に対応する代表的な視野も示す(下側パネル)。図16Cは、BrdUを24時間与え、固定し、核BrdU染色のために免疫染色した後、BrdU陽性細胞のパーセンテージについて分析した、(B)に記載のPreおよびSen(XRA)HCA2細胞を示す。図16Dは、53BP1について免疫染色された（B)に記載のPreおよびSen(XRA)細胞を示す。2を超える53BP1核内フォーカスを有する細胞のパーセンテージを、CELL PROFILERソフトウェアを用いて決定した。条件あたり少なくとも200個の細胞を分析した。図16Eは、CELL PROFILERソフトウェアを用いて決定された、(D)からの53BP1フォーカスの平均数を示す。 図１６Ａ−Ｂの続きである。 図17Aは、鉱質コルチコイド受容体について免疫染色された老化前(A)またはSen(Xra)HCA2細胞を示す。Sen(XRA)細胞に、照射の直後にDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールを与え、その後1または7日間、免疫染色した。図17Bは、RU-486の存在下または非存在下(-)でDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処置され、GRについて免疫染色されたSen(XRA)HCA2細胞を示す。 図18は、DMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで24時間処置されたPre HCA2細胞およびX線照射の直後に開始して7日間、これらの化合物で処置されたSen(XRA)HCA2細胞から抽出されたmRNAを示す。mRNA抽出物を、定量的PCRによりIκBα転写物について分析した(チューブリンに対して正規化した)。DMSO処置されたPre細胞中のIκBα mRNAのレベルに、1の値を任意に割り当てた。 図19は、アピゲニン処置はSASPを部分的に抑制することを示す。対照(モック照射、DMSO処置)、DMSO処置(DMSO)またはアピゲニン処置された老化(Api)細胞からの条件化培地を、SASPの発現について多重ELISAにより分析した。結果を、対数スケールの垂直軸と共に対照(モック照射、DMSO処置)細胞にわたる倍数差として示す。
詳細な説明
薬物療法(内科的治療)により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を投与することにより、薬物療法の有効性を増強するための方法が本明細書に提供される。癌化学療法、放射線治療、ホルモン療法、および様々な抗ウイルス療法などの薬物療法が意図され、異常な代謝、増殖、修復能力および/または他の生理学的および生物学的特性のため、これらの療法に対してより感受性が高いと推定される、疾患を引き起こす異常細胞を標的化するように設計される。しかしながら、これらの薬物療法、特に全身施されるものは、正常細胞に対して作用し、細胞老化の誘導などの、細胞損傷、細胞傷害、および/または遺伝毒性効果をもたらす。損傷した正常細胞および組織の薬物療法に対する生物学的応答は、例えば、薬物療法に対する耐性を促進する、および/または原因となる疾患を悪化させることにより、原因となる疾患を治療する療法の有効性の低下をもたらし得る。従って、本明細書の開示は、損傷的生物学的応答を抑制する薬剤を投与することにより、薬物療法の有効性を増強するための方法を提供することにより、医学界に貢献する。
一実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制し、本明細書に記載の方法において有用である薬剤としては、(a)1つ以上の老化細胞を選択的に破壊する(殺傷する、消失させる、除去する)か、もしくは1つ以上の老化細胞の選択的破壊、殺傷、消失、もしくは除去を容易にする、および/または(b)老化細胞による1つ以上の老化細胞関連分子(例えば、限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、およびプロテアーゼ)の産生および分泌を抑制する薬剤(本明細書では抗老化細胞剤と呼ばれる)が挙げられる。本明細書に例示されるように、癌療法への曝露のため動物において細胞老化が確立された後でも、抗老化細胞剤による老化細胞の除去は、腫瘍進行を阻害する療法の効能を増強し、転移性疾患を有意に減少させた。また、本明細書に記載されるように、生物学的損傷応答が細胞老化の誘導を含む場合、老化細胞による老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する薬剤は、腫瘍細胞侵襲を抑制する。
薬物療法(内科的治療)の有効性を増強するための方法
薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制することにより、それを必要とする被験体に投与された抑制剤は、薬物療法の有効性(すなわち、効能)の増強(すなわち、改善)を提供する。前記療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤の投与は、薬剤の投与の非存在下で観察される利益と比較して、薬物療法の治療的および/または予防的利益の改善または増加をもたらす。特定の実施形態においては、薬物療法の有効性の増強は、薬物療法の有害な生物学的および生理学的効果を抑制することを含む。
本明細書に記載されるように、それを必要とする被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法であって、被験体に、薬物療法への曝露による誘導される生物学的損傷応答を抑制する(すなわち、減少させる、低下させる、防止する、阻害する、減弱させる)ことができる薬剤を投与することを含む前記方法が提供される。生物学的損傷応答を抑制する薬剤を、薬物療法の施行の前または後に被験体に投与することができる。特定の実施形態においては、薬剤を、薬物療法と同時に投与することができる。これらの薬剤としては、例えば、低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸が挙げられる。
薬物療法により誘導される生物学的損傷応答は、応答が療法への治療された被験体の曝露の際に誘導される、被験体の細胞、組織関連および/または全身応答を含む。本明細書に記載される薬物療法により誘導される生物学的損傷応答としては、限定されるものではないが、癌を有する被験体における細胞老化、DNA損傷応答(本明細書および当業界ではDDRとも呼ばれる)、腫瘍促進応答、またはその組合せが挙げられる。特定の例においては、薬物療法が細胞老化を誘導する場合、被験体における老化細胞の割合が増加する。別の言い方をすれば、被験体における老化細胞の数は、薬物療法を受けていない被験体中に存在するものよりも多い。
生物学的損傷応答を抑制するのに有用な薬剤としては、生物学的損傷応答を鈍化させるか、または減少させる(抑制する)様式で老化細胞の活性または生理を変化させる薬剤が挙げられる。生物学的損傷応答を抑制する(すなわち、統計的または臨床的に有意な様式で減少させるか、または阻害する)薬剤としては、細胞損傷的である薬物療法に応答して細胞により発現される、および/または上方調節されるポリペプチド(例えば、老化細胞関連ポリペプチド)の発現および/または分泌を阻害するか、または減少させるものが挙げられる。従って、そのような薬剤としては、細胞シグナリング経路を阻害、防止、もしくは破壊するもの、または前記ポリペプチドの転写もしくは翻訳もしくは輸送を阻害するか、もしくは減少させるか、もしくはいくつかの様式では、それと干渉するものが挙げられる。
誘導される生物学的損傷応答が細胞老化の誘導および確立を含む場合の例においては、有用な薬剤として、老化細胞を破壊するか、またはその破壊(もしくは消失、殺傷、除去)を容易にすることにより損傷応答を抑制する抗老化細胞剤が挙げられる。従って、特定の実施形態においては、被験体の1つ以上の細胞において老化を誘導する薬物療法を被験体に施すこと；および次いで、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする抗老化細胞剤を被験体に投与することを含む方法が提供される。また、薬剤が生物学的損傷応答を抑制したような老化細胞の生物活性を変化させる(例えば、遮断するか、もしくは阻害する)か、またはいくつかの様式では、その生理を変化させる薬剤も有用である。特定の実施形態においては、前記薬剤は、細胞により産生された1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する。
本明細書でより詳細に考察されるように、老化細胞関連ポリペプチドの産生および分泌の減少は、生物学的損傷応答を抑制し、癌に関しては、それによって腫瘍の進行および/または転移を減少させることができる。老化細胞関連ポリペプチドとしては、老化細胞の老化関連分泌表現型(SASP)の成分または分子である、本明細書により詳細に、および当業界で記載されるものが挙げられる。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制するのに有用な薬剤として、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊する(もしくは殺傷する、除去する、消失させる)か、または1つ以上の老化細胞の選択的破壊、殺傷、消失、もしくは除去を容易にする薬剤(本明細書では抗老化細胞剤とも呼ばれる)が挙げられる。in vitroでの細胞試験により、SASPが確立される前の時間により証明されるように、照射への曝露後、約3〜10日の間に老化が確立されることが示されている(例えば、Coppeら、PLoS Biol. 6:2853-68 (2008); Rodierら、Nature Cell Biol. 11:973-70 (2009); Labergeら、Aging Cell 11(4):569-578 (2012) doi: 10.1111/j.1474-9726.2012.00818.x. Epub 2012 Apr 17を参照されたい)。特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法において有用な薬剤として、一度、生物学的損傷応答(例えば、細胞老化)が薬物療法への細胞および組織の曝露により誘導されたら、それを抑制する、阻害する、排除する、または減少させることができるものが挙げられる。従って、一実施形態においては、この生物学的損傷応答を抑制するそのような薬剤は、薬物療法の施行後に投与される。
本明細書に記載の方法において有用な薬剤としては、老化細胞関連分子に特異的に結合し、それと相互作用して、老化細胞関連分子の1つ以上の生物活性を阻害する薬剤も挙げられる。あるいは、ある薬剤は老化細胞関連分子の同種リガンド(例えば、細胞受容体または他の細胞表面ポリペプチド、シグナリング分子、分泌される分子)に結合することによって、老化細胞関連分子のその同種リガンドへの結合を遮断または阻害することができる。次いで、この阻害または遮断は、さもなければ薬剤の非存在下で起こったであろう生物学的損傷活性を抑制することができる。
本明細書でより詳細に考察されるように、驚くべきことに、SASPに特徴的な老化細胞関連分子のポリペプチドの産生および/もしくは分泌の減少ならびに/または老化細胞の集団(老化関連分泌表現型を特徴とする)の減少は、治療(または予防)結果を改善することができる(例えば、腫瘍の進行および/または転移の減少)。一実施形態においては、癌療法(例えば、照射、化学療法)である薬物療法の有効性を増強するための方法が提供される。本明細書に記載されるように、放射線照射および化学療法剤などの癌療法により誘導される生物学的損傷応答は、細胞老化を含む。老化細胞の存在は、腫瘍進行を促進し、これは腫瘍増殖の促進およびサイズの増加、転移の促進、および分化の変化を含んでもよい。本明細書に例示されるように、老化細胞が破壊された場合、腫瘍進行は有意に阻害され、小さいサイズの腫瘍および観察される転移性増殖がほとんどないか、または全くない腫瘍をもたらす。
癌療法(例えば、放射線照射または化学療法)を含む薬物療法により誘導される生物学的損傷応答は、老化細胞関連分子の発現を含む。従って、特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法において有用な薬剤は、1つ以上の老化細胞関連ポリペプチド(例えば、限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、およびプロテアーゼ)などの1つ以上の老化細胞関連分子の産生および分泌の低下を容易にする薬剤を含む。当業界で、および本明細書により詳細に記載されるように、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれる表現型などの老化細胞の表現型は、例えば、いくつかのサイトカイン(例えば、炎症性サイトカイン)、増殖因子、細胞外マトリックス成分(ECM)およびECM分解酵素、ならびにプロテアーゼの分泌を特徴とする。癌を有する被験体におけるなどの特定の例においては、これらの因子の分泌は、例えば、望ましくない炎症応答に寄与することにより、有害であり得る。
1つ以上の老化細胞関連分子の産生および分泌の低下を容易にする薬剤を、生物学的損傷応答を誘導する薬物療法の前に、後に、またはそれと同時に投与してもよい。特定の実施形態においては、1つ以上の老化細胞関連分子の産生および分泌の低下を容易にするか、または引き起こす薬剤を、放射線療法または化学療法の施行の直後に、またはすぐ後に(24、48もしくは72時間以内など)投与してもよい。例えば、薬剤としては、コルチコステロンおよびコルチゾール、プレドニゾン、アンドロステロンなどの糖質コルチコイド；フラボノイド(例えば、アピゲニン、ルテロリン、ナリンゲニン)；トラザミド；クロルプロパミド；グリクラジド；フィナステリド；ノルゲストレル-(-)-D；エストラジオール-17-ベータ；ミノキシジル；ベンフォチアミン；カルシフェロール；ノスカピン、およびプロブコールが挙げられる。
本開示に提供されるように、糖質コルチコイドは、SASPを含む、全てではないが(例えば、老化増殖停止)、いくらか(例えば、IL-6、IL-1αシグナリング)の因子を抑制した。背景を挙げると、糖質コルチコイドは、コルチゾール、コルチコステロン、デキサメタゾンおよび関連類似体を含むステロイドホルモンのクラスであり、これらは全部、代謝および免疫機能に対する広範囲の組織特異的効果を有する(例えば、GrossおよびCidlowski, 2008, Trends Endocrinol. Metabl. 19:331-339; Zanchiら、2010, J. Cell. Physiol. 224:311-315を参照されたい)(例えば、Schlossmacherら、2011, J. Endocrinol. 211:17-25を参照されたい)。糖質コルチコイドは、それぞれ、免疫細胞のアポトーシスを誘導するか、または抗炎症サイトカインを活性化するか、もしくは前炎症サイトカインをコードする遺伝子を抑制することにより、炎症を抑制すると考えられている。後者の活性は、複数のアイソフォームおよび翻訳後改変された状態で存在する、遍在的に発現される糖質コルチコイド受容体(GR)により媒介される(例えば、Zanchiら、2010, J. Cell. Physiol. 224:311-315; OakleyおよびCidlowski, 2011, J. Biol. Chem. 286:3177-3184を参照されたい)。本明細書に記載のように、糖質コルチコイド(例えば、コルチコステロンおよびコルチゾール)は、SASPが有害であると考えられる条件にとって臨床的に有用であり得る。例えば、本明細書で詳細に説明されるように、DNA損傷的放射線療法および化学療法は、in vivoでSASPを誘導し(例えば、Coppeら、2008, PLoS Biol.6:2853-2868を参照されたい)、これは有害な全身効果、ならびに抗癌療法によって根絶されなかった腫瘍細胞の再増殖を刺激する能力を有し得る。1つ以上の老化細胞関連分子の産生および分泌の低下を容易にするか、または引き起こすそのような薬剤の使用は、生物学的損傷応答を抑制するための本明細書に記載の方法において有用である。
別の特定の実施形態においては、1つ以上の老化関連分子(例えば、SASP因子または成分)の発現、産生、および/または分泌を阻害する薬剤などの、本明細書に記載の薬剤を、それを必要とする被験体に投与することにより、放射線療法または化学療法の有害な副作用(特定の実施形態においては、生物学的損傷応答に伴うか、またはその結果生じ得る)の発生を減少させる、阻害する、もしくは防止する(すなわち、発生の可能性を減少させる)か、またはその重篤度を減少させるための方法が提供される。例えば、有害な副作用としては、限定されるものではないが、吐き気、嘔吐、末梢神経障害、疲労、貧血、脱毛、疼痛、感染、粘膜炎、体液貯留、下痢、便秘、爪および皮膚の問題、口、歯茎もしくは喉の問題、または放射線療法もしくは化学療法により引き起こされる任意の副作用が挙げられる(例えば、National Cancer Instituteのウェブサイトを参照されたい)。
本明細書に記載の方法における使用のための薬剤としては、被験体における正常細胞の老化を防止する(すなわち、発生の可能性を減少させる)ものが挙げられる。そのような薬剤は、生物学的損傷応答を抑制するか、もしくは阻害するか、またはいくつかの様式では、それと干渉することができ、細胞シグナリング経路を阻害、防止もしくは破壊するか、またはポリペプチドの転写もしくは翻訳を阻害するか、もしくは減少させるか、またはいくつかの様式では、それと干渉するか、または損傷応答を行うことができる1つ以上の他の老化細胞関連分子の産生と干渉するものを含む。例えば、有用な薬剤としては、いくつかの様式では、SASPの上流の調節因子であるIL-1αの減少を容易にする薬剤が挙げられる。IL-1αは、転写因子である核内因子カッパB(NF-κB)を活性化することにより、SASPを確立および維持する(例えば、Orjaloら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17031-36 (2009); Freundら、EMBO J. 30:1536-48 (2011)を参照されたい)。さらなる例として、(a)p53活性およびPI3K/AKT経路を調節するWNT16B；(b)p53の正の上流調節因子であるp16；(c)pRBの正の上流調節因子であるARF；(d)p53の下流のエフェクターであるp21；(e)癌遺伝子経路に細胞増殖シグナルを送達する1つ以上の因子、例えば、RAS-RAF-MEK経路；(f)アンドロゲン受容体経路を刺激する1つ以上の因子；または老化関連シグナリング経路を刺激することができる、反応性酸素種の産生を阻害する薬剤の発現および/または活性を阻害する薬剤も有用である。
本明細書に記載のように、生物学的損傷応答を抑制する薬剤を、薬物療法より前(前)、それに続いて(後)、またはそれと同時に投与することができる。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答(細胞老化など)が起こった場合、薬剤は薬物療法の施行に続いて、例えば、被験体が薬物療法を受ける少なくとも2、3、4、5、6、7、8、10、30、60、もしくは少なくとも90日後に、または受ける後、少なくとも3〜10日間、少なくとも10〜30日間、30〜60日間または少なくとも60〜90日間、投与される。特定の実施形態においては、前記薬剤は、薬物療法の施行後2〜10日間(すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間)投与される。薬物療法の施行後に投与するのに有用な薬剤としては、例えば、限定されるものではないが、老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする薬剤(例えば、抗老化細胞剤)が挙げられる。他の薬剤としては、老化細胞関連分子の活性を遮断するか、もしくは阻害するか、または老化細胞関連分子の発現および/もしくは分泌を阻害することによって、分子の活性から生じる生物学的損傷を減少させるものが挙げられる。2サイクル以上の薬物療法の施行を含む薬物療法レジメンに関して、薬剤を、それぞれのサイクル後などの1以上のサイクルの療法の後に(それに続いて)投与することができる。
他の実施形態においては、細胞による損傷応答の開始を防止もしくは阻害することができる薬剤を用いる方法または薬物療法への細胞および組織の曝露の際の損傷応答を減弱させる(すなわち、その重篤度を減少させる)ことができる方法が提供される。従って、一実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、薬物療法の施行の前に投与される。特定の実施形態においては、そのような薬剤は、例えば、療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に投与される。1サイクル以上の薬物療法の施行を含む薬物療法レジメンに関して、薬剤を、それぞれのサイクルの前などの、1サイクル以上の療法の前(より前)に投与することができる。
同時投与とは、薬剤が薬物療法の施行の1〜24時間以内に投与されることを意味する。併用療法は、薬物療法と薬剤との重複投与(施行)を含んでもよい。特定の実施形態においては、薬剤は、薬物療法の一部と同時に投与される。例えば、薬剤の投与を、薬物療法の施行の1〜24時間以内に投与してもよく、薬物療法の過程が完了した後も薬剤を投与し続ける。例えば、薬剤を薬物療法の施行の1〜24時間以内に最初に投与し、薬剤の投与を、さらに1〜10、2〜10、3〜10、4〜10、5〜10、6〜10、7〜10、8〜10、9〜10日間または10日より長く(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9または少なくとも10日間)継続する。別の言い方をすれば、送達される薬剤の総量の少なくとも一部である薬剤の一部を、薬物療法の施行と同時に(1〜24時間以内に)投与する。特定の実施形態においては、薬剤を、細胞老化(例えば、細胞のSASPにより例示される)が確立される間の長時間にわたって投与することができる。この治療レジメンは、さもなければ薬剤の投与の非存在下で起こるであろう生物学的損傷を有意に減少させる様式で老化細胞の分泌表現型を変化させることができる。2サイクル以上の薬物療法の施行を含む薬物療法レジメンに関して、薬剤を、それぞれのサイクルの薬物療法施行との同時投与などの、1サイクル以上の療法と同時に投与することができる。
また、薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する少なくとも2つの薬剤(すなわち、2つ以上の薬剤)を投与することにより、薬物療法の有効性を増強するための方法が、本明細書で企図される。便宜上、少なくとも2つの薬剤を、本明細書では第1の薬剤および第2の薬剤と呼び、これらは一緒になって、付加的様式で、または相乗的様式で生物学的損傷応答を抑制することができる。
薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する少なくとも2つの薬剤を投与する場合の別の実施形態においては、少なくとも1つの薬剤(便宜上、第1の薬剤と呼ぶ)は、細胞が損傷応答を開始するのを防止もしくは阻害することができるか、または薬物療法に曝露された場合に細胞および組織による損傷応答を減弱させる(すなわち、その重篤度を減少させる)ことができる薬剤である。そのような薬剤としては、被験体における正常細胞の老化を防止する(すなわち、発生の可能性を減少させる)本明細書に記載のものが挙げられる。従って、この薬剤は、薬物療法の施行の前に投与される。少なくとも1つのさらなる薬剤(本明細書では便宜上、第2の薬剤と呼ばれる)は、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、または薬物療法への曝露の結果として存在する1つ以上の老化細胞の選択的破壊、殺傷、消失、もしくは除去を容易にする抗老化細胞剤である。第2の薬剤は、生物学的損傷応答を誘導し得る薬物療法の施行に続いて投与される。
被験体が生物学的損傷療法である数サイクルの薬物療法を必要とする場合、少なくとも2つの薬剤の投与を含むレジメンを用いることができる。一実施形態においては、薬物療法は、放射線照射または化学療法または放射線照射と化学療法との組合せなどの、癌療法である。第1の薬剤は、薬剤が生物学的損傷応答を抑制するのを可能にするのに十分な時間で薬物療法の施行の前に、例えば、療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に投与される。第2の薬剤は、被験体が薬物療法を受ける少なくとも3、4、5、6、7、8、10、30、60または少なくとも90日後に、例えば、細胞老化が誘導および確立された後の時間に投与される。第1および第2の薬剤のそれぞれが投与される時点は、療法の種類および療法の各サイクル間の時間の長さに依存するであろう。特定の実施形態においては、第1の薬剤は、薬物療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、または少なくとも1週間前に投与され、第2の薬剤は、薬物療法サイクル間の時間間隔(ギャップとも呼ばれる)に応じて、被験体が薬物療法を受けた少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10日後に投与される。
生物学的損傷応答
薬物療法により誘導される(すなわち、活性化される、促進される、もしくは刺激される)生物学的損傷応答は、治療された被験体の療法への曝露の際に誘導される被験体の細胞応答、組織関連応答および/または全身性応答を含む。本明細書に記載の薬物療法により誘導される生物学的損傷応答としては、限定されるものではないが、細胞老化、DNA損傷応答(本明細書および当業界では、DDRとも呼ばれる)、腫瘍促進応答、およびその組合せが挙げられる。
老化を誘導する薬物療法により誘導される生物学的損傷応答は、エピゲノム破壊またはゲノム損傷を引き起こし得る。浸食されたテロメアは永続的なDDRを生成し、老化増殖停止を開始させ、維持する。多くの老化細胞もまた非テロメア部位にゲノム損傷を担持し、老化増殖停止にとって必要とされる永続的DDRシグナリングを生成することができる。生物学的損傷応答は、検出可能なDDRシグナリングの非存在下での細胞老化を含んでもよい(例えば、Rodierら、J. Cell Biol. 192:547-56(2011)、およびそこに引用された参考文献を参照されたい)。さらに、通常、老化増殖停止を実行するサイクリン依存的キナーゼ阻害剤(CDKis)、特に、p21WAF1およびp16INK4aの異所性発現は、明らかなDDRなしに老化を引き起こし得る。
特定の実施形態においては、正常細胞および/または細胞に加えて、薬物療法により害されたか、または損傷された標的(例えば、腫瘍細胞)に対しても薬物療法が意図される。例えば、罹患した正常細胞は、薬物療法の標的(複数可)である細胞および組織の周囲の、それに隣接する、またはそれを包含する微小環境を含む。例えば、癌の治療に関して、放射線照射または化学療法を含む薬物療法は、腫瘍細胞を標的化するが、腫瘍(固形または液性であってもよい)の周囲の、またはそれに隣接する微小環境の良性細胞は、療法への曝露の際に薬物療法誘導性損傷応答を示し得る。
細胞老化は、細胞増殖の安定で本質的には永続的な停止であり、遺伝子発現の広範囲の変化を伴う。正常細胞および腫瘍細胞の両方の多くの細胞型は、ストレスに応答して老化を受ける。当業界で記載されたように、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれる表現型などの、老化細胞の表現型は、例えば、いくつかのサイトカイン(例えば、炎症性サイトカイン)、増殖因子、細胞外マトリックス成分(ECM)およびECM分解酵素、ならびにプロテアーゼの分泌を特徴とする。増殖停止は腫瘍進行に対する手強い障壁をもたらし(例えば、Campisi, Curr. Opin. Genet. Dev. 21:107-12 (2011); Campisi, Trends Cell Biol. 11:S27-31 (2001); Prieurら、Curr. Opin. Cell Biol. 20:150-55 (2008)を参照されたい)、老化細胞により分泌される分子は組織修復を刺激することができる(例えば、Adams, Molec. Cell 36:2-14 (2009); Rodierら、J. Cell Biol. 192:547-56(2011)を参照されたい)が、老化細胞は炎症を引き起こし得る分子も分泌する(例えば、Freundら、Trends Mol. Med. 16:238-46(2010); Davalosら、Cancer Metastasis Rev. 29:273-83(2010)を参照されたい)。低レベルの慢性炎症は、加齢組織の特質であり、炎症は癌などの実質的に全ての主要な加齢に関連する病状の主因であるか、またはそれに対する寄与因子である(Ferrucciら、2004, Aging Clin. Exp. Res. 16:240-243; Franceschiら、2007, Mech. Ageing Dev. 128:192-105; Chungら、2009, Ageing Res. Rev. 8:18-30; Davalosら、2010, Cancer Metastasis Rev. 29:273-283; Freundら、2010, Trends Molec. Med. 16:238-248)。かくして、年齢と共に増加し、加齢に関連する病状の部位にある老化細胞は、局所慢性炎症および組織再モデリングを刺激し、それによって加齢による変性疾患ならびに加齢に関連する癌の両方を刺激し得る。
老化細胞は、以下の特徴のうちのいずれか1つ以上を示し得る。(1)老化増殖停止が本質的に永続的であり、既知の生理的刺激によって逆転させることができない。(2)老化細胞はそのサイズを増大させ、時には、非老化対応物のサイズと比較して2倍より大きく拡大する。(3)老化細胞は、リソソーム質量の増加を部分的に反映する、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)を発現する。(4)多くの老化細胞は、休止しているか、または最終的に分化した細胞によっては一般に発現されないp16INK4aを発現する。(5)永続的なDDRシグナリングと共に老化する細胞は、老化を促進するクロマチン変化を含むDNA断片と呼ばれる永続的な核フォーカスを担持する(DNA-SCARS)。これらのフォーカスは、活性化されたDDRタンパク質を含み、一過的な損傷フォーカスから識別可能である。DNA-SCARSは、機能不全テロメアまたはテロメア機能不全により誘導されるフォーカス(TIF)を含む。(6)老化細胞は、本明細書では老化細胞関連分子と呼ばれる分子を発現し、分泌することができ、これは、特定の例においては、永続的DDRシグナリングの存在下で観察することができる。
老化細胞関連分子としては、増殖因子、プロテアーゼ、サイトカイン(例えば、炎症性サイトカイン)、ケモカイン、細胞関連代謝物質、反応性酸素種(例えば、H2O2)、ならびに被験体の原因となる疾患を促進するか、もしくは悪化させ得る炎症および/または他の生物学的効果もしくは反応を刺激する他の分子が挙げられる。老化細胞関連分子としては、老化関連分泌表現型(SASP)、老化メッセージングセクレトーム、およびDNA損傷分泌プログラム(DDSP)を含むと当業界で記載されたものが挙げられる。当業界で記載されたように、これらの群の老化細胞関連分子は、一般的な分子および3つの別々の異なる群の分子を記載することが意図されていない分子を含有する。老化細胞関連分子は、特定の発現され、分泌された増殖因子、プロテアーゼ、サイトカイン、ならびに強力な自己分泌および傍分泌活性を有する他の因子を含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、老化細胞の負の効果は、少なくとも部分的には、老化細胞のSASPを含む前炎症サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、およびプロテアーゼの分泌の結果であると考えられる(例えば、Coppeら、PLoS Biol. 6:2853-68 (2008)を参照されたい)。SASPを含む老化細胞関連分子は、正常な組織構造および機能を破壊し、前悪性または非侵襲性癌細胞における悪性表現型を刺激することができる(例えば、Coppeら、上掲; Coppeら、J. Biol. Chem. 281:29568-74 (2006); Coppeら、PLoS One 5:39188 (2010); Krtolicaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:12072-77(2001); Parrinelloら、J. Cell Sci. 118:485-96 (2005)を参照されたい)。ECM関連因子は、炎症タンパク質およびECM再モデリングのメディエーターを含み、老化細胞中で強く誘導される(例えば、Kuilmanら、Nature Reviews 9:81-94 (2009)を参照されたい)。腫瘍細胞などの、薬物療法により標的化される細胞に対する傍分泌効果を有し得る因子としては、遺伝毒性療法である薬物療法への曝露後に細胞中での発現が上昇した細胞外タンパク質が挙げられる(例えば、Sunら、Nature Medicine, 18:1359-1368 (2012)を参照されたい)。また、例えば、Campisi, 2003, Nature Rev. Cancer 3:339-349; Coppeら、2010, Annu. Rev. Pathol. 5:99-118; Williams, 1957, Evolution 11:398-411; Colladoら、2010, Nature Rev. Cancer 10:51-57; Beausejourら、2006, Nature 443:404-405; Krizhanovskyら、2008, Cell 134:657-667; Junら、2010, Nature Cell Biol. 12:676-685; Parrinelloら、2005, J. Cell Sci. 118:485-496; Acostaら、2008, Cell 133:1006-1018; Kuilmanら、2008, Cell 133:1019-1031; Labergeら、2012, Cancer Microenivron. 5:39-44も参照されたい。
老化細胞関連分子は、老化細胞の前炎症表現型(例えば、SASP)を構成し得る分泌因子を含む。これらの因子としては、限定されるものではないが、GM-CSF、GROα、GROα、β、γ、IGFBP-7、IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、MCP-2、MIP-1α、MMP-1、MMP-10、MMP-3、アンフィレグリン、ENA-78、エオタキシン-3、GCP-2、GITR、HGF、ICAM-1、IGFBP-2、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-1β、MCP-4、MIF、MIP-3α、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2、オンコスタチンM、オステオプロテゲリン、PIGF、RANTES、sgp130、TIMP-2、TRAIL-R3、Acrp30、アンギオゲニン、Axl、bFGF、BLC、BTC、CTACK、EGF-R、Fas、FGF-7,G-CSF、GDNF、HCC-4、I-309、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-3、IL-1 R1、IL-11、IL-15、IL-2R-α、IL-6 R、I-TAC、レプチン、LIF、MMP-2、MSP-a、PAI-1、PAI-2、PDGF-BB、SCF、SDF-1、sTNF RI、sTNF RII、トロンボポエチン、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β3、MIP-1-デルタ、IL-4、FGF-7、PDGF-BB、IL-16、BMP-4、MDC、MCP-4、IL-10、TIMP-1、Fit-3リガンド、ICAM-1、Axl、CNTF、INF-γ、EGF、BMP-6が挙げられる。当業界では老化メッセージングセクレトーム(SMS)因子と呼ばれることもあるものを含むさらなる同定された因子としては、そのいくつかはSASPポリペプチドの一覧中に含まれるが、限定されるものではないが、IGF1、IGF2、およびIGF2R、IGFBP3、IDFBP5、IGFBP7、PAl1、TGF-β、WNT2、IL-1α、IL-6、IL-8、およびCXCR2結合ケモカインが挙げられる。細胞関連分子としては、限定されるものではないが、Sunら、Nature Medicine、上掲に記載の因子も挙げられ、例えば、MMP1、WNT16B、SFRP2、MMP12、SPINK1、MMP10、ENPP5、EREG、BMP6、ANGPTL4、CSGALNACT、CCL26、AREG、ANGPT1、CCK、THBD、CXCL14、NOV、GAL、NPPC、FAM150B、CST1、GDNF、MUCL1、NPTX2、TMEM155、EDN1、PSG9、ADAMTS3、CD24、PPBP、CXCL3、MMP3、CST2、PSG8、PCOLCE2、PSG7、TNFSF15、C17orf67、CALCA、FGF18、IL8、BMP2、MATN3、TFP1、SERPINI 1、TNFRSF25、およびIL23A遺伝子の産物が挙げられる。老化細胞関連タンパク質はまた、老化細胞上で発現される細胞表面タンパク質(または受容体)も含み、非老化細胞の細胞表面上には検出可能に少量で存在するか、または存在しないタンパク質を含む。
生物学的損傷応答を抑制する薬剤
生物学的損傷応答を抑制する薬剤としては、当業者が、抑制が統計的に、または臨床的に有意であると認識する程度まで損傷応答を減少させるか、または阻害する薬剤が挙げられる。生物学的損傷応答を抑制することができる薬剤としては、低分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、抗体、抗原結合断片(すなわち、少なくとも1個の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドおよびポリペプチド)、組換えウイルスベクター、または核酸が挙げられる。
老化細胞を「選択的に」破壊するか、またはその「選択的」破壊を容易にする治療剤は、優先的に(またはより大きい程度で)、老化細胞を破壊するか、またはその破壊を容易にするか、またはその消失もしくは除去を容易にする薬剤である。換言すれば、治療剤は、非老化細胞を破壊するか、またはその破壊を容易にするその能力と比較して、生物学的、臨床的、および/または統計的に有意な様式で老化細胞を破壊するか、またはその破壊を容易にする。例えば、限定されるものではないが、治療剤は、細胞膜の完全性を破壊すること；細胞中の1つ以上の代謝プロセスを阻害すること；老化細胞のアポトーシスもしくは壊死を誘導するシグナリング経路を増強もしくは刺激すること；細胞生存にとって必要な、それぞれ遺伝子もしくはタンパク質の転写もしくは翻訳を破壊すること；または老化細胞に結合して、細胞の消失もしくは除去、例えば、免疫細胞による消失を容易にすること、またはその任意の組合せにより、老化細胞を直接的または間接的に殺傷することができる。
また、本明細書に記載されるように、老化細胞関連分子(例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞外マトリックス成分(ECM)およびECM分解酵素、ならびにプロテアーゼ)の発現、分泌、または生物活性を阻害する薬剤は、本明細書に記載の方法において有用である。特定の実施形態においては、前記薬剤は、本明細書に記載の、および当業界で公知の1つ以上のSASP因子(または成分)の産生および分泌を阻害する(減少させる、低下させる、防止する)。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF、およびBMP-4のうちの少なくともいずれか1つ以上の産生および/または分泌を阻害する(すなわち、減少させる、抑制する、防止する、遮断する)ものである。特定の他の実施形態においては、前記薬剤は、IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF、およびBMP-4のうちの少なくともいずれか2、3、4、5、6、7、8つ、または全部の産生および/または分泌を阻害する。
対象の薬剤としては、非老化細胞中よりも老化細胞中で高レベルに発現される酵素により、活性化されるか、または活性型に変換されるプロドラッグであるものが挙げられる。他の対象の薬剤としては、非老化細胞と比較して老化細胞上にのみ存在するか、またはより高レベルで存在する細胞の細胞表面上のタンパク質に結合するものが挙げられる。そのようなタンパク質の例としては、βアクチン突然変異体；β-アクチン(ACTB)タンパク質；薬剤耐性関連タンパク質LRP；主要ヴォールトタンパク質(MVP)；甲状腺ホルモン結合タンパク質前駆体；プロリル4-ヒドロキシラーゼ、ベータサブユニット前駆体(P4HB)；ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、A鎖；電子移動フラボタンパク質、ベータポリペプチド(ETFP)；ATPシンターゼ、H+輸送、ミトコンドリアF複合体、アルファサブユニット前駆体；カテプシンB；ならびに名前のないタンパク質産物、GI:35655、GI:158257194；およびGI 158259937(例えば、特許出願公開WO2009/085216、表1(その全体が参照により本明細書に組込まれる)を参照されたい)が挙げられる。特定の実施形態においては、老化細胞に特異的に結合する治療剤は、非老化細胞に対するよりも老化細胞に対する少なくとも2、4、8、10、50、100、もしくは1000倍高い親和性を有するか、または特定の実施形態においては、前記薬剤は非老化細胞に検出可能に結合しない。老化細胞に特異的に結合するペプチドは、PCT特許出願公開第2009/085216号に記載の12アミノ酸のペプチドを含む。非老化細胞よりも老化細胞上により高レベルに存在するタンパク質は、典型的には細胞内タンパク質であり、非老化細胞の細胞表面上では検出可能ではないタンパク質であってもよい。細胞老化を含む生物学的損傷応答を抑制する他の薬剤としては、非老化細胞中よりも老化細胞中でより頻繁に、またはより高い比率で起こる代謝プロセスによって活性化されるものが挙げられる。
細胞老化を含む生物学的損傷応答を抑制する薬剤としては、老化にとって重要である遺伝子産物の分泌および/もしくは発現を直接的もしくは間接的に阻害するか、または遺伝子産物の生物学的活性を阻害する薬剤が挙げられる。これらの遺伝子産物の例を、以下の表に提供する；Sunら、上掲も参照されたい。
Figure 2015502366
本明細書に記載の方法において用いることができる薬剤としては、限定されるものではないが、細胞老化を抑制するなどの、生物学的損傷応答を抑制する低分子有機物質が挙げられる。薬剤としては、老化細胞を破壊するか、またはその破壊もしくは除去もしくは消失を容易にする低分子も挙げられる。対象の低分子化合物を、無作為に、またはSARによって誘導体化して、活性が改善された化合物を得ることができる。低分子有機物質は、典型的には、105ダルトン未満、104ダルトン未満、または103ダルトン未満の分子量を有する。
薬物療法の有効性を増強するための本明細書に記載の方法において有用な薬剤としては、抗体、または抗原結合断片が挙げられる。抗原結合断片は、全抗体から調製された断片であってもよい。抗原結合断片はまた、少なくとも1個の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドまたはポリペプチドも含む。有用な抗体および抗原結合断片としては、非老化正常細胞と比較して、老化細胞によって過剰に発現される、選択的に発現される、またはそれによってのみ発現される同種抗原に特異的に結合するものが挙げられる。抗体は、内在化抗体またはその同種抗原との相互作用を介して老化細胞により内在化される抗原結合断片であってもよい。内在化抗体または抗原結合断片は、細胞傷害剤を老化細胞に送達させるのに有用であってもよい。
抗体のその同種抗原への結合特性は、一般的には、例えば、当業者であれば容易に実施することができる酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降、免疫ブロッティング、対抗電流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイなどの免疫検出法を用いて決定および評価することができる(例えば、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照されたい)。本明細書で用いられるように、抗体は、それが抗原または免疫原と検出可能なレベルで反応する場合、同種抗原に対して「免疫特異的」、「特異的」または「特異的に結合する」と言われる。抗体およびその抗原結合断片の親和性を、従来の技術、例えば、Scatchardら(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949))により記載されるものを用いて、および表面プラズモン共鳴(SPR; BIAcore(商標)、Biosensor、Piscataway、NJ)により容易に決定することができる。
抗体は、動物の免疫化およびその後の抗体の単離により調製されたか、または当業界で日常的に実施され、本明細書に記載された方法および技術に従って特定のB細胞からクローニングされた、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。可変領域または1つ以上の相補性決定領域(CDR)を、抗原結合断片またはペプチドライブラリーから同定および単離することができる。抗体、または抗原結合断片を、組換え的に操作する、および/または組換え的に産生させることができる。
抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、またはIgAに属するものであってよく、動物、例えば、家禽(例えば、ニワトリ)および限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類を含む哺乳動物から取得するか、または誘導することができる。ヒト被験者における使用については、抗体および抗原結合断片は、典型的には、非ヒトペプチドおよびポリペプチド配列に対する被験体による免疫原性応答を減少させるためのヒト、ヒト化、またはキメラである。
抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異的抗体であるモノクローナル抗体、またはそれから調製もしくは誘導された抗原結合断片(例えば、F(ab')2、Fab、Fab'、FvおよびFd)であってもよい。抗原結合断片はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成する点で抗体のように作用する任意の合成の、または遺伝子操作されたタンパク質であってもよい。例えば、抗体断片は、軽鎖可変領域からなる単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなるFv断片、組換え一本鎖ポリペプチド分子(scFvタンパク質)、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。特定の他の実施形態においては、抗体は、ミニ抗体、異なる抗原特異性を有する第2のFvと結合した抗原に特異的な第1のFvを含む二特異的および二官能性抗体、ならびにダイアボディなどの多量体抗体断片である。有用な方法は一般に、例えば、Haydenら、Curr Opin. Immunol. 9:201-12 (1997); Colomaら、Nat. Biotechnol. 15:159-63 (1997); 米国特許第5,910,573号; Holligerら、Cancer Immunol. Immunother. 45:128-30(1997); Drakemanら、Expert Opin. Investig. Drugs 6:1169-78 (1997); Koelemijら、J. Immunother. 22:514-24 (1999); Marvinら、Acta Pharmacol. Sin. 26:649-58 (2005); Dasら、Methods Mol. Med. 109:329-46(2005)に記載されている。
最小認識単位または他の抗原結合断片を、ペプチドライブラリーから同定することができる。そのようなペプチドを、コンビナトリアルライブラリー(例えば、国際特許出願PCT/US91/08694およびPCT/US91/04666を参照されたい)、およびファージディスプレイペプチドライブラリー(例えば、Scottら、Science 249:386 (1990); Devlinら、Science 249:404 (1990); Cwirlaら、Science 276: 1696-99 (1997); 米国特許第5,223,409号; 米国特許第5,733,731号; 米国特許第5,498,530号; 米国特許第5,432,018号; 米国特許第5,338,665号; 1994; 米国特許第5,922,545号; 国際特許出願公開WO96/40987およびWO98/15833を参照されたい)から同定および単離することができる。最小認識単位またはCDR(すなわち、重鎖可変領域中に存在する3個のCDRのうちのいずれか1個以上および/または軽鎖可変領域中に存在する3個のCDRのうちの1個以上)であるペプチドを、本明細書に記載のように対象のポリペプチドに特異的に結合するペプチド配列を比較、予測するために用いることができるコンピュータモデリング技術により同定することができる(例えば、Bradleyら、Science 309:1868 (2005); Schueler-Furmanら、Science 310:638(2005)を参照されたい)。
抗体を、一般的には、当業者には公知の様々な技術のいずれかにより調製することができる。動物を免疫する、および/または所望の特異性の抗体についてスクリーニングするのに用いられる免疫原としては、例えば、非老化細胞よりも老化細胞の細胞表面上により大量に存在するか、または非老化細胞上のものとは異なるコンフォメーションを有する、老化細胞から単離されたタンパク質；および外膜調製物などの老化細胞抽出物、老化細胞から単離されたオルガネラなどが挙げられる。抗体を、ヒト免疫グロブリンファージライブラリー、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリー、マウス免疫グロブリンファージライブラリー、および/またはニワトリ免疫グロブリンファージライブラリーから同定および単離することもできる(例えば、Winterら、Annu. Rev. Immunol. 12:433-55(1994); Burtonら、Adv. Immunol. 57:191-280 (1994); 米国特許第5,223,409号; Huseら、Science 246:1275-81(1989); Schlebuschら、Hybridoma 16:47-52(1997)およびそこに引用された参考文献; Raderら、J. Biol. Chem. 275:13668-76(2000); Popkovら、J. Mol. Biol. 325:325-35(2003); Andris-Widhopfら、J. Immunol. Methods 242:159-31(2000)を参照されたい)。非ヒト種または非ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離される抗体を、本明細書に記載の、および当業界で公知の方法に従って遺伝子操作して、抗体またはその断片を「ヒト化」することができる。
ヒト化抗体を設計するための有用な戦略は、例えば、限定されるものではないが、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域と最も相同であるヒト可変フレームワーク領域の同定(例えば、Jonesら、Nature 321:522-25(1986); Riechmannら、Nature 332:323-27(1988)を参照されたい)を含んでもよい。ヒト化抗体を、例えば、コンピュータモデリング、および次いで、CDRループおよび決定基を公知のヒトCDRループ構造および決定基と比較することにより、CDRループコンフォメーションおよび非ヒト可変領域の構造決定基を含むように設計することができる(例えば、Padlanら、FASEB 9:133-39 (1995); Chothiaら、Nature, 342:377-83 (1989)を参照されたい)。コンピュータモデリングを用いて、配列相同性により選択されたヒト構造鋳型と、非ヒト可変領域とを比較することもできる。
ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、抗体、およびその抗原結合断片(すなわち、少なくとも1個の抗体V領域を含むペプチドもしくはポリペプチド)などの薬剤または老化細胞に対して特異的である他の薬剤を、老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする第2の薬剤に連結する(すなわち、コンジュゲートする、融合する、またはいくつかの様式では、結合する、または付着させる)ことができる。薬剤の老化細胞への結合により老化細胞に送達される場合、細胞傷害部分は、老化細胞を選択的に破壊する。薬剤が組換え産生される場合、細胞傷害部分をコードするヌクレオチド配列を、インフレームで薬剤および1つ以上の調節発現配列に連結して、薬剤と細胞傷害部分とを含む融合タンパク質を作製することができる。そのような第2の薬剤としては、植物および微生物から誘導される毒素などの細胞傷害分子、ならびに上記の抗体、ポリペプチド、またはペプチドに連結されない状態では老化細胞に選択的に結合しない低分子が挙げられる。
生物学的損傷応答を抑制する薬剤としては、ペプチド-IgFc融合ポリペプチド(当業界ではペプチボディとも呼ばれる(例えば、米国特許第6,660,843号を参照されたい))を含むペプチド-免疫グロブリン(Ig)定常領域融合ポリペプチドが挙げられる。ペプチドは、任意の天然の、または組換え的に調製された分子であってもよい。ペプチド-IgFc融合ポリペプチドなどの、ペプチド-Ig定常領域融合ポリペプチドは、対象のタンパク質の活性を変化させることができる生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む。Fcポリペプチドは、Fcポリペプチド突然変異タンパク質であってもよい。免疫細胞の免疫反応性などの、細胞の生物学的機能を変化させるペプチドを、コンビナトリアルライブラリー(例えば、国際特許出願PCT/US91/08694およびPCT/US91/04666を参照されたい)ならびにファージディスプレイペプチドライブラリー(例えば、Scottら、Science 249:386 (1990); Devlinら、Science 249:404 (1990); Cwirlaら、Science 276: 1696-99 (1997); 米国特許第5,223,409号; 米国特許第5,733,731号; 米国特許第5,498,530号; 米国特許第5,432,018号; 米国特許第5,338,665号; 1994; 米国特許第5,922,545号; 国際特許出願WO 96/40987およびWO 98/15833を参照されたい)から同定および単離することができる。
特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制する薬剤は、老化細胞であるか、または疾患微小環境にある細胞のゲノムまたはmRNAの一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり、生物損傷(すなわち、細胞損傷)薬物療法により老化に誘導することができる。対象の老化細胞ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である(例えば、低分子干渉核酸、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、またはペプチド核酸)、ならびに遺伝子および/またはタンパク質発現を変化させるのに用いることができるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書に記載のように、細胞ポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合するか、またはハイブリダイズするこれらのポリヌクレオチドを、当業界で利用可能なヌクレオチド配列を用いて調製することができる。別の実施形態においては、配列特異的ではないアプタマーなどの核酸分子を用いて、遺伝子および/またはタンパク質発現を変化させることもできる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、mRNAまたはDNAなどの核酸分子に配列特異的な様式で結合する。アンチセンス剤としての使用のためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定ならびに標的化送達のための遺伝子をコードするDNAの同定は、当業界で周知の方法を含む。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さ、および他の特徴は周知である。アンチセンス技術を用いて、ポリメラーゼ、転写因子、または他の調節分子の結合との干渉により遺伝子発現を制御することができる(Geeら、In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)を参照されたい)。
低分子干渉RNAを、老化細胞関連ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節する(低下させるか、または阻害する)ために用いることができる。例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、および低分子ヘアピンRNA(shRNA)分子などの低分子核酸分子を、本明細書に記載の方法に従って用いて、対象の細胞ポリペプチドの発現を調節することができる。siRNAポリヌクレオチドは、二本鎖RNA(dsRNA)を含むのが好ましいが、一本鎖RNAを含んでもよい(例えば、Martinezら、Cell 110:563-74(2002)を参照されたい)。siRNAポリヌクレオチドは、本明細書で提供され、当業者には公知であり、使用されるヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは両方の組合せ)および/またはヌクレオチド類似体の他の天然の、組換えの、または合成の一本鎖または二本鎖ポリマーを含んでもよい。
特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが組込まれた組換えベクターによって送達することができる。他の実施形態においては、組換えウイルスベクターは、対象の薬剤である抗体、抗原結合断片、ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、コード配列が1つ以上の調節制御配列に機能し得る形で連結されて、対象のポリペプチド、抗体、抗原結合断片、またはペプチドの発現を駆動するように挿入された組換え発現ベクターであってもよい。組換えベクターまたは組換え発現ベクターは、ウイルス組換えベクターまたはウイルス組換え発現ベクターであってもよい。ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノ随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムが挙げられる。ウイルスベクターは、生、弱毒化、複製制限または複製欠損であってもよく、典型的には、非病原性(欠損)の複製可能ウイルスベクターである。そのようなウイルスベクターを設計および製造するための手順および技術は当業界で周知であり、当業者によって日常的に実施されている。
本明細書に記載の方法において有用な薬剤を、本明細書に記載の、および当業界における技術および手順よって同定またはスクリーニングまたは特性評価することができる。細胞老化を抑制するものなどの生物学的損傷応答を抑制する薬剤を、腫瘍細胞系などの細胞系を用いるin vitroアッセイによって同定することができる。培養細胞を薬物療法および候補薬剤に、同時に、または任意の順序で曝露することができる。そのようなアッセイを、高効率スクリーニング形式を含んでもよいマトリックス(またはアレイ)中で実施することができる。高効率形式は、典型的には、合成または天然の生成物ライブラリーから入手可能であってよい多数の候補薬剤の自動化されたスクリーニングを含む。スクリーニングしようとする候補薬剤を、マイクロフルイディクスに基づくデバイスを用いるなどの高効率スクリーニング形式、または96穴プレート形式、または384穴、48穴もしくは24穴プレート形式などの他の規則的2次元アレイ、または試験管のアレイ中で整理することができる。従って、この形式は自動化に適している。コンピュータまたは他のプログラム可能なコントローラの制御下にある自動化装置を、本明細書に記載の方法の1つ以上のステップのために用いることができる。コントローラは、方法の各ステップの結果をモニタリングし、これらの結果に応答して試験パラダイムを自動的に変化させることができる。
動物モデルを用いて、細胞老化を抑制するものなどの生物学的応答を抑制する薬剤を同定または特性評価することもできる。例えば、老化細胞特異的プロモーターの制御下で発現されるトランスジーンを含む非ヒト動物、特に、遺伝的に改変された非ヒト動物を用いることができる。トランスジーンの老化細胞特異的プロモーターを、対象のポリペプチド(例えば、検出可能な標識または細胞傷害性活性化分子)をコードする核酸配列に機能し得る形で(すなわち、作動可能に)連結することにより、動物内の老化細胞を、制御され、使用者に決定される様式でモニタリングすることができる(本明細書の実施例を参照されたい)。例示的なトランスジーンは、(1)(a)少なくとも1つの検出可能な標識、(b)細胞傷害剤、(c)細胞傷害性活性化分子、(d)RNA、または(e)(a)、(b)、(c)および(d)の任意の組合せをコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された老化細胞特異的プロモーターを含み、腫瘍を示す。例示的動物モデルは、(a)FKBP-キャスパーゼ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(p16-FKBP-キャスパーゼトランスジーン)および緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列(例えば、その全体が参照により本明細書に組込まれるBakerら、Nature 479:232-36(2011)を参照されたい)に機能し得る形で連結されたp16Ink4aプロモーター；または(b)本明細書では3峰性融合タンパク質(3MR)と呼ぶことができる、ルシフェラーゼ、赤色蛍光タンパク質、およびトランケート型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tTK)を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(p16-3MRトランスジーン)に機能し得る形で連結されたp16Ink4aプロモーターを含むトランスジーンを含む。特定のトランスジェニック動物においては、ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、赤色蛍光タンパク質は単量体赤色蛍光タンパク質である。
いくつかの細胞傷害性活性化分子のいずれかを、老化細胞特異的プロモーターに機能し得る形で連結して、動物モデルにおける使用のための好適なトランスジーンを作製することができる。老化細胞特異的様式でのその発現後、細胞傷害性活性化分子は、トランスジェニック動物への活性化剤の投与の際に発現される老化細胞の制御可能な殺傷を誘導することができるものである。細胞傷害性活性化分子の実証例としては、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドおよびFK506結合タンパク質(FKBP)(またはその変異体)-キャスパーゼ融合ポリペプチドが挙げられる。さらなる例を挙げると、トランスジーンによりコードされる細胞傷害性活性化分子は、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチド(トランケート型TKポリペプチドを含む)であり、活性化剤は、発現される細胞にとっては致死的である毒性部分に変換されるプロドラッグであるガンシクロビルである。
生物学的損傷応答を抑制する薬剤の有効性を、細胞老化を抑制する薬剤の能力を決定することができるそのような動物モデルにおいて評価することができる。細胞老化を抑制する薬剤は、結果として動物モデルにおいて腫瘍増殖を阻害してもよい。腫瘍増殖を、腫瘍サイズによって決定することができ、これは触診または腫瘍の体積もしくは面積の測定(検視後に実施してもよい)、腫瘍の位置(例えば、腫瘍細胞が原発腫瘍部位(すなわち、腫瘍細胞が最初に定着する部位)から転移したかどうかを決定するため)などにより、腫瘍動物モデル業界の当業者が精通している様々な方法で測定することができる。腫瘍増殖に対する治療剤の効果を、腫瘍細胞の分化を検査することによって評価することもできる。
老化細胞および老化細胞関連分子を、当業界で記載された技術および手順により検出することができる。例えば、組織から得られた老化細胞などの老化細胞を、老化マーカーSA-βgal(SA-Bgal)を検出する組織化学または免疫組織化学技術により分析することができる(例えば、Dimriら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9363-9367(1995)を参照されたい)。老化細胞関連ポリペプチドp16の存在を、当業界で実施されているいくつかの免疫化学法のいずれか1つ、例えば、免疫ブロッティング分析により決定することができる。細胞中の、p16 mRNAなどの老化細胞関連ポリペプチドをコードする核酸の発現を、定量的PCRなどの当業界で実施されている様々な技術により測定することができる。老化細胞関連ポリペプチド(例えば、SASPのポリペプチド)の存在およびレベルを、当業界で記載された自動化Luminexアレイアッセイ(例えば、Coppeら、PLoS Biol 6: 2853-68(2008)を参照されたい)などの、自動化高効率アッセイを用いることにより決定することができる。DNA損傷応答を含む生物学的損傷応答をモニタリングするために、様々なDNA損傷応答指示因子を、例えば、Rodierら、Nature Cell Biol 11: 973-979(2009)の方法に従って検出することができる。
本開示はまた、老化関連分泌表現型(SASP)を選択的に阻害する薬剤を同定および特性評価するin vitro方法であって、老化細胞および休止(非老化)細胞を、1つ以上の試験薬剤(すなわち、候補薬剤)と接触させること(すなわち、混合すること、組合わせること、またはいくつかの様式では、相互作用を促進すること)；老化細胞および休止細胞によるSASPに特徴的な1つ以上の成分の産生のレベルを決定することを含む前記方法も提供する。本明細書に記載の方法の各ステップは、各ステップにとって好適な条件下で、および十分な時間にわたって実施される。そのような条件および時間は、本明細書および実施例に提供される例示的方法において考察されており、当業者であれば容易に決定することができる。
例えば、サイトカイン(例えば、炎症性サイトカイン)、増殖因子、細胞外マトリックス成分(ECM)およびECM分解酵素、ならびにそれぞれの老化細胞および休止細胞により分泌されるプロテアーゼなどの、SASP分子のレベルを決定し、比較する。全体として細胞傷害を引き起こすことなく、および休止細胞においてSASPを誘導することなく、1つ以上のSASP成分の産生を減少させる試験薬剤は、老化関連分泌表現型を選択的に阻害する薬剤である。全体として細胞傷害性がない試験薬剤を選択することにより、細胞死を介してSASP成分を低下させた化合物を排除することができる。細胞傷害性(または細胞生存能力)を測定する様々な方法が当業界で公知であり、例えば、細胞膜完全性(トリパンブルーまたはヨウ化プロピジウム)を評価するための方法、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、MTTまたはMTSアッセイ、ATPアッセイ、スルホローダミンBアッセイ、およびWSTアッセイが挙げられる。特定の実施形態においては、全体としての細胞傷害性または細胞生存能力を、ATPレベルを検出することにより測定することができる。
特定の実施形態においては、試験薬剤を選択するステップは、全体としての細胞傷害性なしに、および休止細胞中でSASPを誘導することなく、および老化増殖停止を逆転させることなく1つ以上のSASP成分の産生を減少させる試験薬剤を、老化関連分泌表現型を選択的に阻害する候補薬剤として選択することを含む。
特定の実施形態においては、SASPに特徴的な1つ以上の老化関連成分は、分泌される老化関連分子である。特定の実施形態においては、SASPに特徴的な1つ以上の分子は、本明細書に記載の、および当業界で公知のいずれか1つ以上のSASP因子を含む。特定の実施形態においては、生物学的損傷応答を抑制するために本明細書に記載の方法において用いられる対象の薬剤は、IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF、およびBMP-4のいずれか1つ以上の産生および/または分泌を阻害する(すなわち、減少させる、抑制する、防止する、遮断する)ものである。特定の他の実施形態においては、対象の薬剤は、IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、MCP2、IGF1、PDGF-BB、EGF、およびBMP-4の少なくともいずれか2、3、4、5、6、7、8つ、または全部の産生および/または分泌を阻害する。特定の実施形態においては、対象の薬剤は、SASPに特徴的なより多くの成分のうちの1つの産生および/または分泌を阻害し、SASPに特徴的なより多くの成分のうちの1つはIL-6を含む。
SASPに特徴的な成分の産生を、様々な方法により測定することができる。特定の実施形態においては、SASPに特徴的な成分を、細胞が培養された培地中で測定することができる。培地は、条件化培地であってもよく、試験薬剤による細胞の処理後に、細胞を洗浄し、条件化培地を作成するための時間、試験薬剤の非存在下、無血清培地中でインキュベートする。老化細胞関連分子(例えば、SASPのポリペプチド)の存在およびレベルを、当業界で記載された自動化Luminexアレイアッセイ(例えば、Coppeら、PLoS Biol 6:2853-68(2008)を参照されたい)などの自動化高効率アッセイを用いることにより決定することができる。特定の実施形態においては、SASPに特徴的な成分を、例えば、ウェスタンブロット、ELISA、抗体アレイ、側方流動免疫アッセイ、磁気免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、FACS、およびSurround Optical Fiber Immunoassay(SOFIA)などの免疫アッセイを用いて測定することができる。
特定の実施形態においては、SASPを選択的に阻害する化合物を同定または特性評価する方法は、高効率スクリーニング方法である。合成または天然の生成物ライブラリーからの多数の候補治療剤の高効率スクリーニング、典型的には、自動化スクリーニングを用いて、治療剤を同定することができる。薬剤は、認可された化合物または前臨床化合物であってもよい。スクリーニングしようとする候補治療剤を、マイクロフルイディクスに基づくデバイスを用いるなどの高効率スクリーニング形式、または96穴プレート形式、または1536穴、384穴、48穴もしくは24穴プレート形式などの他の規則的2次元アレイ、または試験管のアレイ中で整理することができる。従って、この形式は自動化に適している。コンピュータまたは他のプログラム可能なコントローラの制御下にある自動化装置を、本明細書に記載の方法の1つ以上のステップのために用いることができる。コントローラは、方法の各ステップの結果をモニタリングし、これらの結果に応答して試験パラダイムを自動的に変化させることができる。様々なスクリーニング形式を用いることができることが当業者には明らかであり、例えば、異なる試験薬剤を異なる容器もしくはウェル中に入れるか、または複数の試験薬剤を単一のウェルもしくは容器中に投入することができるか、またはその組合せも可能である。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されるSASPを選択的に阻害する化合物を同定する方法において用いられる老化細胞および休止(すなわち、非老化)細胞は、線維芽細胞を含む。特定の実施形態においては、細胞は、ヒト線維芽細胞を含む。特定の実施形態においては、本明細書に記載のSASPを選択的に阻害する化合物を同定する方法は、1つ以上の線維芽細胞細胞系および/または同じか、もしくは異なる種に由来する一次線維芽細胞を用いる方法を実施および/または反復することを含んでもよい。他の特定の実施形態においては、本明細書に記載のSASPを選択的に阻害する化合物を同定する方法を、2、3、4つ以上の線維芽細胞細胞系および/または同じか、もしくは異なる種に由来する線維芽細胞主要供給源を用いて実施および/または反復することができる。
線維芽細胞および腫瘍細胞などの細胞の生存能力を維持するためには、バッファーおよび栄養素(例えば、グルコース、アミノ酸(例えば、グルタミン)、塩、ミネラル(例えば、セレン)を含有する、および細胞のin vitroでの培養に必要とされるか、またはそれにとって有益であり、当業者には周知である他の添加物または補助物質(例えば、ウシ胎仔血清または血清補助物質を必要としない代替的な製剤；インスリン；プトレシン；プロゲステロン)を含有してもよい培地(抗生物質を含むか、または含まない)(例えば、GIBCO培地、INVITROGEN Life Technologies、Carlsbad、CAを参照されたい)などの、培養物中の細胞の適切な維持のための培地中で、およびそのために当業界で実施される条件下で細胞を培養する。標準的な細胞培養の方法および実施と同様、本明細書に記載の細胞培養物を、二酸化炭素のレベル(典型的には5%)、湿度、および温度を制御することができるような使用のために設計された組織培養インキュベータ中で維持する。細胞培養系は、例えば、培地中で、または基質もしくは表面コーティング中で提供することができる、外因性(すなわち、それ自体は培養細胞によって産生されない)細胞増殖因子の添加を含んでもよい。本明細書に記載の方法における使用のための細胞に特徴的な増殖を、培地の組成または種類を変更すること、1つ以上の栄養素および/または血清の量を調整することにより最適化することができ、これは当業者が精通している手順である。組織培養業界における当業者はまた、細胞培養物の日常的な維持に用いられる条件(すなわち、培地、添加物、栄養素)を、高効率スクリーニングを含む本明細書に記載の技術のために細胞の適切な集密度および増殖特性を確保することなどの、細胞の特定の操作のために適切に調整する必要があることも認識する。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されるSASPを選択的に阻害する化合物を同定または特性評価する方法において用いられる老化細胞を、放射線への曝露(例えば、X線照射)、化学療法剤(例えば、ドキソルビシン)への曝露、または発癌性タンパク質(例えば、MAPK-6、RAS、MYC、ERK、TRK、WNT)などの、老化を誘導する1つ以上のタンパク質を発現する核酸構築物を用いるトランスフェクションにより、老化に誘導する。特定の実施形態においては、老化細胞は、MAPK-6またはRASを発現する構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
特定の実施形態においては、前記方法は、処理された老化細胞が腫瘍侵襲を刺激する能力を減少させる/抑制する/または阻害する試験薬剤の能力を試験することをさらに含む。腫瘍細胞侵襲は、転移表現型の特質の1つである。試験薬剤の効果を、SASPの有害な特性を抑制するその能力、腫瘍侵襲を刺激するSASPの能力により評価することができる。様々な腫瘍侵襲アッセイが当業界で公知であり、例えば、Boydenチャンバーアッセイおよびその改変(例えば、Albiniら、1987, Cancer Res. 47:3239; Shaw, 2005, Methods Mol. Biol. 294:97-105; Nicolson, 1982, J. Histochem. Cytochem. 30:214-220; Rapesh, 1989, Invasion & Metastasis 9:192-208を参照されたい)が挙げられる。
当業者であれば、本明細書に記載の対象の薬剤を特性評価および同定する方法が、方法のステップ(例えば、洗浄、試薬の添加など)を実施し、データを処理するために日常的に用いられる装備、コンピュータ(およびコンピュータ可読媒体)などを用いることができる。統計分析などの分析手段も、当業者によって日常的に用いられる。
疾患および薬物療法(内科的治療)
疾患および治療を必要とする被験体
本明細書に記載の治療方法を必要とする被験体(すなわち、患者)は、ヒトまたは非ヒト動物である。効能が増強された薬物療法を必要とする被験体は、本明細書に記載の疾患の症状もしくは後遺症を示すか、または疾患を発症する危険性を有し得る。治療することができる非ヒト動物としては、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類(例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど)、げっ歯類(例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ)、ウサギ目の動物、ブタ(例えば、ブタ、ミニブタ)、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、および他の家畜、農業用動物、および動物園の動物が挙げられる。
生物学的損傷応答を抑制する薬剤を受けることができる被験体としては、癌を有するか、または癌を発症する危険性がある被験体が挙げられる。癌を有する被験体は、部分的であっても、完全であっても、寛解(本明細書では癌寛解とも呼ばれる)にある被験体も含む。寛解とは、癌の兆候および症状の減少または消失を指す。部分的寛解においては、全部ではないが、いくらかの癌の兆候および症状が消失している。完全寛解においては、癌の全ての兆候および症状が消失しており、癌細胞が残存する場合でも、それらは検出できない。部分的であるか、または完全である寛解にある被験体、および癌の再発の危険性を有する被験体は、本明細書に記載の方法から利益を得ることができる。
癌を発症する危険性がある患者は、被験体が癌を発症する可能性を増加させる1つ以上の遺伝子突然変異を有する患者を含む。例えば、ヒト遺伝子BRCA1およびBRCA2は、腫瘍抑制因子として知られる遺伝子クラスに属する。これらの遺伝子の突然変異は、遺伝性乳癌および卵巣癌と関連している。BRCA1突然変異は、女性が結腸癌、子宮癌、子宮頸癌および膵臓癌を発症する危険性も増加させ得る。BRCA2中の特定の突然変異はまた、膵臓癌ならびに胃癌、胆嚢癌および胆管癌、およびメラノーマの危険性も増加させる。特定のBRCA1突然変異および/またはBRCA2突然変異を有する男性も、乳癌ならびにおそらく、膵臓癌、精巣癌、および早発型前立腺癌の危険性が高い。癌を発症する危険性がある被験体は、ヌクレオチド除去修復にとって必要とされるXPDヘリカーゼ中の突然変異の結果生じる色素性乾皮症を有する被験体も含む。
本明細書で、および当業界で用いられる用語「癌」または「腫瘍」は、典型的には、異常な細胞増殖を示す細胞を特徴とする疾患を包含する臨床記述用語である。用語「癌」は、悪性腫瘍または腫瘍から生じる疾患状態を説明するために一般に用いられる。あるいは、異常な増殖を、当業界では新生物と呼ぶこともある。組織を参照する場合などの用語「腫瘍」は、一般的には、過剰および異常な細胞増殖を少なくとも部分的に特徴とする任意の異常組織増殖を指す。腫瘍は転移性であってもよく、その解剖学的起源部位および最初の定着部位を超えて被験体の身体を通して他の領域に拡散することができる。癌は、固形腫瘍または液性腫瘍(例えば、白血病)を含んでもよい。
本明細書に記載の方法は、医学界で記載される腫瘍型のいずれか1つを有する被験体における癌療法である薬物療法の有効性を増強するのに有用であってもよい。癌(腫瘍)の型としては、以下のものが挙げられる：副腎皮質癌、小児副腎皮質癌、エイズ関連癌、肛門癌、虫垂癌、基底細胞癌、小児基底細胞癌、膀胱癌、小児膀胱癌、骨肉腫、脳腫瘍、小児星状細胞腫、小児脳幹グリオーマ、小児中枢神経系非定型奇形腫様腫瘍/横紋筋様腫瘍、小児中枢神経系胎児性腫瘍、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、小児頭蓋咽頭腫脳腫瘍、小児上衣腫脳腫瘍、乳癌、小児気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、小児カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発不明癌、小児原発不明癌、小児心臓腫瘍、子宮頸癌、小児子宮頸癌、小児脊索腫、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、小児結腸直腸癌、肝外胆管癌、非浸潤性乳管癌(dcis)、子宮内膜癌、食道癌、小児食道癌、小児鼻腔神経芽細胞腫、眼癌、骨の悪性線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、小児胃癌、消化管間質腫瘍(gist)、小児消化管間質腫瘍(gist)、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、頭部および頸部癌、小児頭部および頸部癌、肝細胞(肝臓)癌、下咽頭癌、腎臓癌、腎細胞腎臓癌、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、小児喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病(all)、急性骨髄性白血病(aml)、慢性リンパ球性白血病(cll)、慢性骨髄性白血病(cml)、ヘアリー細胞白血病、口唇癌、肝臓癌(原発性)、小児肝臓癌(原発性)、上皮内小葉癌(lcis)、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫(cns)、メラノーマ、小児メラノーマ、眼内(眼)メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、小児悪性中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、NUT遺伝子を含む正中線神経束癌、口腔癌、小児多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成新生物、骨髄増殖性新生物、多発性メラノーマ、鼻腔癌、鼻咽頭癌、小児鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、小児口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、小児卵巣癌、上皮性卵巣癌、低悪性度腫瘍卵巣癌、膵臓癌、小児膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍(膵島細胞腫瘍)、小児乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、小児胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂移行上皮癌、網膜芽腫、唾液腺癌、小児唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、小児横紋筋肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、小児皮膚癌、非メラノーマ皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、小児扁平上皮癌、精巣癌、小児精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、小児胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、小児甲状腺癌、尿管移行上皮癌、尿道癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症。
液性腫瘍である癌は、血液、骨髄、およびリンパ節に生じるものと当業界では分類されており、一般的には、白血病(骨髄性およびリンパ球性)、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫)、およびメラノーマ(多発性メラノーマを含む)が挙げられる。白血病は、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、およびヘアリー細胞白血病を含む。固形腫瘍であり、ヒトにおいてより高頻度で生じる癌としては、例えば、メラノーマ、前立腺癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、結腸癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、カポジ肉腫、皮膚癌(扁平上皮皮膚癌など)、腎臓癌、頭部および頸部癌、咽頭癌、鼻、口、喉などの湿った粘膜系列上で形成する扁平上皮癌、膀胱癌、骨肉腫(骨腫瘍)、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝臓癌、および腎臓癌が挙げられる。本明細書に記載の方法は、転移性癌の進行を防止する(すなわち、発生の可能性を減少させる)、阻害する、遅延させるか、または減速させるための癌療法である薬物療法の有効性を増強するのにも有用である。
薬物療法の有効性を増強するための方法を、AIDSを発症した患者などの、HIVに感染した被験者に施すこともできる。本明細書に記載されるように、糖尿病を有し、インスリンを受容する被験者または薬物療法としてアンギオテンシンを投与することにより治療可能である状態を有する患者は、生物学的損傷応答を抑制する薬剤を受容することによって利益を得ることができる。
薬物療法(内科的治療)
生物学的損傷応答を誘導する、引き起こす、または促進する薬物療法は、遺伝毒性(例えば、DNA損傷性)および細胞傷害療法を含む。そのような薬物療法の例としては、放射線および様々な化学物質(すなわち、化学療法)などの、癌を治療するために用いられる多くの療法が挙げられる。放射線および化学療法は、正常細胞と比較した腫瘍細胞の示差的特徴を活用することにより、癌細胞(すなわち、腫瘍細胞)を選択的に標的化する細胞傷害剤である。例えば、腫瘍細胞の示差的特徴および特性としては、高い増殖速度、低酸素状態、代謝異常、有効性が低い修復能力、およびゲノム不安定性が挙げられる。
放射線療法は、DNAを損傷させることにより、腫瘍を収縮させ、癌細胞を殺傷するための高エネルギー放射線の使用を含む。放射線としては、X線、ガンマ線、および荷電粒子が挙げられる。放射線を、体外の機械(例えば、外部ビーム放射線療法)または癌細胞の近くの体内に入れられた放射性物質(すなわち、例えば、乳癌および前立腺癌の治療において用いることができる、近接照射療法とも呼ばれる、内部放射線療法)により送達することができる。放射線療法はまた、放射性ヨウ素(例えば、甲状腺癌を治療するため)などの放射性物質を使用し、全身的(例えば、非経口的または経口的)に施される全身放射線療法も含む。
放射線療法を、例えば、腫瘍を排除するか、もしくは癌の再発を防止するか、またはその両方によって、癌を治癒させるために与えることができる。そのような例においては、放射線療法を、単独で、または外科手術、化学療法、もしくは外科手術と化学療法の両方と共に用いることができる。放射線療法を、例えば、症状を軽減する(例えば、脳腫瘍を収縮させる、脊椎および骨を圧迫する腫瘍を収縮させる、嚥下能力を阻害する食道の近くの腫瘍を収縮させる)ための苦痛緩和効果を有するように施すこともできる。癌の種類、腫瘍の位置、および特定の被験体(すなわち、年齢、一般的健康状態などに依存する)のための適切な放射線療法レジメンは、当業者によって容易に決定される。Lawrenceら(編)、Cancer: Principles and Practice of Oncology、第8版、Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2008を参照されたい。
本明細書に記載のように、生物学的損傷応答を誘導することができる薬物療法は化学療法(組合せ化学療法を含む)を含み、化学療法、化学療法剤、または化学療法薬と呼ぶことができる。多くの化学療法剤は、低分子有機物質と呼ばれる化合物である。化学療法剤は、癌の治療のために広く用いられている。当業者であれば理解できるように、化学療法はまた、協調的に投与され、組合せ化学療法と呼ぶことができる2つ以上の化学療法剤分子の組合せを指してもよい。いくつかの化学療法薬が癌において用いられ、限定されるものではないが、アルキル化剤；代謝拮抗剤；アントラサイクリン、植物アルカロイド；およびトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。アルキル化剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、イフォスファミドが挙げられる。代謝拮抗剤の例としては、プリン(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン)およびピリミジンなどのヌクレオシドアンタゴニストが挙げられる。ヌクレオシドアンタゴニストの他の例としては、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、アラビノシルシトシン、カペシタビン、クロファラビン、シタラビン、ダカルバジン、フルダラビン、ゲムシタビンおよびネララビンが挙げられる。ビンカアルカロイドとしては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン；タキサンならびにその類似体および誘導体；ならびにポドフィロトキシンが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤の例は、カンプトテシン、例えば、イリノテカンおよびトポテカンなどのI型トポイソメラーゼ阻害剤である。他のトポイソメラーゼ阻害剤は、II型トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシンの半合成誘導体である、アマスクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドである。化学療法剤である細胞傷害性構成物質としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、およびマイトマイシンが挙げられる。組合せ化学療法剤は、当業者がよく知っており、上記の、および当業界で記載された2つ以上の化学療法薬を含んでもよい頭字語により記載されることも多い(例えば、CHOP、ABVD、BEACOPP、CAV、COPP、EPOCH、MACOP-B、MOPP、R-CHOP、およびStanford Vレジメン)。
特定の化学療法剤は、自己免疫疾患(例えば、強直性脊椎炎、多発性硬化症、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、および強皮症)を含む免疫疾患などの他の状態を治療するためにも用いられる。
生物学的損傷性である他の薬物療法としては、抗ウイルス療法、例えば、HIV/AIDSの治療のために用いられる高活性抗レトロウイルス療法(HAART)が挙げられる。HAARTレジメンは、2つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)とプロテアーゼ阻害剤(PI)；2つのNRTIと非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)；または他の組合せなどの、3つ以上の異なる薬物を含んでもよい。
生物学的損傷応答を含んでもよい他の薬物療法は、一般的には遺伝毒性療法ではないホルモン療法も含む。例えば、アンギオテンシン、アンギオテンシンII(AngII)は、in vitroおよびin vivoの両方において血管平滑筋細胞の早期老化を誘導することにより、血管炎症を促進すると報告されている(例えば、Kuniedaら、Circulation 114:953-60(2006)を参照されたい)。アンギオテンシンは、血管収縮およびその後の血圧の上昇を引き起こすペプチドホルモンである。肉腫を有する患者へのアンギオテンシンの投与が腫瘍に対する血管を収縮させることにより抗腫瘍効果を有するかどうかを決定するために、臨床試験が実施された。インスリンも、細胞老化を誘導するホルモンとして記載されている。
薬物療法はまた、癌などの疾患を有し、幹細胞移植(自己または同種異系)を受けるべき被験体に施される高用量化学療法または高用量放射線療法も含む。例えば、幹細胞置換療法は、再生不良性貧血、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、精巣癌、および白血病(急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、療法関連骨髄異形成(t-MDS)および療法関連急性骨髄性白血病(t-AML))、ならびに骨髄異形成症候群を治療するために用いられている。
用語「薬物療法(内科的治療)」は、薬物治療、治療剤などの当業界で一般的に用いられる他の用語を含むと理解されるであろう。薬物療法は、疾患または傷害を治療するか、または防止(予防)する(すなわち、発生もしくは再発の可能性を減少させる)必要がある被験体に投与される、単一の活性成分もしくは構成要素、1つ以上の活性成分もしくは構成要素、または複数の活性成分もしくは構成要素を含む。本明細書に記載されるように、癌療法などの化学療法である薬物療法は、単一の化学療法剤を含んでもよく、または2つ以上の化学療法薬の組合せ(組合せ化学療法とも呼ばれる)を含んでもよい。さらなる例として、本明細書に記載のように、HAARTは、典型的には、3つの異なるウイルス剤の組合せまたはカクテルである。
薬物療法の有効性の評価
本明細書に記載のように、薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制することにより、それを必要とする被験体に投与される抑制剤は、薬物療法の有効性(すなわち、効能)の増強(すなわち、改善)を提供する。薬物療法の有効性の増強は、薬剤を投与しない場合に観察される利益と比較して治療的および/または予防的利益の改善または増加をもたらす。従って、薬物療法の有効性の増強は、薬物療法の有害な生物学的および生理学的効果を減弱させる(すなわち、減少させる、低下させる、防止する、阻害する、抑制する)ことを含んでもよい。薬物療法の有効性を増加させることにより、療法への生涯曝露を低下させることができ、結果として、生物学的損傷が低下する。
生物学的損傷応答を抑制する薬剤も受容する被験体(すなわち、患者)に施された薬物療法の有効性を、医学界および臨床業界の当業者により容易に決定することができる。身体検査、臨床症状の評価およびモニタリング、ならびに本明細書に記載の分析試験および方法の実施などの、1つまたは任意の組合せの診断方法を、被験体の健康状態のモニタリングのために用いることができる。
薬剤が投与される被験体に関する治療的および/または予防的利益は、例えば、目的が疾患に伴う望ましくない生理学的変化を防止するか、もしくは減速させるか、もしくは遅延させる(減少させる)こと、またはそのような疾患の拡張もしくは重症度を防止するか、もしくは減速させるか、もしくは遅延させる(減少させる)ことである場合に、改善された臨床転帰を含む。本明細書で考察されるように、薬物療法の有効性の増強は、限定されるものではないが、治療しようとする疾患の結果生じるか、もしくはそれに伴う症状の軽減、減少、もしくは緩和；症状の発生率の低下；生活の質の改善；より長い無疾患状態(すなわち、被験体が疾患の診断が行われたことに基づいて症状を提示する可能性もしくは傾向を低下させること)；疾患の程度の縮小；疾患状態の安定化(すなわち、悪化しない)；疾患進行の遅延もしくは減速；疾患状態の改善もしくは緩和；および検出可能であっても、検出不可能であっても、寛解(部分的もしくは全体的)；ならびに/または全生存を含む、有益な、または望ましい臨床結果を含んでもよい。薬物療法の有効性の増強はまた、被験体が生物学的損傷応答を抑制する薬剤を受けていなかった場合の予想される生存と比較した場合の生存の延長を意味してもよい。
特定の実施形態においては、薬物療法が癌療法である場合、薬剤による療法の有効性の増強は、薬剤を投与しない場合に観察される利益と比較して治療的および/または予防的利益の改善または増加をもたらす。例えば、癌療法である薬物療法の増強は、腫瘍サイズの減少、腫瘍進行の阻害、腫瘍増殖の阻害、腫瘍定着の遅延、および/または腫瘍転移の阻害、防止、もしくは遅延のうちのいずれか1つ以上を含む。療法の有効性の増強は、薬物療法に対する癌(すなわち、腫瘍(複数可))の耐性の発生の防止、減速、または低下を含み、それによって、さらなるサイクルの療法を可能にする、および/または療法のサイクル間の時間間隔を減少させることができる。
上記で考察された癌を有する患者に関する利益に加えて、薬物療法が高用量化学療法および/または高用量放射線、次いで、自己または同種異系幹細胞置換療法を含む癌を有する被験体について、生物学的損傷応答を抑制する薬剤を受容する被験体における臨床転帰の改善を、白血球回復のための時間(すなわち、日数)により評価することができる。同種異系幹細胞移植を受ける被験体については、薬剤を受けない被験体と比較した移植片対腫瘍効果の改善および移植片対宿主疾患の非存在または減少は、高用量化学療法または高用量放射線の有効性の増強を示し得る。
癌のための放射線および化学療法と同様、薬物療法が抗ウイルス療法である場合、生物学的損傷応答を抑制することにより、抗ウイルス療法に対する耐性の発生を減少させる、薬物療法の用量を減少させる、または2回の投与の間の時間間隔を増加させることによって、療法への生涯曝露を減少させることができる。臨床転帰の改善は、例えば、感染の完全もしくは部分的根絶に必要とされる時間を減少させること；無疾患状態および/もしくは全生存を延長すること；免疫状態を維持もしくは改善すること；またはウイルス感染(invention)の1つ以上の症状の重篤度を低下もしくは減少させることにより示される。HIVに感染した人については、上記の改善された臨床転帰に加えて、HAARTを含むより有効な抗ウイルス療法は、T細胞計数の安定(すなわち、減少率を低下させる)もしくは改善；カポジ肉腫、AIDS関連リンパ腫、および日和見感染(例えば、カンジダ症、クリプトコッカス髄膜炎、トキソプラズマ症；コクシジオイデス症；進行性多巣性白質脳症；HIV関連脳症；帯状疱疹；クリプトスポリジウム症；CMV、結核を含むマイコバクテリウム、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスにより引き起こされる感染)などの重篤な免疫抑制に伴う疾患の発生の可能性の遅延もしくは減少を提供することができる。
臨床利益および改善または糖尿病を有し、薬物療法としてインスリンを受ける、生物学的損傷応答を抑制する薬剤を受ける被験体を、グルコースレベルの安定性により評価することができる。例えば、生物学的応答を抑制する薬剤を受ける患者において適切なグルコースレベルを維持するのに必要とされるインスリンの用量またはインスリンの用量の低下の間の時間の長さの増加は、インスリンの有効性の改善を示唆する。
医薬組成物
また、生物学的損傷応答を抑制する任意の1つ以上の薬剤を含む医薬組成物も本明細書で提供される。医薬組成物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液または乳濁液であってもよく、生理的に許容される賦形剤(製薬上許容し得るか、もしくは好適な賦形剤もしくは担体)(すなわち、活性成分の活性と干渉しない非毒性材料)をさらに含んでもよい。本明細書に記載の賦形剤は、単なる例であり、いかなる意味でも限定するものではない。有効量または治療上有効量とは、所望の治療効果をもたらすのに有効である、単回用量または一連の用量の一部として、被験体に投与される薬剤または1つ以上の薬剤を含む組成物の量を指す。
一般的には、当業者には公知であり、当業界に記載される、治療または防止される状態にとって好適なアッセイを用いて治療的有効性について被験体をモニタリングすることができる。被験体に投与される薬剤のレベルを、生物学的流体、例えば、血液、血液画分(例えば、血清)、および/もしくは尿、ならびに/または被験体に由来する他の生物学的サンプル中の薬剤のレベルを決定することによりモニタリングすることができる。薬剤を検出するために当業界で実施される任意の方法を用いて、治療レジメンの過程の間に薬剤のレベルを測定することができる。
薬物療法の有効性を増強するための本明細書に記載の薬剤の用量は、被験体の状態、すなわち、疾患のステージ、疾患により引き起こされる症状の重症度、一般的な健康状態、ならびに年齢、性別および体重、ならびに医学界の当業者には明らかな他の因子に依存し得る。医薬組成物を、医学界の当業者により決定されるような治療しようとする疾患にとって適切な様式で投与することができる。適切な用量ならびに好適な投与の期間および頻度を、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、特定の形態の活性成分、ならびに投与方法などの因子によって決定することができる。一般的には、薬剤の最適用量を、実験モデルおよび/または臨床試験を用いて決定することができる。最適用量は、被験体の体格、体重または血液量に依存し得る。有効な療法を提供するのに十分である最小用量の使用が通常は好ましい。本明細書に記載の薬剤(予防的利益のために投与される場合を含む)のための前臨床および臨床試験の設計および実行は、関連業界の当業者の知識の範囲内にある。薬剤の最適用量は、被験体の体格、体重、または血液量に依存し得る。例えば、0.01mg/kg〜1000mg/kg(例えば、約0.1〜1mg/kg、約1〜10mg/kg、約10〜50mg/kg、約50〜100mg/kg、約100〜500mg/kg、または約500〜1000mg/kg)体重の量である。
医薬組成物を、有効量の薬剤を効率的に送達するいくつかの経路のいずれか1つにより、それを必要とする被験体に投与することができる。そのような投与経路としては、例えば、経口、局所、非経口、腸内、直腸、鼻内、頬、舌下、筋肉内、経皮、経膣、直腸、もしくは頭蓋内注射、またはその任意の組合せが挙げられる。そのような組成物は、固体、液体、または気体(エアゾロル)の形態にあってもよい。
製薬上許容し得る賦形剤は製薬業界で周知であり、例えば、Roweら、Handbook of Pharmaceutical Excipients: A Comprehensive Guide to Uses, Properties, and Safety、第5版、2006、およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro、第21版、Mack Pub. Co., Easton, PA (2005))に記載されている。製薬上許容し得る賦形剤の例としては、生理的pHの滅菌塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。保存剤、安定剤、染料、バッファーなどを、医薬組成物中に提供することができる。さらに、酸化防止剤および懸濁剤を用いることもできる。一般的には、賦形剤の種類は、投与の様式、ならびに活性成分の化学組成に基づいて選択される。あるいは、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載の組成物を凍結乾燥物として製剤化するか、または薬剤をリポソーム内に封入することができる。医薬組成物を、本明細書に、および当業界で記載された任意の適切な投与様式のために製剤化することができる。
医薬組成物(例えば、経口投与または注射による送達のための)は、液体の形態にあってもよい。液体医薬組成物は、例えば、以下の1つ以上を含んでもよい：注射用水などの滅菌希釈剤、塩溶液、好ましくは、生理食塩溶液、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として役立ち得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗細菌剤；酸化防止剤；キレート化剤；塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性の調整のためのバッファーおよび薬剤。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒または複数用量バイアル中に封入することができる。生理食塩溶液の使用が好ましく、注射可能な医薬組成物は無菌であるのが好ましい。
経口製剤については、本明細書に記載の少なくとも1つの薬剤を、単独で、または適切な添加物と共に用いて、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着色剤、および香料と共に、錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを作製することができる。薬剤を緩衝剤と共に製剤化して、胃環境の低いpHおよび/または腸内コーティングからの薬剤の保護を提供することができる。組成物中に含まれる薬剤を、例えば、液体、固体または半固体製剤中で香料を用いて、および/または腸内コーティングを用いて経口送達のために製剤化することができる。
本明細書に記載の薬剤のいずれか1つを含む組成物を、持続放出または遅延放出のために製剤化することができる。そのような組成物は、一般的には、周知の技術を用いて調製し、例えば、経口、直腸もしくは皮下埋込みにより、または所望の標的部位への埋込みにより投与することができる。持続放出製剤は、担体マトリックス中に分散され、および/または速度制御膜により取り囲まれた容器内に含有された薬剤を含有してもよい。そのような製剤内での使用のための賦形剤は、生体適合性であり、生分解性であってもよい；好ましくは、製剤は活性成分放出の比較的一定のレベルを提供する。持続放出製剤内に含まれる活性薬剤の量は、埋込みの部位、放出の速度および予想される持続期間、ならびに治療または防止しようとする状態の性質に依存する。
通常は経口または注射用量にある、本明細書に記載の1つ以上の薬剤の単位用量を含むキットが提供される。そのようなキットは、単位用量、対象の病状の治療における薬物の使用および付随する利益を説明する情報パッケージ挿入物、ならびに場合により、組成物の送達のための電化製品またはデバイスを含有する容器を含んでもよい。
(実施例)
p16-3MRトランスジェニックマウスの調製
癌における、癌を発症する危険性における、または癌治療後に生じる副作用における老化細胞の役割を検査するために、三峰性融合タンパク質に機能し得る形で連結されたp16Ink4aプロモーターを含むトランスジェニックマウスを作製して、老化細胞の検出およびこれらのトランスジェニックマウスにおける老化細胞の選択的消失を可能にした。
非老化細胞中ではなく、老化細胞中で転写的に活性であるプロモーターp16Ink4a(例えば、Wangら、J. Biol. Chem. 276:48655-61(2001); Bakerら、Nature、上掲を参照されたい)を、核酸構築物中に遺伝子操作した。p16Ink4a遺伝子プロモーターの断片(例示的ベクターおよび例示的プロモーター配列を提供する図5および図6を参照されたい)を、三峰性リポーター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に導入した。三峰性リポータータンパク質は3MRと呼ばれ、ウミシイタケルシフェラーゼ(rLUC)、単量体赤色蛍光タンパク質(mRFP)およびトランケート型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tTK)からなる(例えば、Rayら、Cancer Res. 64:1323-30(2004)を参照されたい)。かくして、3MRの発現は、老化細胞でのみp16Ink4aプロモーターにより駆動される。3つのタンパク質のそれぞれのポリペプチド配列およびコードポリヌクレオチドは当業界で公知であり、GenBankなどの公共データベースで利用可能である。検出マーカー、rLUCおよびmRFPは、それぞれ、生物発光および蛍光により老化細胞の検出を可能にした。tTKの発現は、tTKにより細胞傷害部分に変換される、プロドラッグガンシクロビル(GCV)への曝露による老化細胞の選択的殺傷を可能にした。C57B16バックグラウンドを有するトランスジェニック創始動物を、トランスジーンを動物に導入するための公知の手順を用いて確立および育種した(例えば、Bakerら、Nature、上掲を参照されたい)。このトランスジェニックマウスは、本明細書ではp16-3MRと呼ばれる。
老化細胞をトランスジェニックp16-3MRマウス中で検出し、消失させることができる
老化細胞を、強力に上方調節されたp16-INK4a腫瘍抑制因子タンパク質(Campisiら、Nature Rev. Molec. Cell Biol. 8:729-40(2007))などの様々なバイオマーカーを用いて検出することができる。そのようなマーカーを用いて、マウスおよびヒトにおいて、イオン化照射またはDNA損傷的化学療法への曝露後に、正常細胞と腫瘍細胞の両方が老化を受けることが示された(Coppeら、PLoS Biol. 6:2853-68(2008); Schmittら、Cell 109:335-46 (2002); te Poeleら、Canc. Res. 62:1876-83 (2002); Leら、Aging Cell 9:398-409 (2010))。例えば、p16-3MRトランスジェニックマウスは、遺伝毒性物質(例えば、イオン化照射、DNA損傷的化学物質)、エピゲノム毒素(例えば、ヒストン改変またはDNAメチル化を混乱させる化合物)、強力な分裂促進シグナル(例えば、癌遺伝子の活性化、増殖因子、特定のホルモンのレベルの上昇)に曝露された場合に老化細胞を蓄積させるであろう。しかし、本明細書に注記されるように、p16-3MRトランスジェニックマウスの1つの利点は、それらが、GCVはtTKによって細胞毒素に変換されるため、プロドラッグガンシクロビル(GCV)をマウスに投与することにより老化細胞の選択的殺傷を可能にするtTKを発現することである。従って、放射線に曝露されたp16-3MRトランスジェニックマウスにおける老化細胞の消失を、GCV処置後に検査した。
簡単に述べると、p16-3MRトランスジェニックマウスの群を、全身イオン化照射(7GyのX線)に曝露し、p16-3MRトランスジェニックマウスの対照群をモック照射した。3ヶ月後、マウスをGCV(25mg/kg)またはビヒクルのみで処置した後、少なくとも2週間後、組織中の生物発光をrLUC基質を投与した後に検査した。
いくつかの組織においては、照射されたマウス(IR)は未照射のマウス(Ctrl)よりも2倍以上高い生物発光を示し、これはrLUCが照射曝露の3ヶ月後に発現され、従って、老化細胞の存在が持続していることを示している(肺組織における生物発光の結果を示す図1Aを参照されたい)。さらに、GCVで処置されたマウスは、未照射のマウスと同等のrLUC発現レベルを示し、これはGCVが老化細胞の排除をもたらしたことを示している(図1A)。
文献中で公知のように、老化細胞は、慢性の場合、癌(Davalosら、Cancer Metastasis Rev. 29:273-83 (2010))などの様々な病状を刺激する、炎症(Freundら、Trends Mol. Med. 16:238-46 (2010))を引き起こし得る分子も分泌する(これは、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれることが多い)。例えば、IL-6(インターロイキン-6)およびMMP-3(マトリックスメタロプロテイナーゼ-3)は、2つの著名なSASP成分である。従って、p16INK4a(p16)、IL-6およびMMP-3などの、SASPと関連する様々なバイオマーカーのRNA発現レベルを検査した。さらに、mRFPリポーターのレベルを測定した。図1Bは、GCVが、p16INK4a(p16)、IL-6、MMP-3およびmRFP発現レベルを、未照射の対照マウスにおいて見られるレベルまで戻したことを示す。さらに、注目すべきことに、GCVは野生型の非トランスジェニックC57Bl6マウスに与えた場合、発現レベルに対する検出可能な効果を有さなかった(データは示さない)。
細胞老化は癌および転移の可能性を増加させる
腫瘍形成または増殖および転移に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査するために、老化細胞を枯渇させたp16-3MRトランスジェニックマウスおよび老化細胞を有する(天然に生じるか、または誘導する)マウスにおいて、腫瘍生着をモニタリングした。
簡単に述べると、実施例2に記載のように、モック照射または照射した約3ヶ月後、蛍ルシフェラーゼ(fLUC、生物発光によるその検出を可能にするため)を発現する、p16-3MRトランスジェニックマウス(C57Bl6バックグラウンド)と同系である高悪性度細胞系である106個のB16マウスメラノーマ細胞を、p16-3MRトランスジェニックマウスの尾静脈に注射した。照射されたマウスを、GCV(25mg/kg)またはビヒクルのみで7日間毎日処置した後、最後のGCV投与の3日後、B16マウスメラノーマ細胞をマウスに注射した。B16マウスメラノーマ細胞は最初に肺に定着し、そこでそれらは注射の約2週間後に原発腫瘍を形成し、その後、遠方の組織に転移して、例えば、膵臓、肝臓および内臓脂肪において二次腫瘍を形成する。生物発光マーカーfLUCおよびrLUCは、これらの酵素が異なる基質を使用するため、識別可能である。
図2に示されるように、腫瘍進行は、モック照射されたマウスと比較して照射されたマウスにおいてはるかに速く起こった。注射の15日後、モック照射(Ctrl)されたマウスは、いくつかの比較的小さい肺結節を有していた(図2Aを参照されたい)。対照的に、放射されたマウスは、有意により多い原発腫瘍を有し、さらに、動物は多数の転移腫瘍を担持していた(図2Bを参照されたい)。これらの動物は、注射後15日目と16日目の間には瀕死状態であった。驚くべきことに、GCV処置後に老化細胞が消失した照射されたマウスは、はるかに小さい原発腫瘍およびはるかに少ない転移を示した(図2Cを参照されたい)。B16マウスメラノーマ細胞を、fLUC生物発光を測定することにより注射後約15〜18日でマウスにおいて検出した。照射されたマウスは注射後15〜16日目で瀕死状態であり、犠牲にした。注射の15日後、モック照射された(Ctrl)マウスおよびGCV処置後に老化細胞が消失した照射されたマウスは両方とも、発光により検出されるように比較的少数のB16細胞を有していた(図3を参照されたい)。照射されたマウスは、発光により検出されるように、有意に多数のB16細胞を有していた(図3を参照されたい)。18日目に、GCV処置後に老化細胞が消失した照射されたマウスは、依然として比較的低レベルのB16細胞を示し、モック照射された対照(Ctrl)マウスも同様であった(図3を参照されたい)。
B16メラノーマ細胞を注射した18日後、GCV処置を受けた照射されたマウスにおいて、大きい原発肺腫瘍が明らかであった(図4Aを参照されたい)。しかし、肺における腫瘍の存在にも拘らず、遠方の臓器はほとんど転移がないままであった(図4Aを参照されたい；また、肝臓および脂肪組織を示す図4Cも参照されたい)。これは、肝臓および脂肪が複数の転移腫瘍を担持し(図4Bを参照されたい)、15日目までに既に存在していたGCVで処置されなかった照射されたマウスとは際だって対照的であった。また、表2に提供されるように、発光性転移結節を対照、照射されたマウス、および照射され、GCVで処置されたマウスにおいても計数した。結節は脂肪組織においては計数することが困難であるため、転移細胞を脂肪の総面積の%見積もり値として表した。
Figure 2015502366
化学療法剤ドキソルビシンを用いて老化細胞蓄積が誘導された場合も、同様の結果が観察された。p16-3MRマウスを用いて、ドキソルビシン(10mg/kg)処置は、放射線の効果と同様、組織における老化細胞の永続的存在を誘導した。様々な組織を単離し(肝臓、心臓、肺、腎臓、および脾臓)、老化細胞のマーカーとしてmRFPおよびp16INK4aをコードするmRNAの存在量について測定した(それぞれ、図5Aおよび図5Bを参照されたい)。ドキソルビシン処置されたマウスは、未処置の対照マウスと比較して、全ての組織においてより高レベルのmRFPおよびp16INK4aを一貫して発現していた。
また、放射線の効果と同様、ドキソルビシン処置は、皮下注射されたB16メラノーマ細胞の増殖を刺激した。再度、放射線処置されたマウスと同様、GCV(p16-3MRマウスにおいて老化細胞を排除する)は、ドキソルビシンで予備処置されたマウスにおいてB16メラノーマ腫瘍のサイズを実質的に減少させた。簡単に述べると、p16-3MRトランスジェニックマウスを、ビヒクル(ctrl)または10mg/kgのドキソルビシンで処置した。ドキソルビシン処置の7日後、マウスをGCV(25mg/kg)またはビヒクルのみで7日間毎日処置した。最後のGCV処置の3日後、4x105個のB16マウスメラノーマ細胞をp16-3MRトランスジェニックマウスに皮下注射し、分析のために12日後にマウスを犠牲にした。
皮膚生検を採取し、老化細胞バイオマーカー(p16INK4aおよびmRFP mRNA)の存在量について測定した。図6に示されるように、ドキソルビシン処置されたマウスからの皮膚生検は、p16INK4aおよびmRFP発現により測定されたように、未処置の対照マウスからの皮膚生検と比較して、老化の増加を示した。対照的に、老化細胞がGCV処置により消失したドキソルビシン処置されたマウスは、低レベルのp16INK4aおよびmRFP発現を示した。
腫瘍増殖は、ビヒクル処置された対照マウスと比較してドキソルビシン処置されたマウスにおいて増加した(図7を参照されたい)。対照的に、老化細胞がGCV処置後に消失したドキソルビシン処置されたマウスは、はるかにより小さい原発腫瘍を示した(図7を参照されたい)。腫瘍直径も測定し、老化細胞がGCV処置によって排除されたドキソルビシン処置されたマウスがより小さい腫瘍サイズを有し、ドキソルビシン処置されたマウスが増加した腫瘍サイズを有することも確認した(図8を参照されたい)。
全体として、放射線またはドキソルビシンにより誘導された老化細胞集団の増加は、大きく増大した原発腫瘍サイズおよび転移(放射線のみ)と相関していたが、これは老化細胞がGCVで処置されたマウスにおいて枯渇された場合、大きく無効化された。換言すれば、これらの結果は、老化を引き起こすストレスに曝露された後の老化細胞の永続的存在が、原発腫瘍の増殖を促進し、転移の発生を進行させ得ることを示している。かくして、老化細胞の消失または枯渇は、腫瘍形成または転移の危険性または可能性を遅延させる、防止する、または減少させることができる。
老化細胞消失はK-Rasに媒介される腫瘍形成の可能性を減少させる
K-Rasに媒介される肺腫瘍形成または増殖および転移に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査するために、老化細胞が枯渇したか、または老化細胞を有する(天然に生じる、または誘導される)INK-ATTACトランスジェニックマウスにおいて、腫瘍形成をモニタリングした。
簡単に述べると、INK-ATTAC(キャスパーゼの標的化された活性化を介するp16Ink4aアポトーシス)トランスジェニックマウスは、p16Ink4aプロモーターの制御下にFK506-結合タンパク質(FKBP)-キャスパーゼ8(Casp8)融合ポリペプチドを有する(トランスジーンのベクター配列を提供する図10およびプロモーター配列を含むトランスジーンの構成要素の配列を提供する図11を参照されたい)。膜結合型ミリストイル化FKBP-Casp8融合タンパク質の二量体化を誘導する合成薬物であるAP20187の存在下では、p16Ink4aプロモーターを介してFKBP-Casp8融合タンパク質を特異的に発現する老化細胞は、プログラム細胞死(アポトーシス)を受ける(例えば、Baker, Nature、上掲、その中の図1を参照されたい)。2つの創始細胞系(INK-ATTAC3およびINK-ATTAC5)を、K-rasLA1腫瘍モデルにおいてそれぞれ育種した。K-rasLA1マウスは、M.I.T.のTyler Jacks(Johnson, L.ら、Nature 410:1111-16 (2001)を参照されたい)によって初めて開発された。このマウスは、自発的組換え事象を介してサイレントなK-ras癌遺伝子を活性化する。K-rasLA1マウスの死亡/犠牲の平均年齢は、広範囲の全身腫瘍組織量の結果として約300日である。最も頻繁な臓器部位は肺であり、ヒト非小細胞肺癌と同様、過形成/異形成から癌腫までの変化する等級の腫瘍がわずか6週間で存在する。胸部リンパ節、腎臓および他の臓器への転移は、低頻度で起こる。他の臓器部位としては、胸腺(胸部リンパ腫)および皮膚(パピローマ)が挙げられる。コンパニオン株(K-rasLA2)は、100%の時間で活性化対立遺伝子(K-RasG12D)に組換える対立遺伝子を担持する。
2つのINK-ATTAC:K-RasLA1を作製した(1つはINK-ATTAC系3であり、1つは系5である)。3週齢から始めて、それぞれのコホートの半分を2mgのAP20187/g体重で処置し、残りの半分をビヒクル(PBS)で処置した。処置の21日後、マウスを犠牲にし、肺における腫瘍多重度を測定した。腫瘍数は、AP20187を用いる処置後に枯渇された老化細胞を有するINK-ATTAC3:K-RasLA1およびINK-ATTAC5:K-RasLA1トランスジェニックマウスにおいて有意に減少していることがわかった(図9を参照されたい)。さらに、p16-陽性細胞の存在下または非存在下で、腫瘍誘導後に転移および全生存をモニタリングする。
老化細胞消失は乳癌または皮膚癌形成の可能性を減少させる
実施例4と同様の実験を、HER2のドキシサイクリン媒介性発現を用いて実施して(例えば、Yehら、J. Clin. Investig. 121:866-79 (2011)を参照されたい; また、Guntherら、FASEB 16:283-92(2002)も参照されたい)、乳癌に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査することができる。例えば、創始INK-ATTAC系を、トランスジェニックマウスMMTV-HER2または2トランスジェニックマウスMMTV-rtT:TetO-HER2遺伝子バックグラウンド上でそれぞれ育種し、ドキシサイクリンを用いて乳腫瘍形成を誘導した後、老化誘導因子(例えば、放射線または化学療法)を用いて老化細胞蓄積を誘導する。
あるいは、INK-ATTACトランスジェニックマウスを、老化誘導因子(例えば、放射線または化学療法)で処置した後、発癌物質で処置して、皮膚癌形成に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査することができる(例えば、Slagaら、J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1:151-6 (1996)を参照されたい)。
老化細胞の減少は老化誘導化学療法に由来する副作用の可能性を減少させる
例えば、既に発症した癌を治療するために用いられる放射線または化学療法の結果生じる副作用に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査する。そのような副作用は、腫瘍形成または増殖および転移を復帰させるか、または再発することを含んでもよい。副作用を、老化細胞を枯渇させたか、または老化細胞を有する(天然に生じるか、もしくは誘導する)p16-3MRトランスジェニックマウスにおいてモニタリングする。
簡単に述べると、蛍ルシフェラーゼ(fLUC)を発現するように腫瘍細胞系を操作して、生きている動物における生物発光による腫瘍および転移の検出を可能にする。特に、B16-fLUCマウスメラノーマ細胞系およびMMTV-PymT:fLUC乳癌細胞系を作製する。腫瘍細胞をマウスに注射し(すなわち、B16を尾静脈に；およびMMTV-PymTを乳腺脂肪体に)、1〜4週間にわたって小さい原発腫瘍を形成させる。次いで、10mg/kgのドキソルビシンまたはビヒクルのみを、1週間にわたって2〜4回投与する。最後のドキソルビシン投与の3日後、25mg/kgのGCVまたはビヒクルのみを5回、毎日腹腔内投与する。マウスの4つの異なる処置群は、(1)ドキソルビシンなし(ビヒクル)、GCVなし(ビヒクル)；(2)ドキソルビシン、GCVなし；(3)ドキソルビシンなし、GCV；および(4)ドキソルビシン、GCVを含む。組織における生物発光を検査(rLUC基質を投与した後)して、腫瘍形成をモニタリングし、マウスの生存もモニタリングする。さらに、マウスを5〜8日間にわたって代謝ケージ中で飼育して、食物消費、水消費、体格、自発的活動および行動、自発的運動、酸素消費、および二酸化炭素産生をモニタリングすることができる。
老化細胞減少は老化誘導放射線療法に由来する副作用の可能性を減少させる
例えば、既に発症した癌を治療するために用いられる放射線または化学療法の結果生じる副作用に寄与する、それを誘導する、またはその可能性を増加させる老化の役割を検査する。そのような副作用は、腫瘍形成または増殖および転移を復帰させるか、または再発することを含んでもよい。副作用を、老化細胞を枯渇させたか、または老化細胞を有する(天然に生じるか、もしくは誘導する)p16-3MRトランスジェニックマウスにおいてモニタリングする。
簡単に述べると、蛍ルシフェラーゼ(fLUC)を発現するように腫瘍細胞系を操作して、生きている動物における生物発光による腫瘍および転移の検出を可能にする。特に、B16-fLUCマウスメラノーマ細胞系およびMMTV-PymT:fLUC乳癌細胞系を作製する。腫瘍細胞をマウスに注射し(すなわち、B16を尾静脈に；およびMMTV-PymTを乳腺脂肪体に)、1〜4週間にわたって小さい原発腫瘍を形成させる。次いで、動物群を非致死的イオン化照射(IR)に曝露するか、または偽照射する。最後の照射の3日後、25mg/kgのGCVまたはビヒクルのみを5回、毎日腹腔内投与する。マウスの4つの異なる処置群は、(1)IRなし(偽照射)、GCVなし；(2)IR、GCVなし；(3)IRなし、GCV；および(4)IR、GCVを含む。組織における生物発光を検査(rLUC基質を投与した後)して、腫瘍形成をモニタリングし、マウスの生存もモニタリングする。さらに、マウスを5〜8日間にわたって代謝ケージ中で飼育して、食物消費、水消費、体格、自発的活動および行動、自発的運動、酸素消費、および二酸化炭素産生をモニタリングすることができる。
老化関連分泌表現型(SASP)の成分を選択的に抑制する化合物のスクリーニングおよび特性評価
老化関連分泌(SASP)表現型を抑制する可能性がある低分子を同定するために、休止しているか、または老化している正常なヒト線維芽細胞およびヒトでの使用について認可された化合物のライブラリーを用いるスクリーニング戦略を、以下にさらに詳細に説明されるように開発した。
実験手順：
細胞培養物および試薬
以前に記載のように(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979; Coppeら、2010, PLoS ONE 5:e9188)、HCA2ヒト新生児包皮、IMR-90ヒト胎児肺線維芽細胞およびT47Dヒト乳癌細胞を取得し、3%O2および10%CO2中で培養した。細胞を、記載のように(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)、X線照射(10Gy)または発癌性RASもしくはMAPキナーゼキナーゼ6(MKK6)のレンチウイルス発現により、老化に誘導した。老化前および老化細胞は、それぞれ、75%を超える、および10%未満の24h BrdU標識指数を有していた(Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979)；それぞれ10%未満および70%を超えるものが老化関連β-ガラクトシダーゼ活性について陽性に染色された(Dimriら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9363-9367) (Biovision老化検出キット)。HEK293FTパッケージング細胞(Invitrogen)を用いて、レンチウイルスを生成した。コルチコステロン、コルチゾールおよびRU-486を、Sigma-Aldrichから取得した。
ウイルスベクターおよび感染
発癌性RASおよびMKK6をコードするレンチウイルスは記載されている(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)。GFP(対照)に対するshRNAをコードするレンチウイルスおよびGRを、Open Biosystemsから購入した。レンチウイルスNF-κB受容体-ルシフェラーゼ構築物を、SA Biosciencesから購入した。レンチウイルスを、記載のように作製し、使用した(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)。感染の副作用を限定するために、ウイルス力価を調整して、細胞の90%に感染させた後、培養物を1μg/mlのピューロマイシン中で3日間選択した。
初期薬物スクリーニング
Biomek FX(Beckman Coulter、CA)を含む自動化液体処理を用いる96穴形式において、初期薬物スクリーニングを実施した。老化細胞を、96穴プレート中にウェルあたり7,500個の細胞でX線照射の24時間後に塗布した。老化細胞を塗布した6日後、老化前の細胞を96穴プレート中にウェルあたり7,500個の細胞で塗布した。老化前細胞の塗布の24時間後、老化前細胞と老化細胞の両方を洗浄し、少量(0.2%)の血清中で48時間インキュベートして、老化前細胞の細胞増殖を停止させた。DMSO中に1120種の生物学的に利用可能な化合物を含有する、Prestwick Chemical Libraryからの薬物を、0.2%血清を含有する培地中の2.5μMで細胞に与えた。化合物添加の48時間後、ELISAによるアッセイのために各ウェル中の培地を除去、凍結して、IL-6のレベルを定量した。培地を除去した後にウェル中に残存した細胞を溶解し、ATPレベルを測定して(ATPlite 1ステップアッセイ、Perkin Elmer、MA)、毒性(細胞死)によりIL-6を低下させる化合物を排除した。各プレート中の実験ウェルを、ELISAおよびATPアッセイのために、それぞれ、プレート平均または同プレートDMSO対照に正規化した。
糖質コルチコイドを用いるその後の処置
SASP調節因子としての糖質コルチコイドを検証するために、それらを照射後15min以内(別途指摘しない限り)に添加した。MKK6またはRAS過剰発現により老化に誘導された細胞については、糖質コルチコイド処置を感染の16時間後に開始した。糖質コルチコイドを、1日おきに新鮮な培地中に再添加した。照射または選択の6日後、細胞に、24時間にわたって糖質コルチコイドを含むか、または含まない無血清DMEMを与えた；条件化培地を採取し、ELISAのために凍結した。
リアルタイム定量的PCR
96穴プレート中の細胞(7,500個/ウェル)を溶解し、Cells-To-Ctキット(Ambion)を用いて逆転写した。Roche Universal ProbeLibrary(UPL)および以下のプライマー-プローブ組合せ：チューブリンA(プローブ58；F:5'-CTT CGT CTC CGC CAT CAG-3' (配列番号25)、R:5'-TTG CCA ATC TGG ACA CCA-3' (配列番号26)); IL-6 (プローブ45; F:5'-GCC CAG CTA TGA ACT CCT TCT-3' (配列番号27)、R:5'-GAA GGC AGC AGG CAA CAC-3' (配列番号28)); IL-8 (プローブ72; F:5'-AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC-3' (配列番号29)、R:5'-ATG GTT CCT TCC GGT GGT-3' (配列番号30)); MMP-3 (プローブ36; F:5'-CAA AAC ATA TTT CTT TGT AGA GGA CAA-3' (配列番号31)、R: 5'-TTC AGC TAT TTG CTT GGG AAA-3' (配列番号32)); GR (プローブ34; F: 5'-GAA AGC CAC GCT CCC TTC-3' (配列番号33)、R: 5'-AGA CTT AGG TGA AAC TGG AAT TGC T-3' (配列番号34)); IL-1α(プローブ6; F: 5'-GGT TGA GTT TAA GCC AAT CCA-3' (配列番号35)、R: 5'-TGC TGA CCT AGG CTT GAT GA-3' (配列番号36)); IκBα (プローブ86; F: 5'-GGT GCT GAT GTC AAT GCT CA-3' (配列番号37)、R: 5'-ACA CCA GGT CAG GAT TTT GC-3' (配列番号38))を用いて、定量的PCRを実施した。
ウェスタンブロッティング
細胞を、RIPAバッファー中で溶解した。溶解物を超音波処理(10sec)した後、遠心分離した。サンプルを70℃で10minインキュベートし、4〜15%勾配のトリス-グリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)上にロードし、電気泳動により分離した。タンパク質をPVDF膜に移し、TBST 5%ミルク中、室温で1時間遮断し、ブロッキングバッファー中の一次抗体を用いて4℃で一晩プローブ化した。膜をTBST中で洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。ブロットを、ウェスタン検出基質(GE Healthcare)を用いて展開した。
免疫蛍光
細胞を8ウェルチャンバースライド中で培養し、4℃で10min、4%ホルムアルデヒド(Sigma)中で固定し、4℃で10min、PBS-0.5%Triton中で透過処理した。スライドを4%ヤギ血清(Invitrogen)中で30min遮断した。一次抗体をブロッキングバッファー中に希釈し、室温で1時間、細胞と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、室温で30min、二次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、slow-fade gold(Molecular Probes)を用いてマウントした。spotfireソフトウェアを備えたOlympus BX20蛍光顕微鏡(Diagnostics Instruments)を用いて画像を獲得し、Photoshop CS(Adobe)を用いて加工した。
抗体
一次抗体および希釈率は、抗GR(SC-8992、Santa Cruz; 1:500)、抗アクチン(ab6276、Abcam; 1:50000)、抗MCR (SC-11412、Santa Cruz; 1:500)、抗IRAK1 (SC-5288、Santa Cruz; 1:500)、抗IκBα (#9247、Cell Signaling; 1:500)、抗RelA (SC-109、Santa Cruz; 1:500)、および抗53BP1 (A300-272A、Bethyl; 1:500)であった。ウェスタン分析に用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート(#170-5047、BioRad; 1:5000)、およびヤギ抗ウサギIgG HRPコンジュゲート(#166-2408、BioRad; 1:5000)であった。免疫染色に用いた二次抗体は、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG(#A11008、Invitrogen; 1:750)であった。
NF-κB結合活性およびトランス活性化アッセイ
核抽出キット(Active Motif)を用いて核抽出物を調製し、TransAM NF-κB p65キット(Active Motif)を用いてNF-κB DNA結合を決定した。トランス活性化アッセイのために、NF-κBリポーター-ルシフェラーゼレンチウイルスに感染させた細胞を、バッファー(Promega)中に溶解し、ルシフェラーゼ活性を、記載のように(Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)、細胞数に対して正規化した。
抗体アレイ
培養物を洗浄し、無血清DMEM中で24時間インキュベートし、条件化培地をDMEMを用いて同じ細胞数に希釈した。Raybiotechからの抗体アレイ(AAH-CYT-G1000-8)を、製造業者の説明書に従って用いた。GenePix 4200A Professionalマイクロアレイスキャナーを用いて、アレイを走査した。LI-COR Odysseyソフトウェアを用いてシグナル強度を定量し、それぞれのサンプルについて陽性対照に対して正規化した後、以前に記載のように(Freundら、2011、EMBO J. 30:1536-1548)、全サンプルにわたって正規化した。
ELISA
条件化培地を濾過し、-80℃で保存した。実験ごとに細胞数を決定した。PerkinElmerからのキットおよび手順(IL-6 AL223F)を用いて、ELISAを実施した。データを正規化し、pg/ml/細胞/24hとして表した。
侵襲アッセイ
T47Dヒト乳癌細胞(120,000細胞/ウェル)を、Transwells(BD Biosciences)の上側チャンバー中のMatrigel層の上に塗布した。下側チャンバーは、コルチコステロンまたはコルチゾールで10d処置された老化前または老化HCA2線維芽細胞に由来する条件化培地を含んでいた。18h後、上側チャンバーのフィルターの下側に移動した細胞を染色し、記載のように計数した(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Coppeら、2010, PLoS ONE 5:e9188)。
統計分析
全てのグラフ上のエラーバーは、少なくとも3つの独立した測定値の標準偏差を表す。抗体アレイについては、シグナルの分布間の統計的有意差を、条件あたり3つの条件化培地に関するStudentの両側t検定および等分散仮定を用いて評価した。
糖質コルチコイドは老化関連分泌表現型の選択された成分を抑制する
潜在的なSASP調節因子であり得る低分子を同定するために、休止しているか、または老化しているヒト線維芽細胞(HCA2株)を含有する平行96穴プレートに化合物を投与することを必要とするスクリーニング戦略を開発した。試験した化合物は、約1,120種の連邦食品医薬品局に認可された薬物の収集物であるPrestwick Chemical Libraryを含んでいた。化合物を、単一の濃度(2.5μM)で2つのウェルに添加した。48時間後、各ウェルから培地を除去し、細胞を溶解した。ELISAを用いて、化合物がSASPを抑制したか、または増強したかどうかを示すものとして、培地中の主要なSASP因子であるIL-6の存在を検出した。細胞溶解物を、細胞数の代用物としてATPについてアッセイした。ATPアッセイの結果により、毒性が高い化合物、または細胞数を全体として変化させる化合物を排除することができた。
試験した1,120種の薬物のうち、いくつかはATPレベルを変化させることなくIL-6分泌を抑制した。次いで、これらの薬物は、細胞傷害を引き起こすか、または老化増殖停止を逆転させることなくSASPを抑制する能力を有するための候補であった。候補薬物は、以下のものを含んでいた：コルチコステロン、コルチゾール、プレドニゾン、アンドロステロン、トラザミド、クロルプロパミド、グリクラジド、フィナステリド、ノルゲストレル-(-)-D、エストラジオール-17-β、ミノキシジル、およびベンフォチアミン。これらの候補のうち、コルチコステロンなどの糖質コルチコイドファミリーのホルモンが最も強力であった。
コルチコステロンが老化関連IL-6分泌を抑制する能力を確認するために、新鮮なHCA2線維芽細胞培養物を調製し、X線照射(10Gy)により老化を誘導した。これらの条件下では、細胞は24〜48時間以内に増殖停止を受けるが、SAPS成分が培地中で検出されるまでに4〜5日を要する(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979; Coppeら、2010, PLoS ONE 5:e9188; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)。照射の直後に、変化する濃度のコルチコステロンを添加し、細胞を薬物中で6日間維持した。6日目に、細胞を、コルチコステロンを含むか、または含まない無血清培地中でインキュベートし、条件化培地を24h後に採取し、培地をELISAによりIL-6についてアッセイした。コルチコステロンは用量依存的様式でIL-6分泌を減少させた(図12A)。20nMで、コルチコステロンはIL-6分泌を約50%減少させた；最大の抑制(90%を超える)は500nMで達成された。コルチコステロンが老化細胞によるIL-6分泌を抑制する能力は、HCA2細胞に特有のものではなかった。別のヒト線維芽細胞株(胎児肺に由来するIMR-90)を用いた場合も同様の減少が観察された(図16A)。
コルチコステロンは、げっ歯類および他の種における主なGRリガンドである；しかしながら、ヒトにおいては、主なGRリガンドは密接に関連する糖質コルチコイドであるコルチゾールである(GrossおよびCidlowski, 2008, Trends Endocrinol. Metab. 19:331-339; Zanchiら、2010, J. Cell Physiol. 224:311-315)。従って、コルチゾールを、X線照射により老化を誘導されたヒト線維芽細胞によるIL-6分泌を抑制する能力について試験した。コルチゾールは用量依存的様式でIL-6分泌を減少させ、コルチコステロンよりも強力であった(図12B)。コルチゾールは、nM以下の濃度(160〜800pM)では50%および100nMでは90%を超えて、老化関連IL-6分泌を減少させた。
コルチコステロンまたはコルチゾールが全SASPを抑制するかどうか、またはどの程度抑制するかを決定するために、抗体アレイを用いて120種のサイトカインおよび増殖因子の相対的分泌を調べた。老化前細胞および老化細胞を、500nMのコルチコステロンまたは100nMのコルチゾールと共にインキュベートした(図12C)。両方の糖質コルチコイドは、いくつかの前炎症サイトカインおよびケモカイン、例えば、IL-6、IL-8、GM-CSFおよびMCP-2の分泌を強力に抑制した。さらに、それらは、VEGFなどのいくつかの増殖因子および血管新生因子の分泌を抑制した。いずれの糖質コルチコイドも、SASPの全成分を抑制せず(図12C)、かくして、選択的SASP調節因子であった。
コルチコステロンおよびコルチゾールが老化関連IL-6分泌を抑制する能力は、X線照射により老化を誘導された細胞に限定されなかった。両糖質コルチコイドとも、増殖停止、細胞拡大、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-Bgal)発現および強固なSASPを誘導する(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)発癌性RASまたはMKK6(マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ6)の過剰発現により老化を誘導された細胞において有効であった(図12D)。
糖質コルチコイドによるIL-6分泌の抑制には、SASPが確立される間の長期間にわたってステロイドが存在することが必要であった。同調して老化を誘導する照射された細胞においては、SASPは、照射の1〜2日後から始まって、確立されるようになるまで3〜4日かかる(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979)。X線照射により老化を誘導する前にコルチコステロンによる細胞の予備処理、または照射直後の24時間だけ、もしくはSASPの確立後(照射の7日後)の処理は、IL-6分泌に対する効果はなかった(図12E)。しかしながら、照射後7日間にわたるコルチコステロンへの連続曝露は、IL-6分泌を強力に抑制した(図12E)。
SASPに対するその効果とは対照的に、コルチコステロンおよびコルチゾールは、SA-Bgalを発現する細胞の画分(図16B)または拡大された老化形態に対する効果を有さなかった。さらに、いずれの糖質コルチコイドも、老化増殖停止を逆転させなかった。かくして、X線照射により作られ、コルチコステロンまたはコルチゾールで7日間処理された細胞は、その低い24h BrdU標識指数を維持した(図16C)。さらに、SASPは、永続的DNA損傷フォーカス(Rodierら、2011, J. Cell Sci. 124:68-81)から生じる構成的な低レベルのDNA損傷応答(DDR)シグナリング(Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979)に依存するが、コルチコステロンおよびコルチゾールは、X線照射による老化を誘導された細胞の核における永続的DNA損傷フォーカスの数に対する効果を有さなかった(図16D;16E)。
これらの結果は、前炎症性サイトカインの分泌などの、老化細胞により分泌されるタンパク質の分泌を選択的に減少させる化合物をスクリーニングする実行可能性を証明している。表現型SASPタンパク質IL-6に関するELISAと組合わせた実質的な細胞損失または獲得を検出するための細胞ATPレベルをアッセイする二重手法により、潜在的なSASP抑制活性を有するが、全体としては毒性がなく、または同様に重要なことに、老化増殖停止を逆転させる能力がない化合物の同定が可能になった。総合すると、データは、コルチコステロンおよびコルチゾールが、増殖停止などの他の顕著な老化表現型に影響することなく顕著なSASP因子の分泌を低下させ、細胞がイオン化照射によってであっても、または発癌性RASもしくはMAPキナーゼキナーゼ6過剰発現により送達される強力な分裂促進シグナルによってであっても老化を誘導された場合に有効であったことを示している。
糖質コルチコイドは糖質コルチコイド受容体を介してSASPの抑制を媒介する
多くのSASP因子はmRNA存在量のレベルで上方調節されるため(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Coppeら、2010, PLoS ONE 5:e9188)、3つの重要なSASP因子(IL-6、IL-8、MMP-3)のmRNAに対する糖質コルチコイドの効果(図13A1)を決定した。本明細書に記載のようにDMSO、500nMコルチコステロン、または100nMコルチゾールで処理された老化前(モック)または老化X線照射HCA2細胞からmRNAを抽出した。3つのmRNAは全て、コルチコステロンおよびコルチゾールによって強く減少したが(図13A1)、これは糖質コルチコイドが転写レベルで作用することを示唆している。第2の実験においては、SASP因子IL-5、IL-6、IL-8、MMP-3、IL-1α、MCP-2、MCP-3、およびGM-CSFのmRNAを決定した(図13A2を参照されたい)。
糖質コルチコイドは、GRアイソフォームに対するリガンドであり、リガンド結合の際に、核に移行し、そこでそれらはいくつかの遺伝子の転写を変化させる；糖質コルチコイドの多くの生理学的効果は、GRに依存する(GrossおよびCidlowski, 2008, Trends Endocrinol. Metab. 19:331-339; Zanchiら、2010, J. Cell Physiol. 224:311-315; OakleyおよびCidlowski, 2011, J. Biol. Chem. 286:3177-3184)。老化またはコルチコステロンもしくはコルチゾールの添加の結果としての変化について、GR発現レベルを測定した(図13B)。GRのmRNAレベルは、老化前細胞と比較して老化細胞においてわずかに増加すると考えられ、糖質コルチコイド添加によっては影響されなかった。GRは老化前細胞中では主に細胞質性であり、X線照射により細胞が老化を誘導された後、最大で7日間、細胞質に残存した(図13C)。しかしながら、GRはコルチコステロンまたはコルチゾールのいずれかに応答して核に移行し(図13C)、これはこれらの糖質コルチコイドが両方ともGRを活性化することができることを示している。対照的に、コルチゾールに結合し、GRと物理的に相互作用することもできる関連する鉱質コルチコイド受容体は、コルチコステロンまたはコルチゾール添加後も細胞質に残存した(図17A)。かくして、コルチコステロンおよびコルチゾールはそれぞれ、老化HCA2細胞においてGR核局在化を特異的に誘導する。
コルチコステロンおよびコルチゾールが選択されたSASP成分の発現を抑制する能力がGRによって媒介されたかどうかを決定するために、RNA干渉(RNAi)およびGRの細胞を枯渇させるように設計された低分子ヘアピン(shRNA)を発現するレンチウイルスを用いた。定量的PCRおよびウェスタンブロッティングにより、2つの異なるshRNAがGR mRNAおよびタンパク質レベルを減少させることが確認された(図13D；13E）。GR枯渇は、コルチコステロンおよびコルチゾールによるIL-6分泌の抑制を部分的に救助した(図13F)。この部分的救助は、shRNAによる不完全なGR枯渇に起因するものであり得る(図13D；13E)。これらの結果と一致して、コルチコステロンまたはコルチゾールと、糖質コルチコイドアンタゴニストRU-486(Cadepondら、1997, Annu. Rev. Med. 48:129-156; Lewis-Tuffinら、2007, Molec. Cell Biol. 27:2266-2282)による老化細胞の同時処理は、糖質コルチコイドによる抑制された老化関連IL-6分泌を救助した(図13G)。RU-486は、GR核移行に影響することなくこの糖質コルチコイド活性を遮断した(図17B)。
総合すると、これらの結果は、コルチコステロンおよびコルチゾールが両方とも、NF-κB DNA結合およびトランス活性化活性を阻害することによりIL-1αシグナリングを抑制する、老化細胞におけるGR核移行を誘導したことを示す。さらに、GRの遺伝的または薬学的阻害(RU-486)は糖質コルチコイドによる老化関連IL-6分泌の抑制を救助したため、結果は、GRが老化細胞における糖質コルチコイドの抑制効果にとって必要であることを示唆する。
糖質コルチコイドは上流のSASP調節因子であるIL-1αの発現を抑制する
IL-1αがSASPの重要な上流の調節因子である(老化関連IL-6/IL-8サイトカインネットワーク)ことは以前に証明されている(Orjaloら、2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17031-17036)。IL-1αは、転写因子である核因子-カッパB(NF-κB)を活性化することによりSASPを確立、維持し(Orjaloら、2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17031-17036; Freundら、2011, EMBO J. 30:1536-1548)、これはIL-1α転写をさらに刺激し、それによって、正のフィードバックループを確立する(Freundら、2010, Trends Molec. Med. 16:238-248)。この正のフィードバックループは、NF-κB活性化の増加を誘導し、結果として、いくつかのSASP因子の転写を誘導する。従って、糖質コルチコイドがIL-1α発現と干渉することによりSASPを抑制したかどうかを検査した。
IL-1α mRNAは、細胞がX線照射により老化を誘導された後に急速に上昇した(図14A)。照射の時点で添加した場合、コルチコステロンおよびコルチゾールは両方ともこの上昇、ならびにIL-6 mRNAの後の上昇を遅延させた(図14A；14B)。さらに、糖質コルチコイドは照射後少なくとも7日間にわたってIL-1αおよびIL-6 mRNAレベルを抑制し続け(対照の10%未満)、その時点でSASPが通常完全に生じる(Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Rodierら、2009, Nature Cell Biol. 11:973-979)。
IL-1αは細胞膜と核の両方に局在化する(Wermanら、2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2434-2439; Orjaloら、2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:10731-10736)。IL-1α mRNAレベルの抑制と一致して、コルチコステロンおよびコルチゾールはまた、IL-1αタンパク質の発現も抑制し、これは糖質コルチコイド処理された老化細胞ではなく、対照において強い核染色として視認できた(図14C)。
糖質コルチコイドはIL-1α/NF-κB経路を損傷する
糖質コルチコイドが、IL-1αシグナリングを抑制することによりSASPを抑制するかどうかを決定するために、インターロイキン-1受容体関連キナーゼ1(IRAK1)およびNF-κBの阻害剤であるIκBαの存在量を測定した。これらのタンパク質は両方とも、IL-1α/IL-1受容体(IL-1R)シグナリングの重要な成分であり(Perkins, 2007, Nature Rev. Molec. Cell Biol. 8:49-62; Gottipatiら、2008, Cell Signal. 20:269-276)、IL-1RがIL-1αに会合した後に迅速に分解される(Perkins, 2007, Nature Rev. Molec. Cell Biol. 8:49-62; Gottipatiら、2008, Cell Signal. 20:269-276; Orjaloら、2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:17031-17036)。IRAK1およびIκBαは、老化前細胞と比較して、老化細胞において存在量が非常に少なかったが、これは老化細胞における活発なIL-1Rシグナリングを示している(図15A)。NF-κBサブユニットであるRelAの存在量は変化しなかった。IL-1α産生の抑制およびIL-1Rシグナリングの遮断と一致して、コルチコステロンおよびコルチゾールは老化前レベル近くまでIRAK1およびIκBαタンパク質を回復させた(図15A)。さらに、糖質コルチコイドは、IκBα mRNAレベルに対する効果を有さなかったが(図18)、これは、それらが間接的に作用して、タンパク質レベルを減少させたことを示唆しており、IL-1α mRNAレベルに対するその効果と一致する。
組換えIL-1αはコルチコステロンおよびコルチゾールによるIL-6分泌の抑制を救助したが(図15B)、これは糖質コルチコイドがIL-1α/IL-1Rシグナリングを標的とすることによりIL-6などのSASP成分を抑制するという考えと一致している。GRはNF-κB活性を調節することが知られているため、糖質コルチコイドがこれに関して作用し得る1つの潜在的な機構は、NF-κB活性を阻害することによるものである。このモデルを支持すれば、コルチコステロンおよびコルチゾールは、老化細胞におけるNF-κB DNA結合とトランス活性化活性との両方を有意に低下させた(図15C；15D；15F)。さらに、いずれかの糖質コルチコイドと、RU-486(糖質コルチコイドアンタゴニスト)または組換えIL-1αとを用いる老化細胞の同時処理は、NF-κBトランス活性化活性を救助した(図15D)。理論によって束縛されることを望むものではないが、GRを介して作用する糖質コルチコイドは、IL-1α発現を損傷することによってSASP成分の発現および分泌を最終的に駆動するIL-1α/NF-κBの正のフィードバックループの確立を防止することによって少なくとも部分的にSASPを抑制すると考えられる。しかしながら、一度確立されたら、フィードバックループは糖質コルチコイドによっては影響されないと考えられる。かくして、SASPの確立を可能にする転写全体像は、それを維持する転写全体像とは異なってもよい。
糖質コルチコイドは腫瘍細胞侵襲を刺激するSASPの能力を抑制する
老化細胞は、前悪性または悪性細胞中で侵襲性癌関連表現型を刺激することができる因子を分泌する(Krtolicaら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12072-12077; Liu and Hornsby, 2007, Cancer Res. 67:3117-3126; Coppeら、2008, PLoS Biol. 6:2853-2868; Bartholomewら、2009, Cancer Res. 69:2878-2886; Coppeら、2010, PLoS ONE 5:e9188)。従って、糖質コルチコイドが、Boydenチャンバー中の基底膜に侵襲するように非侵襲性ヒト乳癌細胞(T47D)を刺激するSASPの能力を抑制したかどうかを調査した。老化前細胞から調製された条件化培地はT47D細胞による最小限の侵襲を刺激したが、老化細胞から調製した培地は予想通り4倍多く侵襲を刺激した(図15E)。コルチコステロンおよびコルチゾールは両方とも、老化前レベルの近くまでT47D侵襲性を刺激する老化条件化培地の能力を減少させた。かくして、複数のSASP因子の分泌の抑制に加えて、糖質コルチコイドはSASPの重要な生物学的特性を抑制した。
フラボノイドアピゲニンは老化関連分泌表現型の選択された成分を抑制する
休止している(非老化；モック照射)か、またはX線照射により老化を誘導されたHCA2ヒト線維芽細胞を用いて化合物ライブラリーから潜在的なSASP調節因子を同定するための以前に記載されたスクリーニングプロトコールを用いて、ATPレベルを変化させることなくIL-6分泌を抑制することができるものとして、糖質コルチコイドと共にフラボノイドも同定された。アピゲニン(4’,5,7-トリヒドロキシフラボン)は、一般的な果実および野菜に存在する天然の植物フラボンである。
アピゲニンがSASP全体を抑制したかどうか、またはどの程度抑制したかを決定するために、多重ELISAを用いて50種のサイトカインおよび増殖因子の相対的分泌を調査した。IMR90線維芽細胞を、照射直後に10μMのアピゲニンまたはDMSOで処理し、6日後に分析した。細胞を洗浄し、アピゲニンを含まない無血清培地中でインキュベートして、条件化培地を作成した。非老化細胞、アピゲニンまたはDMSO処理された照射されたIMR90細胞および対照(モック照射、DMSO処理)細胞に由来する条件化培地を、様々なSASP因子についてELISAにより分析した(図19)。図19に示されるように、アピゲニンはいくつかの前炎症性サイトカインおよびケモカイン、例えば、TGFA、MCP3、LIF、IFNβ、IL-6、GROA、およびIL-2などの分泌を抑制した。2倍未満抑制されたこれらのSASP因子は、有意に抑制されたとは考えなかった。
上記の様々な実施形態を組合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で記載され、および/または出願データシートに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。実施形態の態様を、必要に応じて様々な特許、出願および刊行物の概念を用いてさらなる実施形態を提供するために改変することができる。
これらの変更およびその他の変更を、上記の詳細な説明を考慮して実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、用いられる用語は明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に対して特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が与えられる等価物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。

Claims (67)

  1. 薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤を被験体に投与することを含み、前記薬剤が薬物療法の施行の前、後、またはそれと同時に投与される、被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法。
  2. 薬剤が薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後に被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
  3. 生物学的損傷応答を抑制する薬剤が、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 薬剤が薬物療法の施行の前に被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
  5. 薬剤が薬物療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に被験体に投与される、請求項４に記載の方法。
  6. 薬剤が施される薬物療法の少なくとも一部と同時に投与される、請求項１に記載の方法。
  7. 生物学的損傷応答を抑制する薬剤が、老化細胞により産生される1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 薬剤が低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 薬物療法が被験体における老化細胞の割合を増加させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 薬物療法が放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 被験体が癌を有する、癌の寛解にある、癌の再発を生じる危険性がある、または癌を発症する危険性があり、薬物療法が抗癌療法を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 癌が固形腫瘍または液性腫瘍を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 癌が転移性癌である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 抗ウイルス療法がHIV/AIDS管理療法である、請求項１０に記載の方法。
  15. HIV/AIDS管理療法が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 被験体が癌を有し、幹細胞移植を受けたか、または受ける予定であり、薬物療法が高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 幹細胞移植が(a)自己幹細胞移植、および(b)同種異系幹細胞移植から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 被験体が心血管疾患を有するか、または心血管疾患を発症する危険性があり、薬物療法がアンギオテンシンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  19. 被験体が糖尿病を有し、薬物療法がインスリンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  20. 被験体における薬物療法の有効性を増強するための方法であって、
    (a)被験体に、被験体の1つ以上の細胞における老化を誘導する薬物療法を施すこと；および次いで、
    (b)被験体に、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする抗老化細胞剤を投与すること、
    を含む、前記方法。
  21. 前記薬剤が、薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、または少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後に被験体に投与される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記薬剤が低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 薬物療法が被験体における老化細胞の割合を増加させる、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 薬物療法が放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 被験体が癌を有する、癌の寛解にある、癌の再発を生じる危険性がある、または癌を発症する危険性があり、薬物療法が抗癌療法を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 癌が固形腫瘍または液性腫瘍を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 癌が転移性癌である、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 抗ウイルス療法がHIV/AIDS管理療法である、請求項２４に記載の方法。
  29. HIV/AIDS管理療法が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 被験体が癌を有し、幹細胞移植を受けたか、または受ける予定であり、薬物療法が高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せを含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  31. 幹細胞移植が(a)自己幹細胞移植、および(b)同種異系幹細胞移植から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 被験体が心血管疾患を有するか、または心血管疾患を発症する危険性があり、薬物療法がアンギオテンシンである、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  33. 被験体が糖尿病を有し、薬物療法がインスリンである、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  34. 薬物療法の有効性を増強するための薬物療法により誘導される生物学的損傷応答を抑制する薬剤の使用であって、該薬剤が薬物療法の施行の前、後、またはそれと同時の投与にとって好適である、前記使用。
  35. 前記薬剤が薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後の投与にとって好適である、請求項３４に記載の使用。
  36. 生物学的損傷応答を抑制する薬剤が、1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする、請求項３４または３５に記載の使用。
  37. 前記薬剤が薬物療法の施行の前に投与される、請求項３４に記載の使用。
  38. 前記薬剤が薬物療法の施行の少なくとも1日前、少なくとも2〜6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4〜5週間前、少なくとも6〜8週間前、または少なくとも10〜12週間前に投与される、請求項３７に記載の使用。
  39. 前記薬剤が施される薬物療法の少なくとも一部と同時に投与される、請求項３４に記載の使用。
  40. 生物学的損傷応答を抑制する薬剤が、老化細胞により産生される1つ以上の老化細胞関連分子の発現または分泌を阻害する、請求項３４に記載の使用。
  41. 前記薬剤が低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である、請求項３４に記載の使用。
  42. 薬物療法が被験体における老化細胞の割合を増加させる、請求項３４に記載の使用。
  43. 薬物療法が放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む、請求項３４に記載の使用。
  44. 薬物療法が抗癌療法である、請求項３４に記載の使用。
  45. 癌が固形腫瘍または液性腫瘍を含む、請求項４４に記載の使用。
  46. 癌が転移性癌である、請求項４４または４５に記載の使用。
  47. 抗ウイルス療法がHIV/AIDS管理療法である、請求項４３に記載の使用。
  48. HIV/AIDS管理療法が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む、請求項４７に記載の使用。
  49. 薬物療法が高用量化学療法もしくは高用量放射線療法またはその組合せであり、幹細胞移植の施行の前または後に施される、請求項３４に記載の使用。
  50. 幹細胞移植が(a)自己幹細胞移植、および(b)同種異系幹細胞移植から選択される、請求項４９に記載の使用。
  51. 薬物療法がアンギオテンシンである、心血管疾患を治療または防止するための請求項３４に記載の使用。
  52. 薬物療法がインスリンである、糖尿病を治療または防止するための請求項１に記載の使用。
  53. 薬物療法の有効性を増強するための抗老化細胞剤の使用であって、前記薬物療法が1つ以上の細胞における老化を誘導し、前記薬剤が1つ以上の老化細胞を選択的に破壊するか、またはその選択的破壊を容易にする、前記使用。
  54. 前記薬剤が、薬物療法の施行の少なくとも3日後、少なくとも4日後、少なくとも5日後、少なくとも6日後、少なくとも7日後、または少なくとも10日後、少なくとも30日後、少なくとも60日後、または少なくとも90日後の投与にとって好適である、請求項５３に記載の使用。
  55. 前記薬剤が低分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、ペプチボディ、組換えウイルスベクター、または核酸である、請求項５３に記載の使用。
  56. 薬物療法が老化細胞の割合を増加させる、請求項５３に記載の使用。
  57. 薬物療法が放射線、化学療法、抗ウイルス療法、またはホルモンを含む、請求項５３に記載の使用。
  58. 薬物療法が癌を治療または防止するための抗癌療法を含む、請求項５３に記載の使用。
  59. 癌が固形腫瘍または液性腫瘍を含む、請求項５８に記載の使用。
  60. 癌が転移性癌である、請求項５８に記載の使用。
  61. 抗ウイルス療法がHIV/AIDS管理療法である、請求項５７に記載の使用。
  62. HIV/AIDS管理療法が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)を含む、請求項６１に記載の使用。
  63. 薬物療法がアンギオテンシンである、心血管疾患の治療または防止のための請求項５３に記載の使用。
  64. 薬物療法がインスリンである、糖尿病を治療または防止するための請求項５３に記載の使用。
  65. 老化関連分泌表現型(SASP)を選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、
    (a)老化細胞を候補薬剤と接触させ、休止細胞を候補薬剤と接触させること；
    (b)老化細胞および休止細胞により産生される1つ以上の老化関連分子のレベルを決定すること；
    (c)老化細胞および休止細胞の生存能力を決定すること；ならびに
    (d)老化細胞により産生される1つ以上の老化関連分子のレベルを、休止細胞により産生される1つ以上の老化関連分子のレベルと比較すること、
    を含み、休止細胞により産生される1つ以上の老化関連分子のレベルの減少と比較した、老化細胞により産生される1つ以上の老化関連分子のレベルの減少、ならびに老化細胞および休止細胞の生存能力が候補薬剤の存在下で減少しないことが、老化関連分泌表現型を選択的に阻害する化合物を同定する、前記方法。
  66. SASPに特徴的な前記1つ以上の成分が、IL-6、IL-8、GM-CSF、MCP3、IGF1、PDGF-BB、EGF、BMP4、およびMCP-2からなる群より選択される1つ以上の成分を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記方法が高効率スクリーニング(HTS)形式で実施される、請求項６５または６６に記載の方法。
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