JP5395260B2 - マクロラクチンa及びその誘導体を有効成分として含有する抗炎症性組成物 - Google Patents
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Description
MAとMMAを得るために、本発明者により単離されたバチルス・ポリファーメンチカスKJS−2(KCCM10769P)株を用いる発酵工程を、MA培地中で実施した。
栄養培養液(Nutrient broth)(Difco社製)16g/L、
スキムミルク10g/L、
2.5μMのFeSO4、
500μMのCaCl2、
1mMのMgSO4、
13mMのKCl.
本発明者らによって単離されたバチルス・ポリファーメンチカスKJS−2(KCCM10769P)株をHP−20樹脂(三菱化学社製)10%を含むトリプチックソイブロス(TSB)培地に接種して、30℃、200rpmで2.5日間培養した。培養後、HP−20樹脂を回収し、水で洗浄した。メタノールを用いて結合した物質を溶出した。メタノール溶出液を濃縮して、MPLC用の試料を作成した。
工程1及び2で精製した各物質を下記の装置及び条件で分析した。Zorbax SB−C18カラム(粒径5μm、4.6×250mm)を備えたアジレント(agilent)1100シリーズLC/Massを用いて質量分析を行った。LCの移動相は、アセトニトリルと0.1%ギ酸含有水であり、LC分析条件は、流速1mL/分で20分間、アセトニトリル0%から100%の勾配溶媒を用いて、262nmで検出した。質量分析の条件は、乾燥ガス流13L/分、蒸気圧50psi、及び乾燥ガス温度350℃を用いるAP−ESI(Atmosphere pressure-Electro spray ionization)モードであった。毛細管電圧はカチオンモードで4000V、アニオンモードで3500Vであり、質量範囲は100m/z〜1000m/zであり、そしてフラグメント電圧(fragment voltage)150Vであった。前記条件下で工程1及び2で精製した各物質を分析して、図3、4及び5にその結果を示した。各化合物の質量分析の結果は以下の通りでる。
ネズミマクロファージ細胞株であるRAW264.7は、韓国細胞株銀行(Korean Cell Line Bank;KCLB)から入手した。10%ウシ胎仔血清(FBS;LONZA社製)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma社製)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;LONZA社製)中、37℃、5%CO2恒温器で培養して、細胞密度が80%に達したときに、継代培養を行った。RAW264.7細胞を24時間培養した後、MA(1〜100μM)、MMA(10μM)、SMA(10μM)及び抗炎症活性を有している公知物質である、ヒドロコルチゾン(10μM)を加えた。添加の1時間後に、LPS(0.1又は1.0μm/mL、シグマ社製)を混合物に加え、次いで8時間又は16時間培養した。陰性対照としてジメチルスルホキシド(以下、「DMSO」)を使用し、陽性対照としてマクロラクチン化合物を添加しない状態のLPS(0.1又は1.0μm/mL、シグマ社製)を使用した。
細胞培養液内のNOの濃度は、硝酸/亜硝酸比色アッセイキット(Cayman社製)を使用して測定した。1×105細胞/ウェルに調整したネズミマクロファージRAW264.7細胞を、6ウェルプレート中、実施例2に記載した条件下で24時間培養して、本発明のマクロラクチン化合物とLPS(0.1μg/mL、シグマ社製)で処理した後、16時間さらに培養した。培養培地を製造会社から提供された96ウェルプレート中でグリース試薬R1(スルファニルアミド)で、次いでグリース試薬R2(N−(1−ナフチル)−エチレンジアミン)で処理し、次いで亜硝酸塩からの紫色のアゾ基の形成を検出した。製造会社から提供された標準溶液によってUVスペクトルメータにおける540nmの吸光度で作成した検量線を用いて、NO生成量を算出した。
細胞内の炎症性因子である、PGE2の形成量は、アマシャムプロスタグランジンE2 biotrak エンザイムイムノアッセイ(Amersham prostaglandin E2 biotrak Enzymeimmunoassay;EIA)システムキット(GE Healthcare社製)を用いて測定した。96ウェルプレート中、2×104細胞/ウェルに調整したネズミマクロファージRAW264.7細胞を、実施例2に記載した条件下で24時間培養し、次いで、本発明のマクロラクチン化合物とLPS(0.1μg/mL、Sigma社製)で処理した後、16時間さらに培養した。製造会社から提供された標準溶液によって、UVスペクトルメータにおける450nmの吸光度で作成した検量線を用いて、PGE2生成量を算出した。標準物質に対する検量線のr2値は0.99以上であった。
細胞内の炎症性因子である、iNOS及びCOX−2mRNAの発現に対する本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。6ウェルプレート中、1X105細胞/ウェルに調整したネズミマクロファージRAW264.7細胞を、実施例2に記載した条件下で24時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とLPS(0.1μg/mL、シグマ社製)で処理した後、16時間さらに培養した。培養細胞の全てのRNAをRNase無しの条件下でTrizol試薬(シグマ社製)によって単離した。分離した全てのRNAを用いるPCR用のテンプレートを得るために、cDNA合成キット(タカラ社製)を使用した。Oligo dT Primer(50μM)1μL、dNTP Mixture(それぞれ10mM)1μL、及びテンプレートRNA2μgの混合物にRNaseを含んでいないdH2Oを添加して、総体積を10μLに調整した。混合物を65℃に5分間、次いで氷に入れて2分間保持した。混合液10μL、5×PrimeScript(登録商標)緩衝液4μL、RNase阻害剤(40U/μL)0.5μL、及びPrimeScript(登録商標)RTase(200U/μL)0.5μLの混合物にRNaseを含まないdH2Oを加えて総体積を20μLに調整した。混合物を42℃で30分間反応してcDNAを合成した。
細胞内の炎症性因子である、iNOSとCOX−2タンパク質形成に対する、本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。100mmdish中、1×106細胞/dishに調整したネズミマクロファージRAW264.7細胞を実施例2に記載した条件下で24時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とLPS(0.1μg/mL、シグマ社製)で処理した後、16時間さらに培養した。細胞を冷却したPBSで2〜3回洗浄し、次いで採取した。採取した細胞に50mMのTris−HCl緩衝液pH7.5(0.1MのKCl、1mMのEDTA、1mMのDTT、0.2mMのPMSF)100μLを添加して、液体窒素を使用して溶解した。この溶解物を4℃で10分間、13,000rpmで遠心分離して上清を採取した。タンパク質はBradford法で定量分析した。50μgのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に付した。SDS−PAGEゲルを電圧50Vで2時間、ニトロセルロース膜(Amersham社製)に転写した。1×トリス緩衝食塩液(TBS;0.1MのNaCl、10mMのTris−HCl)でニトロセルロース膜を2回洗浄し、そこに非特異的タンパク質反応を遮断するために3%ゼラチン溶液を添加し、次いで室温で1時間反応した。3%ゼラチン溶液を除去した後、1×トリス緩衝食塩液−Tween(TBS−T;0.1MのNaCl,10mMのTris−HCl、0.1%のTween20)をそこに添加した。iNOSとCOX−2のタンパク質発現を調べるために、抗マウス(anti−mouse )iNOS(Cell Signaling社製)、抗マウス(anti−mouse )COX−2(Cell Signaling社製)、及び抗マウス(anti−mouse )GAPDH(Cell Signaling社製)を、1×TBS−Tで1:1000に希釈して室温で1時間反応した。反応物を1×TBS−Tで2回洗浄し、次いで第2次抗体アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ(anti−rabbit )IgG(Sigma社製)と反応して、1×TBS−Tで、1:5000の比に1時間かけて希釈した。反応物を1×TBS−Tで3回洗浄して、抗体に対応するタンパク質バンドをBCIP/NBT Color Development Substrate(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム、Promega社製)を用いて同定した。
本発明のマクロラクチン化合物のネズミマクロファージRAW264.7に対する細胞毒性効果を調べるために、MTT分析法を使用した。4×104細胞/ウェルに調整した細胞を96ウェルプレートで、実施例2に記載した条件下で24時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物で処理した後、さらに16時間培養した。培地を除去した後、MTT溶液(2mg/mL PBS)100μLを添加し、次いで混合物を37℃、5%CO2恒温器で4時間培養した。MTT溶液を除去した後、DMSO100μLを添加し、次いで混合物を30分間、暗所でしん盪培養した。培養後、遊離ホルマザンの量を540nmでELISAリーダを使用して測定した。
Claims (5)
- バチルス・ポリファーメンチカス KJS−2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P)株から生産されるマクロラクチンAを有効成分として含有してなる、炎症疾患を予防及び治療するための組成物。
- バチルス・ポリファーメンチカス KJS−2(KCCM10769P)株から生産される7−O−マロニルマクロラクチンAを有効成分として含有してなる、炎症疾患を予防及び治療するための組成物。
- バチルス・ポリファーメンチカス KJS−2(KCCM10769P)株から生産される7−O−スクシニルマクロラクチンAを有効成分として含有してなる、炎症疾患を予防及び治療するための組成物。
- 抗炎症活性が、炎症媒介因子である酸化窒素(NO)、プロスタグランジンE2(PGE2)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、インターロイキン−1β(IL−1β)、インターロイキン−6(IL−6)及び顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子(GM−CSF)の形成の阻害に起因している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 抗炎症活性が、誘導型酸化窒素合成酵素(iNOS)及びシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)活性の阻害に起因している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
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