KR100665313B1

KR100665313B1 - 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 화합물 및 이를포함하는 감국 추출물

Info

Publication number: KR100665313B1
Application number: KR1020030042252A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 김형자; 서선희; 이재열
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2007-01-09
Also published as: KR20050001899A

Abstract

본 발명은 감국으로부터 분리된 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 화합물, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하며 물 또는 유기용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 감국 추출물 및 감국 추출물로부터 상기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 감국으로부터 분리된 3,5-디카페오일-에피-퀴닉산 및 1,3-디카페오일-에피-퀴닉산 화합물, 상기 화합물을 함유하고 항산화 및 항바이러스 활성을 가지며 물 또는 유기용매로 추출되는 감국 추출물 및 감국 추출물로부터 상기 화합물들을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물 및 감국 추출물은 활성산소에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방뿐만 아니라, 식품의 유지 및 산화적 손상에 의한 피부의 노화를 방지하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 HIV에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 증상의 완화를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

감국, 항산화 활성, 디카페오일퀴닉산 유도체, 라디칼 소거능, 피부노화, 항바이러스 활성, HIV 인테그라제 저해제

Description

항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 화합물 및 이를 포함하는 감국 추출물{Compound showing anti-oxidant and anti-viral activity and extract of Chrysanthemum indicum comprising the same}

본 발명은 감국(Chrysanthemum indicum)으로부터 분리되고 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 화합물, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하며 물 또는 유기용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 감국 추출물 및 감국 추출물로부터 상기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

안정한 상태로 존재하던 산소가 효소, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical, O_2' ^-), 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical, OH_'), 과산화수소 (hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소 (singlet oxygen, ¹O₂) 등과 같이 반 응성이 큰 활성산소 (reactive oxygen species: ROS)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등을 비가역적으로 파괴할 수 있다. 이러한 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라제 (catalase), 퍼옥시다제 (peroxidase), 글루타치온 (glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비타민 C (vitamin C, ascorbic acid), 비타민 E (tocopherol) 등과 같은 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우에는 잔여 또는 과잉의 활성산소가 생체에 치명적인 산소독성을 일으키고, 세포구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으킨다고 알려져 있다(Cross 등, Ann. Intern. Med., 1987, 107, 526; Alderson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2706).

이와 같이, 산화적 스트레스가 노화를 비롯하여 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체내 활성산소를 효과적으로 제거하는 활성산소 소거제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 활성 산소종을 조절할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 카탈라제, 퍼옥시다제, 글루타치온 (glutathione) 등의 항산화성 효소 및 비티민 C, 비타민 E, 토코페롤 등의 천연물 유래의 저분자 활성산소 소거제에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 또한, 합성된 활성산소 소거 제로는 BHA (butylated hydroxy anosole), BHT (butylated hydroxy toluene) 및 NDGA (nordihydroguaiaretic acid) 등도 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다.

그러나, 합성된 활성산소 소거제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양 등을 발생시킬 수 있는 단점이 있다. 따라서, 천연 활성산소 소거제의 개발이 더욱 요구되고 있으나, 현재까지 알려진 천연 활성산소 소거제는 합성 활성산소 소거제에 비하여 안전하지만 그 효력이나 생산비용 면에서 합성 활성산소 소거제를 능가하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 활성산소 소거활성이 탁월하면서 보다 안전하고 생산비용이 저렴한 새로운 천연활성산소 소거제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 인간면역결핍바이러스(이하, "HIV"라 약칭함)는 주로 사람의 임파구를 공격하는 바이러스로서 외피(envelope)로 둘러싸여 있으며, 유전물질인 RNA 게놈 (genome)을 DNA로 역전사시킨 후 숙주세포의 DNA에 삽입시키는 특성을 가지고 있는 레트로바이러스 중 하나이다. HIV는 가장 내부에 유전정보인 RNA와 역전사효소 (reverse transcriptase)가 존재하며, 상기 RNA와 역전사효소는 껍질 단백질에 의해 둘러싸여 있고, 그 바깥쪽에는 gp120과 gp41로 불리는 당단백질을 포함하는 지질막이 보호막을 형성하고 있는 구조를 하고 있다. gp120 단백질은 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

항 HIV 약제의 약리효과는 주로 HIV의 생활주기를 저해함으로써 이루어지는데, 크게 1) 바이러스의 당단백질인 gp120과 숙주세포의 CD4 수용체간의 작용을 저해하거나, 2) 바이러스의 RNA를 프로바이러스 DNA로 바꾸는데 관여하는 역전사효소를 저해하거나, 3) 바이러스의 조절단백질 (viral regulatory protein, tat, rev)의 작용을 저해하거나, 4) 바이러스의 전구단백질의 분해를 저해하거나, 5) 바이러스의 당단백질 성숙을 위하여 올리고당의 포도당 또는 만노스를 분해하는 효소인 포도당 분해효소 (glucosidase) 또는 만노스 분해효소(mannosidase)의 작용을 저해하는 것 등을 들 수 있다.

현재까지 개발된 HIV 저해제로는, 상기 2)와 같은 역전사효소 저해작용을 갖는 약제로서 디데옥시시티딘 (DDC), 디데옥시이노신 (DDI), AZT (zidobudine, azidothymidine), 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 펩타이드 T, 리바비린 (ribavirin), 카스타노스퍼민(castanospermine), 지엘큐 223 (GLQ 223), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단백질 분해효소 저해제 등이 있으나 부작용 등의 문제점으로 인해 아직도 효과적인 AIDS 치료약으로 쓰이지는 못하고 있는 실정이다. 예컨대, AZT는 AIDS 치료에 어느 정도 효과적인 약물이지만 6개월 이상 치료하면 AZT 내성 HIV-1 균주가 나타나서 약효가 더 이상 나타나지 않고, 과립구감소증과 빈혈 등 심각한 부작용이 있으며, 이외에도 두통, 구역, 불면증 등의 중추신경계 부작용이 있다. 또한, AIDS 치료제로서 조건부 허가를 받은 DDI도 췌장염, 말초신경 장 해와 같은 심각한 부작용이 나타나므로 AZT에 대해 효과를 나타내지 않거나, 독성 등으로 AZT의 사용이 중단된 환자에게만 처방이 가능하다.

또 다른 치료제로는 HIV의 프로테아제 저해제가 있다. HIV는 외피 단백질과 효소들이 모두 붙어있는 gag 단백질과 gag-pol 단백질과 같은 전구 단백질 형태를 만든 후, 자체내의 프로테아제에 의해 분해 되어 외피 단백질과 프로테아제, 역전사효소 및 인테그라제 (integrase) 등을 제조하는데, 이러한 과정에 관여하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되는 것을 기초하여 개발된 것이다. 단백질 분해효소 억제제로서는 사퀴나비르 (saquinavir), 리토나비르 (ritonavir), 인디나비르 (indinavir) 등이 개발되어 AIDS 환자의 치료제로 사용하고 있다. 그러나, 이 또한 당뇨병, 용혈, 출혈, 과지방혈증, 지방대사 장해 등의 부작용을 가지며, 치료제를 장기간 복용해야 하기 때문에 치료제에 대한 내성주가 출현하는 등의 심각한 문제를 일으키고 있다.

HIV 감염자와 ADIS 환자는 세계적으로 급격하게 증가하고 있으며, 이들의 치료를 위해서는 기존의 치료제보다 부작용이 적고, 복용이 간편하며 기존의 치료제에 대하여 내성을 나타내는 유전자 부위에 대하여 내성주가 생성되지 않는 값싼 약제의 개발이 요구되고 있다. AIDS 치료제로 개발된 역전사효소 저해제나 단백질분해효소 억제제의 부작용과 내성주에 대한 문제를 해결하기 위해서 종래의 치료제와는 다른 작용기전에 의한 치료제의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

한편, 감국(Chrysanthemum indicum)은 다년생 식물로서 국내에서는 산지에서 많이 자생할 뿐만 아니라 대량으로도 재배되고 있으며, 본초강목에서는 간을 편안하게 다스리고 눈을 맑게 해주며, 열을 내리고 독기를 풀어준다고 기술하고 있다. 또한, 항균 작용과 항바이러스 작용 및 항염증 작용 등 다양한 생리학적 효과가 보고 되어 있다(Hu 등, Journal of Natural Products, 1994, 57, 42).

이에, 본 발명자들은 감국의 알콜 추출물 및 이로부터 분리된 디카페오일퀴닉산 유도체와 플라보노이드 계열 화합물이 HIV 복제에 필수적인 효소 중 하나로서 아직까지 효소의 활성을 저해할 수 있는 저해제가 개발되어 있지 않은 인테그라제(integrase)에 대한 저해활성을 보임으로써 HIV에 대한 억제제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 항산화 활성이 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감국으로부터 분리된 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 화합물, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하며 물 또는 유기용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 감국 추출물 및 감국 추출물로부터 상기 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이를 포함하는 감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항바이러스용 약학적 조성물, 식품 첨가물 또는 화 장품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 물 또는 유기용매로 추출되고 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 감국 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물로부터 화학식 1 내지 화학식 4의 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항바이러스용 약학적 조성물, 식품 첨가물 또는 화장품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

상기에서, R₁및 R₂는 수소 또는 카페오일기이며, R₃는 카페오일기이다. 카페오일기는 하기와 같은 구조를 가진다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 R₁ 및 R₂가 각각 수소 및 카페오일기인 3,5-디카페오일-에피-퀴닉산 (3,5-O-dicaffeoy-epi-quinic acid) (이하, '화합물 1' 이라 약칭함) 또는 R₁ 및 R₂가 각각 카페오일기와 수소인 1,3-디카페오일-에피-퀴닉산 (1,3-O-dicaffeoy-epi-quinic acid) (이하, '화합물 2'라 약칭함)인 것이 바람직하다(표 1 참조).

	R₁	R₂	R₃
화합물 1	H	카페오일	카페오일
화합물 2	카페오일	H	카페오일

본 발명의 화합물 1의 화합물은 흰색의 무정형 분말로, TLC 플레이트에서 황 산 발색 시 처음엔 노란색을 띠다가 시간이 지나면서 붉은색을 띠는 성질이 있으며, 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 -166.0°로 나타나고, 분자량은 FABMS에서 516인 화학적 특성을 가진다. 상기 화합물 1의 수소 및 탄소 NMR 데이터는 하기와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 2.04 (m, 1H, H-6_ax), 2.11 (m, 2H, H-2), 2.28 (dd, 1H, J=15.2, 2.7 Hz, H-6_eq), 3.91 (dd, 1H, J=9.9, 3.4 Hz, H-4), 5.39 (m, 1H, H-5), 5.55 (m, 1H, H-3), 6.31, 6.43 (d, each 1H, J=15.8 Hz, H-8'), 6.78 (d, 2H, J=8.2 Hz, H-5'), 6.96, 6.97 (dd, each 1H, J=8.2, 2.0 Hz, H-6'), 7.06, 7.08 (d, each 1H, J=2.0 Hz, H-2'), 7.59, 7.62 (d, each 1H, J=15.8 Hz, H-7')

¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 36.6 (C-6), 39.7 (C-2), 71.5 (C-3), 72.1 (C-4), 73.5 (C-5), 75.4 (C-1), 114.3 (C-2'), 114.5, 115.0 (C-8'), 115.5 (C-5'), 122.0 (C-6'), 126.9, 127.1 (C-1'), 145.7, 145.7 (C-7'), 145.9, 146.0 (C-3'), 148.3, 148.5 (C-4'), 168.1, 168.5 (C-9'), 180.4 (COOH)

또한, 본 발명의 화합물 2의 화합물은 미황색의 무정형의 분말로, TLC 플레이트에서 황산 발색시 처음엔 노란색을 띠다가 시간이 지나면서 붉은색을 띠게 되어 디카페오일 유도체임을 알 수 있다. 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 +183.7°로 나타나며, 분자량은 FABMS에서 516인 화학적 특성을 가진다. 상기 화합물 2의 수소 및 탄소 NMR 데이터는 하기와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 2.08 (dd, 1H, J=13.6, 9.0 Hz, H-2_ax), 2.46 (m, 2H, H-6), 2.58 (dd, 1H, J=13.7, 3.4 Hz, H-2_eq), 3.80 (dd, 1H, J=8.0, 3.2 Hz, H-4), 4.31 (dd, 1H, J=7.4, 3.8 Hz, H-5), 5.41 (m, 1H, H-3), 6.28, 6.31 (d, each 1H, J=15.9 Hz, H-8'), 6.79 (d, 2H, J=8.2 Hz, H-5'), 6.92 (dd, 2H, J=8.2, 1.6 Hz, H-6'), 7.07 (br s, 2H, H-2'), 7.58, 7.59 (d, each 1H, J=15.9 Hz, H-7')

¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 34.7 (C-6), 35.9 (C-2), 68.5 (C-5), 70.6(C-3), 71.9 (C-4), 80.0 (C-1), 114.1 (C-2'), 114.2 (C-8'), 115.5 (C-5'), 122.1, 122.2 (C-6'), 126.8 (C-1'), 145.8 (C-3'), 146.6, 146.3 (C-7'), 148.6, 148.6 (C-4'), 167.7, 167.1 (C-9'), 173.9 (COOH)

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있으며, 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속 수산화물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염(예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리금속 탄산염 (예: 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘)등과 같은 무기염기와 1차, 2차 3차 아민 아미노산과 같은 유기염기가 포함된다. 또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있으며, 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어날 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

또한, 본 발명은 물 또는 유기용매로 추출되며 항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 감국 추출물을 제공한다.

상기에서, 유기용매는 알콜, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 용매 또는 이들의 혼합물이 될 수 있으며, 알콜인 것이 바람직하다. 또한, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 메탄올 또는 에탄올인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 감국 추출물을 제조함에 있어서, 감국은 전체가 사용될 수 있으며 음지에서 건조하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 감국 추출물은 활성성분으로서 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물, 바람직하게는 화합물 1 내지 화합물 11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서, R₁은 수소 또는 메틸기이고, R₂ 내지 R₄는 수소 또는 카페오일기이며, R₅는 카페오일기이다.

화학식 2의 화합물은 R₁ 내지 R₅가 각각 표 2에 기재된 작용기를 가지는 3,5-디카페오일퀴닉산 (3,5-O-dicaffeoylquinic acid) (이하, '화합물 3'이라 약칭함), 1,5-디카페오일퀴닉산 (1,5-O-dicaffeoyquinic acid) (이하 '화합물 4'라 약칭함), 4,5-디카페오일퀴닉산 (4,5-O-dicaffeoyquinic acid) (이하 '화합물 5'라 약칭함), 메틸 3,5-디카페오일퀴네이트 (methyl 3,5-O-dicaffeoyquinate) (이하 '화합물 6'이라 약칭함), 메틸 4,5-디카페오일퀴네이트 (methyl 4,5-O-dicaffeoyquinate) (이하 '화합물 7'이라 약칭함) 또는 클로로제닉산 (chlorogenic acid) (이하 '화합물 8'이라 약칭함)인 것이 바람직하다.

	R₁	R₂	R₃	R₄	R₅
화합물 3	H	H	카페오일	H	카페오일
화합물 4	H	카페오일	H	H	카페오일
화합물 5	H	H	H	카페오일	카페오일
화합물 6	Me	H	카페오일	H	카페오일
화합물 7	Me	H	H	카페오일	카페오일
화합물 8	H	H	H	H	카페오일

상기에서, R₁은 수소 또는 글루코스이다.

본 발명의 화학식 3의 화합물에 있어서, R₁이 수소인 루테올린(luteolin) (이하, '화합물 9'라 약칭함) 및 R₁이 글루코스인 루테올린 7-O-β-D-글루코피라노사이드(luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside) (이하, '화합물 10'이라 약칭함)인 것이 바람직하다(표 3 참조).

	R₁
화합물 9	H
화합물 10

상기 화학식 4의 화합물은 에리오딕티올 7-O-β-D-글루코피라노사이드 (eriodictyol 7-O-β-D-glucopyranoside) (이하, '화합물 11'이라 약칭함)이다.

항산화 및 항바이러스 활성을 가지는 본 발명의 감국 추출물은 감국을 알코올, 함수 알코올 또는 에틸 아세테이트와 같은 유기용매로 추출하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다. 즉, 감국을 잘게 절단하거나 분말화하여 그대로 사용하거나 또는 동결건조시킨 후, 여기에 감국 1 ㎏당 메탄올 (MeOH), 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 또는 글리세롤과 같은 60 내지 100%의 저급 알콜 수용액, 또는 아세톤을 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ℓ의 양으로 가하고 상온에서 4 내지 5 일 동안 방치시킨다. 상기 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 감국의 알콜 추출물을 얻는다. 알콜 추출물 1 ㎏당 1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.5 내지 2.0 ℓ의 물을 가한 후, 에틸 아세테이트 (EtOAc) 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 ℓ로 충분히 추출하여 에틸 아세테이트 추출물을 얻을 수 있다. 상기 에틸 아세테이트 추출물은 알코올 추출과정을 생략하고 직접 감국을 에틸 아세테이트로 추출하여 제조할 수도 있다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 감국 추출물의 항산화 및 항바이러스 활성을 확인한 결과, 감국의 메탄올 추출물은 항산화 활성뿐만 아니라(표 5 및 표 6 참조) 항 HIV 활성을 나타내었다(표 7 및 표 8 참조). 또한, 감국의 메탄올 추출물을 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 등으로 분획한 추출물들의 항산화 및 항 HIV 활성을 조사한 결과, 에틸 아세테이트 추출물과 부탄올 추출물에서 활성이 가장 강력하였다(표 4 참조). 따라서, 본 발명의 감국 추출물을 항산화제 및 항HIV제로 사용하기 위해서는 메탄올, 에탄올, 함수 에탄올과 같은 알콜 용매 추출물을 사용할 수 있으며, 에틸 아세테이트 분획과 부탄올 분획을 사용하면 매우 효과적인 약리 작용을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물로부터 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

상기 화합물들은 감국의 에틸 아세테이트 추출물에 대하여 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 (Toyopearl) 및 XAD 수지로 구성된 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 칼럼 크로마토그래피를 수행함으로써 정제될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있는데, 특히 세파덱스, RP-18 및 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기의 칼럼크로마토그래피 과정을 통해 감국의 에틸 아세테이트 추출물로부 터 신규 화합물인 화합물 1 및 화합물 2 뿐만 아니라 화합물 3 내지 화합물 11의 디카페오일퀴닉산 유도체와 플라보노이드 계열 계열의 화합물을 분리 및 정제할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 감국의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 1 내지 화합물 11의 화합물은 항산화 및 항 HIV 활성을 나타내므로, 활성산소에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방, 식품의 유지 및 피부의 산화에 의한 손상을 방지하는데 매우 유용할 뿐만 아니라, HIV에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 증상의 완화를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 HIV 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 감국의 추출물 또는 이로부터 정제된 화합물 1 내지 화합물 11로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하며, 통상의 약리적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 약리적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 담체는 본 발명의 활성성분과 양립가능하며 수용체에 유해하지 않아야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 환자 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.

이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성산소에 의한 세포구성성분의 산화에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 질병으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 노화 (aging), 암 (cancer), 복합성 동맥경화 (multiple atherosclerosis), 관절염, 파킨슨병 (Parkinson's disease), 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 또는 뇌경색 등이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학적 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭씨르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 감국의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 1 내지 화합물 11의 유효량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이다. 바람직하게는 500 내지 5,000 ㎎의 범위가 통상적이며, 일부 질환에 따라 더 높은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화 합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 식품 첨가물을 제공한다.

본 발명에 따른 감국 추출물 및 이로부터 분리된 유효성분은 항산화 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수 있다. 따라서 상기 감국 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 종래의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 감국 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장품을 제공한다.

본 발명의 화장품은 감국 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 감국 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸알콜 및 유동 파라핀 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장품은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점 (갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상 (햇볕에 탐) 등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 감국 추출물의 제조

한방에서 생약으로 쓰이고 있는 감국은 안동 국화꽃 단지에서 재배한 것을 구입하여 실험에 사용하였다. 잘 건조된 감국 1.2 ㎏을 18.4 ℓ의 메탄올에 침지시킨 후 실온에서 4-5일 동안 냉침하여 여과하였고, 용매는 40℃ 이하에서 감압 건조하여 메탄올 엑스를 제조하였다. 상기와 같은 과정을 3회 반복 실시하여 총 메탄올 엑스 441.1 g를 추출하였다. 메탄올 엑스 436 g을 2,500 ㎖의 물에 현탁시키고, 2,000 ㎖의 디클로로메탄 (CH₂Cl₂, 2,000 ㎖ × 3), 에틸 아세테이트 (EtOAc, 2,000 ㎖ × 3) 및 부탄올 (BuOH, 2,000 ㎖ × 3)을 이용하여 용매 극성에 따라 순차적으로 각각 3회씩 반복 추출함으로써 각각의 분획을 나누었다.

<실시예 2> 감국의 에틸 아세테이트 분획으로부터 항산화 활성 물질의 분리

감국의 에틸 아세테이트 분획의 활성이 가장 강하였으므로 에틸 아세테이트 분획 14.47 g을 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스를 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 얻어진 분획들을 순상 실리카겔 TLC (전개용매: 디클클로메탄-메탄올-물=60:20:1)에 전개시킨 후 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 9개의 소분획으로 나누었고, 각각 940EA부터 940EI로 명명하였다. 소분획 940EE (8.4 g)는 세파덱스를 이용하여 에탄올을 전개용매로 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 11개의 소분획 (940EE1-940EE11)으로 나누었다. 소분획 940EE10 (600.7 ㎎)을 역상 실리카젤 (LiChroprep RP-18)을 이용하여 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 사용한 용매는 40% 메탄올로부터 메탄올양을 점차 증가 시켜 50% 메탄올을 사용하였으며, 다시 9개의 소분획 (940EE10a-940EE10i)으로 나누었다. 소분획 940EE10c (422.2 ㎎)를 세파덱스를 이용하여 에탄올을 전개용매로 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 3개의 소분획으로 나눈 후 두 번째 분획을 메탄올에서 재결정하여 화합물 4 (110.1 ㎎)를 얻었으며, 여액을 분취용 역상 실리카젤 (40% 메탄올)을 이용하여 화합물 1 (162.8 ㎎)과 화합물 2 (63.8 ㎎)를 순수하게 얻었다. 소분획 940EE7 3.92 g을 세파덱스를 이용하여 에탄올을 전개용매로 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획 (940EE7a-940EE7h)으로 나누었다. 첫 번째 분획 940EE7a 36.5 ㎎을 분취용 역상 TLC (45% 메탄올)를 이용하여 2.5 ㎎의 화합물 8을 분리하였다. 소분획 940EE7e 1642.4 ㎎을 역상 실리카젤을 이용하여 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 사용한 용매는 34% 메탄올로부터 메탄올의 양을 점차 증가 시켜 70% 메탄올을 사용 하였으며, 역상 TLC (전개용매: 메탄올-물=50:50)에서 유사한 화합물을 한데 모아 12개의 소분획 (940EE7e1-940EE7e12)으로 나누었다. 첫 번째 분획인 940EE7e1 26.3 ㎎을 분취용 역상 TLC (40% 메탄올)를 이용하여 10.8 ㎎의 화합물 11을 분리하였다. 세 번째 분획인 940EE7e3 968.5 ㎎을 세파덱스를 이용한 칼럼크로마토그래피 (70% 에탄올)를 실시하여 화합물 3 (445 ㎎)을 얻을 수 있었다.

소분획 940EE7e11 28.1 ㎎을 에탄올을 전개용매로 하여 세파덱스를 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시한 결과 화합물 7 (22.6 ㎎)을 얻을 수 있었다. 또한, 마지막 분획인 940EE7e12 (7.1 ㎎)로부터는 화합물 9 (2.5 ㎎)를 얻을 수 있었다. 소분획 940EE7e10 143.3 ㎎을 에탄올을 전개용매로 하여 세파덱스를 이용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 4개의 소분획 (940EE7e11a-940EE7e11d)으로 나누었으며, 세 번째 분획인 940EE7e11c 127.4 ㎎을 도요펄 (Toyopearl HW-40)을 이용한 칼럼을 실시하였다. 전개용매는 메탄올을 이용하였으며, 4개의 분획중 처음으로 용출된 분획에서 순수한 화합물 6 (126.2 ㎎)을 얻을 수 있었다.

소분획인 940EE7e7과 940EE7e8 156.8 ㎎을 메탄올에서 재결정하여 생긴 화합물 10 (25.0 ㎎)과 그 여액을 도요펄을 이용한 칼럼 (전개용매: 메탄올)을 실시하여 순수한 화합물 5 (12.0 ㎎)를 얻을 수 있었다.

<실시예 3> 신규 화합물 1의 구조결정

신규 화합물 1에 대하여, 메탄올 용액에서 선광도 [α]^D를 측정하였고, 300 MHz (¹H)와 75 MHz (¹³C)의 NMR 스펙트럼을 측정하였으며, 각 피크의 화학 시프트 (chemical shift)는 내부 표준물질인 트리메틸실란에 대한 상대값으로 나타내었다.

본 발명의 화합물 1의 화학적 특성은 다음과 같다.

White amorphous powder;

[α]²¹ _D -166.0° (c 0.27, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 515 [M-1]-;

상기 화합물은 흰색의 무정형 분말로, TLC 플레이트에서 황산 발색시 처음엔 노란색을 띠다가 시간이 지나면서 붉은색을 띠게 되었다. 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 -166.0°로 나타나고, 분자량은 FABMS에서 516임을 알았다. ¹H NMR에서 이중결합에서 기인하는 피크가 δ 6.31 (d, J=15.8 Hz)과 7.59 (d, J=15.8 Hz)에서 나타나고, 다른 이중결합에서 기인하는 피크가 δ 6.43 (d, J=15.8 Hz)과 7.62 (d, J=15.8 Hz)에서 나타나고 있어, 트란스 (trans)로 위치한 이중결합임을 알 수 있었다. 벤젠고리의 6'에서 기인하는 피크가 각각 δ 6.96과 6.97 (J=8.2, 2.0 Hz)에서 나타나고 있는데, 이 피크들은 δ 7.06과 7.08 (J=2.0 Hz)에서의 2'번 피크들과 서로 메타 커플링 (meta coupling)을 하고, 또 5'번에서 기인하는 피크인 δ 6.78 (J=8.2 Hz)에서의 피크와 각각 오르소 커플링 (ortho coupling)을 하고 있음을 알 수 있었다. 이로부터 이 화합물에는 두 개의 벤젠 고리가 ABX 체계로 치환하고 있는 카페오일기가 두 개 있음을 알 수 있었다.

한편, δ 5.55에서의 다중피크 (multiplet)와 δ 5.39에서의 다중피크 (multiplet)는 각각 1개의 수소에 해당하는 피크로, 이들의 피크 페턴은 퀴닉산의 3번과 5번에 해당하는 피크임을 알 수 있었다. 퀴닉산의 3번 수소는 4번 수소와 diaxial coupling을 하고 2번의 수소와는 diaxial coupling과 axial-equatorial coupling을 하기 때문에 피크 모양이 5번 수소와는 다르게 broad한 multiple임을 알 수 있었다. 퀴닉산의 5번 수소는 3번 수소와는 달리 4번과 6번 수소와 axial-equatorial coupling을 하고 6번의 다른 수소와 equatorial-equatorial coupling으로 비교적 sharp한 다중피크로 나타나고 있다. δ 3.91에서는 하나의 수소에 해당하는 피크가 doublet of doublet (J=9.86, 3.43 Hz)으로 나타나 이 수소가 퀴닉산의 4번에 해당하는 피크임을 알 수 있었다. 따라서 이 화합물은 두개의 카페오일기가 3번과 5번에 치환하고 있는 형태임을 알 수 있었다. 그러나 3,5-디카페오일은 문헌에 발표된 데이터와 비교해 볼 때 화합물 3과 너무도 잘 일치하는 스펙트럼을 가지고 있음을 알 수 있었다 (Tolonen 등, Phytochemical Anal. 2002, 13, 316). 화합물 1은 화합물 3 (3,5-디카페오일)을 비교하여 볼 때, ¹H-NMR에서 화합물 1은 퀴닉산의 5번과 3번에서 기인한 피크가 δ 5.39와 5.55에서 서로 나뉘어져 나타나고 있는 반면에, 화합물 3 (3,5-디카페오일)은 3번과 5번 수소가 δ 5.42에서 중첩 (overlap)되어 나타나고 있음을 알 수 있었다. 또한, 3,5-디카페오일과는 물리적 성질 (용해도, 색깔, 선광도 등)이 서로 다르게 나타나고 있음을 알았다. 화합물 1은 흰색의 무정형 분말로 메탄올에 아주 소량이 용해되는 반면에 3,5-디카페오일 (화합물 3)은 연노랑색 (pale yellow)의 분말로 메탄올에 아주 잘 용해되며, 화합물의 고유성질인 선광도 또한 서로 다르게 나타남을 알 수 있었다. 한편, 퀴닉산의 구조이성질체 중에서 광학활성이 있는 구조는 퀴닉산과 에피 (epi)-퀴닉산 뿐이라는 문헌 (Crose 등, J. Org. Chem. 1970, 35, 1904)에 비추어 본 발명자 가 분리한 화합물이 에피임을 알 수 있었다. 이것은 화합물 1을 메탄올에서 측정한 선광도가 -166.0°로 나타나 화합물 3 (-154.4°)과 다른 광학 활성을 갖는 구조임을 다시 한번 입증해주고 있다.

¹³C NMR에서 퀴닉산에 의한 피크가 δ 36.6 (C-6), 39.7 (C-2), 71.5 (C-3), 72.1 (C-4), 73.5 (C-5), 75.4 (C-1), 180.4 (COOH)에서 나타나고 있어 3,5-디카페오일퀴닉산에 의한 피크와 차이가 있음을 알 수 있었다. HMQC에서 δ 36.6에서의 6번 탄소는 δ 2.04과 2.28에서의 두 개의 수소들과 상관관계 (cross peak)가 나타나고, 2번 탄소에서 기인하는 δ 39.7에서의 피크는 δ 2.11의 수소와 상관관계에 있음을 알 수 있었다. 또한 δ 3.91에서의 4번 수소는 δ 72.1 의 탄소와 상관관계에 있고, 3번과 5번 수소는 각각 δ 71.5과 73.5의 탄소와 상관관계가 나타나 quinic acid의 정확한 위치를 파악할 수 있었다. HMBC로부터는 δ 5.55와 5.39에서의 3번과 5번 수소가 카페오일기에서 기인하는 δ 168.1과 168.5의 카보닐피크와 상관관계가 나타나고 있어 퀴닉산의 3번과 5번에 카페오일기가 치환되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 이 화합물은 3,5-디카페오일-에피-퀴닉산 (3,5-O-dicaffeoy-epi-quinic acid)으로 규명하였으며, 자연계에서 처음으로 분리된 화합물임을 알았다 (Carnat 등, Fitoterapia 2000, 71, 587; Maruta 등, J. Agric. Food. Chem 1995, 43, 2592; Scholz-Bottcher 등, Liebigs Ann. Chem. 1991, 1029).

<실시예 4> 신규 화합물 2의 구조결정

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 신규 화합물 2의 구조를 분석하였다.

본 발명의 화합물 2의 화학적 특성은 다음과 같다.

Pale yellow amorphous powder;

[α]²¹ _D +183.7° (c 1.94, MeOH);

FABMS (negative-ion mode) m/z 515 [M-1]^-;

HRFABMS (negative-ion mode) m/z obsd. 515.1179 (calcd. for 515.1190, C₂₅H₂₃O₁₂);

상기 화합물은 미황색의 무정형의 분말로, TLC 판에서 황산 발색시 처음엔 노란색을 띠다가 시간이 지나면서 붉은색을 띠게 되어 디카페오일 유도체임을 알 수 있었다. 메탄올 용액에서 측정한 선광도 [α]²¹ _D는 +183.7°로 나타나고 있으며, 분자량은 FABMS에서 516임을 알았다. 이 화합물은 ¹H NMR에서 이중결합에서 기인하는 피크가 δ 6.31 (d, J=15.9 Hz)과 7.59 (d, J=15.8 Hz)에서 나타나고, 다른 이중결합에서 기인하는 피크가 δ 6.28 (d, J=15.9 Hz)과 7.58 (d, J=15.9 Hz)에서 나타나고 있어, 트란스 (trans)로 위치한 이중결합임을 알 수 있었다. δ 6.92 (dd, 2H, J=8.2, 1.6 Hz), 7.07 (br s, 2H), 6.79 (d, 2H, J=8.2 Hz)에서의 피크들은 두개의 벤젠고리가 ABX 체계로 치환하고 있음을 알 수 있었다. 이로부터 이 화합물에는 두 개의 카페오일기가 있음을 알 수 있었다. 퀴닉산의 4번에서 기인하는 피크가 δ 3.80에서 doublet of doublet으로 나타나고 있으며, 3번에서 기인하는 피크가 δ 5.41에서 multiplet으로 나타나고, δ 4.31에서는 5번에서 기인하는 피크가 multiplet으로 나타나고 있다. 따라서 이 화합물은 1,5-디카페오일퀴닉산 (화합물 4)과 유사한 구조를 하고 있음을 알았다. 그러나 1,5-디카페오일퀴닉산은 문헌과 비교하여 볼 때 ¹H-NMR에서 화합물 4와 일치하는 스펙트럼을 보여주고 있어 (Tolonen 등, Phytochemical Anal. 2002, 13, 316), 화합물 2는 1,5-디카페오일퀴닉산과 다른 epi 구조임을 알 수 있었다. 화합물 2는 퀴닉산의 3번과 5번, 4번에서 기인하는 피크의 chemical shit와 피크모양이 1,5-디카페오일퀴닉산과 흡사하지만, 퀴닉산의 6번에서 기인하는 CH₂ 피크가 δ 2.46에서 다중피크 (multiplet)로 나타나 두개의 수소가 분리되어 나타나는 1,5-디카페오일퀴닉산과는 다른 피크모양을 나타내고 있다. ¹³C NMR에서도 퀴닉산에서 기인하는 피크가 δ 34.7 (C-6), 35.9 (C-2), 68.5 (C-5), 70.6 (C-3), 71.9 (C-4), 80.0 (C-1), 173.9 (COOH)에서 나타나고 있는데, 이들은 1,5-디카페오일퀴닉산의 경우보다 2-3 ppm정도 고자장으로 이동하고 있음을 알 수 있다. 특히 퀴닉산의 1번 (Δ 2.8 ppm), 4번 (Δ 1.8 ppm), 6번 (Δ 3.0 ppm), 7번 (Δ 3.1 ppm)탄소가 1,5-디카페오일퀴닉산의 경우보다 고자장에서 나타나고 있음을 알 수 있었다. 상기의 결과를 종합하여, 이 화합물 역시 광학 활성을 나타내고 있으므로 1,3-디카페오일-에피-퀴닉산 (1,3-O-dicaffeoy-epi-quinic acid)으로 규명하였으며, 자연계에서 처음으로 분리된 화합물임을 알았다 (Carnat 등, Fitoterapia 2000, 71, 587; Maruta 등, J. Agric. Food. Chem 1995, 43, 2592; Scholz-Bottcher 등, Liebigs Ann. Chem. 1991, 1029; Crose 등, J. Org. Chem. 1970, 35, 1904).

<실시예 5> 감국 추출물 및 분리된 화합물들의 자유라디칼 소거 효과

1) 실험 방법

자유라디칼 소거 (free radical scavenging) 작용은 100 μM 1,1-디페닐-2-피크릴 히드라질 (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl; DPPH) 에탄올 용액 190 ㎕에 실시예 1에서 분획한 감국 추출물 및 실시예 3에서 분리한 각 화합물들에 에탄올 용액 10 ㎕를 가해 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 515 ㎚에서 흡광도를 측정하여 자유라디칼 소거효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다(Blois 등, Nature, 1958, 181, 1199). IC₅₀은 자유라디칼 소거 효과를 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

실시예 1에서 분획한 감국 추출물 및 실시예 2에서 분리한 각 화합물들과 기존 소거제 [아스코르빈산 (비타민 C), α-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤 (resveratrol)]와의 자유라디칼 소거효과를 비교하여 결과를 표 4에 제시하였다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다.

그 결과, 표 4에서 알 수 있는 바와 같이 감국의 에틸 아세테이트 분획과 부탄올 분획에서 높은 활성을 보여주고 있으므로, 높은 활성을 나타내고 있는 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물은 대부분 자유라디칼 소거 활성을 나타내고 있음을 확인하였다.

시험물질	자유라디칼 소거효과 (IC₅₀)
메탄올 추출물	>50
디클로로메탄 분획	>50
에틸 아세테이트 분획	9.89 ±0.46
부탄올 분획	1.59 ±0.66
물 분획	>50
화합물 1	5.64 ±0.11
화합물 2	5.76 ±0.15
화합물 3	5.7 ±0.06
화합물 4	5.88 ±0.13
화합물 5	5.89 ±0.21
화합물 6	5.53 ±0.11
화합물 7	5.36 ±0.13
화합물 8	12.81 ±0.60
화합물 9	6.28 ±0.31
화합물 10	6.19 ±0.22
화합물 11	10.27 ±0.55
아스코르빈산 (비타민 C)	5.53 ±0.13
α-토코페롤 (비타민 E)	9.42 ±0.26
레스베라트롤 (resveratrol)	17.05 ±1.08

실시예 1에서 분획한 감국 추출물 및 실시예 2에서 분리한 각 화합물들의 자유라디칼 소거효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과, 감국의 에틸 아세테이트 추출물의 자유라디칼 소거효과는 항산화제로 잘 알려진 아스코르빈산 (비타민 C)과 α-토코페롤 (비타민 E)의 자유라디칼 소거효과와 유사한 효과를 나타나고 있으며, 부탄올 분획의 자유라디칼 소거효과는 레스베라트롤과는 유사한 소거효과를 나타내었다. 또한, 에틸 아세테이트 분획과 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분은 항산화제로 알려진 아스코르빈산 (비타민 C)과 α-토코페롤 (비타민 E)보다 우수하거나 유사한 효과를 보이고 있어 이들 화합물들이 항산화활성을 갖는 화합물임을 알 수 있었다.

<실시예 6> 감국 추출물 및 분리된 화합물들의 잔틴/잔틴 옥시다제 유도 슈퍼옥사 이드 음이온 (superoxide anion, O _2' ^- )의 소거 효과

1) 실험 방법

잔틴 (Xanthine)과 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase, XOD)의 반응으로 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide anion) 생성을 억제시키는 효능을 평가하기 위하여 토다 등 (Toda 등, Planta, Med., 1991, 57, 8)의 방법을 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로, 0.1 mM 잔틴, 0.1 mM EDTA, 50 ㎍/㎖ 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA), 25 mM 니트로블루 테트라졸린 (Nitroblue tetrazolium, NBT)과 40 mM Na₂CO₃용액, 각 농도별로 희석한 시험 화합물 용액, 그리고 1.4×10^-3 단위 XOD를 포함하는 최종부피가 200 ㎕인 용액을 혼합하여 25℃에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응용액에 6 mM CuCl₂ 6.6 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 생성된 포르마잔 (formazan)을 560 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 소거효과를 비교한 결과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide radical, O_2' ^-) 소거 효과를 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

실시예 1에서 분획한 감국 추출물과 실시예 2에서 분리한 각 화합물들의 잔 틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide radical, O_2' ^-) 소거효과를 기존 소거제 [아스코르빈산 (비타민 C), α-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤 (resveratrol)]들과 비교한 결과를 표 5에 나타내었다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다.

시험물질	잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide radical, O_2' ^-) 소거효과 (IC₅₀)
메탄올 추출물	>50
디클로로메탄 분획	>50
에틸 아세테이트 분획	3.56 ±0.38
부탄올 분획	9.12 ±0.51
물 분획	>50
화합물 1	2.90 ±0.14
화합물 2	2.60 ±0.45
화합물 3	3.82 ±0.36
화합물 4	4.77 ±0.32
화합물 5	3.29 ±0.42
화합물 6	2.53 ±0.44
화합물 7	3.04 ±0.20
화합물 8	3.09 ±0.61
화합물 9	4.14 ±0.7
화합물 10	7.71 ±0.73
화합물 11	3.89 ±0.11
아스코르빈산 (비타민 C)	>50
α-토코페롤 (비타민 E)	>50
레스베라트롤 (resveratrol)	>50

감국 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획의 잔틴/잔틴옥시다제 유도 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide radical, O_2' ^-) 소거효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과, 감국의 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획 그리고 부탄 올 분획이 매우 높은 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었으며, 에틸 아세테이트분획은 특별히 높은 활성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분에서 높은 항산화 활성을 나타냄으로써 이들이 항산화 효과의 주성분임을 알 수 있다. 그러나, 종래에 항산제로 알려진 화합물 대부분은 효과가 없음을 알 수 있었다.

<실시예 7> 감국 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과

1) 실험 방법

지질과산화물은 여러 산화반응에 의해 지질이 과산화되어 생성되는 물질로, 각종 반응성이 큰 활성산소와 자유 라디칼 (free radical) 등이 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 인지질을 산화시켜 세포막에 지질과산화물이 생성된다. 세포막에 지질과산화물이 축적되면 세포막의 유동성과 기능성이 저하되어 세포기능이 저해되고 세포구조가 변화되는 등 조직상에 국소적인 장애가 생긴다. 따라서 감국 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제 효과를 다음과 같이 측정하였다.

에이에이피에이치 (AAPH) [2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드, 2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride]에 의한 리놀렌산 (linoleic acid)의 산화작용을 억제시키는 효능을 평가하기 위해 손 등 (Son 등, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 468-472)의 페릭 티오시아네이트 방법 (Ferric thiocyanate assay)을 수정하여 실시하였다. 구체적으로 3 ㎎/㎖ 리놀렌산, 15 ㎎/㎖ Tween-20, 0.2 M 나트륨 포스페이트 완충용액 (pH 7.0), 1.7 mM AAPH를 혼합하여 만든 용액에 에탄올에 희석한 시료용액을 최종부피가 300 ㎕ 되도록 혼합하여 37℃에서 150분간 반응시켰다 (반응 용액 중 각 시료의 최종농도는 3.125 ㎍/㎖이다). 상기 반응용액 0.1 ㎖와 30% 암모늄 티오시아네이트 (ammonium thiocyanate) 0.1 ㎖, 2×10^-2M 염화제이철 (FeCl₂) 0.1 ㎖를 혼합하여 3분후에 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 500 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 감국 추출물 및 분리된 화합물들의 지질과산화물 생성 억제율 (A, %)을 다음과 같은 공식으로 구하고 그 결과는 표 6에 나타내었으며, 제시되는 값은 3회 평균값이다.

A (%) = 시험물질 시료의 반응흡광도/대조군의 반응흡광도 ×100

시험물질	지질과산화물 생성 억제율 (%)
메탄올 추출물	10.9
디클로로메탄 분획	19.7
에틸 아세테이트 분획	49.9
부탄올 분획	46.0
물 분획	14.0
화합물 1	51.5
화합물 2	50.3
화합물 3	51.2
화합물 4	49.9
화합물 5	51.7
화합물 6	53.8
화합물 7	53.7
화합물 8	47.4
화합물 9	52.2
화합물 10	48.3
화합물 11	47.8
아스코르빈산 (비타민 C)	44.1
α-토코페롤 (비타민 E)	61.2
레스베라트롤 (resveratrol)	39.1
트롤록스 (trolox)	61.6

실시예 1에서 분획한 감국 추출물과 실시예 2에서 분리한 각 화합물들의 지질과산화물 생성 억제율을 기존의 소거제 [아스코르빈산 (비타민 C), α-토코페롤 (비타민 E), 레스베라트롤 (resveratrol), 트롤록스 (trolox)]들과 비교하였다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 감국 메탄올 추출물과 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획과 부탄올 분획이 매우 높은 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 또한, 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물 대부분에서 높은 활성을 보여주고 있는데 이는 항산제로 잘 알려진 여러 화합물보다 우수한 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다. 따라서 감국 추출물 및 분리된 화합물들은 대조물질과 비교할 만한 지질과산화 저해활성을 나타내었다.

<실시예 8> 효소활성 측정 및 활성억제제 검색

인테그라제의 활성을 측정하기 위해서, 바이러스 DNA의 끝 부분 염기배열과 같은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 인테그라제의 엔도뉴클레오타이드 절단활성 (endonucleolytic cleavage activity)을 측정하여 결정하였다. 측정에 사용한 서열번호 1로 기재되는 올리고뉴클레오타이드 A의 3' 말단을 다음과 같이 표식하였다. 5 ㎕ (100 ng)의 올리고뉴클레오타이드 A를 10 X 키나제 완충액 (0.5 M TrisHCl, pH 8.0, 0.1 M MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM EDTA) 4 ㎕, ³²P-ATP (5 mCi/㎖) 30 ㎕ 와 T4 DNA 폴리뉴클레오타이드 키나제 (10 unit/㎕) 1 ㎕ 에 넣고 37℃ 에서 30분간 반응하고 1 ㎕의 0.5 M EDTA를 넣고 85℃ 에서 15분간 가열하였다. 올리고뉴클레오타이드 A와 상보적인 서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오타이드 B 10 ㎕ (200 ng)을 넣고 끓는 물 속에 담근 후, 하룻밤 동안 천천히 식혔다. 반응하지 않은 ³²P-ATP는 Sephadex G25 칼럼을 이용해서 분리하여 제거하였다. 먼저 미리 충진된 칼럼에 존재하는 용액을 버리고, TEN (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) 5 ㎖로 겔을 세척하고, 상층에 반응물 (약 52 ㎕)를 마이크로피펫으로 로딩하고, 용충액을 한 분획에 2 방울씩 (약 100 ㎕) 모았다. 반응물이 완전히 흡수된 후, 200 ㎕의 TEN으로 두 번 세척하고, 4 ㎖의 TEN으로 세척하였다. 각 분획 1 ㎕를 whatman 여과지에 묶혀서 방사능 양을 측정하여 표식된 올리고뉴클레오타이드 위치를 확인하였다.

절단활성은 3 pmol의 표식된 올리고뉴클레오타이드 기질과 30 pmol의 인테그 라제를 10 ㎕의 10 mM TrisHCl, 1 mM MnCl₂에 넣고 34℃에서 90 분간 반응시켰다. 반응은 4 ㎕의 반응종료용액을 넣어 종료시키고, 2-4 ㎕의 반응물을 20% 폴리아크릴아미드 서열분석용 겔에 로딩하여 20 염기의 기질이 18염기로 전환된 것을 측정하였다. 상기 반응의 최적조건을 확인하기 위하여 반응 완충액의 조성과 2가 금속이온의 종류와 농도를 달리하여 절단분석을 반복적으로 시행하여 가장 적합한 반응조건을 확립하고, 이를 토대로 효소활성 발현의 저해제로 작용할 수 있는 화합물들의 존재하에 반응을 수행하여 그 활성의 감소를 측정하여 저해제를 탐색하였다.

<실시예 9> 감국 추출물 및 추출물로부터 분리한 화합물들의 HIV 인테그라제 저해효과

감국의 메탄올 추출물 및 메탄올 추출물로부터 분획한 추출물들의 HIV 인테그라제 저해효과와 에틸 아세테이트로부터 분리한 화합물들의 인간 면역결핍 바이러스 인테그라제에 대한 저해활성을 관찰하였다. 이들 화합물들의 인간 면역결핍 바이러스 인테그라제에 대한 저해활성은 방사선 동위원소를 화합물내에 포함하고 있는 올리고 뉴클레오타이드 기질이 면역결핍 바이러스 인테그라제에 의해 분해되는 것을 본 화합물이 얼마나 저해하는가, 즉 효소반응 후 얻어진 반응 부산물을 전기영동하여 얻어진 젤에 대한 오토라디오그라피 (autoradiography)를 실시하여 결정하였다 (Oh 등, Mol. Cells, 1996, 6, 96). 표 7은 감국의 메탄올 추출물 및 메탄올 추출물로부터 분획한 추출물들의 HIV 인테그라제 저해효율 (%)과 에틸 아세테 이트로부터 분리한 화합물들의 저해효과 결과를 IC₅₀ 값으로 표시한 것이다. IC₅₀은 억제효과를 계산하여 50% 저해효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 의미한다.

감국 추출물 및 추출물로부터 분리한 화합물들의 인간면역 결핍 바이러스 인테그레이즈에 대한 저해활성

분획	100 ㎍/㎖	25 ㎍/㎖	IC₅₀ (㎍/㎖)
메탄올 추출물	45-55%	30% 이하	>100
디클로로메탄 분획	45-55%	30% 이하	>100
에틸 아세테이트 분획	70% 이상	55-70%	14.1 ±2.8
부탄올 분획	55-70%	45-55%	48.0 ±13.3
물 분획	30-45%	-	>100
화합물 1			5.9 ±2.1
화합물 2			10 ±2.5
화합물 3			5.7 ±3.6
화합물 4			6.3 ±4.0
화합물 5			5.4 ±2.6
화합물 6			9.1 ±2.5
화합물 7			12.5 ±3.1
화합물 8			41.7 ±10.7
화합물 9			5.88 ±1.2
화합물 10			16.9 ±2.0
화합물 11			51.4 ±8.4
치커릭산 (L-chicoric acid)^a			7.4 ±3.3
커쿠민 (curcumin)			51.3 ±3.5

상기에서, ^a치커릭산 (L-chicoric acid)은 알려진 문헌에 따라서 제조하여 사용하였다 (King 등, Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, 497).

본 발명의 추출물 및 추출물로부터 분리된 화합물들의 인테그라제 저해효능을 비교하기 위하여 대조약물로 기존에 항바이러스 물질로 잘 알려진 치커릭산 (L- chicoric acid)과 커쿠민 (curcumin)을 사용하였다. 표 7에서 나타낸 바와 같이 감국의 에틸 아세테이트 또는 부탄올의 분획이 우수한 인테그라제 저해효능이 있음을 알 수 있었다. 또한, 감국의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리한 신규 화합물인 화합물 1의 항바이러스 효과는 커쿠민 (curcumin)보다 현저하게 우수한 인테그라제 저해효능을 나타내고 있으며, 치커릭산 (L-chicoric acid) 보다는 약간 우수한 효과를 나타내었다. 나머지 다른 화합물 또한 우수한 인테그라제 저해효능을 보이므로 이 화합물들이 감국의 인테그라제 저해효능을 나타내는데 유효 성분임을 알 수 있었다.

<실시예 10> 항바이러스 활성 및 세포독성 시험

본 발명의 감국 메탄올 추출물 및 메탄올 추출물로부터 분획한 추출물들의 항바이러스 활성효과를 알아보기 위하여 공지된 방법 (Tanaka 등, J. Med. Chem., 1991, 34, 349)에 따라 다음과 같이 시험관내 HIV-1 억제효과 시험을 실시하였다. 숙주세포로서 MT-4 세포를 사용하여 본 발명의 화합물이 바이러스에 감염된 MT-4 세포의 세포독성을 저해하는 정도를 조사하였다.

배양 배지에 MT-4 세포를 1×10⁴ 세포/㎖의 농도로 분산시킨 다음, 500 TCID₅₀ (세포의 50%가 감염되는 농도)/웰이 되도록 HIV-1을 접종하였다. 접종 즉시 본 발명의 추출물 및 추출물로부터 분리된 화합물의 시료가 들어있는 편편한 미세 역가판에 세포분산액을 100 ㎕씩 옮기고 약 4일내지 5일간 37℃에서 배양한 후, MTT 방법을 이용하여 항바이러스 활성을 판정하였다. 동시에, mock-감염된 숙주세포의 생존성을 MTT 방법으로 측정함으로써 세포독성도 판정하였다. 참고화합물로는 치커릭산 (L-chicoric acid)과 커쿠민 (curcumin)을 대조 약물로 사용하여 약효검색을 시행하였다. 시험결과는 표 8에 나타내었다.

감국 추출물로부터 분리한 화합물들의 HIV 세포주에서의 저해효과

화합물	EC_{50 (}㎍/㎖)^a	CC₅₀ (㎍/㎖)^b	S.I.^c
화합물 1	76.9	119.7	1.6
화합물 3	64.32	135.10	2.10
에틸 아세테이트 분획	18.3	32.3	1.8
치커릭산	54.33	>150	>2.76
커쿠민	>0.32	0.32	<1

상기에서, ^a EC₅₀ ; HIV-1의 증식을 50% 억제하는 농도,

^bCC₅₀; MT-4 세포에 대한 50% 세포손상 농도,

^c선택도; Selectivity Index (CD₅₀/ED₅₀)

감국의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리한 화합물들의 항바이러스효과를 치커릭산과 커쿠민을 대조 약물로 사용하여 약효검색을 시행한 결과, 신규 화합물이 HIV 세포주에서도 커쿠민 및 치커릭산에 비해서 좀더 우수하거나 비교할만한 효 과를 보이고 있어 이들 화합물들이 감국의 에틸 아세테이트 분획이 항HIV 효능을 나타내는데 있어서의 유효 성분임을 알 수 있었다(표 8).

이하, 본 발명의 감국 추출물 또는 화합물 1 내지 화합물 11의 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환에 대하여 설명한다.

단, 하기의 적용예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 적용예에 한정되는 것은 아니다.

<적용예 1> 암

암은 무수히 많은 원인으로 일어나지만 가장 근본적인 원인으로 활성산소에 의한 세포의 파괴 및 이의 복구 불능으로 세포의 기능 장애를 일으켜 이것이 진행됨으로써 암으로 전이한다고 밝혀져 있다(Ames, B. N., Science, 1983, 221, 1256-1264). 한편, 과일에 든 페놀산의 간암에 대한 효과(Sun J et al., J Agric Food Chem, 2002, 4;50(25), 7449-7454), 토마토에 있는 리코펜(lycopene)의 유방암에 대한 효과(Hadley CW et al., Exp Biol Med, 2002, 227(10), 869-80), 이소버바스코시드(isoverbascoside)의 위암에 대한 효과(Chen RC et al., Acta Pharmacol Sin, 2002, 23(11), 997-1001) 등 현재 알려진 여러 가지 항산화제가 다른 암에도 효과가 있다. 따라서, 항산화제는 여러 종류의 암의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 암의 치료 및 예방에 효과적으로 사용할 수 있다.

<적용예 2> 노화

정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 활성산소들은 세포 구성 성분인 지질, 단백질, 당 또는 DNA 등을 비선택, 비가역적으로 파괴함으로써 산화적 손상을 주며, 이것이 오랜 시간 축적되면 노화와 죽음에 이르게 된다(Harman, D, Free radical theory of aging, 1986, 3-49). 또한, 실험 조건을 달리해 식이를 제한하거나 운동량을 감소시키는 등 기초 대사율, 즉 산소 소비량을 감소시킴으로서 수명이 연장되는 것이 관찰되었다(Medvedev, Z. A., Biol Rev., 1990, 65, 375-398; Loe, J. et al., J. Biol. Chem., 1971, 32, 103-121; Sohal, R. S., Aging, 1982, 5, 21-24). 즉, 활성산소를 제거하는 것이 노화를 지연시킬 수 있는 방법이며 현재 활성산소를 제거하는 항산화제가 많이 개발되어 있다. 따라서, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 노화를 지연시킬 수 있다.

<적용예 3> 관상 심장 질환, 고지방혈증 및 동맥경화

관상 심장 질환 및 고지방혈증(hypercholesterolemia) 환자에 콜레스테롤 생합성 효소 저해제를 처리하면 저밀도 지방에 있는 콜레스테롤 함량을 감소시키지만, 활성산소에 의한 과산화에 대해서는 유비퀴논 Q10(ubiquinone Q10)의 생합성을 억제하여 저밀도 지단백질을 보호하는 작용을 하여 상기 질환의 치료에 효과적이지 못하므로 상기 환자들에게 항산화물질인 세리바스타틴(cerivastatin) 또는 프로부콜(probucol)을 투여하자 저밀도 지단백질의 함량이 급격히 감소하였다(Lankin VZ et al., Bull Exp Biol Med, 2002, 134(1), 39-42). 또한, 항산화제인 디하이드로피리딘 칼슘 길항제 라시디핀(lacidipine)을 동맥경화(atherosclerosis) 환자에게 투여한 임상 실험에서 혈압강하와 함께 혈관벽의 콜레스테롤 수치를 낮추어 동맥경화 병변의 크기가 감소하였다(Haller H et al., Drugs R D, 2002, 3(5), 311-23). 즉, 항산화 물질은 관상 심장 질환, 고지방혈증 및 동맥경화와 같이 콜레스테롤과 관련한 혈관계 질환의 치료 및 예방에 있어서 우수한 물질임을 알 수 있으며, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 관상 심장 질환, 고지방혈증 및 동맥경화와 같은 혈관계 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

<적용예 4> 다발성 경화증 및 자가면역성 뇌척수염

다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 자가면역성 뇌척수염(autoimmune encephalomyelitis) 질환 모델 생쥐에 항산화제의 일종인 ALA(alpha lipoic acid)를 투여한 임상 실험에서 상기의 병증도가 약해지는 현상을 관찰하였다. 즉, 산화적 스트레스는 다발성 경화증 및 자가면역성 뇌척수염에 있어서 주된 원인이며 항산화제를 이용하여 상기와 같은 신경 관련 질환을 치료할 수 있다(Marracci GH et al., J Neuroimmunol, 2002, 131(1-2), 104-14). 따라서, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 다발성 경화증 및 자가면역성 뇌척수염과 같은 신경 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

<적용예 5> 뇌졸중 및 알츠하이머 병

산화적 스트레스, 즉 활성산소는 세포의 구성성분을 산화시켜 이들의 기능 장애를 가져오며, 이들의 기능 장애로 인해 신경 세포의 기능에도 장애를 준다. 이러한 신경 세포 기능 장애로 인해 발작(stroke), 쇼크(trauma) 등을 일으키게 된다. 그러나 이러한 증상이 치료되지 않고 지속적인 산화적 스트레스가 주어지게 될 경우 심각한 뇌질환 즉, 뇌졸중, 알츠하이머 병과 같은 질환이 생기게 된다. 또한, 활성산소를 제거할 수 있는 항산화제를 이용하여 뇌졸중, 알츠하이머 병과 같은 뇌질환을 치료할 수 있다(Perry G et al., Comp Biochem Physiol C Toxicol Phaarmacol, 2002, 133(4), 507-13; Cecchi C et al., Free Radic Biol Med, 2002, 15:33(10), 1372-9; Smith MA et al., Free Radic Biol Med, 2002, 1:33(9), 1194-9). 따라서, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 뇌졸중, 알츠하이머와 같은 뇌질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

<적용예 6> 장염

장염 환자의 백혈구에는 과량의 과산화 부산물이 축적되어 있으며, 축적된 과산화 부산물에 의한 세포의 손상은 장의 감염에 있어서 일차적 또는 이차적 병리학 메커니즘의 원인이다. 즉, 산화적 스트레스는 장의 감염을 유도하여 염증성 장염을 일으키는 주된 원인이다(Kruidenier L et al., Aliment Pharmacol Ther, 2002, 16(12), 1997-2015). 따라서, 항산화 활성이 우수한 본 발명의 항산화용 약학적 조성물은 염증성 장염 등 염증과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 감국 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 활성산소에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방, 식품의 유지 및 피부의 산화에 의한 손상을 방지하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 HIV에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 증상의 완화를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Compound showing anti-oxidant and anti-viral activity and extract of Chrysanthemum indicum comprising the same <130> 3p-05-39B <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide A <400> 1 tgtggaaaat ctctagcagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide B which is complementary to oligonucleotide A <400> 2 actgctagag attttccaca 20

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염:

<화학식 1>

상기에서, R₁및 R₂는 수소 또는 카페오일기이며, R₃는 카페오일기이다.
제 1항에 있어서, R₁은 수소이고 R₂는 카페오일기인 3,5-디카페오일-에피-퀴닉산 (3,5-O-dicaffeoy-epi-quinic acid)인 것을 특징으로 하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염.
제 1항에 있어서, R₁은 카페오일기이고 R₂는 수소인 1,3-디카페오일-에피-퀴닉산 (1,3-O-dicaffeoy-epi-quinic acid)인 것을 특징으로 하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염.
1) 감국의 에틸 아세테이트 추출물을 얻는 단계; 2) 상기 추출물을 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 (Toyopearl) 및 XAD 수지로 구성된 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 칼럼 크로마토그래피를 수행하는 단계로 구성된 청구항 1항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 방법.
물 또는 유기 용매로 추출되는 감국 추출물 또는 하기 화학식 1, 화학식 3 및 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화, 암, 복합성 동맥경화, 관절염, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 혈관장애, 고지혈증, 심근경색 및 뇌경색으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포구성성분의 산화에 의해 야기되는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

<화학식 1>

상기에서, R1 및 R2는 수소 또는 카페오일기이고, R3는 카페오일기이며,

<화학식 3>

상기에서, R1은 수소 또는 글루코스이다

<화학식 4>
제 5항에 있어서, 상기 유기용매는 알콜, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
물 또는 유기 용매로 추출되는 감국 추출물 또는 하기 화학식 1, 화학식 3 및 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 식품 첨가물.

<화학식 1>

상기에서, R1 및 R2는 수소 또는 카페오일기이고, R3는 카페오일기이며,

<화학식 3>

상기에서, R1은 수소 또는 글루코스이다

<화학식 4>
물 또는 유기 용매로 추출되는 감국 추출물 또는 하기 화학식 1, 화학식 3 및 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 산화적 손상에 의한 피부의 노화를 방지를 위한 항산화용 화장품.

<화학식 1>

상기에서, R1 및 R2는 수소 또는 카페오일기이고, R3는 카페오일기이며,

<화학식 3>

상기에서, R1은 수소 또는 글루코스이다

<화학식 4>
물 또는 유기 용매로 추출되는 감국 추출물 또는 하기 화학식 1, 화학식 3 및 화학식 4로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항 HIV제.

<화학식 1>

상기에서, R1 및 R2는 수소 또는 카페오일기이고, R3는 카페오일기이며,

<화학식 3>

상기에서, R1은 수소 또는 글루코스이다

<화학식 4>
제 10항에 있어서, 상기 유기용매는 알콜, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항 HIV제.
제 11항에 있어서, 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항 HIV제.
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