KR101130640B1

KR101130640B1 - 감국 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101130640B1
Application number: KR1020100075141A
Authority: KR
Inventors: 김건희; 윤지혜
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-08-04
Filing date: 2010-08-04
Publication date: 2012-04-02
Also published as: KR20120021494A

Abstract

본 발명은 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 감국의 물 또는 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 에스트로겐 유사작용을 통해 조골세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스 상황에서도 세포내 ROS 생성과 염증매개성 사이토카인의 생성을 감소시켜 조골세포의 손상과 활성 감소를 억제하고 증식과 분화를 촉진시킬 수 있으므로 골다공증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감국 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Extract of Chrysanthemum indicum Linne}

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 조골세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스 상황에서도 조골세포의 손상과 활성 감소를 억제하여 증식과 분화를 촉진시킬 수 있는 감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골조직은 교원질, 수산화인회석 등의 무기질로 구성된 세포외기질(extra cellular matrix)과 조골세포, 파골세포, 골세포 등 여러 종류의 세포들로 구성되어 있는 매우 복잡하고 활동적인 조직으로서, 조골세포와 파골세포의 작용을 매개로 일생동안 끊임없이 형성과 흡수를 반복하며 골재형성 과정을 진행해 나간다. 이러한 골재형성 과정은 PTH(parathyroid hormone), 칼시토닌(calcitonin), 에스트로겐 등과 같은 호르몬과 IGF-I(insulin-like growth factor I) 등의 골조직에서 분비되는 다양한 성장인자, TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등과 같은 사이토카인을 통해 조골세포와 파골세포의 활성 균형을 조절하며 항상성을 유지시킨다. 그러나, 유전적, 생리적, 환경적 인자의 변화와 더불어 조골세포의 활성도가 약화되어 골형성이 감소하거나 파골세포의 활성도 강화로 골흡수가 증가되는 경우, 또는 두 가지 요소가 동시에 작용되는 경우에 골대사 질환이 발생하게 된다.

골다공증은 대표적인 골대사질환으로, 골대사에 이상을 일으키는 질환이나 약물복용 유무에 따라 원발성과 속발성으로 나눌 수 있으며, 원발성 골다공증은 다시 폐경 이후 급격한 에스트로겐 감소로 인해 골흡수가 증가되어 골량이 감소하는 제1형 폐경성 골다공증(postmenopausal osteoporosis)과 70세 이후 골흡수는 그리 심하지 않으나 골형성능이 감소하여 골량 감소를 초래하는 제2형 노인성 골다공증(senile osteoporosis)으로 분류할 수 있다.

골다공증의 치료방법으로는 현재 칼슘보충제, 비타민 D 대사산물과 티아자이드(thiazide) 이뇨제 요법, 칼시토닌 요법, 비스포스포네이트(bisphosphonate) 요법, 에스트로겐 요법 등이 이용되고 있으나, 아직까지 감소된 골량을 완전히 회복시킬 수 있는 약물이 없어 골다공증은 치료보다 예방의 중요성이 강조되고 있다. 폐경성 골다공증의 치료를 위해 투여되는 에스트로겐은 생체 내에서 성호르몬의 기능 외에도 조골세포의 에스트로겐 수용체 α(ER α) 혹은 β(ER β)와 결합한 후 핵으로 이동하여 골대사에 관여하는 국소인자 유전자의 전사활성을 조절할 뿐만 아니라, 콜라겐의 발현, 칼슘과 인 대사에 관여하는 염기성 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 활성 및 성장 인자인 IGF-I의 생성과 유전자의 발현을 증가시킴으로써 골 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다(McCarthy TL, et al., Adv. Exp. Med. Bio., 343:407-414, 1993). 또한, 조골세포를 자극하여 골의 석회화(mineralization)를 촉진하고, 파골세포의 생성을 촉진하는 RANK 리간드(RANKL)의 분비를 억제하여 새로운 파골세포의 생성을 억제하는 한편, 기 생성된 파골세포의 사멸(apoptosis)을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Stuart I Fox. pp. 652-657, Bone deposition and resorption In: Human Physiology 9th ed., McGraw Hill Inc. New York, NY, 2008). 그러나, 장기간 사용 시 오심, 체중증가, 불규칙한 자궁출혈, 자궁내막암 및 유방암과 같은 부작용을 유발하기도 하여 최근에는 그 위험성을 보완하기 위해 다른 부작용 없이 골손실을 최소화하면서 골형성을 촉진할 수 있는 한약재 및 식품 등의 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 제니스테인(genistein)이나 다이드제인(daidzein) 등의 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적 반응성이 매우 강한 물질로서, 세포구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적비가역적 파괴 작용을 함으로써 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨씨병 등의 뇌질환과 심장질환, 동맥경화, 염증 등의 각종 질병과 노화를 초래하는 것으로 알려져 있다(Beckman KB Ames BN, Physiol. Reviews, 78:547-581, 1998; Stadtman ER, Berlett BS., Drug Metabolism Reviews, 30:325-243, 1998). 특히, 과산화수소(H₂O₂)는 조골세포에서 DNA 합성의 감소와 석회화 과정에 관여하는 ALP 및 석회화된 골기질의 활성을 감소시키며, 염증성 매개물질로 작용하는 사이토카인인 TNF-α, IL-6, NO 등의 생성을 촉진하여 세포 독성을 유발하는 것으로 알려져 있다(Lee KH, Choi EM., Biol., Pharm. Bull., 28(10):1948-1953, 2005). 그러므로, 이러한 산화적 스트레스로부터 세포손상을 보호하고, 염증성 매개물질을 억제하는 것은 골다공증의 예방 및 치료 측면에서 의미가 있다.

한편, 감국(Chrysanthemum indicum Linne)은 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로, 우리나라 중부 이남의 산간지역에 널리 분포하는 야생국화이며, 예로부터 궁중에서는 국화주로, 민가에서는 고혈압 환자들이 약술로 애용해 왔다. 한의학에서는 해열, 소염, 혈압강하, 두통 완화 등을 목적으로 이용되고 있으며, 최근 여러 연구들을 통해 항균, 항암, 항염증, 면역조절, 항산화 활성 등이 알려져 있다. 그러나, 현재까지 감국과 골다공증과의 상관관계를 보여주는 문헌은 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 조골세포와 유사한 대사적 특정을 가지고 있는 마우스 두개관(calvaria) 유래의 MC3T3-E1 조골세포를 이용하여 감국 추출물이 조골세포의 증식 및 분화, H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상황에서의 증식 및 분화, ROS 생성 및 사이토카인 등에 미치는 영향을 분석함으로써, 감국 추출물이 뛰어난 골다공증 예방 또는 치료 효과를 보인다는 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 감국 추출물은 감국, 바람직하게는 건조한 상태의 감국에 2～15배량의 물 또는 유기용매를 가한 후, 70 내지 100℃에서 추출함으로써 제조할 수 있다. 상기 유기용매로는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 감국 추출물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 감국 추출물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 감국 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 골다공증 예방 또는 치료 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 추가로 첨가할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명에 따른 감국 추출물의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되며, 성인에게 10～300 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 20～100 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 감국 추출물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 5 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 감국 추출물은 조골세포의 증식을 유의적으로 증가시키고(도 1 참조), 분화지표인 ALP 활성과 콜라겐 함량 및 석회화 정도를 유의적으로 증가시켰다(도 2 내지 도 4 참조). 또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 감국 추출물은 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상황에서도 조골세포의 증식(도 5 참조)과 ALP 활성, 석회화를 유의적으로 증가시키는 효과를 보였으며(도 6 및 도 8 참조), 세포내 ROS와 TNF-α 생성에도 억제 효과를 나타내었다(도 9 및 도 10 참조). 이러한 결과는 본 발명에 따른 감국 추출물이 조골세포의 기능을 증진시킬 뿐만 아니라 산화적 스트레스 상황에서도 조골세포의 손상과 활성 감소를 억제시키는 효과가 있음을 나타낸다.

또한, 본 발명은 감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따른 감국 추출물은 골다공증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 상기 감국 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우에는 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명에 따른 감국 추출물이 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 감국 추출물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01～0.04 g, 바람직하게는 약 0.02～0.03 g이다.

상기 외에도 본 발명에 따른 감국 추출물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 본 발명에 따른 감국 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않지만 본 발명에 따른 감국 추출물 100 중량부 당 0.01～0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 감국 추출물을 함유하는 조성물은 에스트로겐 유사작용을 통해 조골세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 산화적 스트레스 상황에서도 세포내 ROS 생성과 염증매개성 사이토카인의 생성을 감소시켜 조골세포의 손상과 활성 감소를 억제하고 증식과 분화를 촉진시킬 수 있으므로 골다공증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 감국 추출물(CIE)이 MC3T3-E1 세포의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, (A)는 감국 추출물의 존재 또는 부재시 MC3T3-E1 세포의 성장 정도를 나타낸 것이고, (B)는 100 ㎍/㎖의 감국 추출물과 1 μM의 타목시펜(tamoxifen, Txf)을 단독으로 또는 조합하여 48시간 동안 처리한 후 MC3T3-E1 세포의 성장 정도를 나타낸 것이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 2× 10⁴ 세포 당 대조군의 흡광도(OD) 값은 0.357± 0.005였다. "*" 표시는 대조군과 비교하여 p<0.05 임을 나타낸다.
도 2는 감국 추출물(CIE)이 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, (A)는 감국 추출물의 존재 또는 부재시 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 것이고, (B)는 30 ㎍/㎖의 감국 추출물과 1 μM의 타목시펜(Txf)을 단독으로 또는 조합하여 48시간 동안 처리한 후 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 것이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 ALP 활성은 9.37±0.40 unit/㎎ 단백질이었다. "*" 표시는 대조군과 비교하여 p<0.05 임을 나타낸다.
도 3은 감국 추출물(CIE)이 MC3T3-E1 세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, (A)는 감국 추출물의 존재 또는 부재시 MC3T3-E1 세포의 콜라겐 합성 정도를 나타낸 것이고, (B)는 200 ㎍/㎖의 감국 추출물과 1 μM의 타목시펜(Txf)을 단독으로 또는 조합하여 48시간 동안 처리한 후 MC3T3-E1 세포의 콜라겐 합성 정도를 나타낸 것이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 콜라겐 합성은 2× 10⁴ 세포 당 6.82± 0.12 ㎍이었다. "*" 표시는 대조군과 비교하여 p<0.05 임을 나타낸다.
도 4는 감국 추출물(CIE)이 MC3T3-E1 세포의 석회화에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 석회화 정도는 2 × 10⁴ 세포 당 0.337± 0.017 OD였다. "*" 표시는 대조군과 비교하여 p<0.05 임을 나타낸다.
도 5는 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂ 처리에 의해 감소된 MC3T3-E1 세포의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 성장 정도는 2×10⁴ 세포 당 0.326± 0.003 OD였다. "#" 표시는 대조군과 H₂O₂ 처리군이 p<0.05 임을 나타내고, "*" 표시는 대조군과 감국 추출물 처리군이 p<0.05 임을 나타낸다.
도 6은 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂가 처리된 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 ALP 활성은 8.33±0.55 unit/㎎ 단백질이었다. "#" 표시는 대조군과 H₂O₂ 처리군이 p<0.05 임을 나타내고, "*" 표시는 대조군과 감국 추출물 처리군이 p<0.05 임을 나타낸다.
도 7은 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂가 처리된 MC3T3-E1 세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 콜라겐 합성은 2× 10⁴ 세포 당 3.26± 0.12 ㎍이었다. "#" 표시는 대조군과 H₂O₂ 처리군이 p<0.05 임을 나타내고, "*" 표시는 대조군과 감국 추출물 처리군이 p<0.05 임을 나타낸다.
도 8은 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂가 처리된 MC3T3-E1 세포의 석회화에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 콜라겐 합성은 2× 10⁴ 세포 당 0.355± 0.005 OD였다. "#" 표시는 대조군과 H₂O₂ 처리군이 p<0.05 임을 나타내고, "*" 표시는 대조군과 감국 추출물 처리군이 p<0.05 임을 나타낸다.
도 9는 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂ 처리에 의해 유도된 MC3T3-E1 세포의 ROS 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 20 μM의 트롤록스가 ROS 생성 저해에 대한 양성 대조군으로 사용되었다.
도 10은 감국 추출물(CIE)이 0.3 mM의 H₂O₂ 처리에 의해 유도된 MC3T3-E1 세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 데이터는 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 대조군의 TNF-α 농도는 121.98± 3.56 pg/㎎ 단백질이었다. "#" 표시는 대조군과 H₂O₂ 처리군이 p<0.05 임을 나타내고, "*" 표시는 대조군과 감국 추출물 처리군이 p<0.05 임을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감국 추출물의 제조

본 발명에 사용한 감국은 음건(陰乾)한 후 사용하였으며, 추출용 에탄올을 비롯한 실험에 사용한 시약들은 모두 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis. MO., USA)의 특급 시약을 사용하였다. 음건한 감국에 시료 무게의 10배량(w/v)의 70% 에탄올을 첨가하여 100℃ 항온수조에서 3시간 동안 환류추출하였고, 이 과정을 3회 반복하였다. 추출액을 여과지(Whatman No.1, England)로 여과하여 회전형 진공 증발기(rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Japan)로 감압농축한 후 동결건조하여 본 발명의 감국 추출물의 분말 시료를 얻었으며(수율: 25.3%, w/w), 이를 100% DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹여 여과(Whatman PVDF 0.45 μM)하여 실험에 사용하였다.

실험예 1. 감국 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향

MC3T3-E1 세포(RCB1126, osteoblast like cell line from C57BL/6 mouse calvaria)는 열로 불활성화된(heat inactivated) 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 항생제(100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin)를 함유하는 α-MEM(α-modified minimal essential midium, GibcoBRL Grand Is1and, NY, USA) 배지로 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였으며, 세포 밀도가 90% 정도 포화되면 0.02% EDTA-0.05% 트립신 용액을 사용하여 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 분화 유도를 위하여 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였으며, 2-3일 간격으로 배지를 교환해주었다.

시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 증식 정도와 자유 라디칼(H₂O₂) 투여시 세포 증식 정도는 그린 등의 방법(Green LM, et al., J. Immunol. Meth., 70:257, 1984)에 따라 MTT(3-(3,4-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석으로 측정하였다. MTT 분석은 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 포르마잔(formazan)으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 포르마잔의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.

먼저, 48-웰 플레이트에 2× 10⁴ 세포/well의 조골세포를 분주하여 2일 동안 배양한 후, 시료의 최종 농도가 3, 10, 30, 100 및 200 ㎍/㎖이 되도록 배양액에 시료를 첨가한 군과 타목시펜(1 μM) 처리 시료군, 각 농도별 시료와 0.3 mM H₂O₂를 함께 처리한 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 5 ㎎/㎖ 농도로 20 ㎕를 각 웰에 첨가하여 2시간 더 배양하고, 배지를 제거한 후, DMSO를 200 ㎕씩 첨가하여 생성된 불용성의 포르마잔 결정을 용해시켜 ELISA 판독기(Spectra MAX M2, Molecular Device, USA)로 570 ㎚ 파장에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다. 본 발명의 모든 실험 결과는 평균±표준오차(mean± SEM, n=6)로 나타내었으며, 통계분석은 SAS 프로그램(V8, SAS Institute, North Carolina, USA)을 이용한 one way ANOVA(p<0.05)를 실시하여 Duncan‘s multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이를 검증하였다.

그 결과, MC3T3-E1 조골세포는 본 발명의 감국 추출물 처리시 농도 의존적으로 세포를 증가시키는 경향을 보였으며, 특히 100 ㎍/㎖ 농도에서 122%의 세포 증식을 보여 유의적인 차이를 나타내었다(도 1의 A). 그러나, 골조직의 에스트로겐 수용체에 대한 길항제(antagonist, anti-estrogen reagent)로서 에스트로겐 반대 효과 기전을 보이는 타목시펜(Damien E, et al., J. Bone Miner. Res., 13:1275-1282, 1998; Ishibashi O, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 289:705-711, 2001) 1 μM을 122%의 세포성장을 보였던 100 ㎍/㎖ 농도의 시료와 병행 처리시에는 시료 처리에 의한 세포성장 증가 효과가 억제되는 것이 관찰되었다(도 1의 B). 이로부터, 본 발명의 감국 추출물이 MC3T3-E1 조골세포의 증식에 유효한 효과가 있다는 것을 확인하였다. 또한, 에스트로겐 길항제인 타목시펜 처리에 의해 성장 증가가 억제되는 것으로부터, 본 발명의 감국 추출물의 MC3T3-E1 조골세포에 대한 증식 유도는 에스트로겐 유사 효과에 의한 것임을 확인하였다.

실험예 2. 감국 추출물이 조골세포의 분화에 미치는 영향

<2-1> ALP 활성

ALP) 활성의 측정은 p-니트로페닐 포스페이트의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 원리를 이용하여 가수분해 산물인 p-니트로페놀의 양을 측정함으로써 ALP의 농도를 산출하는 방식이다. MC3T3-E1 세포를 2× 10⁴ 세포/well 농도로 48-웰 플레이트에 분주한 후 세포가 90% 포화되게 자라면 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유한 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하였고, 6일 후 각 농도별 시료와 타목시펜(1 μM) 처리 시료군 및 0.3 mM H₂O₂를 함께 처리한 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 DPBS로 세척하고, 0.1% Triton X-100을 첨가해 30분간 세포를 용해시킨 후, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고, ALP 키트(아산제약)를 사용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질량은 상등액 50 ㎕ 중 5 ㎕를 96-웰 플레이트에 넣은 후 BSA(bovine serum albumin) 단백질 분석 시약을 이용하여 정량하였고, p-니트로페놀에 대한 표준곡선 그래프와 500 ㎚ 파장에서 ELISA 판독기(Spectra MAX RE, Molecular Device, USA)를 이용하여 측정한 각 시료 처리군별 p-니트로페놀의 흡광도(OD)로부터 산출한 활성도를 정량한 단백질량으로 나누어 단위 단백질 함량 당 효소 활성도(unit/㎎ protein)를 산출하였다. 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, MC3T3-E1 조골세포의 ALP 활성은 본 발명의 감국 추출물 처리에 의해 10～30 ㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적인 증가 경향을 보였으며, 30 ㎍/㎖ 농도에서 최대 122%의 ALP 활성을 나타내었다(도 2의 A). 그러나, 이러한 활성 증가 효과는 시료와 에스트로겐 길항제인 타목시펜 1 μM을 병행 처리시 상쇄되는 것이 관찰되었다(도 2의 B). 이로부터, 본 발명의 감국 추출물은 조골세포의 ALP 활성을 촉진시키며, 그 촉진 효과는 에스트로겐 유사 작용에 의한 것임을 확인하였다.

<2-2> 콜라겐 함량

조골세포의 콜라겐 합성 능력은 툴버그-레이너트 등(Tullberg-Reinert et al., Histochem. Cell Biol., 112(4):271-276, 1999)의 방법에 따라 시리우스 레드(sirius red) 시약에 기반한 비색 분석법(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. MC3T3-E1 세포를 2× 10⁴ 세포/well 농도로 48-웰 플레이트에 분주한 후 세포가 90% 포화되게 자라면 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유한 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하였고, 6일 후 각 농도별 시료와 타목시펜(1 μM) 처리 시료군 및 0.3 mM H₂O₂를 함께 처리한 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 DPBS로 세척한 후 주로 동물조직 고정에 사용되는 보우인 유체(bouin's fluid, saturated picric acid : 35% formaldehyde : glacial acetic acid = 15 : 5 : 1)로 1시간 동안 고정시켰다. 이후 3차 증류수로 세척하고 건조시킨 후, 시리우스 레드 염색액(1 ㎎/㎖ saturated picric acid)으로 1시간 동안 흔들어주며 염색하였다. 0.01 N HCl로 세척한 후, 0.1 N NaOH 0.2 ㎖을 첨가하여 용해시켜 ELISA 판독기(Spectra MAX M2, Molecular Device, USA)를 사용하여 550 ㎚ 파장에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 콜라겐 함량(㎍/2× 10⁴ 세포)은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, 콜라겐 함량은 본 발명의 감국 추출물 처리시 농도 의존적인 증가 경향을 보였으며, 200 ㎍/㎖ 농도에서 125%의 함량 증가를 나타내어 유의적인 차이를 보였다(도 3의 A). 또한, 타목시펜 1 μM을 125%의 콜라겐 함량 증가를 나타내었던 200 ㎍/㎖ 농도의 시료와 병행 처리 시에는 시료 처리에 의한 콜라겐 함량 증가 효과가 상쇄되는 것이 관찰되었다(도 3의 B). 이는 조골세포의 초기 분화 지표인 ALP 활성 측정 결과에서와 마찬가지로 본 발명의 감국 추출물이 조골세포의 콜라겐 합성능을 증가시킬 수 있으며, 이러한 증가 효과는 타목시펜 처리에 의해 상쇄되는 것으로 보아 에스트로겐 유사 효과에 의한 것임을 확인하였다.

<2-3> 석회화

뼈 결절(bone nodule) 형성능은 조골세포의 분화에 대한 중요한 표식인자이다. 알리자린(alizarin)은 식물성 염료로서 칼슘에 특이적으로 흡착력이 높으며, 무기질화된 세포의 세포외 기질에 염색되므로 무기질화된 양과 염색된 정도가 상호비례한다(Maeda T, et al., Biochem. Biophy. Res. Comm., 280:874-877, 2001; Schiller PC, et al., Bone, 28:362-369, 2001). 이에, 본 발명자들은 알리자린 레드 염색을 사용하여 칼슘의 침착 정도를 측정함으로써 분화 과정의 중요한 석회화 지표를 확인하였다.

이를 위하여, MC3T3-E1 세포를 2× 10⁴ 세포/well 농도로 48-웰 플레이트에 분주한 후 세포가 90% 포화되게 자라면 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유한 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하였고, 10일 후 각 농도별 시료 처리군과 시료 및 0.3 mM H₂O₂를 함께 처리한 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. 분석을 위해 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, 70% EtOH로 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 이후 40 mM 알리자린 레드(AR) 용액으로 10분간 염색하고, 3차 증류수로 세척한 후, 10% 세틸피리디늄 클로라이드를 첨가하여 15분간 녹여 염색된 정도를 ELISA 판독기(Spectra MAX RE, Molecular Device, USA)를 이용하여 561 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 석회화 정도는 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 감국 추출물에 대해 농도 의존적으로 석회화가 증가하는 경향을 보였으며, 분화 12일째 200 ㎍/㎖ 농도에서 111% 석회화를 보이며 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내었다(도 4).

실험예 3. 산화적 스트레스시 감국 추출물이 조골세포의 기능에 미치는 영향

<3-1> 조골세포의 증식에 미치는 영향

본 발명의 감국 추출물이 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 조골세포의 증식 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 먼저 세포 밀도에 따른 H₂O₂에 대한 반응도를 알아보고자 2× 10³, 2× 10⁴, 2× 10⁵ 세포/well 농도로 세포를 분주하고 0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1 mM 농도의 H₂O₂를 처리하여 48시간 동안 배양한 후 세포의 생존 정도를 관찰하였다. 그 결과, 2× 10³ 세포/well 군은 0.1 mM H₂O₂ 농도, 2× 10⁴ 세포/well 군은 0.3 mM H₂O₂ 농도에서 50% 이하의 세포 생존능을 나타내었고, 2× 10⁵ 세포/well 군은 0.5 mM H₂O₂ 농도에서도 유의적인 감소를 보이지 않았다. 본 실험에서는 2× 10⁴ 세포/well 군을 주로 사용하였으므로, H₂O₂ 처리 농도를 0.3 mM로 결정하여 이후의 실험을 진행하였다.

그 결과, 0.3 mM의 H₂O₂를 처리함으로써 MC3T3-E1 조골세포의 성장이 유의적으로 감소하였고, 감소되었던 성장이 감국 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하여 30～100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군(-/+)에 비해 유의적 차이를 나타내었으며, 특히 100 ㎍/㎖ 농도에서는 H₂O₂를 처리하지 않은 세포군(-/-) 대비 최대 98% 수준으로 회복되었다(도 5). 상기 결과로부터, 0.3 mM H₂O₂ 처리 후 MC3T3-E1 조골세포의 증식이 유의적으로 감소하였고, MC3T3-E1 조골세포의 증식 감소 측면에서 산화적 스트레스가 골다공증의 원인이 된다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 감국 추출물이 30～100 ㎍/㎖ 농도에서 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상황의 조골세포 증식을 유의적으로 증가시킨 것으로부터, 감국 추출물이 항산화 기능을 통한 세포손상 방어 효과를 나타낸 것임을 확인하였다.

<3-2> 조골세포의 분화에 미치는 영향

<3-2-1> ALP 활성

상기 실시예 <2-1>에 개시된 방법을 이용하여 본 발명의 감국 추출물이 0.3 mM의 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 측정하였다.

그 결과, MC3T3-E1 조골세포의 ALP 활성이 0.3 mM H₂O₂ 처리에 의해 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 그러나, 감소된 ALP 활성은 본 발명의 감국 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군(-/+) 대비 153%의 ALP 활성 수준을 나타냄으로써 유의적 차이를 보였다(도 6).

<3-2-2> 콜라겐 합성

상기 실시예 <2-2>에 개시된 방법을 이용하여 본 발명의 감국 추출물이 0.3 mM의 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 조골세포의 콜라겐 합성능에 미치는 영향을 측정하였다.

그 결과, 배양액만 처리한 세포(-/-)에 비해 0.3 mM H₂O₂를 처리한 세포의 콜라겐 함량이 유의적으로 감소하였으며, 본 발명의 감국 추출물 처리에 의한 콜라겐 함량은 유의적 차이를 보이지 않았다(도 7).

<3-2-3> 석회화

상기 실시예 <2-3>에 개시된 방법을 이용하여 본 발명의 감국 추출물이 0.3 mM의 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서의 조골세포의 석회화에 미치는 영향을 측정하였다.

그 결과, H₂O₂ 처리시 배양액만 처리한 세포(-/-)에 비해 석회화가 유의적으로 감소하였고, 본 발명의 감국 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 석회화의 증가 경향을 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖ 농도에서 배양액만 처리한 세포군(-/-) 수준을 회복하며 대조군(-/+)과 유의적인 차이를 보였다(도 8).

<3-3> 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향

본 발명의 감국 추출물이 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 조골세포 내의 ROS 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 세포내 H₂O₂의 생성은 2’,7’-DCF-DA(dichlorofluorescein diacetate)가 에스테라제(esterase) 또는 산화적 가수분해에 의해 비형광성인 DCFH로 탈아세틸화되고, DCFH는 활성산소종에 의해 산화되어 강한 형광물질인 2’,7’-DCF(dichlorofluorescein)로 전환되는 원리를 이용한 DCF-DA 분석으로 ROS 생성수준을 측정하였다(Kooy NW, et al., Free. Radic. Res. Commun, 16:149-156, 1994).

이를 위하여, MC3T3-E1 세포를 배양접시에 분주하여 배양하였고, 80～90% 포화되게 자라면 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 후 0.02% EDTA 0.05% 트립신 용액을 사용하여 수확하였다. 수확된 세포는 원심분리하여 상층액을 제거하고, HBSS (Hank‘s balanced saline solution)를 넣어 세포를 부유시킨 후 최종 농도가 5 μM이 되도록 DCF-DA를 첨가하였고, 형광발광을 막기 위해 튜브를 호일로 감싸고 37℃ 항온수조에서 2시간 동안 진탕배양시켰다. 이후 원심분리하여 HBSS를 제거하고, DPBS를 첨가하여 2회 세척한 후, DPBS를 다시 첨가하여 DCF-DA로 표지된 세포액을 마련하였다. 세포에 농도별로 본 발명의 감국 추출물을 처리한 후 0.3 mM H₂O₂ 투여하였고, 형광 분광기(F-4500 FL Spectrophotometer, Hitachi)를 이용하여 여기(excitation) 485 ㎚, 발광(emission) 530 ㎚ 파장에서 1,800초까지의 형광 강도의 변화를 측정하였다.

그 결과, 0.3 mM H₂O₂ 투여 후의 조골세포 내의 ROS 생성 수준은 1,800초에서 DCF-DA 형광 강도가 99.5 정도로 증가하였으나 본 발명의 감국 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며, 감국 추출물 최저 처리 농도인 3 ㎍/㎖ 농도에서 대조군의 1/4 수준인 37.9를 나타내었다. 또한, 30 ㎍/㎖ 농도(26.4)에서는 항산화제인 트롤록스(trolox) 20 μM 투여(27.4) 시의 ROS 생성 정도와 비슷한 수준을 나타내었다(도 9).

<3-4> TNF -α 생성 저해에 미치는 영향

본 발명의 감국 추출물이 H₂O₂로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 조골세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 이를 위하여, MC3T3-E1 세포를 2× 10⁴ 세포/well 농도로 48-웰 플레이트에 분주한 후, 세포가 90% 포화되게 자라면 10 mM β-글리세로포스페이트와 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유한 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 분화를 유도하였고, 6일 후 0.3 mM H₂O₂와 각 농도별 시료를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰에서 TNF-α를 함유한 배지를 취하여 효소 면역 분석 시스템(enzyme immunoassay system, R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 TNF-α의 함량을 측정하였다.

그 결과, H₂O₂ 투여시 염증성 매개 사이토카인인 TNF-α는 배양액만 처리한 세포군(-/-)에 비해 유의적으로 증가하였고, 본 발명의 감국 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군(-/+) 대비 89%의 TNF-α 농도를 나타냄으로써 유의적 차이를 보였다(도 10).

제조예 1: 감국 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 제조

<1-1> 시럽제의 제조

본 발명에 따른 감국 추출물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 제조한 감국 추출물 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.

감국 추출물 ???????????????????????? 2 g

사카린?????????????????????????? 0.8 g

당 ??????????????????????????? 25.4 g

글리세린????????????????????????? 8.0 g

향미료 ????????????????????????? 0.04 g

에탄올?????????????????????????? 4.0 g

소르브산????????????????????????? 0.4 g

증류수?????????????????????????? 정량

<1-2> 정제의 제조

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

감국 추출물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성 성분은 다음과 같다.

감국 추출물 ??????????????????????? 250 g

락토오스???????????????????????? 175.9 g

감자전분????????????????????????? 180 g

콜로이드성 규산?????????????????????? 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분????????????????????????? 160 g

활석 ??????????????????????????? 50 g

스테아르산 마그네슘 ???????????????????? 5 g

<1-3> 주사액제의 제조

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

감국 추출물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성 성분은 다음과 같다.

감국 추출물 ???????????????????????? 1 g

염화나트륨???????????????????????? 0.6 g

아스코르브산??????????????????????? 0.1 g

증류수 ?????????????????????????? 정량

제조예 2: 감국 추출물을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

본 발명에 따른 감국 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 감국 추출물 20～95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

본 발명의 감국 추출물 0.2～1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 감국 추출물 0.5～5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 감국 추출물 0.1～5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 감국 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품의 제조

본 발명의 감국 추출물 5～10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 감국 추출물을 진공 농축기에서 감압?농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 감국 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

감국 추출물의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5～10%, 구연산 0.05～0.3%, 카라멜 0.005～0.02%, 비타민 C 0.1～1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79～94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85～98℃에서 20～180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5～0.82%를 주입하여 본 발명의 감국 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 감국 추출물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

본 발명의 감국 추출물 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

본 발명의 감국 추출물 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

없음

Claims

감국 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 감국 추출물은 감국의 유기용매 추출물 또는 수추출물인 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 감국 추출물은 감국에 2～15배량의 물 또는 유기용매를 가한 후 70 내지 100℃에서 추출하여 제조되는 조성물.
청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올인 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 알코올은 에탄올인 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 건강식품의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.