CN102438613A - 含有大环内酯菌素a及其衍生物作为有效成分的消炎药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由新的芽孢杆菌菌株—聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacil lus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株产生的大环内酯菌素A(macrolactin A)、7-O-丙二酰大环内酯菌素A(7-O-malonyl macr olactin A)以及7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinyl macrolacti n A)等大环内酯类化合物作为抗炎物质的用途。已确认本发明提供的上述大环内酯类化合物通过强烈抑制作为与产生炎症介质相关的蛋白的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase:iNOS)及环氧合酶-2(cyclooxygenase-2:COX-2)表达及生成,从而抑制其代谢产物一氧化氮(nitric oxid,NO)和前列腺素E2(prostagladin E2,PGE2)的生成,并确认了对作为促炎细胞因子(pro-inflammator y cytokine)的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage col ony-stimulating factor,GM-CSF)生成的抑制效果优异。因此本发明的聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)菌株生成的上述大环内酯类化合物能够提供优异的消炎药。
Description
技术领域
本发明涉及由聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticusKJS-2,KCCM10769P)菌株产生的大环内酯菌素A(macrolactin A,以下称为MA”)、7-O-丙二酰大环内酯菌素A(7-O-malonyl macrolactin A,以下称为“MMA”)以及7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinyl macrolactin A,以下称为“SMA”)等大环内酯类化合物的用途发明,尤其涉及通过抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthetase:iNOS,以下称为“iNOS”)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2:COX-2,以下称为“COX-2”)、作为促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokine)的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α,以下称为“TNF-α”)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β,以下称为“IL-1β”)、白介素-6(interleukin-6,IL-6,以下称为“IL-6”)及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF,以下称为“GM-CSF”)的生成,从而具有优异的抗炎活性的上述大环内酯类化合物等的用途。
背景技术
大环内酯类化合物是包含24环内酯环的大环内酯类抗炎物质(J.Am.Chem.Soc.,1989,111,7519-7524)。据报道上述化合物是从未分类的海洋细菌、放线菌以及芽孢杆菌菌株中产生,到目前为止已确认了21种。到目前为止报道的大环内酯类化合物具有多种药理活性。现有的针对大环内酯类化合物药理活性的研究如下。
1989年,威廉·冯尼克(Willam Fenical)揭示了MA(大环内酯菌素A)具有对单纯疱疹病毒(Herpes simplex)和艾滋病病毒(HIV)的抗病毒活性。1997年ICK-DONG YOO从马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)菌株中分离出MA,该分离出的MA被用于研究通过谷氨酸盐(glutamate)触发的神经细胞保护。2001年Hiroshi Sano从芽孢杆菌(Bacillus.sp.)PP19-H3菌株中分离出MA,并研究了其针对金黄色葡萄球菌IFO 12732和枯草杆菌IFO 3134菌株的抗菌活性。2003年Sung-Won Choi从链霉菌(Streptomyces sp.)YB-401菌株中分离出MA,并显示MA具有对胆固醇生物合成的抑制效果。在2004年,Keun-Hyung Park从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CHO104菌株中分离出MA,并研究了其针对金黄色葡萄球菌KCTC 1928、大肠杆菌KCTC 2593以及葡萄孢菌的抗菌活性。2005年Joo-Won Suh从芽孢杆菌sunhua(Bacillus sp.sunhua)菌株中分离出MA,并将分离出的MA用于研究对疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)的抑制作用。2006年Gabriella Molinari从枯草芽孢杆菌DSM 16696菌株分离出MA、MMA以及SMA,并进行了各相应物质针对耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistantEnterococci,VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)以及洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia)的抗菌试验。在该研究中MMA和SMA显示出对上述用于试验的细菌的优异的抗菌活性,不过MA仅显示出了对MRSA的抗菌活性。
像这样,大环内酯类化合物虽然具有如上所述的多种药理活性,却从没有除此之外的关于其它药理活性的研究报告。尤其是到目前为止还没有对于大环内酯类化合物的抑制炎症作用的报告。
炎症是针对身体局部发生的伤害而进行的活体组织的防御反应。即、对各种有害刺激发生反应,通过去除因刺激引起的伤害,欲恢复到原来的状态的活体防御反应是炎症反应。
诱发这种炎症的物质之一的一氧化氮(nitric oxid,NO,以下称为“NO”)在正常状态下由内皮细胞或巨噬细胞中产生,是血管扩张、血细胞粘附和聚集、神经传导、消化器官运动、阴茎勃起等的关联介质,其不仅在炎症细胞,在非免疫细胞中也能生成,起到防御微生物感染的作用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,以下称为“LPS”),炎症诱发因子及放射线照射等刺激尤其能够诱导细胞内的iNOS蛋白表达,从而持续生成NO,诱发炎症疾患。
其它炎症诱发物质前列腺素E2(prostagladin E2,PGE2,以下称为″PGE2″)作为源自花生四烯酸(arachidonic acid)的一种荷尔蒙,与多种生理活性相关,其生成基于COX-2蛋白的表达。妨碍COX-2表达的药物在局部炎症中具有基于抑制PGE2生成的镇痛、抗水肿作用、解热作用、抗炎及抗血细胞凝聚性,利用这样的特性可以用于血栓(thrombus)、减轻水肿(edema)、梗塞(infarction)、中风(stroke)及脑血管疾患的预防与治疗。
上述两种炎症诱发因子iNOS和COX-2相互密切关联,生成的过量NO也会影响COX-2的表达。随着NO及PGE2代谢产物的过量产生身体出现多种疾病(例如,炎症疾病),iNOS及COX-2活性抑制剂作为用于预防或治疗上述疾病的药品,具有很高的开发可能性。
目前为止,类固醇或非类固醇性消炎药(nonsteroidalanti-inflammatory drug,NSAID)在相当一段时间内有选择性地使用在急性及慢性炎症疾患的治疗中。但是由于现有消炎药的副作用,难以长期使用。现在,使用上述药物进行治疗,副作用的严重性增加,迫切需要开发新的消炎药。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明涉及由聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticusKJS-2,KCCM10769P)菌株产生的抗炎物质诸如MA、MMA以及SMA等大环内酯类化合物的用途发明,尤其提供通过抑制iNOS及COX-2的生成而具有优异的抗炎活性的上述大环内酯类化合物的用途。
此外,本发明目的在于提供含有上述大环内酯类化合物作为有效成分的用于预防及治疗炎症的药物组合物。
解决技术问题的技术手段
本发明提供聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticusKJS-2,KCCM10769P)菌株产生的化学式1所示的MA的用途,还提供化学式2所示的MMA和化学式3所示的SMA化合物的用途。
本发明还提供一种含有上述MA、MMA以及SMA等大环内酯类化合物为有效成分的作为iNOS及COX-2蛋白以及促炎细胞因子生成抑制剂的用途。
本发明的目的还在于提供含有上述大环内酯类化合物、用于炎症的预防与治疗的药物组合物。
下面对本发明进一步详细说明。
为了获得与上述化学式1和化学式2对应的化合物MA和MMA,使用MA培养基将本发明人分离出的聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacilluspolyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株发酵。用乙酸乙酯(ethylacetate)提取生成的发酵液后,进行浓缩,经过下述<实施例1>所述的过程分离出相应的物质,纯化后进行结构分析。
为了获得对应上述化学式3的化合物SMA,上述菌株在含有HP-20树脂的胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth,TSB)培养基中培养后,经下述<实施例1>所述过程分离出相应物质并纯化。
从上述步骤纯化得到的物质的结构分析是利用液相色谱质谱仪(LC/Mass)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)装置实施的。
目前为止,还没有关于对从上述过程中获得的大环内酯类化合物MA、MMA以及SMA的炎症抑制作用进行研究的报告。
因此,本发明的发明人通过确认上述化合物的炎症抑制作用,从而完成了本发明。为了研究上述纯化得到的化合物的抗炎活性,用上述化合物对鼠巨噬细胞RAW264.7进行处理之后,用LPS(0.1μg/ml或1.0μg/ml,西格玛(Sigma))进行刺激,从而对炎症诱发物1)NO和2)PGE2的生成以及与生成相关酶的表达进行了研究。然后,采用相同方法刺激细胞,研究促进炎症反应的3)促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及GM-CS的生成。
1)上述化合物的NO生成抑制效果是通过格里斯反应(Griessrecation)实施的。其结果可确认:与对照组LPS单独处理组相比,MA、MMA以及SMA可强烈抑制NO的生成。尤其可确认,为了比较上述大环内酯类化合物对NO生成的抑制活性使用了氢化可的松(hydrocortisone,Hyd),确认了所述化合物的抑制活性与氢化可的松相当或优于氢化可的松。
NO的生成与iNOS蛋白有关,一旦iNOS活性得以诱导则在长期间内生成大量NO。已经知道生成的NO不仅表现出对活体的有害作用,诸如病理上的血管扩张、细胞毒性、组织损伤等,而且在炎症状态下促进血管通透性、水肿等炎症反应,促进炎症介质的生物合成,加重炎症。
为了研究与上述NO生成相关的抑制机理,本发明人用上述化合物对鼠巨噬细胞RAW264.7进行处理后,用LPS进行刺激从而诱导iNOS的生成后,通过实时荧光定量PCR(Real time-PCR)及蛋白印迹法(western blot)对各实验物的抑制iNOS生成的程度进行了了解。
通过实时荧光定量PCR,结果表明,在基因表达过程中,MA、MMA以及SMA强烈地抑制了iNOS mRNA(信使核糖核酸messengerRibo-nucleic acid,mRNA,以下称为“mRNA”)表达,并且其抑制效果与氢化可的松相当或优于氢化可的松。此外,在基于蛋白印迹法(western blot)的蛋白表达水平方面,本发明化合物同LPS单独处理的对照组相比显示了很强的抑制效果。
通过上述实验结果,由本发明化合物强烈抑制iNOS蛋白表达方面来看,可以认为本发明化合物强烈抑制iNOS蛋白表达,从而抑制了NO的生成。
2)上述化合物的其它炎症介质PGE2的抑制效果是使用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(kit)进行的定量。其结果可确认,与对照组LPS单独处理组相比,MA、MMA以及SMA强烈抑制了PGE2的生成。尤其是为了比较上述大环内酯类化合物的PGE2生成使用了氢化可的松(hydrocortisone),上述化合物的抑制活性与氢化可的松相当或优于氢化可的松。许多炎症抑制药物都具有抑制PGE2合成的作用机制,这是通过抑制COX-2蛋白的生成及活性而实现的。基于COX-2的PGE2合成介导炎症反应。另外,已知由COX-2蛋白生成的PGE2与促进炎症反应、免疫反应以及促进血管形成相关,而且与癌症的发生也有很大的关系。本发明的发明人为了研究抑制PGE2生成与抑制COX-2蛋白生成之间的关联性,用本发明的化合物对鼠的巨噬细胞RAW264.7进行处理后,用LPS进行刺激,诱导COX-2生成后,通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹法对各实验物的抑制COX-2蛋白成程度进行了检测。其结果表明,本发明的化合物强烈地抑制了COX-2mRNA表达,其抑制活性与氢化可的松相当或优于氢化可的松。此外,通过蛋白印迹法测定COX-2蛋白表达水平,本发明的化合物同对照区LPS单独处理组相比,显示了很强的抑制效果。
根据上述实验结果,从本发明的化合物强烈抑制COX-2蛋白表达来看,可认为本发明的化合物通过强烈抑制COX-2蛋白表达,强烈地抑制了PGE2生成。
从上述实验结果可确认,本发明的化合物通过抑制iNOS和COX-2蛋白的生成,强烈地抑制了其生成物NO和PGE2生成。
3)上述化合物对促炎细胞因子的抑制效果是使用小鼠ELISA试剂盒(Mouse ELISA kit,格玛生物技术(KOMA Biotech))进行定量的。
TNF-α定量结果,同对照组LPS单独处理组相比,MA、MMA以及SMA抑制TNF-α生成。另外可确认,为了比较上述大环内酯类化合物的TNF-α生成,使用了氢化可的松(hydrocortisone),其抑制活性与氢化可的松相当,或者大环内酯类化合物的抑制活性更优异。尤其是MA,同其它参考药物相比,其对TNF-α生成的抑制活性优异。
IL-1β定量结果可确认,同对照组LPS单独处理组相比,MA和SMA强烈地抑制了IL-1β生成,尤其是为了比较上述大环内酯类化合物的IL-1β生成使用了氢化可的松,其抑制活性与氢化可的松相当或优于氢化可的松。
IL-6定量结果可确认,同对照组LPS单独处理组相比,MA、MMA以及SMA强烈地抑制了IL-6生成。为了比较上述大环内酯类化合物的IL-6生成使用了氢化可的松,其抑制活性不如氢化可的松出众。
GM-CSF定量结果可确认,与对照组LPS单独处理组相比,MA和SMA强烈地抑制GM-CSF生成。尤其是为了比较上述大环内酯类化合物的GM-CSF生成使用了氢化可的松,MA和SMA的抑制活性比氢化可的松优异。
根据上述实验结果,可以认为本发明的化合物强烈地阻碍了与急性炎症和慢性炎症均相关的促炎性细胞因子的生成。
此外,通过溴化噻唑蓝四氮唑(Thiazolyl Blue TetrazoliumBromide,MTT,以下称为“MTT”)法,测定了本发明的大环内酯类化合物和目前典型的作为消炎药使用的氢化可的松对鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。研究结果表明,本发明的化合物的细胞毒性低于氢化可的松的细胞毒性。
附图说明
图1为聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株发酵液提取物的MPLC色谱图(MPLC chromatoram)。
图2为聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株培养液提取物的MPLC色谱图(MPLC chromatoram)。
图3为用液相色谱质谱仪对从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株中产生的大环内酯菌素A进行分析的结果:a)在262nm波长下分析出的LC色谱图(LC chromatogram);b)紫外线光谱;c)电喷雾电离光谱(Electrospray ionize-spectrum)。
图4为用液相质谱仪(LC/Mass)对从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株中产生的7-O-丙二酰大环内酯菌素A进行分析的结果:a)在波长262nm处分析出的LC色谱图;b)紫外线光谱;c)ESI光谱(Electrospray ionize-spectrum)。
图5为用液相色谱质谱仪(LC/Mass)对从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株中产生的7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinyl macrolactinA)进行分析的结果:a)在262nm波长下分析出的LC色谱图(LCchromatogram);b)紫外线光谱;c)ESI-光谱(Electrosprayionize-spectrum)。
图6为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成NO的抑制效果。
图7为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成PGE2的抑制效果。
图8为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中iNOS mRNA表达的抑制效果。
图9为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中COX-2mRNA表达的抑制效果。
图10为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成iNOS和COX-2蛋白的抑制效果。
图11为本发明的化合物对RAW264.7细胞产生的细胞毒性影响。
图12为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成TNF-α的抑制效果。
图13为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中的生成抑制效果,生成IL-1β的抑制效果。
图14为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成IL-6的抑制效果。
图15为本发明的化合物对在RAW264.7细胞中生成GM-CSF的抑制效果。
具体实施方式
下面通过下述实验及实施例对本发明的构成进一步详细说明,但本发明的权利范围不受下述实施例的限制。
实施例1:从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株产生、分离大环内酯菌素A(macrolactin A)、7-O-丙二酰大环内酯菌素A(7-O-malonylmacrolactin A)、7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinyl macrolactinA),以及它们的结构分析
[步骤1:从聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2)菌株中产生、分离大环内酯菌素A(macorlactin A)及7-O-丙二酰大环内酯菌素A(7-O-malonyl macrolactin A)]
为了获得MA和MMA,使用MA培养基发酵由本发明人分离出的聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株。MA培养基的组成如下所述。
营养肉汤(Nutrient broth(Difco))16g/L,脱脂牛奶(Skim milk)10g/L,2.5μM硫酸亚铁(FeSO4),500μM氯化钙CaCl2,1mM硫酸镁(MgSO4),13mM氯化钾KCl。
发酵工艺是在空气流入量0.143vvm、转速200rpm、温度30℃条件下,使用1N的HCl和3N的NaOH使pH保持在6.8进行发酵。生成的发酵液用等量的乙酸乙酯(ethyl acetate)提取、浓缩后,溶于甲醇中,作为试样,用于采用中压液相色谱分析法(middle pressureliquid chromatography,MPLC,以下称为″MPLC″)分离相应物质。为了分离物质使用的MPLC为步琪MPLC系统(步琪泵C-605(Buchipump C-605),色谱柱1.5×23cm,馏分收集器步琪C-660(Fractioncollector Buchi C-660)),色谱柱内用LiChroprep C-18(40~63μm,默克公司)填充。检测波长设为262nm,流动相为40%乙腈(acetonitrile),流量为15ml/min。使上述发酵提取液流入色谱柱内后,分馏图1所示的峰1和峰2相应的部分,然后浓缩,作为试样用于下一个分析。
[步骤2:从聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticusKJS-2)菌株产生和分离7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinylmacrolactin A)]
为了获得SMA,将由本发明人分离出的聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株接种到含10%HP-20(三菱化学)树脂的胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth,TSB)培养基后,在30℃、200rpm条件下培养2.5天。培养后仅回收HP-20树脂,用水洗净后,再用甲醇洗脱出结合的物质。甲醇洗脱液被浓缩后,作为试样用于以MPLC装置分离相应物质。MPLC的操作条件与上述言及的内容相同。分馏下述[图2]所示峰相应的部分,然后浓缩,作为试样用于下一个分析。
[步骤3:分析装置的分析条件及结构分析]
对由上述步骤纯化的各物质采用如下所示的装置及条件进行分析。使用装有Zorbax SB-C18(粒子大小5μm,4.6X250mm)色谱柱的安捷伦(agilent)1100系列的液相质谱仪(LC/Mass)对各物质进行了质量分析。流动相为含0.1%甲酸的乙腈和水,LC条件为20分钟、0%-100%乙腈梯度(gradient)溶剂分析法、流量1ml/min,检测波长为262nm。质量(mass)分析条件为:在AP-ESI(大气压电喷雾电离Atmosphere pressure-Electro spray ionization)模式中,干燥气体(drying gas)流量13L/min,蒸汽压(vapor pressure)50psi,干燥气体(drying gas)温度350℃,毛细管电压(capillary voltage)在阳离子模式下4000V、在阴离子模式下3500V,质量范围(mass range)为100~1000m/z,碎片电压(fragment voltage)为150V。在上述条件下对从上述步骤纯化得到的各物质进行了分析,[图3、4]以及[图5]图示了该结果。各物质的质量分析结果如下。
[图1]所示的馏分1确认为[M+Na]+425.4m/z,[M+K]+441.4m/z,最大吸光度(λmax)262nm,纯度98.3%;馏分2确认为[M+Na]+511.7m/z,最大吸光度(λmax)258nm,纯度84.88%。[图2]所示馏分确认如下:[M+Na]+526.0m/z,[M-H]-502.0m/z,最大吸光度(λmax)258nm,纯度97.02%。
为了研究各纯化物质的化学结构,将各纯化物质约30mg溶于二甲基亚砜-d6(DMSO-d6)溶液中进行核磁共振分析。为了研究各纯化物质的化学结构采用1H-NMR、13C-NMR、DEPT-90、DEPT-135、Homo COZY、HMQC、HMBC核磁共振技术,进一步为了解决由于1H-NMR光谱复杂难以进行结构分析的问题,还采用了质子去偶(Proton decoupling)方法。
结合[图3]的质量分析结果和[图1]所示的馏分1的核磁共振分析结果可确认为MA,其结果记载于[表4和1]。用偏光计(Polarimeter)POLAX-D(爱宕)测量该物质的比旋度结果确认为:在17℃时为-10(c=4.0,甲醇),确认为与化学式1所示的结构相同的物质MA。
表1
从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株产生的抗炎物质大环内酯菌素A的NMR分析结果
结合[图4]的质量分析结果和[图1]所示的馏分2的核磁共振分析结果可确认为MMA,其结果记载于[表4和2]。用偏光计(Polarimeter)POLAX-D(爱宕)测量该物质的比旋度结果确认为在17℃时为-5(c=4.0,甲醇),确定为与化学式2所示的结构相同的物质MMA。
表2
从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株生成的抗炎物质7-O-丙二酰大环内酯菌素A的NMR分析结果
结合[图4]的质量分析结果和[图2]所示的馏分的核磁共振分析结果可确认为SMA,其结果记载于[表4和3]。用偏光计(Polarimeter)POLAX-D(爱宕)测量该物质的比旋度结果确认为在17℃时为-15(c=4.0,甲醇),确定为与化学式2所示的结构相同的物质SMA。
表3
从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株产生的抗生素7-O-丁二酰大环内酯菌素A的NMR分析结果
参见[表4]。[表4]记载了聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株所生成的MA、MMA、SMA的产生方法、收率、纯度以及通过此次研究确定的各物质特性。
表4
从聚酵素芽孢杆菌KJS-2菌株产生的三种大环内酯类化合物的产生方法、收率、纯度及特性
缩写-MA,大环内酯菌素A;MMA,7-O-丙二酰大环内酯菌素;SMA,7-O-丁二酰大环内酯菌素A
缩写-MA,大环内酯菌素A(macrolactin A);MMA,7-O-丙二酰大环内酯菌素A;SMA,7-O-丁二酰大环内酯菌素A
实施例2:大环内酯类化合物对鼠的巨噬细胞RAW264.7细胞的抗炎活性的研究
从韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank,KCLB)获得小鼠巨噬细胞(Murine macrophage cell line)RAW264.7细胞,用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS;LONZA(龙沙))和1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,西格玛(Sigma))的细胞培养基(DMEM;龙沙),在37℃、在5%CO2的恒温器内进行培养,一旦达到80%的细胞密度,就进行继代培养。将RAW 264.7细胞培养24小时后,添加MA(1~100μM)、MMA(10μM)、SMA(10μM)和活性参考药物氢化可的松(10μM),1小时后进行LPS(0.1或1.0μg/ml,西格玛)处理,继续培养8小时或16小时。使用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,以下称为″DMSO″)溶液作为阴性对照组,使用在不添加物质的状态下采用LPS(0.1或1.0μg/ml,西格玛)的诱导物作为阳性对照组。
实验例1:NO生成的抑制效果的研究
采用硝酸盐/亚硝酸盐比色检测试剂盒(Nitrate/Nitrite colorimetricassay Kit,开曼(Cayman))测定细胞培养液内的NO浓度。将鼠的巨噬细胞RAW264.7在6孔板(6孔板)上调整为1X105细胞/孔(cells/well),采用在上述实施例2中已描述的过程培养细胞24小时。细胞培养后进行物质和LPS(0.1μg/ml,西格玛)处理,再培养16小时。将获得的细胞培养液在上述制造商所提供的96孔板上用格里斯(Griess)试剂R1(磺胺,Sulfanilamide)处理后,再与格里斯试剂R2(N-(1-萘基)-乙二胺,N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine)一起处理,可确认亚硝酸盐(nitrite)生成紫色的偶氮基。此时,使用紫外线分光计在吸光度540nm处用制造商提供的标准溶液制作标准曲线,根据该曲线计算NO生成量。
其结果显示:MA和参考药物氢化可的松(hydrocortisone)强烈抑制NO生成,它们的效果相似,但是MMA和SMA则显示低抑制活性[图6]。
实验例2:PGE2生成的抑制效果的研究
采用阿莫仙前列腺素E2 biotrak酶免疫测定(EIA)系统试剂盒(Amersham prostaglandin E2 biotrak enzymeimmunoassay(EIA)system kit,通用电气医疗集团GE Healthcare)测定细胞内促炎因子PGE2的生成量。将鼠的巨噬细胞RAW264.7在96孔板上调整为2×104细胞/孔,采用在上述实施例2中已描述的过程培养细胞24小时。细胞培养后进行物质和LPS(0.1μg/ml,西格玛)处理,再培养16小时。培养后采用制造商提供的方法,在450nm波长处用紫外线吸光度法对细胞内的PGE2生成量测定了相应的吸光度,用制造商提供的PGE2标准溶液制作标准曲线,代入该数值换算PGE2生成量。相应于标准物质的校准曲线的r2值0.99以上。
其结果显示:MA、MMA以及SMA强烈抑制PGE2生成,其抑制活性与参考药物氢化可的松类似或相当,参见[图7]。
实验例3 对iNOS和COX-2mRNA表达影响的研究
为了研究本发明化合物对细胞内促炎性因子iNOS和COX-2mRNA表达的影响,在6孔板上将鼠巨噬细胞RAW264.7调整为1X105细胞/孔,采用在上述实施例2中已描述的过程培养细胞24小时。细胞培养后进行物质和LPS(0.1μg/ml,西格玛)处理,再培养16小时。培养细胞的总RNA使用了RNA抽提试剂盒(Trizol reagent,西格玛公司)在去RNA酶(RNase-free)条件下形成的。为了使用分离出的总RNA确保为实施聚合酶链反应(PCR)的模板(template)使用cDNA合成试剂盒(宝生物(TAKARA))。添加1μl寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物(Oligo dT Primer,50μM)、1μl dNTP混合物(各10mM)、2μg模板RNA后,用去除RNA酶的去离子水将总体积调整为10μl。然后,在65℃下放置5分钟后立即加入到冰块中,持续2分钟。添加生成的10μl上述混合液和4μl 5X缓冲液、0.5μl Nase抑制剂(RNase inhibitor,40U/μl),0.5μl PrimeScriptTM核糖核酸酶(RNase,200U/μl),再用去除RNA酶的去离子水将总体积调整为20μl后,在42℃下反应30分钟后合成cDNA。添加25~50ng合成的cDNA和5μl sensiMixPlus SYBR 2X缓冲液(Quantance)、添加[表5]所示各引物,使得每个引物达到0.25pmol,然后用蒸馏水将整体体积调整为10μl。使用实时荧光基因扩增仪(科比特生命科学转子基因6000,Corbett life science Rotor-gene 6000))测量上述制得的混合物的iNOS和COX-2mRNA表达量。实时荧光基因扩增仪的操作条件如下所示。在95℃开始预变性5min之后,在94℃下30秒,57℃下30秒,72℃下30秒,50个循环。经过聚合酶链反应(PCR)后,各自的mRNA表达量在与不同的试样比较时,除了测定目标基因外,还同时测定管家基因,从而能够求出相对定量。通过对管家基因测定的RNA值进行补偿,从而根据Ct(循环阈值,Threshold cycle)值计算出每个试样中的mRNA生成量。
其结果为MA、MMA以及SMA强烈抑制了iNOS和COX-2mRNA得表达,其抑制活性与参考药物氢化可的松(hydrocortisone)类似或相当[图8和图9]。
表5 实时基因扩增时使用的引物序列及片段大小
实验例4:研究对生成iNOS和COX-2蛋白的影响
为了研究本发明化合物对细胞内的促炎性因子iNOS和COX-2蛋白生成的影响,在100mm平皿上将鼠巨噬细胞RAW264.7调整为1X106细胞/平皿,采用在上述实施例2中已描述的过程培养细胞24小时。细胞培养后进行物质和LPS(0.1μg/ml,西格玛)处理,再培养16小时。用冷的PBS清洗细胞2~3回,收集细胞。向获得的细胞中添加100μl 50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液(0.1M KCl,1mMEDTA,1mM DTT,0.2mM PMSF)后,使用液氮溶解细胞。以13,000rpm离心分离细胞溶解物10分钟,收集上清液。采用考马斯亮蓝法(Bradford)法定量蛋白后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrlyamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对50μg蛋白施加电泳后,在电压50V下,将SDS-PAGE凝胶通过2小时转移到硝化纤维膜上(nitrocellulose membrane)(阿莫仙公司)。用1X Tris缓冲液(Tris buffered saline,TBS;0.1M NaCl,10mM Tris-HCl)洗涤硝化纤维膜2次,为了中断对非特异性蛋白的反应,添加3%明胶溶液,在室温下反应1小时。去除3%明胶溶液添加1X Tris缓冲液-吐温(TBS-T;0.1M NaCl,10mM Tris-HCl,0.1%吐温20)。为了研究iNOS和COX-2蛋白表达形态,将抗鼠iNOS(细胞信号传到)、抗鼠COX-2(细胞信号传导)、抗鼠GAPDH(细胞信号传到)以1∶1000的比例稀释到1X TBS-T中,在室温下反应1小时。反应后用1X TBS-T清洗2次,将结合有2次抗体碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的抗兔IgG(西格玛公司)用1X TBS-T以1∶5000的比例进行稀释,反应1小时。反应后用1X TBS-T清洗3次,用BCIP/NBT彩色显影基质(Color Development Substrate)(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝,普洛麦格(Promega))确认对应抗体的蛋白条带。
其结果为,MA、MMA以及SMA强烈抑制iNOS和COX-2蛋白的生成,其抑制活性与参考药物氢化可的松(hydrocortisone)相似或与之相当[图10]。
实验例5:研究对细胞毒性的影响
为了研究本发明化合物对鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性,采用了MTT分析方法。在96孔板上将细胞调整为4×104细胞/孔,培养24小时。添加各相应物质后再培养16小时。去除培养基后按100μl添加MTT溶液(2mg/ml PBS),在37℃、5%CO2恒温器中培养4小时。去除MTT溶液后添加100μl DMSO,在黑暗中振荡培养30分钟。采用酶素免疫分析仪在540nm波长下测定培养后游离的甲瓒量。
其结果可确认,MA、MMA以及SMA比现有的用作消炎药的氢化可的松的细胞毒性低[图11]。
产业应用可能性
从本发明提供的聚酵素芽孢杆菌KJS-2(KCCM10769P)菌株中产生的3种大环内酯类化合物MA、MMA以及SMA通过直接强烈抑制炎症介质生成蛋白的iNOS和COX-2蛋白的表达及生成,从而抑制其代谢产物NO和PGE2的生成,能够预防或治疗由这种代谢产物的过量生成伴随导致的人体的多种疾病(例如,炎症疾患)。此外,大环内酯类化合物同现有消炎药相比显示低细胞毒性,被寄望能够改善现有药物导致的副作用问题。
Claims (5)
1.一种消炎药物组合物,其含有作为有效成分的由聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株产生的大环内酯菌素A(macrolactin A)。
2.一种消炎药物组合物,其含有作为有效成分的由聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株产生的有效成分7-O-丙二酰大环内酯菌素A(7-O-malonyl macrolactinA)。
3.一种消炎药物组合物,其含有作为有效成分的由聚酵素芽孢杆菌KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2,KCCM10769P)菌株产生的有效成分7-O-丁二酰大环内酯菌素A(7-O-succinyl)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的消炎药物组合物,其抗炎活性是基于作为炎症介质的一氧化氮(Nitric oxide,NO)、前列腺素E2(Prostagladin E2,PGE2)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)生成的抑制作用。
5.如权利要求1-3中任一项所述的消炎药物组合物,抗炎活性是基于诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase:iNOS)及环氧合酶-2(cyclooxygenase-2:COX-2)活性的抑制作用。
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