KR100560100B1 - 상황버섯에서 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상황버섯에서 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 버섯의 일종인 상황버섯(Phellinus baumi)으로부터 분리된 항산화 활성을 갖는 다음 화학식 1의 화합물, 이 화합물의 제조방법 및 이 화합물이 항산화 작용에 관련된 여러 가지 치료제 및 건강식품에 이용될 수 있는 화합물의 용도에 관한 것이다.

상황버섯, 항산화 활성

Description

상황버섯에서 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물의 제조방법{Manufacture of antioxidant from Phellinus baumi}

도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 화학식 1로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물의 이차원 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 화학식 1로 표시되는 화합물의 항산화활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 상황버섯에서 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 버섯의 일종인 상황버섯(Phellinus baumi)으로부터 분리된 항산화 활성을 갖는 화합물 및 이 화합물의 제조방법 및 이 화합물이 항산화 작용에 관련된 여러 가지 치료제 및 건강식품에 이용될 수 있는 화합물의 용도에 관한 것이다.

호기성 생물은 지구상에서 가장 많은 원소인 산소를 최종 전자수용체로 사용하는 호흡에 의해 에너지를 확보한다. 그러나, 이러한 생명현상에 필수적인 산소이지만 안정한 분자상태인 기저삼중항 산소가 물리화학적, 환경적 요인에 의하여 생체에 치명적인 산소독성의 유리라디칼을 생성한다. 생체내에서 가장 큰 문제가 되는 대표적 유리 라디칼은 활성산소로서 자연계에 널리 존재하는 안정한 분자상태인 기저삼중항 산소로부터 효소계, 환원대사과정, 화학적 약품, 공해물질 및 광화학적 반응 등에 의하여 생성된다. 그 생성물로는 O₂ ^-(슈퍼옥사이드), H₂ O₂(하이드로겐파옥사이드), OHㆍ(수산화라디칼), ¹O₂(싱글렛옥시겐) 등이 있으며, 이들은 세포내 과립 및 세포질에서 생성된다. 활성산소는 생체내에서 대식세포의 살균작용, 오래된 단백질의 제거 등에 이용되는 필수불가결한 물질이나, 반응성이 커서 생체내에서 유해한 작용을 나타낼 수 있다.

그러나, 활성산소 방어기구에 이상이 생겼을 경우 또는 물리적, 화학적 요인에 의해 활성산소가 지나치게 증가되었을 경우에는 활성산소가 생체내의 각 부위에 치명적인 손상을 일으키기도 한다. 이로 인해 암을 비롯한 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기 질환, 염증, 류머티스, 자기면역질환 등의 각종 질병 및 노화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 활 성산소를 제거시키거나 유리 라디칼 생성을 억제시키는 항산화 물질들은 과량 생성된 활성산소에 의해 발생한 각종 질병의 예방 및 치료와 피부 노화억제를 목적으로 이용될 수 있을 것이다.

최근에는 식품첨가물로서의 항산화제 개발, 각종 질병의 예방을 위한 건강식품, 노화억제를 목적으로 하는 의약품 및 화장품산업으로까지 다양화되고 있는 상태이다. 현재 사용되고 있는 항산화제로는 t-부틸하이드록시톨루엔(BHT), t-부틸하이드록시아니솔(BHA) 등의 합성 항산화제와 토코페롤(tocopherol), 카로티노이드, 플라보노이드(flavonoid), 탄닌 등의 천연 항산화제 및 SOD와 같은 항산소성 효소 등이 사용되고 있다. 합성 항산화제는 인체에 대한 독성과 비싼 가격 등의 문제로 사용에 제한을 받고 있으므로, 인체에 무해하면서도 보다 강한 항산화효과를 나타내는 천연 항산화물질의 개발이 필요하다.

천연 항산화제 중에서 특히 각종 향신료 스피어민트(speamint), 마르조람(marjoram), 스위트 바실(sweet basil), 개늠교의 추출물에서 토코페롤, BHA와 비슷한 항산화효과를 보고했으며, 참깨의 항산화성분으로 세사미놀(sesaminol), γ-토코페롤, 트랜스-페루릭산(trans-ferulic acid), 비스에폭실리간(bisepoxyligan) 동족체 등이 함유되어 있는 것으로 보고하였다. 식용식물로부터의 항산화 효과에 대한 연구로는 더덕의 에탄올 추출물로부터 항산화 효과가 있음이 밝혀졌다. 칡뿌리로부터는 플라보노이드성 푸에라린(puerarin)이 항산화성분임이 밝혀졌고, 식용 해조류로부터 벤젠계열의 항산화 물질이 분리되었으며, 인삼으로부터 살리실산(salicylic acid), ρ-쿠마르산(ρ-cumaric acid), 젠 티식산(gentisic acid), 카페인산(caffeic acid) 등의 페놀성 항산화 물질이 분리되었다. 왕겨의 메탄올 추출물에는 플라보노이드계의 물질이 존재하고 이들이 항산화 효과를 나타내는데, 그 활성물질은 C-글리코실 플라보노이드(C-glycosyl flavonoid)임이 밝혀졌다. 한약재로 사용하고 있는 붉나무의 에탄올 추출물 또한 강한 항산화 효과를 나타내었는데 토코페롤과 같이 사용했을 때 상승효과를 보였다. 그 외에 각종 식용식물로는 오미자, 각과 겨자, 산사 등에서 항산화 활성이 보고되었다.

이에, 본 발명자들은 약용식물 소재로부터 항산화 물질을 탐색하던 중 상황버섯에서 항산화 활성을 보이는 물질을 밝혀내어 이 항산화 물질을 분리하여 구조를 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상황버섯(phellinus baumi)에서 분리한 항산화 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 우수한 항산화 활성 효과를 나타내는 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 이를 포함하는 의약품 또는 건강식품을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 상황버섯(phellinus baumi)으로부터 분리한 항산화 활성을 갖는 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및 이의 제조방법을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 이 조성물을 포함하는 의약품 또는 건강식품를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 약용버섯의 일종인 상황버섯으로부터 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물, 이 화합물의 제조방법 및 이 화합물이 항산화 작용에 관련된 여러 가지 치료제 및 건강식품에 이용될 수 있는 신규 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규 화합물의 제조방법은

1) 상황버섯을 채취하여 음지에서 건조하고 메탄올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 단계;

2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 에틸아세테이트로 진탕추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계;

3) 상기 에틸아세테이트층을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 얻 는 단계;

4) 상기 활성분획을 감압 건조하여 아세토나이트릴 수용액으로 고속액체크로마토그래피를 수행하는 단계로 이루어진다.

이렇게 분리된 활성분획을 정제하여 신규 화합물의 구조를 NMR로 분석한 결과, 세 가지 기가 치환된 벤젠환을 가지며, 이중 두개는 수산화기에 치환되어 있고 다른 하나는 트랜스형의 올레핀, 케톤과 메틸기로 구성되어 있는 화합물로 C₁₀H₁₀O ₃로 분자량은 178이며, 상기 화학식 1로 표시되었다.

이 화합물에 대한 항산화 활성의 조사를 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 환원법을 수행하여 확인하였다. 따라서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 항산화 효과를 나타내는 유효성분으로 유해산소나 유리 라디칼에 기인하는 각종 질환을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 항산화 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

상기 화합물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이와 같은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항산화 조성물은 항 산화 작용에 관련된 질환 등을 예방 또는 치료에 유용하다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 상황버섯에서 항산화 활성 물질의 분리

본 발명자들은 추출 및 크로마토그래피를 이용하여 상황버섯으로부터 강한 항산화 활성이 있는 새로운 항산화 물질을 분리하였다.

먼저, 재배한 상황버섯 건조물 1.5 kg를 쇄절하고 100% 메탄올로 3일 동안 추출하여 감압여과한 후, 그 여액을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 1 L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2 L의 에틸아세테이트로서 진탕 추출하여 에틸아세테이트층을 얻은 다음 다시 에틸아세테이트층을 60 ℃의 수조에서 감압농축하였다. 에틸아세테이트층의 농축물을 소량의 메탄올에 녹여 메탄올에 평형화된 세파덱스 엘에이치-20 칼럼(Sephadex LH-20 gel column chromatography)에서 전개시켜 활성분획을 얻고 그 분획을 YMC 젤 ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC gel ODS column chromatography)에서 10% 아세토나이트릴 수용액을 용매로 사용하여 고속액체크로마토그래피를 수행하였다.

분리 정제된 물질을 중메탄올(CD₃OD)에 녹여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 이차원 NMR을 통하여 다음 표 1의 수소 및 탄소의 케미칼시프트(chemical shift)를 확정할 수 있었다. 또한, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 이차원 NMR 스펙트럼 결과는 첨부도면에 나타내었다.

탄소번호	수소 NMR의 케미칼시프트(ppm)	탄소 NMR의 케미칼시프트(ppm)
1	-	127.7
2	7.07	115.3
3	-	150.1
4	-	147.0
5	6.78	116.6
6	6.99	123.5
7	7.52	146.9
8	6.55	124.7
9	-	201.6
10	2.32	27.0

상기 분리 정제된 물질은 벤젠환에 두개의 수산화기가 치환되어있고, 트랜스형의 올레핀기에 케톤기과 메틸기가 붙어 있는 화합물로 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온(4-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-but-3-en-2-one, 상혼(sanghone))으로 명명하였고, 그 구조는 다음 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

실시예 3: 정제된 화합물의 항산화 활성의 확인

분자내에 유리 라디칼(free radical)을 함유하고 있는 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온은 전자나 수소 라디칼을 쉽게 받아들여 안정한 분자로 되므로 유리 라디칼 제거효능을 측정할 수 있다. 시료의 DPPH에 대한 수소공여능은 다음과 같이 측정하였다. DPPH 12 mg을 100 ㎖의 에탄올에 완전히 용해시킨 후 증류수 100 ㎖을 첨가하여 0.5 mM DPPH 용액을 만들어 각 분리정제 중의 시료에 대하여 2 ㎕에 DPPH 용액 200 ㎕를 첨가하였다. 30분 후에 분광광도계를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도로 나타내었다. 이때 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온은 최종농도로 50 ㎍/㎖ 되게 2 ㎕를 0.5 mM의 DPPH 용액과 반응시킨 결과, 517 nm에서 반응시간에 따른 흡광도 감소를 첨부도면 도 4에 나타내었으며, 음성 대조군으로 메탄올만을 첨가한 경우와 양성 대조군으로 알파 토코페롤을 첨가한 경우를 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온와 비교하여 본 결과, 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온은 알파-토코페롤에 비해 우수한 항산화 활성을 나타내었다.

실시예 4: 독성시험

화학식 1로 표시되는 화합물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명에 따른 신규 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

상기 신규 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

제제예 2: 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

본 발명에 따른 신규 화합물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

본 발명에 따른 신규 화합물 500 ㎎을 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제 를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제의 제조

본 발명에 따른 신규 화합물 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

제제예 5: 음료 제조

본 발명에 따른 신규 화합물 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 화합물은 항산화 활성이 우수하여 항산화 작용이 관련된 질환의 치료제 또는 건강식품으로 사용이 유용하다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 1) 상황버섯을 채취하여 음지에서 건조하고 메탄올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 단계;

   2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 에틸아세테이트로 진탕추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계;

   3) 상기 에틸아세테이트층을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 얻는 단계;

   4) 상기 활성분획을 감압 건조하여 아세토나이트릴 수용액으로 고속액체크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법.

   [화학식 1]

   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제

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