KR101729848B1

KR101729848B1 - 신규한 해양 바실러스속 균주, 이로부터 분리한 화합물 및 상기 화합물의 약제학적 용도

Info

Publication number: KR101729848B1
Application number: KR1020150093535A
Authority: KR
Inventors: 최혁재; 장현욱; 김금진; 이선
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2017-04-24
Also published as: KR20170003180A

Abstract

본 발명은 신규한 해양 바실러스속 균주, 이로부터 분리한 화합물 및 상기 화합물의 약제학적 용도에 관한 것으로, 신규 해양 바실러스속 균주에서 분리한 새로운 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 염증 반응 및 알레르기 억제 효과를 통해 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.

Description

신규한 해양 바실러스속 균주, 이로부터 분리한 화합물 및 상기 화합물의 약제학적 용도{Novel marine Bacillus sp., compounds isolated from the marine Bacillus sp. and pharmaceutical use of the compounds}

본 발명은 염증과 천식 같은 알레르기 질환의 예방 및 치료에 효과가 있는 신규한 해양 바실러스속 균주 유래의 신규 화합물에 관한 것이다.

염증이란 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극 (stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있다. 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유라디칼 (free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다. 염증의 과정은 보통 2가지로 나누며, 급성 및 만성 염증으로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 개재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 나타난다.

알레르기 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 및 혈액의 호염기성 세포 및 호산구에서 유리되는 매개체들 (주로 히스타민 (histamine), 류코트리엔 (leukotrienes), 종양괴사인자α (TNFα), 사이토카인 (cytokines) 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알레르기 치료 약물들의 용도는 증상완화에 머무르고 있기 때문에 보다 근본적인 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다.

염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류 (prostaglandindes), 류코트리엔류 (leukotriens), 혈소판활성화인자 (PAF) 등은 포스포리파제 A₂(phospholipase A₂, PLA₂) 및 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 및 리폭시게나제 (lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 생성된다. 아라키돈산 대사계 율속효소인 PLA₂는 세포내 분포위치에 따라 세포내성 (cPLA₂) 및 세포외성 (분비성 PLA₂, sPLA₂)으로 나누며, sPLA₂의동종효소 (isozyme)는 10종류가 있으며, 이 효소중에서 특히 sPLA₂-IIA, sPLA₂-V는 각종 염증질환, 알레르기 반응에 직접 및 간접적으로 관여함이 알려져 있다 (Murakami M et al, Prostaglandins Other Lipid Mediat vol. 68-69, pp. 3-58, 2002; Reid RC, Curr Med Chem vol. 12, pp. 3011-3026, 2005).

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 환식 아데노신모노포스페이트 (cyclic Adenosine MonoPhosphate, cAMP; 경우에 따라서는 환식 구아노신모노포스페이트, cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. 환식 아데노신모노포스페이트의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 프로스타글란딘 A₂(Prostaglandin A₂, PGA₂), 프로스타글란딘 B₂(Prostaglandin B₂, PGB₂), 프로스타글란딘 C₂ (Prostaglandin C₂, PGC₂)는 혈압을 강하시키고, 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂), 프로스타글란딘 E₁ (Prostaglandin E₁, PGE₁)은 혈소판 응집을 억제하고 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다. 프로스타글란딘 D₂는 특히 기관지 천식환자의 평활근을 수축하여 천식을 악화시키는 주범으로 알려져 있다 (Loewen PS, CJEM, vol. 4, pp. 268-75, 2002; Ueno A, Nippon Yakurigaku Zasshi, vol. 117, pp. 255-61, 2001).

류코트리엔은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄ (LTC₄), 류코트리엔 D₄ (LTD₄) 및 류코트리엔 E₄ (LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭시드 (epoxide)를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔 (LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 아토피성피부염 등의 염증 및 동맥경화 (Lotzer K et al, Biochim . Biophys . Acta, vol. 1736(1), pp. 30-37, 2005) 및 심장병질환 (Back M, Bull Acad Natl Med, vol. 190(7), pp.1511-1518; discussion pp.1518-1521, 2006)을 유발시킨다고 보고되어있다. 최근 알레르기 질환인 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성억제, 혈소판 활성화인자 생성억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다.

AMP-activated protein kinase (AMPK)는 과거 에너지 대사와 관련한 단백질로서 널리 알려졌으나 (Winder W.W. J. Appl . Physiol. vol. 91(3), pp. 1017-1028. 2001), 최근 경구결과에 의하면 염증반응의 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히 AMPK의 활성화는 염증반응을 상위단계에서 조절하므로 기존의 항염약물이 가질 수 있는 부작용을 경감시킬 수 있는 것으로 보고되었다 (Hwang et al ., J. Allergy Clin . Immunol. vol. 134(3), pp. 714-721. 2014).

천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용 가능성이 높아 매력있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다. 미생물이 생산하는 유용물질탐색은 주로 육상미생물을 중심으로 활발하게 진행되어 그 중에는 발효공업과 의약 등에서 유용성이 확립된 것도 많이 존재한다. 해양생물은 육상생물에 비해 종다양성이 풍부하고 연구 역사가 상대적으로 짧아 기존의 육상미생물과 육상식물에서 발견된 기지물질의 재발견 확률이 낮아 생리활성물질 탐색의 원천으로 사용되고 있다. 해양생물을 이용한 생리활성물질 탐색에는 주로 해양무척추동물이 소재로 사용되어 왔는데, 대량 채집 등이 어려워 유기합성법을 개발하는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 그러나 최근에는 해양무척추동물의 생리활성물질이 함께 공생, 기생, 부착 등의 관계에 있는 박테리아 등 미생물에 의해 생합성 될 것이라는 예측이 지배적이다. 또한 박테리아는 배양이 가능하여 안정적으로 물질을 공급할 수 있다.

Murakami M et al, Prostaglandins Other Lipid Mediat vol. 68-69, pp. 3-58, 2002 Reid RC, Curr Med Chem vol. 12, pp. 3011-3026, 2005 Loewen PS, CJEM, vol. 4, pp. 268-75, 2002 Ueno A, Nippon Yakurigaku Zasshi, vol. 117, pp. 255-61, 2001 Lotzer K et al, Biochim. Biophys. Acta, vol. 1736(1), pp. 30-37, 2005 Back M, Bull Acad Natl Med, vol. 190(7), pp. 1511-1518 Winder W.W. J. Appl. Physiol. vol. 91(3), pp. 1017-1028. 2001 (Hwang et al., J. Allergy Clin. Immunol. vol. 134(3), pp. 714-721. 2014

본 발명의 목적은 해양 바실러스속 미생물에서 분리한 신규한 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 염증 또는 알레르기 질환의 예방 또는 치료적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물을 생산하는 신규 해양 바실러스속 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 식에서,

R은 수소, 하이드록시, 할로겐, 나이트릴, C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타낸다.

본 발명은 또한 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 또는 이의 배양물로부터 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는, 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 염증 또는 알레르기 질환 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 또는 알레르기 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 생성하는 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주를 제공한다.

본 발명은 신규 해양 바실러스속 균주에서 분리한 새로운 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물이 AMPK를 활성화시켜 베타-헥소스아미니다아제 활성을 억제하고, 시클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하며, LTC4 또는 PGD₂ 생성에 관여하는 MAP kinase인 ERK, JNK 또는 p38의 활성을 억제하며, 지방산 생합성 율속효소인 아세틸-CoA 카르복실라제 활성을 억제함을 확인함으로써 상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물을 염증 또는 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 A의 ¹H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 A의 COSY 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 A의 HMQC 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 A의 HMBC 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B의¹H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B의¹³C NMR 스펙트럼(63 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 C의¹H NMR 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 C의 COSY 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 C의 HSQC 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인 화합물 C의 HMBC 스펙트럼(500 MHz, DMSO-d₆)을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B에 의한 탈과립 억제 효능을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인화합물 B에 의한 LTC4 생성억제 효능을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B에 의한 PGD2 생성억제 효능을 나타낸 것이다.
도 14은 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B에 의한 염증관련 지표 조절 효능 (β-Hex 유리억제, LTC4 생성억제, PGD₂ 생성억제 효능 및 AMPK를 활성화, 아세틸-CoA 카르복실라제 활성 억제 효능)을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물인, 화합물 B의 용량의존적인 제1형 알레르기 반응 (PCA)의 억제 효과 (A)와, PCA 모델에서 혈액 내 LTC4 (B) 및 PGD₂ 생성의 용량의존적 억제 효과 (C)를 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 해양무척추동물로부터 분리한 박테리아의 추출물을 이용하여 베타-헥소스아미니다아제 (β-hex) 활성억제, 류코트리엔 C4 생성억제, 프로스타글란딘 D₂ 생성억제, AMPK 활성화 효능이 우수한 화합물을 연구하던 중, 신규한 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물이 쥐 골수 비만세포에 항원-항체로 자극한 후 억제된 AMPK를 활성화하여 알레르기, 염증반응을 유발시키는 과립내 물질의 방출(탈과립 지표효소인 β-hex 활성 측정) 및 LTC4, PGD₂ 생성에 관여하는 MAP kinase인 ERK, JNK, p38의 활성을 억제함으로써 알레르기, 염증 반응을 억제하고, 상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 지방산 생합성의 율속효소인 ACC 활성을 억제하는 활성을 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기 식에서,

본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.

"할로겐"은 -F, -Cl, -Br 또는 -I이다.

"알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 측쇄 또는 고리형의 포화 탄화수소를 가리킨다. C₁ _-10 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐 및 이소데실이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한 상기 알킬은 "시클로알킬"을 포함한다. 상기 시클로알킬은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 3 내지 12의 비방향족, 포화 탄화 수소환으로서 단일환 및 융합환을 포함한다. C₃ _-12 시클로알킬의 대표적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.

"알콕시"는 C₁-C₁₀ 알킬-O-를 포함하며, 여기에서 알킬 그룹은 본 원에 기술된 바와 같이 임의로 치환된다.

상기 화학식 1의 화합물은 이중고리형 뎁시펩타이드계(depsipeptide) 화합물로서, 바람직하게는

R이 수소, 하이드록시, 할로겐, C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타내는 화합물일 수 있다.

보다 바람직하게는, R이 수소, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내는 화합물일 수 있다.

가장 바람직하게는, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표현되는 화합물일 수 있다:

[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

상기 화학식 1의 화합물은 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 상기 "입체이성질체"는 화학 구조가 동일하지만 공간 내 원자 또는 치환기의 배열이 상이한 화합물을 말한다.

또한, 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 메탄술폰산계 염을 포함한다. 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 또는 붕산계 염을 포함한다.　바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.

상기 언급된 산 부가염은 a) 상기 화학식 1의 화합물 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 한 가지를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 화학식 1의 화합물을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.

위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염 또는 아스파르트산염 등이 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 Mycale 속 해면동물 (Mycale sp.)에서 분리한 해양 미생물인 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 또는 이의 배양물로부터 얻은 것으로, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁되어 있다.

따라서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 또는 이의 배양물로부터 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는, 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 생성하는 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주를 제공한다.

상기 균주는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는 예컨대, 자연 돌연변이 또는 인위적 돌연변이에 의해 생긴 변이체일 수 있다. 인위적 돌연변이는 자외선 등 물리적 돌연변이원, 또는 염기 화합물 등 화학적 돌연변이원에 의해 발생할 수 있다.

상기 균주는 균주의 포자, 균체, 또는 이것의 배양물을 포함한다.

상기 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주의 배양물은 균주를 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양하여 얻을 수 있다.

상기 배지는 탄소원으로서 예를 들면, 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 또는 식물유를 포함할 수 있다.

상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모니움, 질산소다 또는 요소를 포함할 수 있다.

상기 배지는 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 또는 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 포함할 수 있다.

배양은 호기성 조건에서 진탕 또는 정치하면서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면 약 20℃ 내지 약 37℃, 또는 약 25℃ 내지 약 30℃일 수 있다.

상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 상기 균주 또는 이의 배양물을 용매 추출, 농축, 크로마토그래피를 수행하여 얻을 수 있다.

상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 균주 배양물 외에 균체에서 존재하기 때문에 균주 또는 이의 배양물에 용매를 가하여 추출액을 감압 증발을 통해 농축할 수 있다.

상기 용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트 등의 유기용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있다.

상기 크로마토그래피는 예를 들면, 정지상의 형태에 따라 컬럼 크로마토그래피, 평판 크로마토그래피(planar chromatography), 종이 크로마토그래피 또는 얇은 막 크로마토그래피일 수 있다. 또는 이동상의 물리적 특성에 따라, 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 또는 친화 크로마토그래피일 수 있다. 액체 크로마토그래피는 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)일 수 있다. 크로마토그래피는 예를 들면, 분리 방법에 따라, 이온 교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피일 수 있다. 크로마토그래피는 예를 들면, 정상 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피일 수 있다.

본 발명의 일구체예에 따르면, 균주 또는 이의 배양물의 에틸아세테이트 추출물을 메탄올과 디클로로메틸의 혼합용매를 이용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시한 후 메탄올 및 물의 혼합용매를 이용하여 고속 액체 크로마토그래피로 정제하여 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물을 얻을 수 있다.

본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 AMPK를 활성화시켜 베타-헥소스아미니다아제 (β-Hexosaminidase) 활성을 억제하고, 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂) 생성을 억제하며, LTC4 또는 PGD₂ 생성에 관여하는 MAP kinase인 ERK, JNK 또는 p38의 활성을 억제하며, 지방산 생합성 율속효소인 아세틸-CoA 카르복실라제 (acetyl-CoA carboxylase) 활성을 억제하는 특성이 있다.

따라서, 상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 염증 또는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물로 사용할 수 있으므로,

본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 염증 또는 알레르기 질환 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 약제학적 유효량의 상기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 또는 알레르기 질환의 치료방법을 제공한다.

상기 용어, "예방"은 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 "대상체"는 개, 고양이, 생쥐, 인간 등의 척추동물을 포함한다.

본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 의약 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.1n g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물을 염증 또는 알레르기 질환의 치료제와 임의의 조합으로 사용할 수 있다. 예컨대, 면역억제제(예컨대, 타크롤리무스(tacrolimus), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 라파마이신(rapamicin), 메토트렉사트(methotrexate), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 메캅토퓨린(mercaptopurine), 미코페놀레이트(mycophenolate, 또는 FTY720), 글루코코르티코이드(예컨대, 프레드니손(prednisone), 코르티손 아세테이트, 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론, 덱사메타손(dexamethasone), 베타메타손(betamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 베클로메타손(beclometasone), 플루드로코르티손 아세테이트(fludrocortisone acetate), 데옥시토르티코스테론 아세테이트(deoxycorticosterone acetate), 알도스테론), 비스테로이드성 항염증성 약물(예를 들어, 살리실레이트(salicylate), 아릴알카논산, 2-아릴프로피온산, N-아릴 안트라닐 산, 옥시캄(oxicams), 콕시브(coxib), 또는 설폰아닐라이드), 콕스(Cox)-2-특이적 저해제(예컨대, 발레콕시브(valdecoxib), 셀레콕시브(celecoxib), 또는 로페콕시브(rofecoxib)), 레플루노마이드(leflunomide), 골드 티오글루코스, 골드 티오말레이트, 아우로핀(aurofin), 설파살리진, 하이드록시클로로퀸, 미노시클린(minocycline), TNF-알파 결합 단백질(예컨대, 인플릭시맙(infliximab), 에타네르셉트(etanercept), 또는 아달리무맙(adalimumab)), 아바타셉트(abatacept), 아나킨라(anakinra), 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터루킨-2, 알레르기 백신, 항히스타민, 항류코트리엔, 베타-아고니스트, 데오필린(theophylline), 또는 항콜린작용제.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

< 실시예 1> 바실러스 속( Bacillus sp .) L056 균주의 분리, 동정 및 배양

본 균주는 2012년 12월 제주도 성산에서 채집된 Mycale 속 해면동물(Mycale sp.)로부터 분리하였다. 채집한 해면동물은 채집 즉시 멸균된 플라스틱 백에 넣어 실험에 사용하기까지 냉장보관 하였다. 해면동물은 무균실험대에서 건조시킨 후 분말로 만들어 해수를 이용한 전분-펩톤-효모-아가(10 g의 가용성 전분, 2 g의 펩톤, 4 g의 효모 추출물, 16 g의 아가 / 1 L 해수) 배지에 도말하여 28℃에서 5일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리 하였다.

본 균주의 rRNA 서열 분석을 통하여 얻어진 염기서열의 GenBack 검색 결과, 바실러스 속( Bacillus sp.)에 대하여 98.75%의 상동성을 보였다(SEQ ID NO: 1). 이에, 본 균주를 바실러스 속으로 동정하였고, 이를 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056로 명명하고, 2015년 4월 21일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 12796BP).

바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주는 해수를 이용하여 만든 가용성 전분-펩톤-효모(10 g의 가용성 전분, 2 g의 펩톤, 4 g의 효모 추출물 / 1 L 해수) 액체 배지에 적종하고 25 ℃의 온도에서 150 rpm으로 10일간 진탕배양하였다.

< 실시예 2> 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 분리

바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 배양액 (24L)을 에틸아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물 (2.2 g)에 대해 진공 액체 크로마토그래피 (Vacuum Liquid Chromatography)를 수행하고, MC-MeOH 구배를 통해 용출하여 7개의 분획을 얻었다.

분획 L056-E (642.0 mg)에 대해 추가로 역상 HPLC [Shim-pack ODS, 25 × 20 mm; ACN:H₂O=55:45의 혼합 용매로 용출 → 55:45 (20 분) → 80:20 (60 분); 6.0 mL/min] 분리를 통해 1 (화학식 1a) (24.9 mg), 2 (화학식 1b) (50.1 mg), 및 3 (화학식 1c) (7.9 mg) 화합물을 얻었다.

[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

< 실시예 3> 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 구조분석

상기 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주의 배양액으로부터 제조한 화학물 A (화학식 1a)로 표시되는 화합물은 ESIMS 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석(Jeol ECA-500 spectrometer)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY (Correlation Spectroscopy), HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 화합물의 분자구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 상기 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주의 배양액으로부터 제조한 물질은 상기 화학식 A-C, 로 표시되는 신규한 고리형 뎁시펩타이드 화합물로 동정하였다.

화합물 A는 아세트산, 루신-1, 알라닌, 타이로신-1, 트레오닌, 루신-2, 루신-3, 아이소루신, 타이로신-2으로 구성되어 있으며 트레오닌과 타이로신-2가 에스터 결합을 형성하고, 타이로신-1과 타이로신-2가 에테르 결합을 형성하여 이중 고리를 함유하고 있는 신규한 뎁시펩타이드계 화합물임을 규명하였다(¹H, ¹³C NMR 데이터

화합물 A: 흰색 분말; [α]_D -33.5 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 206 (4.5), 276 (3.4); HRFABMS m/z 991.5504 [M+H]⁺ (calcd for C₅₁H₇₅N₈O₁₂, 991.5504).

	δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)		δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)
acetic acid			leucine -2
1	22.94, CH₃	1.86, s	25-NH		7.51, d (8.7)
2	172.38, C		25	51.06, CH	4.52, q (6.0)
leucine -1			26	41.03, CH₂	1.36, ovl^a 1.44, ovl^a
3-NH		8.05, d (7.8)	26	41.03, CH₂	1.36, ovl^a 1.44, ovl^a
3	56.49, CH	4.21, ovl^a	27	24.29, CH	1.39, ovl^a
4	41.05, CH₂	1.37, ovl^a 1.44, ovl^a	28	22.84, CH₃	0.79, ovl^a
4	41.05, CH₂	1.37, ovl^a 1.44, ovl^a	29	23.52, CH₃	0.81, ovl^a
5	24.57, CH	1.57, n	30	170.05, C
6	21.45, CH₃	0.81, ovl^a	leucine -3
7	23.11, CH₃	0.89, ovl^a	31-NH		8.26, brs
8	170.17, C		31	59.90, CH	3.90, m
alanine			32	40.62, CH₂	1.36, ovl^a 1.52, m
9-NH		8.13, ovl^a	32	40.62, CH₂	1.36, ovl^a 1.52, m
9	47.82, CH	4.35, q (7.5)	33	24.63, CH	1.62, m
10	18.38, CH₃	1.16, d (7.1)	34	21.86, CH₃	0.81, ovl^a
11	172.53, C		35	23.14, CH₃	0.89, ovl^a
modified tyrosine -1			36	173.90, C
12-NH		8.18, ovl^a	isoleucine
12	56.23, CH	4.62, m	37-NH		7.87, brs
13	37.70, CH₂	2.77, ovl^a 3.02, ovl^a	37	60.33, CH	3.73, t (9.3)
13	37.70, CH₂	2.77, ovl^a 3.02, ovl^a	38	34.68, CH	1.90, m
14	131.96, C		39	22.69, CH₂	0.94, m 1.32, m
15	130.48, CH	7.03, d (8.5)	39	22.69, CH₂	0.94, m 1.32, m
16	125.03, CH	6.66, ovl^a	40	22.76, CH₃	0.8, ovl^a
17	156.52, C		41	15.83, CH₃	0.78, ovl^a
18	125.03, CH	6.66, ovl^a	42	173.95, C
19	130.48, CH	7.03, d (8.5)	modified tyrosine -2
20	171.55, C		43-NH		8.28, d (3.4)
threonine			43	53.14, CH	4.18, ovl^a
21-NH		8.17, ovl^a	44	36.15, CH₂	2.78, ovl^a 2.99, ovl^a
21	56.08, CH	4.27, d (7.6)	44	36.15, CH₂	2.78, ovl^a 2.99, ovl^a
22	70.44, CH	5.15, q (6.6)	45	124.96, C
23	17.08, CH₃	0.39, d (6.6)	46	116.42, CH	6.44, d (2.0)
24	168.77, C		47	145.83, C
			48	146.54, C
			49	117.42, CH	6.80, d (8.2)
			50	115.35, CH	6.64, ovl^a
			51	170.82, C
a : 겹친 신호 b : HMQC 및 HMBC 결과로부터 결정한 값 c : 500MHz에서 측정한 값

화합물 B (화학식 1b)는 프로피오닐기, 루신-1, 알라닌, 타이로신-1, 트레오닌, 루신-2, 루신-3, 아이소루신, 타이로신-2으로 구성되어 있으며 트레오닌과 타이로신-2가 에스터 결합을 형성하고, 타이로신-1과 타이로신-2가 에테르 결합을 형성하여 이중 고리를 함유하고 있는 신규한 뎁시펩타이드계 화합물임을 규명하였다(¹H, ¹³C NMR 데이터를 하기 표 2에 나타내었다).

화합물 B: 흰색 분말; [α]_D -10.7 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 206 (4.6), 275 (3.5); HRFABMS m/z 1005.5666 [M+H]⁺ (calcd for C₅₂H₇₇N₈O₁₂, 1005.5661).

	δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)		δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)
propionic acid			leucine -2
1	9.70, CH₃	0.96, t (7.6)	26-NH		7.52, d (8.4)
2	28.07, CH₂	2.15, q (7.6)	26	50.47, CH	4.51, dd (5.8, 8.0)
3	173.32, C		27	41.25, CH₂	1.36, ovl^a 1.44, ovl^a
leucine -1			27	41.25, CH₂	1.36, ovl^a 1.44, ovl^a
4-NH		8.05, d (7.1)	28	24.03, CH	1.37, ovl^a
4	51.51, CH	4.21, ovl^a	29	22.23, CH₃	0.79, ovl^a
5	40.34, CH₂	1.37, ovl^a 1.44, ovl^a	30	21.32, CH₃	0.81, ovl^a
5	40.34, CH₂	1.37, ovl^a 1.44, ovl^a	31	171.17, C
6	24.22, CH	1.58, m	leucine -3
7	21.36, CH₃	0.81, ovl^a	32-NH		8.21, brs
8	22.79, CH₃	0.89, ovl^a	32	52.92, CH	3.99, m
9	171.72, C		33	40.23, CH₂	1.37, ovl^a 1.52, m
alanine			33	40.23, CH₂	1.37, ovl^a 1.52, m
10-NH		8.14. ovl^a	34	24.29, CH	1.62, m
10	47.30, CH	4.36, q (6.6)	35	21.36, CH₃	0.81, ovl^a
11	17.82, CH₃	1.16, d (7.1)	36	22.79, CH₃	0.89, ovl^a
12	171.79, C		37	171.65, C
modified tyrosine -1			isoleucine
13-NH		8.17, d (5.8)	38-NH		7.89, brs
13	55.77, CH	4.59, dd (3.9, 11.7)	38	59.69, CH	3.71, d (8.7)
14	37.23, CH₂	2.79, ovl^a 3.03, ovl^a	39	35.24, CH	1.92, brs
14	37.23, CH₂	2.79, ovl^a 3.03, ovl^a	40	24.27, CH₂	0.91, m 1.32, m
15	130.74, C		40	24.27, CH₂	0.91, m 1.32, m
16	130.86, CH	7.21, brs	41	22.77, CH₃	0.80, ovl^a
17	120.24, CH	6.98, brs	42	10.4, CH₃	0.78, ovl^a
18	155.75, C		43	170.36, C
19	120.24, CH	6.98, brs	modified tyrosine -2
20	130.86, CH	7.21, brs	44-NH		8.32, d (3.2)
21	171.25, C		44	52.58, CH	4.19, ovl^a
threonine			45	35.67, CH₂	2.77, ovl^a 2.98, ovl^a
22-NH		8.14, ovl^a	45	35.67, CH₂	2.77, ovl^a 2.98, ovl^a
22	55.62, CH	4.27, d (7.2)	46	128.26, C
23	69.89, CH	5.15, q (6.6)	47	115.88, CH	6.40, brs
24	16.57, CH₃	0.38, d (6.5)	48	145.78, C
25	167.90, C		49	146.29, C
			50	116.86, CH	6.77, d (8.1)
			51	124.45, CH	6.62, dd (1.5, 8.3)
			52	169.82, C
a : 겹친 신호 b : 125MHz에서 측정한 값 c : 500MHz에서 측정한 값

화합물 C (화학식 1c)는 3-메틸부탄기, 루신-1, 알라닌, 타이로신-1, 트레오닌, 루신-2, 루신-3, 아이소루신, 타이로신-2으로 구성되어 있으며 트레오닌과 타이로신-2가 에스터 결합을 형성하고, 타이로신-1과 타이로신-2가 에테르 결합을 형성하여 이중 고리를 함유하고 있는 신규한 뎁시펩타이드계 화합물임을 규명하였다(¹H, ¹³C NMR 데이터를 하기 표 3에 나타내었다).

화합물 C: 흰색 분말; [α]_D -27.5 (c 0.08, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 206 (4.5), 276 (3.4); HRFABMS m/z 1033.5964 [M+H]⁺ (calcd for C₅₄H₈₁N₈O₁₂, 1033.5974).

	δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)		δC^b, type	δH^c, mult (J in Hz)
3- methylbutanoic acid			leucine -2
2-Me	15.46, CH₃	0.85, d (6.5)	27-NH		7.57, d (8.3)
1	22.22, CH₃	0.87, ovl^a	27	50.72, CH	4.51. m
2	25.67, CH₂	1.98, m	28	41.22, CH₂	1.36, ovl^a 1.51, ovl^a
3	44.46, CH₂	2.02, ovl^a	28	41.22, CH₂	1.36, ovl^a 1.51, ovl^a
4	172.36, C		29	24.22, CH	1.37, ovl^a
leucine -1			30	22.22, CH₃	0.78, ovl^a
5-NH		8.10, d (6.3)	31	23.00, CH₃	0.80, ovl^a
5	51.71, CH	4.21, ovl^a	32	171.77, C
6	40.24, CH₂	1.41, ovl^a 1.45, ovl^a	leucine -3
6	40.24, CH₂	1.41, ovl^a 1.45, ovl^a	33-NH		8.30, brs
7	24.22, CH	1.58, m	33	53.22, CH	3.97, quint (4.4)
8	22.87, CH₃	0.83, d (6.4)	34	40.40, CH₂	1.35, ovl^a 1.49, ovl^a
9	21.72, CH₃	0.89, ovl^a	34	40.40, CH₂	1.35, ovl^a 1.49, ovl^a
10	172.05, C		35	24.34, CH	1.31, ovl^a
alanine			36	21.39, CH₃	0.81, ovl^a
11-NH		8.12, d (8.1)	37	21.29, CH₃	0.89, ovl^a
11	47.44, CH	4.35, quint (7.2)	38	172.34, C
12	18.02, CH₃	1.15, d (7.0)	isoleucine
13	172.02, C		39-NH		7.80, brs
modified tyrosine -1			39	59.67, CH	3.77, brs
14-NH		8.25, ovl^a	40	35.47, CH	1.88, brs
14	56.07, CH	4.56, m	41	25.71, CH₃	0.8, ovl^a
15	37.07, CH₂	2.77, ovl^a 3.07, ovl^a	42	24.33, CH₂	0.95, m 0.98, m
16	131.94, C		43	10.33, CH₃	0.78, ovl^a
17	130.98, CH	7.21, brs	44	170.72, C
18	120.35, CH	6.97, brs	modified tyrosine -2
19	155.81, C		45-NH		8.26, ovl^a
20	120.35, CH	6.97, brs	45	52.80, CH	4.18, ovl^a
21	130.98, CH	7.21, brs	46	35.47, CH₂	2.80, ovl^a 2.98, ovl^a
22	171.53, C		46	35.47, CH₂	2.80, ovl^a 2.98, ovl^a
threonine			47	128.25, C
23-NH		8.23, ovl^a	48	115.89, CH	6.43, brs
23	55.83, CH	4.28, d (10.1)	49	145.82, C
24	70.05, CH	5.17, q (6.4)	50	146.36, C
25	16.50, CH₃	0.38, d (6.4)	51	117.09, CH	6.80, d (8.2)
26	168.28, C		52	124.63, CH	6.66, d (8.3)
			53	170.01, C
a: 겹친 신호 b: HSQC 및 HMBC 결과로부터 결정한 값 c: 500MHz에서 측정한 값

< 실시예 4> 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물의 항염활성 평가

(실험재료)

PGD₂, LTC₄ Enzyme linked immunoassay (EIA) Kit, N-[2- (cyclohexyloxy)-4-nitrophenyl]-methanesulfonamide (NS398)는 Cayman Chemical사 (Ann Arbor, MI, USA)로 부터 구입하였으며, 배양액으로 RPMI-1640, Modified Eagle Medium (MEM) non-essential amino acids solution, penicillin-streptomycin는 GIBCO-BRL 사 (Carlsbad, CA, USA), 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS)는 Hyclone사 (Logan, UT, USA)사에서 구입하여 사용하였다.

(세포 배양)

쥐 골수 유래의 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 수컷 BALB/C 마우스 (대한바이오링크, 6주령, 23 그램, Eumseong, Korea)로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3 (쥐의 비장세포에 pokeweed mitogen으로 자극하여 얻은 상층액을 최종 20%가 되도록 넣은 배양액)로 약 3주 정도 배양하여 90% 이상의 균질한 BMMC를 얻었다.

(세포 생존율 확인 실험)

상기에서 얻은 BMMC 생존율을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다 (Jin M et al , Biol Pharm Bull, vol. 31(7), pp. 1312-15, 2008).

1×10⁶ cells/ml의 BMMC에 화합물 A-C를 농도별로 처리하여 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 전-배양한 후 0.5 mg/ml 농도의 MTT를 처리하여 4시간 배양하여 0.04N의 HCI/isopropanol을 가한 후 완전히 세포를 용해시킨 다음 ELISA를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.

그 결과 최종농도 100 μM 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않았다 (세포생존률: 90% 이상, 표 4).

(베타-헥소스아미니다아제 (β-Hex) 방출에 대한 억제효과 실험)

상기 실시예의 얻은 BMMC의 탈과립 지표 (marker)물질인 β-hex 효소 활성 측정을 통해 탈과립의 정도를 확인하기 위하여, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다 (Son JK et al , Biol Pharm Bull, vol. 28(12), pp. 2181-84, 2005).

2×10⁵ cells/well의 BMMC에 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C를 농도 별로 처리 하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분 동안 전-배양한 후에 KL (100 ng/ml) (c-kit ligand, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)로 자극하여 15분간 배양하고 3000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 β-hex 기질[100mM 시트레이트 버퍼 (시트르산 0.955%, 소듐 시트레이트 디하이드레이 1.478%, pH 4.5), 1.3 mg/ml p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide]와 1:2 (w/v)의 혼합비로 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후에 0.2M 글리신 (pH 10.7) (Sigma 사)으로 반응을 정지시켜 ELISA 판독기 (Tecan System, San Jose, CA, USA)를 사용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 분비율 (release %)로 환산하였다.

상기 실험을 실시한 결과, 화합물 A와 화합물 B, 화합물 C의 β-hex에 대한 IC₅₀는 각각 12.6μM, 8.2μM과 48.4μM이었다 (표 4, 도 11).

(류코트리엔 생성에 대한 영향 분석 실험)

상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물들의 LTC₄ 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다 (Yang JH et al , Arch Pharm Res, vol. 31(12), pp.1597-603, 2008).

BMMC 배양 3주 후 비만세포에 실시예에서 얻은 분리된 물질들을 농도별로 미리 30분간 전처리 한 후 SCF 자극제 (Sigma 사, S9915)를 15분 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 LTC₄ 정량은 LTC₄ EIA (Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211) kit를 이용하여 측정하였다.

상기 실험을 한 결과, 화합물 A와 화합물 B, 화합물 C, 화합물 D의 LTC₄에 대한 IC₅₀는 각각 8.2μM, 5.5μM과 8.2μM이었다 (표 4, 도 12).

(COX-2 의존적인 PGD₂ 생성 억제 측정)

상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물들의 알레르기 질환에 대한 저해정도를 확인하기 위해 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)의 생성량을 측정하였다 (Son JK et al , Biol Pharm Bull, vol. 28(12), pp. 2181-84, 2005).

BMMC 배양 3주 후에 세포농도 2×10⁵cells에 실시예에서 얻은 분리된 물질들을 30분간 전 처리한 후에 100 ng/ml의 KL 100 ng/ml의 LPS (Lipopolysaccharde, Sigma 사) 및 100 U/ml의 IL-10 혼합자극제 (Sigma 사)를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후에 상층액의 PGD₂를 PGD₂ 분석 키트 (Cayman 사 PGD₂ EIA kit PGD₂-MOX EIA kit, product no. 512011)를 이용하여 EIA로 측정하였다.

이때 COX-1에 의해서 생성되는 PGD₂의 생성을 억제시키기 위하여 BMMC에 아스피린 (aspirin) 10 ㎍/ml을 1시간 전에 미리 전 처리한 후에 사용하였다.

상기 실험을 한 결과, 화합물 B의 PGD₂생성에 대한 IC₅₀는 41.5μM이었다 (표 4, 도 13).

	IC₅₀ (μM)
	β-hex 방출억제	PGD₂ 생성억제	LTC4 생성억제	세포독성
화합물 A	12.6	> 50	8.18	> 100
화합물 B	8.18	41.5	5.48	> 100
화합물 C	48.4	> 50	8.18	> 100

(AMPK 활성화 측정법-웨스턴 블랏 분석)

1×10⁶cells/ml의 세포를 PBS로 세척 후 라이시스 버퍼를 넣고 얼음에 20분 정치한 후 원심분리 하여 얻어진 단백질을 8% SDS-polyacrylamide gel에 전기 영동을 한 후, 20% 메탄올, 25 mM Tris (pH 7.4), 192 mM 글리신이 포함된 버퍼를 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)으로 전기이동 (electrotransfer) 시켰다. 이 멤브레인을 5% 스킴 밀크 용액으로 1시간 실온에서 블록킹하였다. 다음으로, 멤브레인을 TBST (0.05 M Tris, 0.75 M NaCl, 0.25% Tween 20) 완충액으로 희석한 AMPK 항체와 12시간 이상 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST로 3회 세척하고, 2차 항체와 1시간 반응시키고 다시 TBST로 3회 세척하였다. 세척이 끝나면 ECL 용액으로 반응한 후 필름에 감광하여 나타난 밴드를 비교시켜 단백질 발현 유무 (인산화된 AMPK)로 활성화를 비교하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, 쥐 골수에서 분화시킨 비만세포에 항원-항체로 자극하면 활성화된 비만세포에서 AMPK (활성화시 제2당뇨 및 비만억제작용을 나타냄)의 활성이 억제되는데, 화합물 B는 10μM의 농도에서 AMPK를 활성화시켰으며, 또한 LTC₄, PGD₂의 생성에 영향을 미치는 MAP kinase인 ERK, JNK, p38의 활성억제하였다. 이때 대조군으로는 AMPK 활성화제인 AICAR를 사용하였다.

또한, 지방산 생합성의 율속효소인 아세틸-CoA 카르복실라제의 활성도 억제하였다.

(알레르기 반응 억제 효과)

상기 이중고리형 뎁시펩타이드계 화합물, 화합물 B의 제1형 알레르기 반응에 대한 효과를 확인하였다. 이를 위해, 첫째 날, 마우스의 한쪽 귀에 4 ㎍/ml anti-dinitrophenyl (DNP)를 20 ㎕씩 피내 주사하였다. 24시간 뒤 화합물 B를 25, 50 mg/kg 농도로 경구 투여한 후 혈관투과성항진 억제 현상을 관찰하였다. 이때 양성 대조군으로 펙소페나딘 (Fexofenadine·HCl) (50 mg/kg)을 사용하였다. 1 시간 뒤 마우스 꼬리에 1% 에반스 블루 (evans blue, 푸른 색소) 용액 (300 ㎍/ml DNP-HSA 함유) 200 ㎕씩을 정맥주사 하였다. 정맥주사 1시간 뒤 마우스 심장에서 피를 뽑아 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 뒤 혈청을 분리하여 LTC4 와 PGD2 생성을 측정하고 에반스 블루가 유출된 귀를 잘라내어 400 ㎕ 포름아마이드 (Formamide)를 가하여 63℃에서 12시간 반응시킨 후 반응액 250 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고 630 nm에서 흡광도를 측정하여 혈관 투과성 정도를 관찰하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, 화합물 B는 용량의존적으로 제1형 알레르기 반응(PCA, passive cutaneous allergy)을 억제하였고 (A), 혈관투과성항진 억제 대조군으로 펙소페나딘 (Fexofenadine·HCl)을 사용한 PCA 모델에서 혈액 중의 LTC4 (B)와 PGD₂ (C) 생성은 용량의존적으로 억제되었다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Novel marine Bacillus sp., compounds isolated from the marine Bacillus sp. and pharmaceutical use of the compounds <130> P15U10C0402 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1292 <212> DNA <213> Bacillus safensis L056 <400> 1 nnnnnngngn gctatantgc agtcgagcgg acagaaggga gcttgctccc ggatgttagc 60 ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120 ccggagctaa taccggatag ttccttgaac cgcatggttc aaggatgaaa gacggtttcg 180 gctgtcactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca 240 aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300 ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360 gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420 aagtgcgaga gtaactgctc gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540 agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600 cattggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720 cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctgggga gtccacgccg 780 taaacgatga gtgctaagtg ttggggggtt tccgcccctt antgctgcag ctaacgcatt 840 agcactccgc ctgggagtac ggtcgcagga ctgaaactca aggaattaga cgaggagccc 900 gcacaagcgt ggagcatgtc ggtgtaattc gaagcaacgc gaagaagctt accaggtcgt 960 gacatgcgtc tgacacccta aagatagggc tttcgcttcg ggacggagtg acaagtgaat 1020 ggatgntgtc gtcagctcct gtcctgagat gttgaggttg aggcccgcaa ccaccgcaac 1080 cctgacctag tnncnngcnn tgcagatgnt tcgtnttngc tacttgcggt gacggggccg 1140 nnncaannng agaatnngnn agnncatcnn gccncgttan ggactgngnn ctacnnnngn 1200 gngnaccant ggcanntncn nnggnatgcg naaannnnnn nntaagcnan ngatnngtan 1260 atannctnnt ncnnannnta tannnnnctg cn 1292

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, 나이트릴, C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타낸다.
제1항에 있어서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타내는, 화합물.
제1항에 있어서,
R은 수소, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내는, 화합물.
제1항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표현되는 화합물인, 화합물.
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]
제1항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 또는 이의 배양물로부터 생성되는, 화합물.
제1항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 AMPK를 활성화시켜 베타-헥소스아미니다아제 (β-Hexosaminidase) 활성을 억제하고, 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂) 생성을 억제하며, LTC4 또는 PGD₂ 생성에 관여하는 MAP kinase인 ERK, JNK 또는 p38의 활성을 억제하며, 지방산 생합성 율속효소인 아세틸-CoA 카르복실라제 (acetyl-CoA carboxylase) 활성을 억제하는 것인, 화합물.
기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는, 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, 나이트릴, C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타낸다.
제7항에 있어서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타내는, 방법.
제7항에 있어서,
R은 수소, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내는, 방법.
제7항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표현되는 화합물인, 방법.
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]
하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, 나이트릴, C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타낸다.
제11항에 있어서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타내는, 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제11항에 있어서,
R은 수소, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내는, 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제11항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표현되는 화합물인, 염증 또는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]
하기 화학식 1로 표현되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 생성하는 기탁번호 KCTC 12796BP로 기탁된 해양 바실러스 사펜시스 (Bacillus safensis) L056 균주:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, 나이트릴, C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타낸다.
제15항에 있어서,
R은 수소, 하이드록시, 할로겐, C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시를 나타내는, 균주.
제15항에 있어서,
R은 수소, 또는 C₁ _-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타내는, 균주.
제15항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표현되는 화합물인, 균주.
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]