KR100831757B1 - 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물들, 즉 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl), 하이폴로민 B(hypholomine B), 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan), 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2) 및 펠리닌 C(phellinin C)가 수퍼옥사이드 라티칼 소거 효과, ABTS 라디칼 소거 효과 및 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내어 항산화 활성이 있음을 밝히고 있어, 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병에 대한 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 위한 의약품, 화장품 소재, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용한 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물에 관한 것이다.
페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯, 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯, 하이폴로민 B, 1,1-디스티릴피릴에탄, 3,14-비히스피디닐, 펠리닌 A, 펠리닌 B, 펠리닌 C

Description

페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물 및 이를 포함하는 조성물{Antioxidants from the culture broth of fungi Phellinus and Inonotus spp., and composition containing them}
도 1은 본 발명의 펠리닌 A의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 펠리닌 A의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 펠리닌 B의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 펠리닌 B의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 펠리닌 C의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 펠리닌 C의 1H-1H COSY 스펙트럼을 나타낸 것이다.
본 발명은 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물들, 즉 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl), 하이폴로민 B(hypholomine B), 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan), 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2) 및 펠리닌 C(phellinin C)가 수퍼옥사이드 라티칼 소거 효과, ABTS 라디칼 소거 효과 및 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내어 항산화 활성이 있음을 밝히고 있어, 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병에 대한 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 위한 의약품, 화장품 소재, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용한 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물에 관한 것이다.
인간의 몸은 산소를 최종 전자수용체로 하는 호흡을 통해 에너지를 획득한다. 그러나 이와 같이 생명유지에 절대적으로 필요한 산소이지만 안정한 분자상태인 기저 삼중항산소가 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼(O2 -), 하이드록실 라디칼(HOㆍ), 과산화수소(H2O2), 일중항산소(1O2)와 같은 반응성이 매우 큰 자유 라디칼 또는 활성산소(reactive oxygen species)로 전환되면 생체에 치명적인 산소독성을 일으키는 양면성을 지니고 있다. 즉, 이들 활성산소는 세포 구성성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병 원인으로 작용함은 물론이고 노화 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 활성산소를 제거시키거나 유리 라디칼 생성을 억제시키는 항산화 물질들은 과량 생성된 활성산소에 의해 발생한 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각 질병의 예방 및 치료와 피부 노화억제를 목적으로 이용될 수 있다[Hajieva, P.; Behl, C. Antioxidant as a potential therapy against age-related neurodegenerative diseases: amyloid Beta toxicity and Alzheimer's disease. Curr. Pharm. Des. 12(6): 699-704. 2006. Cherubini, A.; Vigna, G. B.; Zuliani, G.; Ruggiero, C.; Senin, U.; Fellin, R. Role of antioxidants in atherosclerosis. Curr. Pharm. Des. 11((16): 2017-2032. 2005. Zhao, B. Natural antioxidants for neurodegenerative diseases. Mol. Neurobiol. 31: 283-293, 2005. Murakami, A.; Ohigashi, H. Cancer-preventive antioxidants that attenuate free radical generation by inflammatory cells. Biol. Chem. 387: 387-392. 2006].
지금까지 알려진 합성 항산화제로는 BHA(Butylated hydroxy anisole), BHT(Butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(Nordihydro-guaiaretic acid) 등이 있으며, 천연 항산화제로는 수퍼옥시다이드 디뮤스타제, 퍼옥시다아제, 카탈라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제 등의 항산화 효소와 비타민 E, 비타민 C, 글루타치온 등의 비효소적 항산화 물질이 있다. 그러나, 합성 항산화제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양을 발생시킬 수 있으며, 온도에 약해 한번 열을 가하면 쉽게 파괴되는 단점이 있다. 반면에 천연 항산화제는 합성 항산화제에 비교하여 생체에 안전한 장점은 있지만, 그 효과가 약하다는 단점이 있다. 따라서, 항산화 활성이 탁월하고 보다 생체에 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 실제로 자유 라디칼을 소거할 수 있는 천연 항산화제 개발을 통하여 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각 질병에 대한 치료제 및 노화 억제제로 이용하고자 하는 노력은 계속적으로 있어 왔다.
최근 웰빙 열풍과 함께 건강식품으로 각광받고 있는 버섯은 식용뿐만 아니라 의약품으로 이용되고 있다. 버섯은 고등균류(Higher fungi) 중 담자균아강(Basidiomycotina)과 자낭균아강(Ascomycotina) 및 불완전균류(Imperfect fungi)에서 균사체가 영양대사를 한 결과 대사산물이 축적된 자실체의 형태로 나타나는 것으로 지구상에는 20,000 여종이 존재하는 것으로 알려져 있고 우리나라에는 68과 261속 992종이 보고 되어 있으며, 이 중 328종이 식용 및 약용버섯으로 알려져 있다. 버섯의 약리효과는 항암, 혈중 콜레스테롤 저하, 혈압 강하, 항바이러스, 면역 증강, 항균, 인터페론 유도 효과 등이 알려져 있으며, 지금까지 알려진 약용 버섯들은 다당체에 의한 항암활성이 주류를 이룬다. 상기와 같은 버섯의 약리효과는 버섯의 항산화 활성에 의해 유추될 수 있는 것으로 판단된다.
특히, 가장 많이 사용되고 있는 약용 버섯인 상황버섯(Phellinus linteus)과, 차가 버섯(Inonotus obliquus)은 그 약효로 인해 의약품 및 건강 식품으로 잘 알려져 있다. 페리너스 속과 이노노투스 속에 속하는 이들 버섯들은 공통적으로 노란색의 색소를 생산하며, 이들 색소는 버섯의 다양한 생리활성과 관련되어 있을 것으로 추정되고 있다. 본 연구는 상기와 같은 노란색 색소로부터 신규한 항산화 화합물 펠리닌 A, B 및 C를 분리하였다. 또한, 본 발명에서 밝힌 화합물들에 대한 항산화 활성은 어느 문헌에서도 밝혀진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 페리너스(Phellinus) 속 버섯 [예) 상황버섯(Phellinus linteus), 찔레버섯(Phellinus ribis)] 및 이노노투스(Inonotus) 속 버섯 [예) 차가버섯(Inonotus obliquus), 기와층버섯(Inonotus xeranticus)]에 속하는 버섯균주의 배양액으로부터 항산화 활성을 나타내는 화합물을 탐색하여 항산화 활성 물질을 분리, 정제하여 구조를 결정한 결과, 활성 물질은 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2)와 펠리닌 C(phellinin C)로 명명된 신규 화합물들과 이미 알려진 바 있는 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl), 하이폴로민 B(hypholomine B), 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan)을 동정하고 규명하였고, 각 버섯 균주에서 공통적으로 상기 화합물들이 생산되었고, 이들에 대한 항산화 활성을 확인하여 동맥경화, 암, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각 질병의 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 목적으로 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 신규한 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2)와 펠리닌 C(phellinin C)를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2), 펠리닌 C(phellinin C), 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl), 하이폴로민 B(hypholomine B) 및 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan) 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 펠리닌 A(phellinin A), 다음 화학식 2로 표시되는 펠리닌 B(phellinin B, 화학식 2a:펠리닌 B1<->화학식 2b:펠리닌 B2) 및 다음 화학식 3으로 표시되는 펠리닌 C(phellinin C)를 그 특징으로 한다.
Figure 112006092443574-pat00001
Figure 112008005291065-pat00040
Figure 112008005291065-pat00041
Figure 112006092443574-pat00003
또한, 본 발명은 다음 화학식 1, 2a, 2b, 3, 4, 5 및 6으로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112008005291065-pat00004

[화학식 2a]
Figure 112008005291065-pat00042

[화학식 2b]
Figure 112008005291065-pat00043
삭제
[화학식 3]
Figure 112006092443574-pat00006
Figure 112006092443574-pat00007
Figure 112006092443574-pat00008
Figure 112006092443574-pat00009
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물들, 즉 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl), 하이폴로민 B(hypholomine B), 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan), 펠리닌 A(phellinin A), 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2) 및 펠리닌 C(phellinin C)가 수퍼옥사이드 라티칼 소거 효과, ABTS 라디칼 소거 효과 및 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내어 항산화 활성이 있음을 밝히고 있어, 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병에 대한 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 위한 의약품, 화장품 소재, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용한 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물에 관한 것이다.
본 발명이 특징으로 하는 페리너스 속 및 이노노투스 속 버섯을 알콜류를 이용하여 표면 소독한 후, 무균상자에서 멸균된 칼을 이용하여 소독된 버섯 조직의 절편을 분리하여 포테이토-덱스트로즈 아가 배지에 올려놓은 후 일정 기간동안 배양하여 균사를 확보한다. 또한, 버섯 포자로부터 직접 발아를 통하여 균사를 확보할 수 있다. 이 같은 방법의 유효성을 입증하기 위하여 본 발명에서는 페리너스 속 버섯을 대표하여 상황버섯(Phellinus linteus KCTC 10975BP)과, 이노노투스 속 버섯을 대표하여 기와층버섯(Inonotus xeranticus KCTC 10976BP)을 실험에 사용하였으며, 이 외에도 페리너스 속 균주로서 페리너스 리비스(Phellinus ribis), 페리너스 이그니아리우스(Phellinus igniarius), 페리너스 바우미(Phellinus baumii), 페리너스 로부스투스(Phellinus robustus), 페리너스 포필리우스(Phellinus popilius)와 이노노투스 속 균주로서 이노노투스 오블리쿼스(Inonotus obliquus) 등은 상기 상황버섯과 기와층버섯의 분리과정과 동일하게 수행하면 동일한 화합물을 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
균사체 배양물로부터 활성물질을 분리하기 위해서는 균사체 배양물을 클로로포름류, 에틸아세테이트류 등의 유기 용매에 의하여 추출, 물의 분배, 컬럼크로마토그래피 등 유용성분의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수 있다. 조추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다.
본 발명에서는 페리너스(Phellinus) 속 버섯 또는 이노노투스(Inonotus) 속 버섯 균주의 배양물을 사용한다. 본 발명에 따른 이들 균주의 배양물과 이 배양물로부터 활성물질로서 히스피딘 유도체를 효율적으로 분리할 수 있는 바람직한 방법은 다음과 같다:
본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 대하여 40~60% 메탄올 수용액을 사용하여 RP-TLC를 수행하여 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl)를 분리한다.
또한, 본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 대하여 60~80% 메탄올 수용액을 사용하여 RP-TLC를 실시하여 하이폴로민 B(hypholomine B)를 분리한다. 또는, 상기 활성 분획물에 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 40~60% 메탄올(0.04% TFA)을 전개용매로 하여 하이폴로민 B(hypholomine B)를 분리할 수 있다.
본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 85~95% 메탄올 수용액을 전개용매로 RP-TLC를 실시하여 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan)을 분리한다. 또한, 상기 활성 분획물에 40~60% 메탄올(0.04% TFA)을 전개용매로 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 수행하여 1,1-디스티릴피릴에탄을 분리할 수 있 다.
본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 40 ~ 90%의 메탄올 수용액을 용매로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)로 분획하여 85~95% 메탄올 수용액으로 용출된 분획에서 펠리닌 A(phellinin A)를 분리한다.
본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 40 ~ 90%의 메탄올 수용액으로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)를 사용하여 분획한 다음, 60 ~ 70%의 메탄올 수용액 분획물을 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 펠리닌 B(phellinin B, 펠리닌 B1<->펠리닌 B2)를 분리한다.
본 발명은
1) 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯 자실체를 표면 소독 후, 멸균한 상태에서 균주를 확보한 다음, 포테이토-덱스트로즈 함유 배지를 이용하여 25 ~ 30 ℃에서 7 ~ 20일간 진탕 배양하여 배양물을 얻는 단계;
2) 상기 배양물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소의 용매로 추출하여 용매 추출물을 얻는 단계; 및
3) 상기 용매 추출물에 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성 분획물에 40 ~ 90%의 메탄올 수용액으로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)를 사용하여 분획한 다음, 60 ~ 70%의 메탄올 수용액 분획물을 60~80% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 펠리닌 C(Phellinin C)를 분리한다.
상기 분리방법에 각각의 2) 단계에서 사용되는 용매로는 바람직하게 메탄올, 에탄올, 아세톤, 프로판올, 에틸아세테이트 등이 적합하다.
또한, 본 발명의 화합물은 버섯 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 얻을 수 있다.
이렇게 얻어진 화합물들의 물리화학적 특성은 다음과 같다.
모든 화합물은 노란색의 분말로 획득되었다.
상기 화합물의 분자식을 결정하기 위하여 ESI-mass를 측정한 결과, 3,14-비히스피디닐은 분자식 C26H18O10, 분자량 490이었으며, 하이폴로민 B는 분자식 C26H18O10, 분자량 490, 1,1-디스티릴피릴에탄은 분자식 C28H22O10, 분자량 518, 펠리닌 A는 분자식 C33H20O13, 분자량 448, 펠리닌 B는 분자식 C18H18O6, 분자량 330, 펠리닌 C는 분자식 C19H20O6, 분자량 344로 각각 결정되었다.
UV 스펙트럼을 측정한 결과 이들 화합물 모두 250 nm 부근 및 370 ~ 390 nm에서 최대 흡수피크를 나타내었다.
NMR 결과와 상기의 물리화학적 특성을 근거로 분리된 화합물들의 화학구조를 해석한 결과는, 화학식 1에 나타내었다.
본 발명에 따른 화합물들은 1) 크산틴/크산틴 옥시다아제 효소계를 이용한 수퍼옥사이드 라디칼, 2) ABTS 라디칼, 3) DPPH 라디칼을 이용하여 항산화 물질로 알려져 있는 카페인산(caffeic acid), BHA, 트롤록스(trolox)와 비교하여 항산화 활성을 나타내었다.
이러한 항산화 활성으로부터 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨 슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병에 대한 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 위한 의약품, 화장품 소재 또는 식품으로 적용가능하다.
따라서, 본 발명에서는 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 얻은 화학식 1, 2a, 2b, 3, 4, 5 및 6의 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명의 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 얻은 화학식 1, 2a, 2b, 3, 4, 5 및 6의 항산화 화합물에 대하여 급성 독성을 시험한 결과, 50% 치사량(LD50)은 적어도 1 g/kg 이상인 것으로 나타나 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다.
본 발명의 항산화 화합물들을 의약으로 사용하는 경우에는 1 ~ 600 mg/kg을 성인에게 1일에 투여할 수 있으며, 추출물을 사용하는 경우에는 추출물을 증발시켜 그 잔사를 기준으로 10 ~ 100 mg/kg을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 항산화 화합물에 무기 또는 유기의 담체를 가하여, 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
경구 투여를 위한 제제로서는 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제(乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수가 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형으로 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 수액(輸液), 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제(乳劑), 유제(油濟), 좌제(坐劑) 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 물과 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화하여 사용하면 된다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 페리너스 속 또는 이노노투스 속 버섯 균주의 분리 및 배양
상황버섯(Phellinus linteus KCTC 10975BP) 균주 또는 기와층버섯(Inonotus xeranticus KCTC 10976BP) 균주 버섯 자실체를 70% 에탄올 수용액으로 표면 소독한 후 무균상자에서 멸균된 칼을 이용하여 버섯 절편을 분리한 후 포테이토-덱스트로즈 아가 배지에서 20일간 배양하여 균주를 확보하였다. 또한, 각 버섯 자실체 로부터 분리한 포자를 포테이토-덱스트로즈 아가 배지 상에서 발아하여 균주를 확보할 수 있다. 확보된 균주는 포테이토-덱스트로즈를 함유한 배지를 이용하여 27 ℃에서 14일간 진탕 배양하였다.
실시예 2: 버섯 균사체 추출물의 활성 분획물의 제조
상기 실시예 1의 배양물을 에틸아세테이트로 추출하고 메탄올을 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 다시 70% 메탄올 수용액을 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻었다.
실시예 3: 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물에 대하여 50% 메탄올 수용액을 사용하여 RP-TLC를 수행하여 Rf값 0.56에서 다음 화학식 4로 표시되는 3,14-비히스피디닐(3,14-bihispidinyl)를 3 mg 분리하였다.
[화학식 4]
Figure 112006092443574-pat00010
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 490
③ 분자식 : C26H18O10
④ 질량분석 스펙트럼 : ESIMS m/z 489 [M-H]-, m/z 513 [M+Na]+
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH) 250, 373 nm
⑥ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (400MHz, CD3OD) 6.25 (s), 6.64 (d, J = 15.9 Hz), 7.36 (d, J = 15.9 Hz), 7.05 (d, J = 1.5 Hz), 6.78 (d, J = 8.4 Hz), 6.97 (dd, J = 1.5, 8.4 Hz), 6.09 (s), 6.56 (d, J = 15.9 Hz), 7.22 (d, J = 15.9 Hz), 7.23 (s), 6.66 (s)
실시예 4: 하이폴로민 B(hypholomine B)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물에 대하여 70% 메탄올 수용액을 사용하여 RP-TLC를 실시하여 Rf값 0.4에서 다음 화학식 5로 표시되는 하이폴로민 B(hypholomine B)를 5 mg 분리하였다. 또는 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 50% 메탄올(0.04% TFA)를 전개용매로 하여 체류시간 38분에서 분리할 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112006092443574-pat00011
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 490
③ 분자식 : C26H18O10
④ 질량분석 스펙트럼 : ESIMS m/z 513 [M+Na]+
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH) 257, 388 nm
⑥ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD3OD) 4.30 (d, J = 6.4 Hz), 5.77 (d, J = 6.4 Hz), 6.08 (s), 6.40 (s), 6.67 (d, J = 16.0 Hz), 6.72 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 6.78 (d, J = 8.4 Hz), 6.79 (d, J = 8.0 Hz), 6.80 (d, J = 2.0 Hz), 6.96 (d, J = 8.4, 2.0 Hz), 7.05 (d, J = 2.0 Hz), 7.38 (d, J = 16.0 Hz)
⑦ 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (100MHz, CD3OD)
162.5 (C-2), 99.7 (C-3), 174.5 (C-4), 96.0 (C-5), 165.6 (C-6), 116.9 (C-7), 138.8 (C-8), 128.6 (C-9), 115.0 (C-10). 146.8 (C-11), 149.1 (C-12), 116.9 (C-13), 122.4 (C-14), 167.8 (C-2'), 91.0 (C-3'), 173.2 (C-4'), 103.5 (C-5'), 163.6 (C-6'), 53.4 (C-7'), 92.8 (C-8'), 131.5 (C-9'), 118.9 (C-10'), 116.9 (C-11'), 147.6 (C-12'), 146.9 (C-13'), 113.8 (C-14')
실시예 5: 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물을 90% 메탄올 수용액을 전개용매로 RP-TLC를 실시하여 Rf값 0.6에서 다음 화학식 6에 나타낸 1,1-디스티릴피릴에탄(1,1-distyrylpyrylethan)을 5 mg 분리하였다. 또는 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 50% 메탄올(0.04% TFA)를 전개용매로 하여 체류시간 62분에서 분리할 수 있다.
[화학식 6]
Figure 112006092443574-pat00012
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 518
③ 분자식 : C28H22O10
④ 질량분석 스펙트럼 : HRESIMS m/z 519.1287 [M+H]+
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH)(logε) 253, 387 nm
⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) νmax 3430, 1650, 1550 cm-1
⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD3OD) 6.13 (s), 6.51 (d, J = 16.5 Hz), 7.24 (d, J = 16.5 Hz), 7.00 (d, J = 1.8 Hz), 6.75 (d, J = 8.7 Hz), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 6.13 (s), 6.51 (d, J = 16.5 Hz), 7.24 (d, J = 16.5 Hz), 7.00 (d, J = 1.8 Hz), 6.75 (d, J = 8.7 Hz), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 4.79 (q, J = 7.6 Hz), 1.58 (d, J = 7.6 Hz)
실시예 6: 펠리닌 A(phellinin A)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물을 40 ~ 90%의 메탄올 수용액을 용매로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)로 분획하여 90% 메탄올 용리액으로 용출된 분획에서 펠리닌 A(phellinin A) 17 mg을 분리하였다[도 1, 도 2 참조].
[화학식 1]
Figure 112006092443574-pat00013
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 448
③ 분자식 : C33H20O13
④ 질량분석 스펙트럼 : ESIMS m/z 447 [M-H]-
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH) 257, 391 nm
⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) νmax 3430, 1650, 1550 cm-1
⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (400MHz, CD3OD) 6.14 (s), 6.59 (d, J = 16.0 Hz), 7.30 (d, J = 16.0 Hz), 7.02 (d, J = 2.0 Hz), 7.77 (d, J = 8.4 Hz), 6.95 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz), 6.40 (d, J = 16.0 Hz), 5.46 (d, J = 16.0 Hz), 1.42 (s), 1.35 (m), 1.57 (m), 1.50 (m), 1.60 (m), 1.65 (m), 1.93 (m). 1.50 (m), 1.19 (m), 1.45 (m), 0.91 (s), 0.81 (s), 4.55 (m), 4.79 (m)
⑧ 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (100MHz, CD3OD) 163.9 (C2), 99.4 (C3), 166.7 (C4), 101.1 (C5), 161.4 (C6), 116.8 (C7), 137.4 (C8), 128.9 (C9), 114.9 (C10), 146.8 (C11), 148.8 (C12), 116.6 (C13), 122.1 (C14), 117.4 (C1'), 125.9 (C2'), 84.5 (C3'), 41.6 (C4'), 21.5 (C5'), 55.4 (C6'), 150.4 (C7'), 33.4 (C8'), 24.7 (C9'), 37.2 (C10'), 35.8 (C11'), 28.8 (C12'), 26.7 (C13'), 110.0 (C14'), 27.8 (C15')
실시예 7: 펠리닌 B(phellinin B)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물을 40 ~ 90%의 메탄올 수용액으로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)를 사용하여 분획한 다음, 60 ~ 70%의 메탄올 수용액 분획물을 70% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 프렉션(fraction) 21-25를 농축하여 펠리닌 B(화학식 2a:펠리닌 B1<->화학식 2b:펠리닌 B2) 4 mg을 분리하였다[도 3, 도 4 참조].
[화학식 2a]

[화학식 2b]
Figure 112008005291065-pat00045
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 330
③ 분자식 : C18H18O6
④ 질량분석 스펙트럼 : ESIMS m/z 329 [M-H]-, 353 [M+Na]+
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH) 258, 375 nm
⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) νmax 3430, 1650, 1550 cm-1
⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD3OD) 6.13 (s), 6.51 (d, J = 16.5 Hz), 7.24 (d, J = 16.5 Hz), 7.00 (d, J = 1.8 Hz), 6.75 (d, J = 8.7 Hz), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 2.81 (m), 2.15 (dd), 1.99 (dd), 1.55 (s), 1.39 (d)
실시예 8: 펠리닌 C(Phellinin C)의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 활성 분획물을 40 ~ 90%의 메탄올 수용액으로 C-18 세팍 카트리지(sepak catridge)를 사용하여 분획한 다음, 60 ~ 70%의 메탄올 수용액 분획물을 70% 메탄올 수용액으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 프렉션(fraction) 30-34를 농축하여 펠리닌 C(Phellinin C) 3 mg을 분리하였다[도 5, 도 6 참조].
[화학식 3]
Figure 112006092443574-pat00015
① 성상 : 노란색의 분말
② 분자량 : 344
③ 분자식 : C19H20O6
④ 질량분석 스펙트럼 : ESIMS m/z 343 [M-H]-, 367 [M+Na]+
⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λmax (MeOH) 255, 381 nm
⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) νmax 3430, 1650, 1550 cm-1
⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD3OD) 6.13 (s), 6.51 (d, J = 16.5 Hz), 7.24 (d, J = 16.5 Hz), 7.00 (d, J = 1.8 Hz), 6.75 (d, J = 8.7 Hz), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 2.81 (m), 2.15 (dd), 1.99 (dd), 1.55 (s), 1.39 (d) 3.28 (s)
시험예 1: 수퍼옥사이드 라디칼 소거 효과
본 화합물들의 수퍼옥사이드 라디칼 소거능을 조사하기 위하여, 96 웰 마이크로플레이트의 웰당 포타슘 포스페이트 버퍼(50 mM, pH 7.8)에 용해시킨, 크산틴(xanthine, 0.5 mM), NBT(nitrobluetetrazolium, 0.1 mM) 1:1 혼합용액 75 ㎕, DMSO(dimethylsulfoxide)에 항산화 화합물 각 농도의 시료 5 ㎕를 넣은 후 1 unit/㎖의 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase) 25 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 다음 수학식 1로부터 자유 라디칼 소거 활성(%)을 산출하였다. 양성 대조군으로는 비타민 E, 카페인산, BHA를 사용하였다. 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성은 시료를 넣지 않은 대조구에 비하여 흡광도 값을 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC50으로 하여 다음 표 1에 나타내었다.
다음 수학식 1에서 A는 본 발명의 화합물을 첨가하지 않은 시험군의 흡광도, B는 본 발명의 화합물을 첨가한 시험군의 흡광도이다.
Figure 112006092443574-pat00016
시험예 2: ABTS 라디칼 소거 효과
본 화합물들의 ABTS 라디칼 소거 활성을 조사하기 위하여 95 ㎕의 ABTS 라디칼 cation 용액에 5 ㎕ 시료를 넣어 실온에서 5분간 방치 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 734 nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 넣지 않은 대조구와 비교하였다. 농도별로 각각 활성을 측정하였으며, 50% 소거 활성을 나타내는 농도를 트롤록스(Trolox)의 상대치(TEAC, Trolox equivalen antioxidant capacity)로 다음 수학식 2에 의하여 계산하고, 양성 대조군인 카페인산, BHA와 비교하여 다음 표 1에 나타내었다.
Figure 112006092443574-pat00017
시험예 3: DPPH 라디칼 소거 효과
본 화합물들의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하기 위하여, 마이크로플레이트 웰당 95 ㎕의 150 μM의 DPPH 용액과 시료 5 ㎕를 넣고 실온에서 20분간 방치한 후 마이크로플레이트 리더로 517 nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 넣지 않은 대조구 와 비교하여 소거 활성을 나타내었다. 농도별로 각각 활성을 측정하였으며, TEAC를 수학식 2에 의하여 계산하고, 양성 대조군인 카페인산, BHA와 비교하여 다음 표 1에 나타내었다.
Figure 112006092443574-pat00018
상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 버섯 균사체 배양물로부터 분리된 항산화 화합물의 자유 라디칼 소거 활성을 조사한 결과, 화합물들은 양성 대조구인 카페이산, BHA와 비슷한 소거 활성을 나타내었다.
시험예 4: 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 시험
페리너스 속 또는 이노노투스 속 버섯 균사체 배양물로부터 분리한 화학식 1 내지 6의 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 화학식 1 내지 6의 화합물 각각을 10 ml의 생리식염수에 현탁하여 1 g/kg의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 전경골근(anterior tibialis)에 근육 내 주사 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 화학식 1 내지 6의 화합물 각각은 랫트에서 1 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구 투여 최소치사량(LD50)은 1 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
제제예 1: 시럽제의 제조
화학식 1 내지 6의 항산화 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 2%(중량/부피) 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1 내지 6의 항산화 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.
유효성분 ················ 2 g
사카린 ················ 0.8 g
당 ················ 25.4 g
글리세린 ················ 8.0 g
향미료 ················ 0.04 g
에탄올 ················ 4.0 g
소르브산 ················ 0.4 g
증류수 ················ 정량
제제예 2: 정제의 제조
화학식 1 내지 6의 항산화 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.
유효성분 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 3: 주사액제의 제조
화학식 1 내지 6의 항산화 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
유효성분 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
이상에서 상세히 살펴본 바와 같이, 페리너스 속 또는 이노노투스 속 버섯 균사체 배양물로부터 얻어진 화학식 1 내지 6의 화합물들은 자유라디칼을 강하게 소거하는 항산화 활성이 있음을 밝히고 있어, 암을 비롯하여 동맥경화, 관절염, 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역질환 등의 각종 질병에 대한 예방 및 치료와 피부 노화 억제를 위한 식품, 화장품 및 의약품의 소재로서 산업적으로 널리 이용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 1]
    Figure 112006092443574-pat00025
  3. 다음 화학식 2a로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 2a]
    Figure 112008005291065-pat00046
  4. 다음 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 3]
    Figure 112006092443574-pat00027
  5. 다음 화학식 1, 2a, 2b, 및 3으로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 712008001321050-pat00028
    [화학식 2a]
    Figure 712008001321050-pat00047
    [화학식 2b]
    Figure 712008001321050-pat00048
    [화학식 3]
    Figure 712008001321050-pat00030
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물은 페리너스 속(Phellinus sp.) 버섯 또는 이노노투스 속(Inonotus sp.) 버섯의 균사체 배양물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 항산화 조성물.
  7. 다음 화학식 2b로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    [화학식 2b]
    Figure 112008005291065-pat00049
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