KR101070324B1

KR101070324B1 - 마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물

Info

Publication number: KR101070324B1
Application number: KR1020100029016A
Authority: KR
Inventors: 지용훈; 김동희; 강재선; 김천규; 정성욱; 황성우; 강경란; 김도형
Original assignee: 대우제약 주식회사
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-10-06
Also published as: CA2761254A1; CA2761254C; US20120071549A1; EP2433631B1; CN102438613B; KR20100126184A; CN102438613A; WO2010134790A2; JP2012527452A; EP2433631A2; ES2440329T3; JP5395260B2; US9089543B2; EP2433631A4; WO2010134790A3

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 균주인 바실러스 폴리퍼멘티큐스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주에서 생산되는 마크로락틴 에이(macrolactin A), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A), 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)와 같은 마크로락틴류 화합물들의 항염물질로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 상기 마크로락틴류 화합물들은 염증매개인자 생성 관련 단백질인 유도형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthetase, iNOS) 및 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 발현 및 생성을 강력히 저해함으로써 그 대사산물인 산화질소(nitric oxid, NO)와 프로스타글란딘 이투(prostagladin E2, PGE2)의 생성을 억제하는 것이 확인되었고 염증을 촉진하는 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 인터류킨-1 베타(interleukin-1β, IL-1β), 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)의 생성을 억제하는데 탁월한 효과가 있음이 확인되었다.
따라서, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 균주가 생산하는 상기 마크로락틴류 화합물들은 우수한 항염증제를 제공할 수 있다.

Description

마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물 { compositions for anti-inflammatory containing macrolactin A and its derivatives}

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 항염물질인 마크로락틴 에이(macrolactin A, 이하 “MA"라 칭함), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A, 이하 “MMA”라 칭함) 그리고 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A, 이하 “SMA"라 칭함)와 같은 마크로락틴류 화합물들의 그 용도발명에 관한 것으로서, 특히 유도형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthetase : iNOS, 이하" iNOS"라 칭함) 및 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2 : COX-2, 이하 "COX-2"라 칭함) 및 염증을 촉진하는 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α, 이하 “TNF-α”라 칭함), 인터류킨-1베타(interleukin-1β, IL-1β, 이하 “IL-1β”라 칭함), 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6, 이하 “IL-6”라 칭함) 및 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF, 이하 “GM-CSF”라 칭함)의 생성을 억제함으로써 뛰어난 항염활성을 가지는 상기 마크로락틴류 화합물들의 용도에 관한 것이다.

마크로락틴류 화합물들은 24 환의 락톤링을 포함하고 있는 마크로라이드계 항생물질이다(J. Am. Chem. Soc., 1989,111, 7519-7524). 상기 화합물들은 분류되지 않은 해양 박테리아, 방선균 그리고 바실러스 균주에서 생산되는 것으로 보고되었고, 지금까지 21 종류가 확인되었다. 지금까지 보고된 마크로락틴류 화합물들은 다양한 약리활성을 갖고 있다. 마크로락틴류 화합물의 약리활성에 대한 종래 연구는 다음과 같다.

1989년 Willam Fenical은 MA가 Herpes simplex와 HIV에 대해 항바이러스 활성을 지니고 있다는 것을 밝힌바 있다. 1997년 ICK-DONG YOO은 Actinomadura sp. 균주에서 MA를 분리하였고, 분리된 MA를 이용하여 글루타메이트(glutamate)에 유발된 신경세포의 보호에 관한 연구를 하였다. 2001년에 Hiroshi Sano는 Bacillus. sp. PP19-H3 균주에서 MA를 분리하였고, Staphylococcus aureus IFO 12732와 Bacillus subtilis IFO 3134 균주에 대한 항균활성에 관하여 연구하였다. 2003년 Sung-Won Choi는 Streptomyces sp. YB-401 균주에서 MA를 생산하였으며, MA가 콜레스테롤 생합성 억제효과를 나타낸다고 하였다. 2004년에는 Keun-Hyung Park은 Bacillus amyloliquefaciens CHO104 균주에서 MA를 분리하였으며, Staphylococcus aureus KCTC 1928, Escherichia coli KCTC 2593 그리고 Botrytis cinerea에 대한 항균활성에 관한 연구를 수행하였다. 2005년에는 Joo-Won Suh은 Bacillus sp. sunhua 균주에서 MA를 분리하였고, 생산된 MA로 감자 더뎅이병균의 억제에 관한 연구를 하였다. 2006년에는 Gabriella Molinari는 Bacillus subtilis DSM 16696 균주에서 MA, MMA 그리고 SMA를 분리하였고, 각 해당물질을 반코마이신 내성 장구균(vancomycin-resistant Enterococci, VRE), 메치실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 그리고 Burkholderia cepacia에 대해 항균 실험을 수행하였다. 이 연구에서는 MMA와 SMA는 상기 실험균에 대해 항균활성이 뛰어난 것으로 밝혀진 반면, MA는 단지 MRSA 균에 대해서만 항균 활성이 나타난다고 밝힌바 있다.

이렇듯, 마크로락틴류 화합물들은 상기와 같은 다양한 약리활성을 갖고 있으나, 그밖에 다른 약리활성에 대한 연구 보고는 전무하다. 특히, 마크로락틴류 화합물들의 염증 억제 효능에 대한 연구는 현재까지 전혀 보고된 바가 없다.

염증이란 신체 국소에 일어나는 상해에 대한 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극에 반응하여, 자극에 의한 상해를 제거함으로써 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다.

이러한 염증을 유발하는 물질 중 하나인 산화질소(nitric oxid, NO, 이하 “NO”라 칭함)는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며, 혈관확장, 혈소판 부착 및 응집, 신경전달, 소화기관 운동, 음경발기 등에 관여하는 매개물질이며, 염증세포 뿐만 아니라 비면역 세포에서도 생성되어 미생물 감염에 대한 방어작용을 하기도 한다. 지방다당질(lipopolysaccharide, LPS, 이하 “LPS” 라 칭함), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 세포내의 iNOS 단백질의 발현을 유도하여 NO를 계속 생성하여 염증질환을 유발한다.

다른 염증유발 물질인 프로스타글란딘이투(prostagladin E2, PGE2, 이하 "PGE2"라 칭함)는 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 COX-2 단백질의 발현에 의해 생성된다. COX-2의 발현을 저해하는 약물은 국소염증에서 PGE2의 생성 억제에 의한 진통, 항부종작용, 해열작용, 항염증 및 혈소판 항응집성이 있으며, 이러한 특성들을 이용하여 혈전증(thrombus), 부종(edema)의 경감, 경색(infarction), 발작(stroke) 및 뇌혈관 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

상기 두 종류의 염증 유발인자인 iNOS와 COX-2는 서로 밀접한 관련이 있으며, 생성된 과량의 NO는 COX-2 발현에 영향을 주기도 한다. 따라서, iNOS 및 COX-2 활성 저해제는 NO 및 PGE2 대사산물의 과잉 생성으로 수반되는 인체의 다양한 질병(예, 염증질환)을 예방 또는 치료할 수 있는 의약품으로서 개발 가능성이 높다 할 수 있다.

현재까지 스테로이드 또는 비스테로이드성 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)의 사용으로 상당 기간 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 기존 항염증제의 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 현재 상기 약물들을 이용한 치료에서 부작용의 심각성이 증대되어 새로운 항염증제 개발은 절실히 요구된다..

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 항염물질인 MA, MMA 그리고 SMA와 같은 마크로락틴류 화합물들의 그 용도발명에 관한 것으로서, 특히, iNOS 및 COX-2 단백질 생성을 억제함으로써 뛰어난 항염활성을 가지는 상기 마크로락틴류 화합물들의 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 마크로락틴류 화합물들을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 및 치료를 위한 의학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 화학식 1의 MA외에 화학식 2의 MMA와 화학식 3의 SMA 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 MA, MMA 그리고 SMA와 같은 마크로락틴류 화합물들을 유효성분으로 포함하는 iNOS 및 COX-2 단백질 그리고 염증성 사이토카인 생성 억제제로서의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마크로락틴류 화합물들을 함유하는 염증질환의 예방 및 치료를 위한 의약 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.

상기 화학식 1과 화학식 2에 해당하는 화합물인 MA와 MMA를 얻기 위해서는 본 발명자들에 의해 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주를 엠에이(MA) 배지를 사용하여 발효한다. 생성된 발효액을 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 후 농축하고 하기 <실시예 1>에 기술된 과정을 거쳐 해당물질은 분리되고 정제된 후 구조분석을 실시하게 된다.

상기 화학식 3에 해당하는 화합물인 SMA를 얻기 위해서는 상기 균주를 HP-20 수지를 포함하고 있는 티에스비(Tryptic soy broth, TSB) 배지에 배양한 후 하기 <실시예 1>에 기술된 과정을 거쳐 해당물질은 분리되고 정제된다.

상기 단계로부터 정제된 물질의 구조규명은 엘씨매스(LC/Mass)와 엔엠알 (nuclear magnetic resonance, NMR) 장비를 사용하여 실시하였다.

상기 과정에서 얻은 마크로락틴류 화합물 MA, MMA 그리고 SMA의 염증 억제 효능에 대한 연구는 현재까지 전혀 보고된 바가 없다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기 화합물들에 대한 염증 억제 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다. 상기 정제된 화합물들의 항염활성을 조사하기 위하여, 쥐의 대식세포 RAW264.7에 상기화합물을 처리한 후 LPS(0.1㎍/㎖ 또는 1.0㎍/㎖, Sigma)로 자극하여 염증유발물질인 1) NO와 2) PGE2 생성 및 그 생성에 관련된 효소의 발현을 조사하였다. 그리고 동일한 방법으로 세포를 자극하여 염증 반응을 촉진하는 3)염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 GM-CSF의 생성을 조사하였다.

1) 상기 화합물들의 NO 생성 억제효과는 그리스 반응(Griess recation)을 통하여 실시하였다. 그 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA, MMA 그리고 SMA가 NO 생성을 강력하게 저해하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 마크로락틴류 화합물들의 NO 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 억제 활성이 필적할 만하거나 우수한 것으로 확인되었다.

NO 생성은 iNOS 단백질과 관련이 있으며, 일단 iNOS 활성이 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하게 된다. 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낼 뿐만 아니라, 염증상태에서는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시키고 염증 매개인자들의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

상기에 기술된 NO 생성에 관한 억제기전을 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 화합물을 쥐의 대식세포 RAW264.7에 처리하고 LPS로 자극하여 iNOS의 생성을 유도한 후, 각 실험물질들에 대한 iNOS 생성 억제 정도를 실시간 유전자 증폭기(Real time-PCR) 및 웨스턴블랏(western blot)을 통해 알아보았다.

그 결과, 실시간 유전자 증폭에 의한 유전자 발현에 있어서 MA, MMA 그리고 SMA는 iNOS mRNA(messenger Ribo-nucleic acid, mRNA, 이후 “mRNA”라 칭함) 발현을 강하게 억제하였고, 그 억제활성은 하이드로코로티손과 필적할 만하거나 우수하였다. 또한, 웨스턴블랏(western blot)에 의한 단백질 발현 수준에서도 본 발명의 화합물들은 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다.

상기 실험결과를 유추어 볼때, 본 발명의 화합물들이 iNOS 단백질 발현을 강하게 억제시키는 것으로 보아 본 발명의 화합물들은 iNOS 단백질 발현을 강하게 억제하여 NO 생성을 억제하는 것으로 여겨진다.

2) 상기 화합물들의 다른 염증매개인자인 PGE2 억제효과는 효소결합면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트(kit)를 이용하여 정량하였다. 그 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA, MMA 그리고 SMA가 PGE2의 생성을 강력히 저해하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 마크로락틴류 화합물들의 PGE2 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 저해 활성이 필적할 만하거나 유사한 것으로 확인되었다. 다수의 염증 억제 약물들의 작용기전은 PGE2 합성 억제를 나타내며, 이는 COX-2 단백질 생성 및 활성을 저해함으로써 나타난다. COX-2에 의한 PGE2의 합성은 염증반응을 매개한다. 또한, COX-2 단백질에 의해 생성된 PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 맥관형성을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 발명자들은 PGE2 생성 억제가 COX-2 단백질 생성 억제와의 관련성을 조사하기 위해 쥐의 대식세포 RAW264.7에 본 발명의 화합물들을 처리하고 LPS로 자극하여 COX-2 생성을 유도한 후, 각 실험물질들에 대한 COX-2 단밸질 생성 억제 정도를 실시간 유전자 증폭 및 웨스턴블랏을 통해 알아보았다. 그 결과, 본 발명의 화합물들은 COX-2 mRNA 발현을 강하게 억제하였고, 그 억제활성은 하이드로코로티손과 필적할 만하거나 우수하였다. 또한, 웨스턴블랏에 의한 COX-2 단백질 발현 수준에서도 본 발명의 화합물들은 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다.

상기 실험결과에 의하면, 본 발명의 화합물들이 COX-2 단백질 발현을 강하게 억제시키는 것으로 보아 본 발명의 화합물들은 COX-2 단백질 발현을 강하게 억제하여 PGE2 생성을 강력하게 저해하는 것으로 여겨진다.

상기의 실험 결과로부터 본 발명의 화합물들은 iNOS와 COX-2 단백질 생성을 억제함으로써 그 생성물들인 NO와 PGE2 생성을 강력히 저해한다는 것을 확인하였다.

3) 상기 화합물들의 염증성 사이토카인 억제효과는 Mouse ELISA kit (KOMA Biotech)를 이용하여 정량하였다.

TNF-α 정량 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA, MMA 그리고 SMA가 TNF-α의 생성을 억제하였다. 그리고, 상기 마크로락틴류 화합물들의 TNF-α 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 비교에서는 그 억제 활성이 필적할만하거나 마크로락틴류 화합물들의 억제 활성이 더 우수한 것으로 확인되었다. 특히, MA는 다른 비교물질보다 TNF-α 생성 억제활성이 우수하였다.

IL-1β 정량 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA와 SMA는 IL-1β 생성을 강력하게 저해하였고, 특히, 상기 마크로락틴류 화합물들의 IL-1β 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 억제 활성이 필적할만하거나 우수한 것으로 확인되었다.

IL-6 정량 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA, MMA 그리고 SMA는 IL-6 생성을 강력하게 저해하는 것을 확인하였다. 상기 마크로락틴류 화합물들의 IL-6 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)보다 그 억제 활성은 뛰어나지 않았다.

GM-CSF 정량 결과, 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 MA와 SMA가 GM-CSF 생성을 강력하게 저해하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 마크로락틴류 화합물들의 GM-CSF 생성을 비교하기 위해 사용된 하이드로코르티손(hydrocortisone)보다 그 억제 활성이 우수하였다.

상기 실험결과에 의하면, 본 발명의 화합물들이 급성염증과 만성염증 모두에 관여하는 염증성 사이토카인의 생성을 강력하게 저해하는 것으로 여겨진다.

또한, 본 발명의 마크로락틴류 화합물들과 더불어 항염증제로 현재사용하고 있는 하이드로코르티손이 쥐의 대식세포 RAW264.7에 미치는 세포독성을 엠티티(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT, 이후 “MTT”라 칭함) 분석을 통하여 조사한 결과, 본 발명의 화합물들이 하이드로코르티손보다 세포독성이 적은 것으로 확인되었다.

본 발명이 제공하는 바실러스 폴리퍼멘티큐스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주에서 생산되는 3 종류의 마크로락틴류 화합물, MA, MMA 그리고 SMA는 염증매개인자 생성 단백질인 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 및 생성을 직접적으로 강력히 억제함으로써 그 대사산물인 NO와 PGE2 생성을 저해하며, 이러한 대사산물의 과잉 생성으로 수반되는 인체의 다양한 질병(예, 염증질환)을 예방 또는 치료할 수 있을 것이다. 또한, 마크로락틴류 화합물들은 기존 항염증제에 비해 낮은 세포독성을 나타내어 기존 약물로 초래되는 부작용 문제를 개선할 수 있으리라 기대된다.

[도 1] 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주 발효액 추출물의 엠피엘씨 크로마토그램(MPLC chromatoram).
[도 2] 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주 배양액 추출물의 엠피엘씨 크로마토그램(MPLC chromatoram).
[도 3] 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주에서 생산된 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 엘씨매스(LC/Mass) 분석. a) 파장 262 nm에서 분석된 엘씨 크로마토그램(LC chromatogram), b) 자외선 스펙트럼, c) ESI-스펙트럼 (Electrospray ionize-spectrum).
[도 4] 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주에서 생산된 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A)의 엘씨매스(LC/Mass) 분석. a) 파장 262 nm에서 분석된 엘씨 크로마토그램(LC chromatogram), b) 자외선 스펙트럼, c) ESI-스펙트럼 (Electrospray ionize-spectrum).
[도 5] 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주에서 생산된 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)의 엘씨매스(LC/Mass) 분석. a) 파장 262 nm에서 분석된 엘씨 크로마토그램(LC chromatogram), b) 자외선 스펙트럼, c) ESI-스펙트럼 (Electrospray ionize-spectrum).
[도 6] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 NO 생성 억제효과.
[도 7] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 PGE2 생성 억제효과.
[도 8] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 iNOS mRNA 발현 억제효과.
[도 9] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 COX-2 mRNA 발현 억제효과.
[도 10] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2 단백질 생성 억제효과.
[도 11] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에 미치는 세포독성 영향.
[도 12] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 TNF-α 생성 억제효과
[도 13] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 생성 억제효과 IL-1β 생성 억제효과
[도 14] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 IL-6 생성 억제효과
[도 15] 본 발명의 화합물들이 RAW264.7 세포에서 GM-CSF 생성 억제효과

이하, 본 발명의 구성을 하기 실험 및 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 균주로부터 마크로락틴 에이(macrolactin A), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A), 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A) 생산, 분리 및 구조분석

[제 1단계: 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2 균주로부터 마크로락틴 에이(macorlactin A) 및 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A) 생산 및 분리]

MA와 MMA를 얻기 위해 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주를 엠에이(MA) 배지를 사용하여 발효한다. 엠에이(MA) 배지의 조성은 다음과 같다.

Nutrient broth(Difco) 16 g/L, Skim milk 10 g/L, 2.5 μM FeSO4, 500 μM, CaCl2, 1 mM MgSO4, 13 mM KCl.

발효공정은 공기유입량 0.143 vvm, 회전수 200 rpm, 온도 30℃이며, 1N HCl과 3N NaOH를 사용하여 pH는 6.8로 유지하며 발효한다. 생성된 발효액은 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 후 농축하고 메탄올에 용해하여 엠피엘씨(middle pressure liquid chromatography, MPLC, 이하 "MPLC"라 칭함)로 해당물질을 분리하기 위한 시료로 사용한다. 물질을 분리하기 위해 사용된 MPLC는 Buchi MPLC system(Buchi pump C-605, column 1.5×23 cm, Fraction collector Buchi C-660)이 사용되었고, 컬럼내에는 LiChroprep C-18 (40 ～ 63 ㎛, Merck)으로 충진하였다. 검출파장은 262 nm로 설정하였고, 이동상은 40% 아세토니트릴(acetonitrile), 유량은 15 ml/min이다. 상기 발효추출액을 컬럼내에 유입시킨 후 [도 1]에 기술된 1번 피크와 2번 피크에 해당하는 부분을 분획하고 농축한 후 차기 분석을 위한 시료로 사용하였다.

[제 2단계 : 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2 균주로부터 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A) 생산 및 분리]

SMA를 얻기 위해 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주를 에이치피-20(HP-20, Mistubishi 화학) 수지 10%가 포함된 티에스비(Tryptic soy broth, TSB) 배지에 접종한 후 30℃, 200 rpm으로 2.5일 동안 배양한다. 배양 후 에이치피-20 수지만을 회수하고 물로 수세한 후 메탄올로 결합된 물질을 용출시킨다. 메탄올 용출액은 농축한 후 MPLC 장비로 해당물질을 분리하기 위한 시료로 사용한다. MPLC 조작조건은 상기에 언급한 것과 동일하게 수행한다. 하기 [도 2]에 기술된 피크에 해당하는 부분을 분획하고 농축한 후 차기 분석을 위한 시료로 사용하였다.

[제 3단계 : 분석장비의 분석조건 및 구조분석]

상기단계로 정제된 각 물질은 하기에 제시된 장비 및 조건을 이용하여 분석되었다. 조르박스 에스비-씨에이틴(Zorbax SB-C18, 입자크기 5㎛, 4.6 X 250 mm) 컬럼이 장착된 에질런트(agilent) 1100 시리즈 엘씨매스(LC/Mass)를 사용하여 각 물질을 질량분석을 실시하였다. 이동상은 아세토니트릴과 물에 0.1% 포름산을 포함하고 있으며, 엘씨(LC) 조건은 20분 동안 에세토니트릴을 0%에서 100%로 구배(gradient)용매 분석방법으로 유량 1 ml/min, 검출파장 262 nm이다. 매스(mass) 분석 조건은 AP-ESI(Atmosphere pressure-Electro spray ionization) 모드로 건조가스(drying gas) 유량 13 L/min, 증기압(vapor pressure) 50 psi, 건조가스(drying gas) 온도 350℃, 모세관 전압(capillary voltage)은 양이온 모드에서 4000 V, 음이온 모드에서 3500 V, 질량범위(mass range)는 100 m/z에서 1000 m/z, 토막이온전압(fragment voltage) 150 V이다. 상기 조건으로 상기단계에서 정제된 각 물질은 분석되었고, [도 3, 4] 그리고 [도 5]에 그 결과를 도시하였다. 각 물질들의 질량분석 결과는 다음과 같다.

[도 1]에 도시된 1번 분획은 [M+Na]+ 425.4 m/z, [M+K]+ 441.4 m/z, 최대흡광도(λmax) 262nm, 순도 98.3%로 확인되었고, 2번 분획은 [M+Na]+ 511.7 m/z, 최대흡광도(λmax) 258nm, 순도 84.88%로 확인되었다. [도 2]에 도시된 분획은 [M+Na]+ 526.0 m/z, [M-H]- 502.0 m/z, 최대흡광도(λmax) 258nm, 순도 97.02%로 확인되었다.

각각의 정제된 물질의 화학구조를 규명하기 위해 각각의 정제된 물질 약 30 mg을 디엠에스오-디6(DMSO-d6) 용액에 녹여 엔엠알 분석을 실시하였다. 각 물질의 화학구조를 규명하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-90, DEPT-135, Homo COZY, HMQC, HMBC 엔엠알 기술을 사용하였으며, 추가로 1H-NMR 스펙트럼이 복잡한 문제로 구조분석에 어려움을 해결하기 위해 수소짝풀림(Proton decoupling) 방법을 추가로 이용하였다.

질량분석결과[도 3]와 더불어 [도 1]에 도시된 1번 분획의 엔엠알 분석결과 MA로 확인되었고, 그 결과를 [표 4와 1]에 기록하였다. 선광계(Polarimeter) 폴락스-디(POLAX-D, Atago)를 사용하여 본 물질의 비선광도를 측정한 결과 17℃에서 -10(c = 4.0, 메탄올)으로 확인되어, 화학식 1에 제시된 구조와 동일한 물질인 MA로 확인되었다.

질량분석결과[도 4]와 더불어[도 1]에 도시된 2번 분획의 엔엠알 분석결과 MMA로 확인되었고, 그 결과를 [표 4와 2]에 기록하였다. 선광계(Polarimeter) 폴락스-디(POLAX-D, Atago)를 사용하여 본 물질의 비선광도를 측정한 결과 17℃에서 -5(c = 4.0, 메탄올)로 확인되어, 화학식 2에 제시된 구조와 동일한 물질인 MMA로 규명되었다.

질량분석결과[도 4]와 더불어[도 2]에 도시된 분획의 엔엠알 분석결과 SMA로 확인되었고, 그 결과를 [표 4와 3]에 기록하였다. 선광계(Polarimeter) 폴락스-디(POLAX-D, Atago)를 사용하여 본 물질의 비선광도를 측정한 결과 17℃에서 -15(c = 4.0, 메탄올)로 확인되어, 화학식 2에 제시된 구조와 동일한 물질인 SMA로 규명되었다.

참고로, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2) 균주가 생산하는 MA, MMA, SMA의 생산 방법, 수율, 순도 그리고 본 연구를 통하여 규명된 각 물질들의 특성을 [표 4]에 기록하였다.

축약어 - MA, 마크로락틴 에이(macrolactin A); MMA, 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A); SMA, 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)

실시예 2: 쥐의 대식세포 RAW264.7 세포에 대한 마크로락틴류 화합물의 항염활성 조사

대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW264.7 세포는 한국유전자은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 10% Fetal Bovine Serum(FBS; LONZA)와 1% penicillin/streptomycin(Sigma사)이 포함된 Dulvecco's modified Eagle's medium(DMEM; LONZA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였고 세포의 80% 밀집상태에 도달하면 계대배양을 실시하였다. RAW 264.7 세포를 24시간 배양한 후 MA (1 ~ 100 μM), MMA(10 μM), SMA(10μM)과 활성비교물질인 하이드로코르티손(10 μM)을 첨가하고 1시간 후 LPS(0.1 또는 1.0 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하여 8시간 또는 16시간동안 추가로 배양한다. 음성대조군으로는 디엠에스오(dimethyl sulfoxide, 이하 "DMSO"라 칭함) 용액을 사용하였고, 양성대조군으로는 물질을 첨가하지 않은 상태에서 LPS(0.1 또는 1.0 ㎍/㎖, Sigma)로 유도한 것을 사용하였다.

실험예 1: NO 생성 억제효과 조사

세포 배양액 내의 NO의 농도는 Nitrate/Nitrite colorimetric assay Kit (Cayman)를 사용하여 측정하였다. 쥐의 대식세포 RAW264.7을 6 well plate에 1 X 105 cells/well로 조정하고 상기 실시예 2에 기술된 과정으로 세포를 24시간 배양한다. 세포 배양 후 물질과 LPS(0.1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하고 16시간을 추가로 배양한다. 전 과정으로 생성된 세포 배양액을 상기 제조사에서 제공한 96 well plate에 Griess 시약 R1 (Sulfanilamide) 처리 후 Griess 시약 R2 (N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine)를 함께 처리하여 나이트라이트(nitrite)가 보라색의 아조염으로 생성되는 것을 확인한다. 이때 자외선 분광계로 흡광도 540nm에서 제조사에서 제공한 표준용액을 사용하여 작성된 표준곡선에 의해 NO 생성량을 산출한다.

그 결과, MA와 비교물질인 하이드로코르티손(hydrocortisone)은 NO 생성을 강력히 저해함으로써 그 효과가 유사하였으나, MMA와 SMA는 낮은 저해활성을 보였다[도 6].

실험예 2: PGE2 생성 억제효과 조사

세포내의 염증성 인자인 PGE2의 생성량은 Amersham prostaglandin E2 biotrak enzymeimmunoassay(EIA) system kit (GE Healthcare)를 사용하여 측정하였다. 쥐의 대식세포 RAW264.7을 96 well plate에 2×104cells/well로 조정하고 상기 실시예 2에 기술된 과정으로 세포를 24시간 배양한다. 세포 배양 후 물질과 LPS(0.1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하고 16시간을 추가로 배양한다. 배양 후 제조사에서 제공한 방법으로 세포내의 PGE2 생성량을 450 nm 파장에서 자외선 흡광도법으로 해당 흡광도를 측정하고 제조사에서 제공한 PGE2 표준 용액으로 작성한 검량선에 그 수치를 대입하여 PGE2 생성량을 환산한다. 표준물질에 대한 검량곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.

그 결과, MA, MMA 그리고 SMA는 PGE2 생성을 강력히 저해하였고, 비교물질인 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 저해활성이 유사하거나 필적할 만하였다[도 7].

실험예 3: iNOS와 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향 조사

세포내의 염증성 인자인 iNOS와 COX-2 mRNA 발현에 있어 본 발명의 화합물들이 미치는 영향을 조사하기 위하여 6 well plate에 쥐의 대식세포 RAW264.7을 1 X 105 cells/well로 조정하고 상기 실시예 2에 기술된 과정으로 세포를 24시간 배양한다. 세포 배양 후 물질과 LPS(0.1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하고 16시간을 추가로 배양한다. 배양 세포의 total RNA는 Trizol reagent(Sigma사)를 사용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 분리된 total RNA로 PCR을 수행하기 위한 주형(template)을 확보하기 위해 cDNA 합성 kit (TAKARA)를 사용한다. Oligo dT Primer(50 μM) 1 ㎕ , dNTP Mixture(10 mM each) 1 ㎕, 주형 RNA 2 ㎍를 첨가한 후 RNase free dH2O를 이용해서 총 부피를 10㎕로 조정한다. 이후, 65℃에서 5분간 방치하고 바로 얼음에 넣어 2분간 유지한다. 생성된 상기 혼합액 10 ㎕와 5 X PrimeScript™ buffer 4 ㎕, RNase inhibitor(40U/㎕) 0.5 ㎕, PrimeScript™ RTase(200 U/㎕) 0.5 ㎕를 첨가하고 RNase free dH2O를 이용해서 총 부피를 20㎕로 조정한 후 42℃에서 30분간 반응하여 cDNA를 합성한다.

합성된 cDNA 25 ~ 50 ng과 sensiMixPlus SYBR 2 X buffer(Quantance) 5 ㎕, primer[표 5] 각각 0.25 pmol로 되게 첨가한 후 증류수로 전체 부피를 10 ㎕로 맞춘다. 상기 제조된 혼합물의 iNOS와 COX-2 mRNA 발현양은 실시간 유전자 증폭기(Corbett life science Rotor-gene 6000)를 사용하여 측정한다. 실시간 유전자 증폭기의 조작조건은 다음과 같다. 초기 변성은 95℃에서 5 min으로 시작한 후 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 30초로 50회 반복한다. PCR 과정 후 각각의 mRNA 발현양은 서로 다른 시료로 비교할 때는 목적 유전자외에 housekeeping 유전자도 동시에 측정하여 상대정량을 구할 수 있다. Housekeeping 유전자의 측정값에서 RNA량을 보정함으로써 시료의 mRNA 생성량을 Ct(Threshold cycle) 값으로 산출하여 측정한다.

그 결과, MA, MMA 그리고 SMA는 iNOS와 COX-2 mRNA 발현을 강력히 저해하였고, 비교물질인 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 저해활성이 유사하거나 필적할 만하였다[도 8과 9].

실험예 4: iNOS와 COX-2 단백질 생성에 미치는 영향 조사

세포내의 염증성 인자인 iNOS와 COX-2 단백질 생성에 본 발명의 화합물들이 미치는 영향을 조사하기 위하여 100mm dish에 쥐의 대식세포 RAW264.7을 1 X 106 cells/dish로 조정하고 상기 실시예 2에 기술된 과정으로 세포를 24시간 배양한다. 세포 배양 후 물질과 LPS(0.1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하고 16시간을 추가로 배양한다. 세포를 차가운 PBS로 2 ~ 3회 세척하고 세포를 모은다. 수거된 세포에 50 mM Tris-HCl buffer pH7.5 (0.1 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF)를 100 ㎕ 첨가한 후 액체질소를 사용하여 세포를 용해시킨다. 세포 용해물은 4℃에서 10분간 13,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 모은다. 단백질은 Bradford 법으로 정량한 후 50 ㎍의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrlyamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동한다. 전기영동 후 SDS-PAGE 젤을 전압 50 V로 2시간 동안 nitrocellulose membrane (Amersham사)에 전이한다. 1 X Tris buffered saline(TBS; 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl)로 nitrocellulose membrane을 2번 세척하고 비특이적 단백질에 대한 반응을 차단하기 위해 3% gelatin 용액을 첨가하고 1시간동안 실온에서 반응시킨다. 3% 젤라틴 용액을 제거하고 1 X Tris buffered saline-Tween(TBS-T;0.1M NaCl, 10mM Tris-HCl, 0.1% Tween 20)을 첨가한다. iNOS와 COX-2 단백질 발현양상을 조사하기 위해 anti-mouse iNOS(Cell Signaling), anti-mouse COX-2(Cell Signaling), anti-mouse GAPDH(Cell Signaling)를 1 X TBS-T에 1 : 1000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응한다. 반응 후 1 X TBS-T로 2번 세정하고 2차 항체 Alkaline phophatase가 결합된 anti-rabbit IgG(Sigma사)를 1 X TBS-T로 1 : 5000으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후 1 X TBS-T로 3회 세척하고 항체에 대한 대응 단백질 band는 BCIP/NBT Color Development Substrate(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phsophate/nitro blue tetazolium, Promega)를 이용해서 확인한다.

그 결과, MA, MMA 그리고 SMA는 iNOS와 COX-2 단백질 생성을 강력히 저해하였고, 비교물질인 하이드로코르티손(hydrocortisone)과 그 저해활성이 유사하거나 필적할 만하였다[도 10].

실험예 5: 세포독성에 미치는 영향 조사

본 발명의 화합물들이 쥐의 대식세포 RAW264.7에 미치는 세포독성을 조사하기 위하여 MTT 분석방법을 사용하였다. 세포는 96 well plate에 4×104cells/well로 조정하고 24시간 동안 배양한다. 각 해당물질을 첨가하고 추가로 16시간 동안 배양한다. 배지를 제거한 후 MTT 용액 (2 ㎎/㎖ PBS)을 100 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 4시간 동안 배양한다. MTT용액을 제거하고 DMSO를 100 ㎕를 첨가해서 30분 동안 암소에서 진탕배양한다. 배양 후 유리된 formazan의 양을 540 nm 파장에서 ELISA reader 장비를 사용하여 측정하였다.

그 결과, MA, MMA 그리고 SMA는 현재 항염증제로 사용중인 하이드로코르티손(hydrocortisone) 보다 세포독성이 낮은 것으로 확인되었다[도 11].

Claims

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 마크로락틴 에이(macrolactin A)를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A)를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P) 균주가 생산하는 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 항염활성은 염증매개인자인 산화질소(Nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 이투(Prostagladin E2, PGE2), 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 인터류킨-1베타 (Interleukin-1β, IL-1β), 인터류킨-6(Interleukin-6, IL-6) 및 과립구대식세포콜로니-자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 생성의 억제작용에 의한 것임을 특징으로 하는 항염제 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 항염활성은 유도형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthetase : iNOS) 및 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2 : COX-2) 활성의 억제작용에 의한 것임을 특징으로 하는 항염제 조성물.