KR20060107562A - 세라미다아제 저해제 - Google Patents

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KR20060107562A
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무츠미 사노
히로유키 이즈
미츠오 이마무라
모토코 오카모토
도요히사 구리타
이쿠노신 가토
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 세라미다아제 활성, 그 중에서도 중성/알칼리성 세라미다아제 활성을 저해하는, 은행 나무과 식물, 참외과 식물, 귤과 식물, 다시마과 식물, 도금양과 식물 및 국화과 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 식물 유래의 처리물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성 저해제, 및 이 저해제를 함유하여 이루어지는 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품을 제공한다.

Description

세라미다아제 저해제{CERAMIDASE INHIBITOR}
본 발명은 식물 유래의 처리물, 예를 들어 추출물을 함유하는 세라미다아제 활성 저해제, 당해 저해제를 함유하는 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품에 관한 것이다.
스핑고 지질 (스핑고 당지질, 스핑고미엘린 및 그들의 대사 산물 세라미드 등) 은 세포의 증식, 분화, 아포토시스 등을 제어하는 정보 분자로서 최근 급속히 주목을 받기 시작했다. 암, 자기 면역 질환, 감염증 등의 질환에 있어서 스핑고 지질 대사는 크게 변화되기 때문에, 창약 (創藥) 의 타겟으로서 강한 관심이 모아지고 있다. 그 중에서도 세라미드는 스핑고 지질의 기본 골격이 되는 지질로 세포의 생과 사를 조절하는 중요한 인자라고 생각되어 왔다. 현재 적어도 3개의 세라미드의 생성 경로가 알려져 있다. 즉, 1) 세린과 팔미토일 CoA 의 축합 반응으로부터 시작되는 de novo 의 합성 경로, 2) 스핑고미엘린의 분해계, 3) 글루코실세라미드의 분해계의 3 경로이다. 이 중에서 스핑고미엘린의 분해계는 세포사를 유도하는 TNF-α, Fas 등의 사이토카인이나 혈청 고갈, 자외선, 방사선 조사, 산화 스트레스에 의해 활성화된다. 이 밖에 비타민 D3, 인터페론 γ, 인터류킨 1β 등의 분화 인자에 의해서도 스핑고미엘린의 분해를 통한 세라미드 생성이 항진된다. 또한, 세포외로부터 세라미드아날로그인 C2-세라미드 (D-erythro-N-acetylsphingosine) 를 첨가함으로써 아포토시스, 분화 유도, 증식 억제 등의 현상이 유도되는 것, 또는 박테리아의 스핑고미엘리나아제로 세포를 처리함으로써도 스핑고미엘린의 분해에 의해 세라미드가 축적하고, C2-세라미드를 첨가한 것과 마찬가지로 세포의 증식 억제, 아포토시스가 유도되므로, 세포내 세라미드는 중요한 세포내 시그널로서 기능하고 있다고 생각되고 있다.
세라미드는 세라미다아제의 작용에 의해 유리의 지방산과 장쇄 염기인 스핑고신으로 분해된다. 스핑고신은 1 위치의 수산기가 인산화되어 스핑고신-1-인산으로 대사된다. 스핑고신-1-인산은 세라미드와는 반대로 세포 증식 촉진 작용을 나타내고, 세라미드에 의해 유도되는 아포토시스를 억제하는 것이 알려져 있다. 이와 같이 세포의 증식, 분화, 세포사 등의 조절에 있어서 세포내의 세라미드와 그 대사 산물인 스핑고신, 스핑고신-1-인산 등의 밸런스가 매우 중요하다고 생각되고 있다. 따라서, 세포내 세라미드량을 증가시키고, 또한 스핑고신이나 스핑고신-1-인산 레벨을 감소시키는 약제는 세포의 증식, 분화, 세포사를 조절하는 약제로서 매우 유용하다.
세라미드는 L-세린과 팔미토일 CoA 로부터 de novo 합성되는데, 이 합성계의 시초 효소인 팔미토일 CoA : 세린팔미토일트랜스페라아제를 저해하는 물질로서 ISP-I (예를 들어, 비특허 문헌 1) 나 Sphingofungin B (예를 들어, 비특허 문헌 2) 가 알려져 있다. 또한, 디히드로스핑고신으로부터 디히드로세라미드로의 변환 효소인 아실 CoA : 스핑가닌 N-아실트랜스페라아제의 저해제로서 푸모니신 B1 (예를 들어, 비특허 문헌 3) 이 알려져 있다. 이들 물질은 모두 세라미드의 de novo 합성을 저해하고, 세포내 세라미드량을 감소시키는 것이 알려져 있다.
한편, 세라미드 레벨을 상승시키는 물질로는 세라미드에 글루코오스를 전이하여 글루코실세라미드를 합성하는 UDP-글루코오스 : 세라미드글루코실트랜스페라아제의 활성을 저해하는 물질로서 D-threo PDMP 가 알려져 있고 (예를 들어, 비특허 문헌 4), 이 물질은 세포내 세라미드의 증가를 야기하는 것이 알려져 있다. 그러나, 이 효소는 스핑고 당지질 생합성의 시초 효소이기 때문에, 스핑고 당지질의 합성도 억제된다.
세라미드 및 스핑고신, 스핑고신-1-인산의 밸런스를 조절하는 대사 효소로서 중성/알칼리성 세라미다아제 (예를 들어, 비특허 문헌 5, 비특허 문헌 6 및 비특허 문헌 7), 알칼리성 세라미다아제 (예를 들어, 비특허 문헌 8) 의 중요성이 주목받고 있지만, 이들 효소의 활성을 저해하는 물질은 거의 알려져 있지 않다. 유일 세라미드의 아날로그인 D-erythro-2-(N-myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol(D-e-MAPP) 가 알칼리성 세라미다아제의 활성을 저해하고, 세포내의 세라미드 레벨을 상승시키는 것이 알려져 있다 (예를 들어, 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 9 참조). 그러나, 이 물질의 중성/알칼리성 세라미다아제에 대한 저해 활성은 강하지 않아 결코 만족할 수 있는 것은 아니다. 비특허 문헌 10 에는 마찬가지로 세라미드의 아날로그인 (1R,2R)-2-N-myristoylamino-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol (D-NMAPPD 또는 B13) 가 알칼리성 세라미다아제보다도 오히려 산성 세라미다아제를 효율적으로 저해하는 것이 기재되어 있지만, 중성/알칼리성 세라미다아제에 대한 유 효한 저해 물질에 관해서는 보고되어 있지 않다. 비특허 문헌 9 에는 N-oleoylethanolamine 이 산성 세라미다아제에 대한 저해 효과를 갖는 것이 기재되어 있지만, 이 물질은 중성/알칼리성 세라미다아제에 대해서는 거의 저해 효과를 나타내지 않는다. 또한, 특허 문헌 2 에는 피부 각층 중의 세라미드의 분해를 억제하는 터메릭, 범의귀, 병풀, 해총의 추출액을 포함하는 세라미다아제 활성 저해제, 및 이들을 포함하는 피부 외용제가 개시되어 있지만, 이들 식물 추출물의 중성/알칼리성 세라미다아제에 대한 저해 효과에 관한 기재는 없고, 또한 피부 세라미드 레벨의 상승 효과는 충분하지 않아 만족할 수 있는 것은 아니었다.
한편, 세라미드는 피부에 있어서의 주요한 세포간 지질 성분이고, 피부의 보습능이나 배리어 기구에 중요한 역할을 하고 있다. 최근 그 환자수가 증가하고 있는 아토피성 피부염 환자의 피부 각층에서는 세라미드 함량이 감소하고 있고, 이것이 아토피성 피부염의 특징으로 되어 있는 건조 피부 및 각층의 배리어 기능 이상의 원인의 하나로서 생각되고 있다. 최근 아토피성 피부염 환자로부터 세라미다아제 생산균이 건강한 사람에 비해 높은 빈도로 검출되는 것이 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허 문헌 11). 또한, 아토피성 피부염 환자로부터 세라미다아제 생산균 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) AN17 주가 분리되고, 그 세라미다아제가 정제, 클로닝되어 있다 (예를 들어, 비특허 문헌 12 및 비특허 문헌 13). 따라서, 이러한 박테리아가 생성하는 세라미다아제가 아토피성 피부염 환자에 있어서의 피부의 세라미드를 분해함으로써 각층 세라미드가 감소하고, 피부의 배리어 기능이 저하되어 질환이 악화된다는 가능성이 생각되고 있다. 그러나, 미생물 유래 세라미다아제의 활성을 저해하는 특이적인 저해 물질은 전혀 알려져 있지 않다.
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발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
상기와 같이, 동물 또는 미생물이 생성하는 중성/알칼리성 세라미다아제의 활성을 저해하는 유효한 저해제는 아직 알려져 있지 않고, 산업적으로 이용되고 있지 않은 것이 현재의 상황이다. 본 발명의 목적은 세라미다아제 활성, 그 중에서도 중성/알칼리성 세라미다아제 활성에 대한 식물 유래의 저해제, 당해 저해제를 함유하는 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기의 현황을 감안하여 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 중성/알칼리성 세라미다아제의 저해 물질이 세포내 세라미드 레벨의 조절, 나아가서는 세포내 세라미드에 의해 야기되는 세포의 증식 억제, 분화 유도, 아포토시스의 조절에 유효하다고 생각하고, 널리 다양한 물질에 대하여 중성/알칼리성 세라미다아제의 저해 활성을 조사한 결과, 다양한 식물 유래의 처리물이나, 그 처리물 유래의 특정한 화합물이 중성/알칼리성 세라미다아제에 대하여 특이적인 저해 활성을 갖고 있는 것을 발견하였다. 또한, 이들 식물 유래의 처리물이나 식물 유래의 특정한 화합물에 동물 배양 세포, 또는 피부 각층의 세라미드 함량을 증가시키는 활성이 있는 것을 확인하고, 이들에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 예를 들어 은행 나무, 참외, 오렌지, 개다시마, 오이, 그레이프후르츠, 동아, 여주, 참다시마, 유칼리, 쑥, 라임 및 미역으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 식물 유래의 추출물, 정유, 예를 들어 수증기 증류물, 압착물 등의 식물 유래의 처리물이나 식물 유래의 특정한 화합물을 유효 성분으로 하는 세라미다아제 활성 저해제, 이러한 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포 내외 세라미드 레벨의 조절제, 나아가서는 항염증제, 항암제, 피부 외용제 등의 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 제 1 발명은 은행 나무과 식물, 참외과 식물, 귤과 식물, 다시마과 식물, 도금양과 식물 및 국화과 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 식물 유래의 처리물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성 저해제에 관한 것이다. 본 발명의 제 1 발명에 있어서, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 은행 나무과 식물이 은행 나무이고, 참외과 식물이 월과, 오이, 동아 및 여주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 귤과 식물이 오렌지, 그레이프후르츠 및 라임으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 다시마과 식물이 개다시마, 참다시마 및 미역으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 도금양과 식물이 유칼리이고, 국화과 식물이 쑥인 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 발명은 제 1 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미드량 조절제에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 발명은 제 1 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품에 관한 것이다. 본 발명의 제 3 발명에 있어서, 의약품이 피부 외용제, 세포 증식 억제를 필요로 하는 질환에 대한 치료제 또는 예방제, 암의 치료제 또는 예방제이어도 된다.
본 발명의 제 4 발명은 제 1 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 부외품에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 발명은 제 1 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 발명은 제 1 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 발명은 하기의 이화학적 성질을 갖는 화합물, 그 유도체, 또는 약학적으로 허용되는 그들의 염에 관한 것이다.
(1) 질량 스펙트럼 : m/z 565(M+H)+
(2) MS/MS 분석 : 상기 (1) 을 친이온(precursor ion)으로 했을 때의 딸이온(product ion)이 m/z 547, m/z 338
(3) 1H-NMR (중클로로포름) : δ
Figure 112006045973963-PCT00001
(4) 13C-NMR (중클로로포름) : δ
Figure 112006045973963-PCT00002
본 발명의 제 8 발명은 본 발명의 제 7 발명의 화합물, 유도체 및 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성 저해제에 관한 것이다.
본 발명의 제 9 발명은 본 발명의 제 8 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미드량 조절제에 관한 것이다.
본 발명의 제 10 발명은 본 발명의 제 8 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품에 관한 것이다. 본 발명의 제 10 발명에 있어서, 의약품이 피부 외용제, 세포 증식 억제를 필요로 하는 질환에 대한 치료제 또는 예방제, 암의 치료제 또는 예방제이어도 된다.
본 발명의 제 11 발명은 본 발명의 제 8 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 부외품에 관한 것이다.
본 발명의 제 12 발명은 본 발명의 제 8 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료에 관한 것이다.
본 발명의 제 13 발명은 본 발명의 제 8 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품에 관한 것이다.
발명의 효과
본 발명에 의해 세라미다아제 활성 저해제, 그 저해제를 함유하는 세라미드량 조절제, 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품이 제공된다.
본 발명의 저해제에는 동물 세포의 증식 억제, 분화 유도, 아포토시스를 유도하는 등의 효과를 기대할 수 있고, 나아가서는 본 발명의 저해제를 함유하는 의약, 건강 증진에 유용한 식품은 염증성 질환, 악성 종양 등, 세포의 증식 또는 분화의 이상에 기인하는 질환에 대한 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한 본 발명의 저해제를 포함하는 크림, 로션, 또는 입욕제를 피부에 도포하거나 또는 접촉시킴으로써 건강한 사람 또는 아토피성 피부염 환자의 피부 각질층의 세라미드 함량을 상승시켜 피부의 보습성이나 배리어 기능을 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 아토피성 피부염 관련 미생물이 생성하는 세라미다아제의 활성을 저해함으로써, 아토피성 피부염에 있어서의 피부 세라미드의 감소를 억제하고, 건조 피부 나아가서는 피부염을 개선시키는 효과를 기대할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 2 는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 본 발명의 화합물의 질량 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 화합물의 MS/MS 분석의 질량 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 8 은 본 발명의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 9 는 본 발명의 화합물의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
(1) 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제
본 발명의 세라미다아제 활성 저해제는 세라미다아제의 효소 활성을 저해하는 것이지만, 반드시 세라미다아제에 직접 작용하여 그 활성을 저해하는 것일 필요는 없다. 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제로는, 예를 들어 세라미다아제 저해제를 들 수 있다. 이하, 편의적으로 세라미다아제 활성 저해제를 세라미다아제 저해제라고 하는 경우가 있다.
본 발명의 세라미다아제 활성 저해제에 의한 세라미다아제의 효소 활성의 저해 작용이란, 세라미다아제 본래의 활성과 비교하여 그 활성을 저감시키는 작용을 말하며, 예를 들어 후술하는 참고예 1 에 기재된 방법에 따라서 확인할 수 있다. 세라미다아제의 효소 활성의 저해 작용은 세라미다아제 본래의 활성과 비교하여 이것을 저감시키면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5%, 바람직하게는 10%, 보다 바람직하게는 20%, 40%, 60%, 80%, 90% 저해하는 것이 바람직하다.
본 발명의 세라미다아제 저해제는 소정의 식물 유래의 처리물 또는 그 처리물 유래의 특정한 화합물 등을 유효 성분으로 하고, 세라미다아제, 그 중에서도 중성/알칼리성 세라미다아제에 대하여 우수한 저해 활성을 나타내는 것이다. 또, 본 발명의 세라미다아제 저해제는 유효 성분 그 자체로 이루어지는 것이어도 된다. 또한, 처리물 유래의 화합물 등이라는 기재는 단지 화합물 등의 기원을 나타내는 것이고, 식물과는 관계 없이 별도 합성된 상기 화합물 등과 동일한 화합물 등도 본 발명의 유효 성분에 포함된다.
본 발명에서 유효 성분으로서 사용되는 식물 유래의 처리물 (이하, 본 발명의 처리물이라고 하는 경우가 있음) 로는 식물에 대하여 인위적인 처리를 실시하여 얻어진 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 추출물 (엑기스), 정유 (예를 들어, 수증기 증류물, 착즙액, 압착물, 용제 추출물, 초임계 유체 추출물) 를 들 수 있다. 이들 처리물은 각각 단독으로 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 식물로는 은행 나무과 식물, 참외과 식물, 귤과 식물, 다시마과 식물, 도금양과 식물 및 국화과 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어 도 1개를 들 수 있다.
이들 식물 유래의 처리물로는 적어도 중성/알칼리성 세라미다아제에 대하여 저해 활성을 나타내는 것이면 특별히 한정은 되지 않는다. 식물로는 그 처리물이 세라미다아제 활성 저해 작용이 우수하므로, 이하에 예시하는 식물이 바람직하게 사용된다.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 은행 나무과 (Gin㎏oaceae) 식물로서 은행 나무 (Gin㎏o biloba, Gin㎏oaceae) 를 바람직하게 사용할 수 있고, 주로 잎이 사용된다.
본 발명에 사용되는 참외과 (Cucurbitaceae) 식물로서 월과 (Cucumis melo L. var. conomon Makino) 또는 참외 (Cucumis melo L. var. makuwa Makino) 또는 머스크멜론 (Cucumis melo L.) 을 바람직하게 사용할 수 있고, 주로 과실이 사용된다. 또한, 오이 (Cucumis sativus L.), 동아 (Benincasa cerifera Savi), 여주 (Momordica charantia L.) 도 바람직하게 사용할 수 있고, 주로 과실이 사용된다. 참외과 식물로는 월과, 오이, 동아 또는 여주의 1 또는 2 이상의 사용이 보다 바람직하다.
본 발명에 사용되는 귤과 (Rutaceae) 식물로서 오렌지 (Citrus sinensis, Citrus aurantium 또는 Citrus reticulate), 그레이프후르츠 (Citrus Paradisi), 또는 라임 (Citrus aurantifolia) 의 1 또는 2 이상의 사용이 바람직하고, 주로 과실이 사용된다. 또, 오렌지의 껍질로부터 추출된 오일인 리모넨을 본 발명에 사용할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 다시마과 식물, 그 중에서도 갈조류 다시마과 (Laminariaceae) 식물로서 개다시마 (Kjellmaniella crassifolia Miyabe), 참다시마 (Laminaria japonica Areschoug), 또는 미역 (Undaria pinnatifida) 의 1 또는 2 이상의 사용이 바람직하고, 주로 잎, 줄기 또는 미역 포자엽이 사용된다.
본 발명에 사용되는 도금양과 (Myrtaceae) 식물로서 유칼리, 즉 상록 고목 유칼리나무 또는 그 근연식물 (Eucalyptus globulus, Eucalyptus citriodora, 또는 Eucalyptus dives) 을 바람직하게 사용할 수 있고, 주로 그 잎이 사용된다.
본 발명에 사용되는 국화과 (Compositae) 식물로서 쑥 (Artemisia vulgaris L. var. indica Maxim.) 을 바람직하게 사용할 수 있고, 주로 그 잎이 사용된다.
그러나, 상기 식물을 사용하는 경우, 본 발명에 사용되는 식물의 조직에 대해서는 상기의 것에 한정되는 것이 아니라, 예를 들어 근경, 잎, 과실, 미역 포자엽 또는 식물 전체를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 처리물의 원료로는 세단물이나 파쇄물, 건조물 등의 가공품을 사용할 수도 있다. 또, 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 조제에는 상기 식물을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 이들 식물 또는 그들의 처리물, 및 후술하는 본 발명의 특정한 화합물에 관해서 중성/알칼리성 세라미다아제 저해 효과를 갖는 것은 전혀 알려져 있지 않다.
본 발명에서 사용하는 식물의 추출물의 추출 방법으로는, 예를 들어 상기 식물을 그대로, 또는 건조 분쇄한 것을 통상 식물 성분의 추출에 사용되는 용매에 의 해 추출하고, 용매를 증류 제거함으로써 얻을 수 있다. 추출 용매로는, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로필알코올, 부탄올, 이소부틸알코올 등의 저급 알코올 또는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올, 아세톤, 아세트산 에틸, 에테르, 클로로포름, 디클로로에탄, 톨루엔, n-헥산, 석유 에테르 등의 각종 유기 용매, 또는 물 등을 각각 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 특히 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 또는 에탄올 수용액, 프로필렌글리콜 수용액, 1,3-부틸렌글리콜 수용액이 추출물의 추출 효율이나 수량의 점에서 바람직하다.
추출 방법으로는 통상 식물 성분의 추출에 사용되는 조건을 적용할 수 있고, 예를 들어 상기 식물을 4 ∼ 100℃ 에서 수시간 내지 수주간, 추출 용매에 침지하거나 가열 환류하면 되는데, 사용하는 원료 식물, 식물체의 부위나 형태 등에 따라 적절히 최선의 방법을 설정할 수 있다. 그 때에는 추출물의 중성/알칼리성 세라미다아제 저해 활성을 후술하는 참고예 1 에 기재된 방법에 따라서 측정하고, 저해 활성이 최대가 되도록 추출 방법을 설정하면 된다.
본 발명의 처리물로서 정유를 사용하는 경우에도 통상 사용되는 방법으로 조제할 수 있다. 예를 들어 상기 식물로부터 수증기 증류법, 착즙법, 압착법, 용제 추출법, 초임계 유체 추출법 등을 사용하여 조제할 수 있다.
식물의 추출물의 추출 방법이나 정유의 조제 방법은 공지된 방법에 따르면 되는데, 예를 들어 바이오 세퍼레이션 편람 (1996 년, 화학 공학회 「생물 분리 공학 특별 연구회」편) 을 참조하면 된다.
이상의 식물 추출물이나 정유는 본 발명의 처리물로서 그대로 사용할 수도 있지만, 추가로 흡착 분배 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 분배 크로마토그래피, 역상 분배 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 분획한 프랙션의 중성/알칼리성 세라미다아제의 저해 활성을 측정함으로써 고순도이며 활성이 높은 획분을 취득하거나, 또는 중성/알칼리성 세라미다아제 저해 활성을 갖는 물질을 단리하여 사용할 수도 있다. 또한, 중성/알칼리성 세라미다아제의 저해 활성이 높은 획분을 단독으로 사용해도 되고, 복수의 획분을 혼합한 혼합물로서 사용해도 된다.
또한, 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제로는 이하의 화합물, 그 유도체 및 약학적으로 허용되는 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개를 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 당해 화합물은 세라미다아제 활성 저해 작용을 갖는 미역 포자엽으로부터 얻어진 신규 화합물이고, 도 6 에 그 질량 스펙트럼을, 도 7 에 그 MS/MS 분석의 질량 스펙트럼을, 도 8 에 그 1H-NMR 스펙트럼을, 도 9 에 그 13C-NMR 스펙트럼을 각각 나타낸다. 당해 화합물의 단리 방법, 각종 스펙트럼의 측정 방법·측정 결과, 세라미다아제 활성 저해 작용 등의 상세에 대해서는 후술하는 실시예 11 을 참조할 것. 즉, 상기 이화학적 성질을 갖는 화합물, 및 그 유도체 및 약학적으로 허용되는 그들의 염 (본 명세서에 있어서 화합물 등이라고 하는 경우가 있음) 은 세라미다아제 활성의 저해 작용을 갖고 있고, 본 발명의 처리물과 동등한 기능을 발휘할 수 있다. 또, 그들 화합물 등은 본 발명에 있어서 처음으로 단리된 것이고, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 화합물로는 이하의 식 (1) 로 표시되는 화합물이 예시된다.
[화학식 1]
Figure 112006045973963-PCT00003
본 발명에 있어서, 염은 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 상기 식 (1) 로 표시되는 화합물의 유도체로는, 예를 들어 에스테르 등 체내에서 용이하게 가수 분해되어 원하는 효과를 발휘할 수 있는 유도체 (프로드러그) 를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 포유 동물에 투여하여 대사되어 생긴 유도체도 본 발명의 유도체에 포함된다. 이러한 프로드러그의 조제는 공지된 방법에 따르면 된다. 또, 이러한 유도체는 그들의 염이어도 된다. 따라서, 본 발명의 유효 성분에는 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 한, 본 발명의 화합물의 유도체 및 그들의 염도 포함된다. 또한, 본 발명에 사용되는 화합물의 광학 이성체, 케토-에놀 호변 이성체, 기하 이성체 등의 각종 이성체, 각 이성체의 단리된 것이어도, 세라미다아제 활성 저해 작용을 갖는 한, 모두 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 염으로는, 예를 들어 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 유기 염기와 같은 염 등이 예시된다. 이러한 염으로는 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서 사용되는 약학적으로 허용되는 염 이란 생물에 대하여 실질적으로 무독성이고, 또한 세라미다아제 활성 저해 작용을 갖는 화합물의 염을 의미한다. 당해 염으로는, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 프로톤화된 벤자틴(N,N'-디-벤질에틸렌디아민), 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글라민(N-메틸글루카민), 베네타민(N-벤질펜에틸아민), 피페라진 또는 트로메타민(2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올) 등의 염을 들 수 있다.
본 발명의 세라미다아제 저해제란 세라미다아제 활성을 저해하는 것이면, 그 제형은 특별히 정해진 것은 없다. 상기 세라미다아제 활성 저해제에 사용되는 첨가물로는 특별히 한정되는 것은 없고, 공지된 기제를 사용할 수 있다. 본 발명의 세라미다아제 저해제는 본 발명의 유효 성분과 공지된 기제를 적절히 혼합하여, 예를 들어 시약의 형태로 조제할 수 있다. 또한 본 발명의 세라미다아제 저해제는, 예를 들어 세라미드량 조절제, 의약품 (피부 외용제, 세포 증식 억제제, 암 치료제 또는 예방제를 포함), 의약 부외품, 화장료, 식품으로서 사용되는 것에 배합할 수도 있다.
본 발명의 세라미다아제 저해제 중의 유효 성분의 함유량으로는 유효 성분이 본 발명의 처리물인 경우, 건조 중량으로서 바람직하게는 0.000001 ∼ 100 중량%, 보다 바람직하게는 0.00001 ∼ 20 중량% 이고, 유효 성분이 본 발명의 화합물 등인 경우, 바람직하게는 0.000001 ∼ 100 중량%, 보다 바람직하게는 0.00001 ∼ 20 중량% 이다. 또한, 본 발명의 세라미다아제 저해제를 상기 의약품 등에 배합하는 경우, 그 배합량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 건조 중량으로서 바람직하게는 0.000001 ∼ 100 중량%, 보다 바람직하게는 0.00001 ∼ 20 중량%, 더욱 바람직하게는 0.0001 ∼ 10 중량% 정도의 범위이다.
또한, 본 발명의 유효 성분을 함유하는 세라미다아제 활성 저해제는 그 생리 작용에 의해 세포 증식, 암, 염증, 주름 형성 (피부 탄성의 저하, 피부 비후의 메카니즘), 피부 각질층 배리어 기능, 건조 피부, 미생물 감염, 피부 면역의 연구나, 또한 본 발명의 의약품 외에 스핑고 지질 (세라미드) 이 관련된 질병용 의약품, 피부 외용제, 세포 증식 억제제, 암 치료제 또는 예방제의 스크리닝에도 유용하다.
또, 본 명세서에 있어서 「함유」 라는 말은 희석 및 첨가의 의미를 포함하여 사용되는 경우가 있다. 여기에서, 「첨가」 란 원료에 본 발명에서 사용되는 유효 성분을 첨가한다는 양태를, 「희석」 이란 본 발명에서 사용되는 유효 성분이 원료에 첨가되거나, 또는 본 발명에서 사용되는 유효 성분에 원료가 첨가됨으로써 유효 성분이 희석되어 있는 양태를 포함한다.
(2) 본 발명의 세라미드량 조절제
본 발명의 세라미드량 조절제는 본 발명의 세라미다아제 저해제가 갖는 세라미다아제 저해 작용에 의해 세라미드량을 조절하는 효과를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 여기에서, 「세라미드량을 조절하는 효과」 란, 예를 들어 하기 실시예 6 ∼ 10 에 기재된 바와 같이, 세라미다아제 저해제에 의한 배양 세포, 인공 피부 중의 세라미드량의 상승, 상승한 세라미드량에 대하여 세라미다아제 저해제의 첨가량을 적절히 선택하는 것에 의한, 원하는 세라미드량으로의 강하에 의해 달성되는 효과를 말한다. 특별히 한정되지는 않지만, 본 발명의 세라미드량 조절제 는 스핑고 지질의 기본 골격인 세라미드량을 조절한다는 점에서, 세포의 증식, 분화, 아포토시스 등을 제어하는 정보 분자인 스핑고 지질량의 조절이나, 피부의 보습능이나 배리어 기능에 관한 주요한 세포간 지질 성분인 세라미드량을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 세라미드량 조절제는 세라미드량에 더해 세라미드의 대사에 관여함으로써 스핑고신량, 지방산량, 스핑고신-1-인산량의 조절제로서도 기능하므로, 스핑고신량 조절제, 지방산량 조절제, 스핑고신-1-인산량의 조절제로도 사용할 수 있다.
본 발명의 세라미드량 조절제의 제형은 특별히 정해진 것은 없고, 본 발명의 세라미다아제 저해제와 공지된 기제를 적절히 혼합하여, 예를 들어 시약의 형태로 조제할 수 있다. 본 발명의 세라미드량 조절제 중의 본 발명의 세라미다아제 저해제 (유효 성분) 의 함유량으로는 본 발명의 세라미다아제 저해제를 의약품 등에 배합하는 경우의, 그 저해제의 배합량과 동일한 범위를 들 수 있다. 본 발명의 세라미드량 조절제의 용도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세라미드에 관한 생화학의 연구를 위한 시약으로서의 사용이 바람직하다.
(3) 본 발명의 의약품 등
본 발명의 의약품은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하여 이루어지는 것이고, 피부 외용제 (보습제, 배리어 기능 유지제, 피부의 탄성 향상제 또는 유지제, 피부 비후 개선제 또는 예방제, 그들을 용도로 하는 연고, 크림, 유액, 로션, 팩, 목욕용제 등), 세포 증식 억제제, 항염증제, 암 치료제 또는 예방제, 세라미드 또는 그 대사 산물을 통한 시그널 전달이 관련된 질환의 치료제 또는 예방제 로서 제공된다. 그 중에서도, 본 발명의 의약품은 피부 외용제, 세포 증식 억제를 필요로 하는 질환에 대한 치료제 또는 예방제, 또는 암의 치료제 또는 예방제로서 매우 유용하다.
세라미드는 피부에 있어서의 주요한 세포간 지질 성분이고, 피부의 보습능이나 배리어 기구에 중요한 역할을 하고 있다. 아토피성 피부염 환자의 피부 각층에서는 세라미드 함량이 감소하고 있고, 이것이 아토피성 피부염의 특징으로 되어 있는 건조 피부 및 각층의 배리어 기능 이상의 원인의 하나로서 생각되어 질환이 악화된다는 가능성이 생각되고 있다. 또한, 세라미드량의 감소는 피부 탄성의 저하나 피부 비후의 증진으로 이어지는 것이 알려져 있다. 본 발명의 유효 성분에 의하면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 세라미드를 분해하는 세라미다아제 활성의 저해를 통해 세포 내외의 세라미드량을 증가시키고, 또는 세라미드량의 감소를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유효 성분을 함유하는 본 발명의 의약품에 의하면, 상기와 같은 질환이나 증상의 치료 또는 예방 효과를 기대할 수 있다.
또한, 세포의 증식, 분화, 아포토시스 등의 제어에 관련된 스핑고 지질 (스핑고 당지질, 스핑고미엘린 및 그들의 대사 산물인 세라미드, 스핑고신, 스핑고신-1-인산 등) 에 관해서는 암, 자기 면역 질환, 감염증, 피부염이나 관절염 등의 염증 등의 질환에 있어서의 대사 및 이들 분자를 통한 시그널, 시그널 전달이 주목받고 있다. 그 중에서도 세라미드는 스핑고 지질의 기본 골격이 되는 지질에서 세포의 생과 사를 조절하는 중요한 인자라고 생각되고 있다. 따라서, 세라미드 의 대사 이상은 세포의 증식 또는 분화의 이상을 야기하고, 염증성 질환이나 악성 종양 (암) 등의 상기 이상에 기인하는 질환의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 암세포에 항암제 처리나 방사선을 조사하면 세포내 세라미드 레벨이 상승하여 암세포가 아포토시스를 일으키는 것이 알려져 있는데, 항암제 내성을 획득한 암세포에서는 세라미드의 대사 효소, 예를 들어 세라미드에 글루코오스를 전이하는 글루코실트랜스페라아제의 활성이 상승하고, 세포내 세라미드 레벨이 상승하지 않는 것이 보고되어 있다 (예를 들어, Lavie, Y., Cao, H., Bursten, S.L., Giuliano, A.E., and Cabot, M.C. (1996) J. Biol. Chem. 271, 19530-19536). 본 발명의 유효 성분에 의하면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 세라미드를 분해하는 세라미다아제 활성의 저해를 통해 세포의 증식 억제나 아포토시스를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유효 성분을 함유하는 본 발명의 의약품에 의하면, 세라미드의 대사 이상의 발생을 억제하거나, 또는 그 이상을 개선하여 상기와 같은 질환이나 증상의 치료 또는 예방 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 의약품은 세포 증식의 억제 효과를 발휘할 수 있으므로 세포 증식 억제제로서도 사용 가능하다.
또한, 상기와 같이, 글루코실트랜스페라아제가 세라미드의 대사 이상에 관여하는 경우가 있으므로, 본 발명의 의약품은 세라미다아제 이외의 세라미드 대사 효소, 예를 들어 글루코실트랜스페라아제의 저해제와 함께 사용함으로써, 예를 들어 다제 내성이 된 암의 치료 또는 예방 효과를 기대할 수 있다.
이어서, 본 발명의 의약품의 제조 방법에 대하여 설명한다. 본 발명의 의약품은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 유효 성분으로 하는 것이고, 당해 유효 성분을 공지된 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 된다. 일반적으로는, 본 발명의 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 원하는 바에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 첨가하여 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 한다. 또한, 사용전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 할 수 있는 건조품이나, 외용제로 할 수도 있다.
의약용 담체는 본 발명의 의약의 투여 형태 및 제형에 따라 선택할 수 있고, 경구제의 경우에는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니트, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면 활성제, 윤활제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우에는 통상적인 방법에 따라서 본 발명의 유효 성분을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 콩기름, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시키고, 원하는 바에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가함으로써 조제할 수 있다.
피부 외용제로는 경피 투여용 고체, 반고체 또는 액상의 제제가 포함된다. 또한, 좌제 등도 포함된다. 예를 들어, 유제, 로션제 등의 유탁제, 외용 팅크제 등의 액상 제제, 유성 연고, 친수성 연고 등의 연고제, 필름제, 테이프제, 파프제 등의 경피 투여용 부착제 등으로 할 수도 있다.
본 발명에 포함되는 세포 증식 억제제, 암의 치료제 또는 예방제에는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제의 아포토시스 유발 작용, 세포 증식 억제 또는 예방 효과, 암 치료 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 의약품은 적절히 제약 분야에서의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 의약품 중의 본 발명의 세라미다아제 저해제 (유효 성분) 의 함유량으로는 본 발명의 세라미다아제 저해제를 의약품 등에 배합하는 경우의 그 저해제의 배합량과 동일한 범위를 들 수 있다.
본 발명의 의약품은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여할 수 있다. 투여 방법도 특별히 한정은 없고, 내용, 외용 및 주사로 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.
본 발명의 의약품의 투여량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 당해 의약품의 투여 대상인 환자의 연령, 체중, 증상에 따라 적절히 설정되어 일정하지 않다. 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효 성분의 투여량으로, 건조 중량으로서 바람직하게는 성인 1 일당 0.1 ∼ 2000㎎/㎏ 체중이다. 물론 투여량은 여러 가지의 조건에 따라 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 투여는 원하는 투여량 범위내에서 1 일내에 단회에, 또는 수회로 나눠 행해도 된다. 또, 본 발명의 의약품은 그대로 경구 투여하는 것 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
피부 외용제로서 사용하는 경우에는 본 발명의 유효 성분 외에 통상 화장품 이나 의약품 등의 피부 외용제에 사용되는 성분, 예를 들어 수성 성분, 유성 성분, 분말 성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선 흡수제, 미백제, 방부제, 산화 방지제, 계면 활성제, 향료, 색소 등을 적절히 필요에 따라 배합하면 된다.
본 발명의 의약 부외품은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 의약 부외품으로는 특별히 한정은 되지 않지만, 인체에 대한 작용이 느린 양치질약, 치약, 구중 청량제, 건위 청량제, 비타민 함유 보건제, 트로키제, 자외선 방지 로션, 비누, 염모제, 생리대, 목욕용제, 구취, 체취, 땀띠, 탈모의 방지, 발모 또는 제모를 목적으로 하는 것 및 이들에 준하는 것이 포함된다. 본 발명의 의약 부외품에 의하면, 본 발명의 의약품과 동일한 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 의약 부외품은 본 발명의 세라미다아제 저해제와 공지된 기제를 적절히 혼합하여 임의의 형태로 조제할 수 있다. 본 발명의 의약 부외품 중의 본 발명의 세라미다아제 저해제 (유효 성분) 의 함유량으로는 본 발명의 세라미다아제 저해제를 의약품 등에 배합하는 경우의 그 저해제의 배합량과 동일한 범위를 들 수 있다.
(4) 본 발명의 화장료
본 발명의 화장료는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하여 이루어지고, 본 발명의 화장료의 원하는 효과의 발현은 이러한 화장료에 포함되는 상기 저해제 (유효 성분) 가 갖는 상기 생리 작용에 기초하는 것이다. 각층 및/또는 각질층을 포함하는 피부 내부에서 세라미드량이 증가하면, 보습성, 배리어 효과, 피부의 팽팽함이나 탄성, 보습성 (습기) 를 높일 수 있는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명의 화장료에 의하면, 예를 들어 피부의 팽팽함이나 탄성을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 세라미다아제 활성 저해제를 유효 성분으로 하는 보습성 개선 작용 또는 악화 예방 작용, 배리어 효과 개선 작용 또는 악화 예방 작용, 주름 개선 작용 또는 예방 작용, 피부의 탄성 향상 작용 또는 유지 작용, 피부 비후 개선 작용 또는 예방 작용, 세라미드 생성 증강 작용 또는 감소 억제 작용 또는 세포 증식 억제 작용이 우수한 화장료가 제공된다. 또, 당해 화장료로는, 예를 들어 항종양 활성, 보습성 개선 작용 또는 예방 작용, 배리어 효과 개선 작용 또는 예방 작용, 주름 개선 작용 또는 예방 작용, 피부의 탄성 향상 작용 또는 유지 작용, 피부 비후 개선 작용 또는 예방 작용, 세라미드 생성 증강 작용 또는 감소 억제 작용 또는 세포 증식 억제 작용에 의한 원하는 효과의 발현을 위해 사용되는 것이라는 표시를 한 화장료로 할 수도 있다.
본 발명의 화장료에 있어서의 본 발명의 유효 성분의 함유량은 건조 중량으로서 통상 바람직하게는 0.0001 ∼ 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 ∼3 중량% 이다.
또한, 본 발명의 화장료에는 본 발명의 유효 성분 이외의 그 밖의 성분으로서 원하는 바에 따라 1,3-부틸렌글리콜, 피롤리돈카르복실산염 등의 보습제, 유동 파라핀, 바셀린, 올리브유, 스쿠알란, 라놀린, 합성 에스테르유 등의 피부 유연제, 야자유, 팜유 등의 유지류, 비타민 E 등의 비타민류, 밀랍, 프로필렌글리콜모노스테아레이트, 스테아르산 등의 계면 활성제, 스테아릴알코올 등의 유화 안정 보조 제, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 가용화제, 메틸파라벤 등의 방부제, 안료, 향료, 항산화제, 자외선 흡수제, 약리 활성 물질, 기제, 계면 활성제 등을 함유시킬 수 있다. 또한, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산으로 대표되는 다당류 등의 보수(保水) 작용을 갖는 것을 병용해도 된다.
본 발명의 화장료의 형상으로는 유효 성분의 상기 생리 작용을 기대할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 로션류, 유액류, 크림류, 팩류, 목욕용제, 세안제, 목욕용 비누, 목욕용 세제 또는 연고가 바람직하다.
본 발명의 화장료는 본 발명의 유효 성분 및 원하는 바에 따라 상기 그 밖의 성분을 원료로서 사용하고, 화장품 분야에서의 공지된 방법에 따라서 적절히 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어 후술하는 식품, 음료 등과 동일하게 하여 음식품 분야에서의 공지된 방법에 따라서 경구 섭취에 적합한 화장료를 제조할 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 유효 성분을 상기 함유량 범위로 포함하는 화장료를 각각의 용도 형태에 따라 원하는 양, 예를 들어 로션류이면 예를 들어 인간의 안면 전체에 적용하는 경우, 1 회의 사용당 바람직하게는 0.01 ∼ 5g, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 2g 정도를 사용하면, 보습 효과, 배리어 효과, 주름 개선 효과 또는 예방 효과, 피부의 탄성 향상 효과 또는 유지 효과, 피부 비후 개선 효과 또는 예방 효과, 세라미드 생성 증강 효과 또는 감소 억제 효과 및 세포 증식 억제 효과가 얻어지고, 피부에 탄력이나 윤기를 부여하여 고운 피부가 얻어지는 효과를 나타내는 등, 본 발명의 원하는 효과가 얻어진다.
또, 본 명세서 중에 기재된 피부란, 얼굴, 목, 가슴, 등, 팔, 손, 다리, 발, 엉덩이부 및 두피 등의 인간이나 동물의 외측을 덮어 싸고 있는 부분 모두를 포함한다.
(5) 본 발명의 식품
본 발명의 식품은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하여 이루어지고, 본 발명의 식품의 원하는 효과의 발현은 이러한 식품에 포함되는 그 저해제 (유효 성분) 가 갖는 상기 생리 작용에 기초하는 것이다. 본 발명에서는 본 발명의 세라미다아제 저해제를 함유하는 식품을 제공하는데, 당해 식품에 있어서는 종래의 식품에 비하여 본 발명의 세라미다아제 저해제를 고농도 및/또는 고순도로 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 즉, 본 발명의 식품을 섭취함으로써, 세포 증식 억제, 아포토시스 유발 등의 효과를 기대할 수 있고, 세라미드가 관련된 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 작용할 수 있다. 또, 당해 식품으로는 예를 들어 세포 증식 억제 활성, 아포토시스 유발 활성에 의한 원하는 효과의 발현을 위해 사용되는 것이라는 표시를 한 건강 식품 (특정 보건용 식품) 으로 할 수도 있다. 또, 본 발명의 식품에는 음료도 포함되고, 편의적으로 음용 형태의 식품을 음료라고, 음용 형태 이외의 형태의 식품을 식품이라고 하는 경우가 있다.
본 발명의 식품으로는 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 함유하여 이루어지는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 곡물 가공품 (소맥분 가공품, 전분류 가공품, 프리믹스 가공품, 면류, 마카로니류, 빵류, 팥소류, 메밀국수류, 밀기울, 쌀국수, 당면, 포장떡 등), 유지 가공품 (가소성 유지, 튀김유, 샐러드유, 마요네즈류, 드레싱 등), 대두 가공품 (두부류, 된장, 낫토 등), 식육 가공품 (햄, 베이컨, 프레스햄, 소시지 등), 수산 제품 (냉동 연육(surimi), 어묵, 찌꾸와 (어묵을 길쭉하게 빚어 대꼬챙이에 꿰어 굽거나 찐 어묵), 한펜 (다진 생선살에 마 등을 갈아 넣고 반달형으로 쪄서 굳힌 것), 사쯔마아게 (어육을 갈아서 당근·우엉 등을 섞어 기름에 튀긴 것), 쯔미래 (생선을 다져 밀가루 반죽과 함께 동그랗게 뭉쳐서 삶은 것), 스지 (뼈나 껍질까지 섞어서 만든 하치 어묵), 어육 햄, 소시지, 가쯔오부시, 어란 가공품, 수산 통조림, 쯔꾸다니 (어패, 해초, 채소 등을 설탕, 간장으로 조린 반찬 등), 유제품 (원료유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유, 아이스크림 등), 야채·과실 가공품 (페이스트류, 잼류, 절임채소류, 과실음료, 야채음료, 믹스음료 등), 과자류 (초콜릿, 비스켓류, 과자빵류, 케이크, 떡과자, 쌀과자류 등), 알코올 음료 (정종, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 진, 럼주, 맥주, 청량 알코올 음료, 과실주, 리큐어 등), 기호 음료 (녹차, 홍차, 우롱차, 커피, 청량 음료, 유산 음료 등), 조미료 (간장, 소스, 식초, 미림 등), 통조림·병조림·팩포장 식품 (쇠고기덮밥, 솥밥, 찰팥밥, 카레, 기타 각종 조리된 식품), 반건조 또는 농축 식품 (리버 페이스트, 기타 스프레드, 메밀국수·우동의 국물, 농축 스프류), 건조 식품 (즉석 면류, 즉석 카레, 인스턴트 커피, 분말 쥬스, 분말 스프, 즉석 된장국, 조리된 식품, 조리된 음료, 조리된 스프 등), 냉동 식품 (스키야키, 차완무시, 장어구이, 햄버그스테이크, 슈마이 (중국 요리의 찐 만두의 일종), 만두, 각종 스틱, 후루츠칵테일 등)), 고형 식품, 액체 식품 (스프 등), 향신료류 등의 농산·임산 가공품, 축산 가공품, 수산 가공품 등을 들 수 있다. 이들 식품은 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제를 사용하고, 공지된 식품의 제조 방법에 따라서 제조할 수 있다.
본 발명의 식품에 있어서의 본 발명의 유효 성분의 함유량은 특별히 한정되지 않고, 그 관능과 작용 발현의 관점에서 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 유효 성분의 함유량은 식품의 경우, 건조 중량으로서 예를 들어 식품 그 자체의 원료 100 중량부당 바람직하게는 0.0001 중량부 이상, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 10 중량부이고, 음료의 경우, 건조 중량으로서 예를 들어 음료 그 자체의 원료 100 중량부당 바람직하게는 0.0001 중량부 이상, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 10 중량부이다.
본 발명의 식품은 상기 유효 성분이 단독 또는 복수 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있고, 그 사용 형태에 따라 유효 성분의 함유량이 세라미다아제 활성을 저해하기 위한 필요량에 상당하는 것이면 특별히 그 형상에 한정은 없고, 타블렛상, 과립상, 캡슐상, 소프트캡슐상, 액상, 분상 등의 형상의 경구적으로 섭취 가능한 형상물도 포함한다.
(6) 본 발명의 세라미다아제 활성 저해 방법
본 발명의 세라미다아제 활성 저해 방법은 생체 (예를 들어 포유 동물, 포유 동물 유래 조직, 포유 동물 유래 세포, 진균, 효모, 담자균 등의 세포) 또는 생체 유래 시료 (예를 들어, 세포 추출물 또는 그 정제물) 에 본 발명의 유효 성분을 적용하여 세라미다아제 활성을 저해하는 방법이고, 통상 본 발명의 세라미다아제 활성 저해제, 세라미드량 조절제, 의약품, 의약 부외품, 화장료 또는 식품을, 그들의 사용 양태에 따라 생체 또는 생체 유래 시료에 적용함으로써 실시할 수 있다. 적용 방법은 본 발명의 유효 성분을 생체 또는 생체 유래 시료와 접촉시킬 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 포유 동물로의 본 발명의 유효 성분의 투여, 포유 동물 유래 세포 배양액으로의 본 발명의 유효 성분의 첨가 등의 방법을 들 수 있다.
본 발명의 세라미다아제 활성 저해 방법은, 예를 들어 세포 증식 이상, 암, 자기 면역 질환, 피부 면역 이상, 감염증, 피부염이나 관절염 등의 염증, 주름 형성 (피부 탄성의 저하, 피부 비후의 메카니즘), 피부 각질층 배리어 기능 이상, 건조 피부의 치료, 증상의 완화 및 그들의 연구, 세라미드의 제조, 정제에 유용하다.
본 발명의 세라미다아제 활성 저해 방법의 실시 양태는 본 발명의 유효 성분이 저해 활성을 발휘할 수 있는 한 특별히 한정은 되지 않지만, 생체, 세포, 조직 및 이들 유래의 시료의 세라미다아제 활성을 저해할 수 있다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 세라미다아제의 조제
중성/알칼리성 세라미다아제로서 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa AN17 주) 유래의 세라미다아제와 래트 뇌 유래의 세라미다아제의 2 종류를 사용하였다.
Pseudomonas aeruginosa AN17 주는 아토피성 피부염 환자의 피부 각질 박리로부터 분리된 균주로 중성/알칼리성 세라미다아제를 생산하는 [Journal of Biological Chemistry, 제273권, 제14368 ∼ 14373페이지 (1998)]. 또, 상기 균주는 AN17 이라고 명명, 표시되고, 평성 8년 6월 26일 (원기탁일) 부터 우편번호 305-8566 일본국 이바라기현 쯔쿠바시 히가시 1 초메 1 반치 1 중앙 제 6, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 수탁 번호 FERM P-15699 로서 기탁되어 있다. 세라미다아제 조효소액은 이하와 같이 하여 조제하였다.
Pseudomonas aeruginosa AN17 주를 스핑고미엘린 함유 펩톤 효모 엑기스 배지 (0.5% 펩톤, 0.1% 효모 엑기스, 0.5% NaCl, 0.01% 스핑고미엘린 (시그마사 제조), 0.05% 타우로데옥시콜산 나트륨 (TDC), pH 7.2) 에서 30℃, 3 일간 배양하고, 원심 분리에 의해 배양 상청을 얻었다. 이것을 미리 0.1% 루브롤 PX (나카라이테스크사 제조) 를 포함하는 50mM 트리스염산 버퍼 (pH 7.5) 로 평형화한 Q-세파로오스 FF (Pharmacia 사 제조, 2.5 × 20㎝) 에 어플라이하고, 그 후 2mL/min 의 유속으로 동 버퍼를 흘려 칼럼을 세정한 후, 1M 까지의 NaCl 구배를 가하여 효소를 용출하였다. 활성 획분을 회수하고, 소 혈청 알부민 (BSA) 을 최종농도 1㎎/mL 이 되도록 첨가하여 0.1% 루브롤 PX 를 포함하는 50mM 트리스염산 버퍼 (pH 7.5) 에 대하여 투석하여 조효소 표품으로 하였다.
한편, 래트 뇌 유래의 세라미다아제 조효소액의 조제는 이하의 방법으로 행하였다. 먼저, 래트 뇌 조직 2개 (3.5g) 를 30mL 의 0.25M 슈크로오스 용액 중에서 포터에르베젬 호모지나이저를 사용하여 호모지나이즈하였다. 이것을 700 × g 으로 10 분간 원심 분리한 후, 상청을 25,000 × g 으로 10 분간 원심 분리하여 얻어진 상청을 추가로 100,000 × g 으로 60 분간 원심 분리하여 얻어진 침전을 25mM 트리스염산 버퍼 (pH 8.0) 3mL 에 현탁하였다. 이것에 9mL 의 0.5% Triton X-100 함유 25mM 트리스염산 버퍼 (pH 8.0) 를 첨가하여 빙상에서 2 시간 방치하여 추출하였다. 이것을 100,000 × g 으로 60 분간 원심 분리하여 상청을 회수하고, 조효소 표품으로 하였다.
실시예 1 미역 포자엽 엑기스의 조제
건조 미역 포자엽 칩 10g 에 100mL 의 에탄올을 첨가하여 조용히 수회 교반하고, 그대로 하루 정치하였다. 이것을 여과하여 미역 포자엽 에탄올 추출액을 얻었다. 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 4㎎ 이었다.
실시예 2 참다시마 엑기스, 개다시마 엑기스의 조제
건조 참다시마 칩 10g 에 100mL 의 에탄올을 첨가하여 조용히 수회 교반하고, 그대로 하루 정치하였다. 이것을 여과하여 참다시마 에탄올 추출액을 얻었다. 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 2.7㎎ 이었다.
개다시마에 대해서도 동일하게 추출액을 얻었다. 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 1.8㎎ 이었다.
실시예 3 각종 식물 엑기스의 조제
은행 나무 잎, 월과 과실, 동아 과실, 오이 과실, 여주 과실, 쑥 잎은 호모지나이저로 쥬스상으로 한 후, 동결 건조시키고, 이것에 1g 당 10mL 의 에탄올을 첨가하여 하룻밤 정치하여 추출하였다. 이것을 여과하여 에탄올 추출액을 얻었다. 은행 나무 잎 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 15㎎, 월과 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 120㎎, 동아 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 53㎎, 오이 엑기스 1mL 당 의 건조 중량은 45㎎, 여주 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 42㎎, 쑥 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 43㎎ 이었다.
또한, 오렌지 오일, 그레이프후르츠 오일 등의 식물 정유에 관해서는 야마모토 향료 (주) 로부터 시판되고 있는 것을 사용하였다.
참고예 1 세라미다아제 저해 활성 측정
녹농균 유래 중성/알칼리성 세라미다아제 (Pseudomonas aeruginosa Ceramidase) 에 대한 저해 활성은 이하와 같이 하여 측정하였다. 먼저, 녹농균 세라미다아제를 희석용 버퍼 (5mM 염화 칼슘, 0.45% 소 혈청 알부민을 포함하는 100mM 트리스염산 버퍼 pH 8.5) 로 적당한 효소 농도로 희석한 희석 효소액 10μL 와 저해제 5μL 를 혼합하고, 37℃ 에서 10 분간 보온하였다. 여기에 0.05mM 또는 1.5mM NBD-C12-Ceramide (마트레아사 제조), 5mM CaCl2, 0.5% Triton X-100 을 포함하는 트리스염산 버퍼 pH 8.5 의 기질 용액 10μL 를 첨가하고 추가로 37℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 메탄올 75μL 를 첨가하여 반응을 멈추고, 이 중의 25μL 를 HPLC 분석에 사용하였다.
래트 뇌 유래 중성/알칼리성 세라미다아제 (RatBrain Ceramidase) 에 대한 저해 활성은 이하와 같이 하여 측정하였다. 먼저, 래트 뇌 유래 세라미다아제를 희석용 버퍼 (12.5mM 염화 마그네슘을 포함하는 100mM 글리신-NaOH 버퍼 pH 9.5) 로 적당한 효소 농도로 희석한 희석 효소액 10μL 와 저해제 5μL 를 혼합하고, 37℃ 에서 10 분간 보온하였다. 여기에 0.05mM 또는 1.5mM NBD-C12- Ceramide, 1.25% 타우로데옥시콜산을 포함하는 100mM 글리신-NaOH 버퍼 pH 9.5 의 기질 용액 10μL 를 첨가하고 추가로 37℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 메탄올을 75μL 첨가하여 반응을 멈추고, 이 중의 50μL 를 HPLC 분석에 사용하였다.
HPLC 분석은 이하와 같이 하여 행하였다. 칼럼은 Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ, 4.6 × 50㎜ (나카라이테스크 제조), 용출액은 MeOH/1% TFA = 90 : 10 (v/v) 을 사용하여 아이소크라틱으로 용출하였다. 유속은 1mL/min, 검출은 형광 검출기를 사용하여 여기광 465㎚, 형광 535㎚ 에서 행하였다.
어느 효소의 경우도, 샘플은 효소 + 저해제 + 기질, 대조군으로서 효소 + 기질, 블랭크로서 저해제 + 기질의 조합으로 반응하고, 대조군의 활성을 100% 로 한 경우의 샘플의 활성의 비율로부터 저해율을 산출하였다.
또, 본 명세서에 있어서 단지 참고예 1 의 방법을 참조하는 경우, 래트 뇌 유래 중성/알칼리성 세라미다아제를 사용하는 방법을 의도한다.
실시예 4 해조 엑기스, 식물 엑기스 등의 세라미다아제 저해 효과
참고예 1 에 기재된 방법을 사용하여 실시예 1 ∼ 3 에서 얻어진 각종 해조, 식물 엑기스 등의 세라미다아제 저해 활성을, 최종농도 0.6mM 의 NBD-C12-Ceramide 를 기질로서 사용하여 측정하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다. 해조, 식물 엑기스 및 오렌지 오일 (리모넨) 의 희석은 디메틸술폭사이드로 행하였다.
Figure 112006045973963-PCT00004
실시예 5 미역 포자엽 엑기스의 세라미다아제 저해 효과
건조 미역 포자엽 칩 1g 을 5mL 의 100% 에탄올, 50% 에탄올, 25% 에탄올 용액으로 각각 하룻밤 추출하고, 여과하여 미역 포자엽 추출액을 얻었다. 엑기스 1mL 당의 건조 중량은 각각 8㎎, 72㎎, 74㎎ 이었다. 또한, 참고예 1 에 기재된 방법을 사용하고, 미역 포자엽 엑기스의 저해 활성을 최종농도 0.02mM 의 NBD-C12-Ceramide 를 기질로서 사용하여 측정하였다. 그 엑기스의 10 배 희석액의 세라미다아제 저해율은 각각 71%, 43%, 11% 이었다.
실시예 6 인간 백혈병 배양 세포에 대한 해조, 식물 엑기스의 효과 (TLC)
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL60 을 10% 소 태아 혈청과 페니실린·스트렙토마이신액 (GIBCO BRL 사 제조 : Lot No. 20K 1346) 1% 를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양하였다. 배양 세포를 1500rpm 의 원심 분리로 회수하고, 세포 펠릿을 UltraDOMA-PF 배지 (BioWhittaker 사 제조) 에서 세정하고, 세포수를 계수하고 최종적으로 2 × 10e7 세포/1.8mL 의 농도로 조정하여 6well 플레이트에 1.8mL 씩 분주하고, 추가로 동일한 환경에서 2 시간 배양을 계속하였다. 실시예 1 ∼ 3 에서 얻어진 각종 해조, 식물 엑기스는 2mL 분을 미리 농축 원심에 의해 용매를 증류 제거한 후, 40μL 의 디메틸술폭사이드 (DMSO) 를 첨가하여 용해하고, 추가로 UltraDOMA 배지를 1.8mL 첨가하였다. 이 엑기스 희석액을 상기 배양 세포 1.8mL 에 대하여 0.2mL 씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 3 시간까지 배양하였다. 대조군에 대해서는 엑기스 희석액의 조제에 사용한 것과 동등한 희석 성분만을 배양액에 첨가하였다. 하기와 같이 측정용 샘플링을 하여 생세포수와 스핑고 지질 측정용 샘플을 조제하였다.
10mL 의 스크류 캡이 부착된 유리 튜브에 마이크로 피펫으로 배양 세포액을 회수하고, 40μL 를 생세포 계수용으로 샘플링하였다. 이것에 UltraDOMA 배지를 140μL, 트리판 블루를 20μL 첨가하여 혈구 계수판에서 생세포수를 계측하였다. 나머지 세포를 사용하여 스핑고 지질 측정용 샘플을 조제하였다. 배양 세포액을 1,500rpm 으로 5 분간 원심 분리하고, 세포 펠릿을 1mL 의 PBS 로 3 회 세정하였다. 세정한 세포 펠릿에 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 포함하는 한크스 완충액 [HBSS, 라이프 테크놀로지즈사 제조 (Life Technologies Inc.)] 을 1mL 첨가하고, 이것을 지질 분석용 샘플로서 분석까지 -30℃ 에서 보존하였다.
분석용 샘플로부터의 지질의 추출은 이하와 같이 하여 행하였다.
1mL 의 분석 샘플에 클로로포름/메탄올 = 2 : 1 (v/v) 을 3mL 첨가하여 쉐이커로 20 분간 잘 교반하였다. 이것을 3,000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 하층을 별도의 유리 튜브에 옮겨 원심 농축기로 용매를 완전히 증류 제거하여 건조시켰다. 이것을 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석용 샘플로서 분석할 때까지 -30℃ 에서 보존하였다. TLC 분석은 이하의 조건으로 행하였다.
TLC 분석용 샘플에 클로로포름/메탄올 = 1 : 1 (v/v) 을 20μL 첨가하여 용해하고, 이것을 TLC 플레이트 (Merk 사 제조, HPTLC 플레이트 실리카 겔 60F254) 에 전량 어플라이하였다. 세라미드 스탠다드로서 Non-hydroxy fatty acid ceramide 또는 Non-hydroxyceramide (ceramide type Ⅲ, Sigma-Aldrich 사 제조) 및 Hydroxy fatty acid ceramide 또는 Hydroxyceramide (ceramide type Ⅳ, Sigma-Aldrich 사 제조) 를 사용하였다. 클로로포름/메탄올/아세트산 = 190 : 9 : 1 (v/v) 을 전개 용매로 하여 2 회 전개한 후, TLC plate 에 인산-구리 시약 (10% CuSO3 을 포함하는 8% 인산 용액) 을 분무하고 160℃ 에서 10 분간 가열하고, 나타난 스팟을 덴시토미터로 정량하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 동아, 여주, 쑥, 참외, 오이, 미역 포자엽의 추출물을 첨가한 군에서는 대조군에 비해 세포내의 세라미드량이 증가하고 있었다.
실시예 7 인간 백혈병 배양 세포에 대한 미역 포자엽 엑기스의 효과 (LCMS)
인간 전골수성 백혈병 세포주 HL60 을 10% 소 태아 혈청과 페니실린·스트렙토마이신액 (GIBCO BRL 사 제조 : Lot No. 20K 1346) 1% 를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양하였다. 배양 세포를 1500rpm 의 원심 분리로 회수하고, 세포 펠릿을 UltraDOMA-PF 배지 (BioWhittaker 사 제조) 에서 세정하고, 세포수를 계수하고 최종적으로 2 × 10e7 세포/1.8mL 의 농도로 조정하여 6well 플레이트에 1.8mL 씩 분주하고, 추가로 동일한 환경에서 2 시간 배양을 계속하였다. 미역 포자엽 엑기스는 2mL 분을 미리 농축 원심에 의해 용매를 증류 제거한 후, 40μL 의 디메틸술폭사이드 (DMSO) 를 첨가하여 용해하고, 추가로 UltraDOMA 배지를 1.8mL 첨가하여 DMSO 의 농도가 2% 가 되도록 조정하였다. 이 식물 엑기스 희석액을 상기 배양 세포 1.8mL 에 대하여 0.2mL 씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 24 시간까지 배양하였다. 대조군에 대해서는 엑기스 희석액의 조제에 사용한 것과 동등한 희석 성분만을 배양액에 첨가하였다. 0 시간, 0.5 시간, 1 시간, 3 시간 하기와 같이 측정용 샘플링을 행하고, 생세포수와 스핑고 지질 측정용 샘플을 조제하였다.
10mL 의 스크류 캡이 부착된 유리 튜브에 마이크로 피펫으로 배양 세포액을 회수하고, 40μL 를 생세포 계수용으로 샘플링하였다. 이것에 UltraDOMA 배지를 140μL, 트리판 블루를 20μL 첨가하여 혈구 계수판에서 생세포수를 계측하였다. 나머지 세포를 사용하여 신노 등의 방법 [Analytical Biochemistry, 제244권, 제291-300페이지, 1997 년] 에 따라서 스핑고 지질을 정량하였다. 배양 세포액을 1,500rpm 으로 5 분간 원심 분리하고, 세포 펠릿을 1mL 의 PBS 로 3 회 세정하였다. 세정한 세포 펠릿에 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 포함하는 한스크 완충액을 1mL 첨가하고, 이것을 지질 분석용 샘플로서 분석까지 -30℃ 에서 보존하였다.
LCMS 에서 사용하는 정량용 스핑고 지질 스탠다드는 다음과 같이 하여 조제하였다.
스핑고 지질은 모두 메탄올에 용해하였다. C18-스핑고미엘린 (C18-SM, 마트레야사 제조) 1㎎/mL 를 300μL, C18-세라미드 (C18-Cer, 마트레야사 제조) 10μg/mL 를 100μL, 스핑고신 (Sph, 시그마사 제조) 10μg/mL 를 100μL, 스핑고실포스포릴콜린 (SPC, 시그마사 제조) 3μg/mL 를 100μL, 디메틸스핑고신 (DMS, 아반티리피드사 제조) 1μg/mL 를 100μL, 사이코신 (Psy, 시그마사 제조) 1μg/mL 를 100μL 와 메탄올 200μL 를 혼합하여 전량을 1mL 로 하고, 이것을 스탠다드액 원액으로 하였다. 이것을 추가로 메탄올로 희석하여 10 배 희석액과 100 배 희석액을 조제하였다. 각 희석액 100μL 를 취해 900μL 의 0.1% BSA 를 포함하는 HBSS 에 첨가하여 잘 교반하고, 이것을 스핑고 지질 스탠다드 혼합액으로서 사용할 때까지 -30℃ 에서 보존하였다.
분석용 샘플 및 스탠다드로부터의 지질의 추출은 이하와 같이 행하였다.
1mL 의 분석 샘플에 클로로포름/메탄올 = 2 : 1 (v/v) 을 3mL 첨가하고, 추가로 내부 표준으로서 1μg/mL 의 C2-세라미드 (C2-Cer, 마트레야사 제조) 메탄올 용액을 100μL 첨가하여 볼텍스믹서로 10 분간 잘 교반하였다. 이것을 3,000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 하층을 별도의 유리 튜브에 옮겨 원심 농축기로 용매를 완전히 증류 제거하여 건조시켰다. 이것을 LCMS 분석용 샘플로서 분석할 때까지 -30℃ 에서 보존하였다.
LCMS 는 이하의 조건으로 행하였다.
HPLC 칼럼은 YMC 제조 세미마이크로 쇼트 칼럼, YMC-Pack Pro C18 (2.0 × 35㎜, 3㎛, YMC 사 제조) 을 사용하였다. 용출액 A 는 5mM 포름산 암모늄/메탄올/테트라히드로푸란 = 5 : 2 : 3 (v/v/v) (최종농도 0.01% 포름산 함유), 용출액 B 는 5mM 포름산 암모늄/메탄올/테트라히드로푸란 = 1 : 2 : 7 (v/v/v) (최종농도 0.01% 포름산 함유). HPLC 로부터의 용출액을 스플리터를 통해 이온 스프레이식 4중 극형 질량 분석 장치 (API 300, 어플라이드바이오시스템즈사 제조) 에 도입하였다. 오레피스 전압은 70eV, 이온 스프레이 전압은 5000V, 포지티브 모드이고, 아르곤 가스를 콜리존 가스로서 사용하여 멀티플 리액션 모니터링 모드로 측정하였다. 모니터링 이온은 표 2 에 나타낸다.
결과를 도 2 에 나타낸다. 도면 중, 미역 포자엽 엑기스 첨가군을 검은 동그라미, 대조군을 흰 동그라미로 나타낸다. A 는 C18-스핑고미엘린 (C18-SM), B 는 C-16 세라미드 (C16-Cer), C 는 C18-세라미드 (C18-Cer), D 는 스핑고신 (Sph), E 는 스핑고신-1-인산 (SPP), F 는 HL60 세포수를 나타낸다. 미역 포자엽 엑기스 첨가군에서는 대조군에 비하여 세포내 C16-Cer 이 약 15 배, C18-Cer 이 약 10 배로 상승하였다. 한편, 세라미드의 분해 산물인 Sph 는 대조군과 비교하여 약 4 배 증가되어 있었다. 또한, 스핑고신의 대사 산물인 스핑고신-1-인산은 미역 포자엽 엑기스 첨가군에서는 대조군에 비교하여 약간 감소 경향을 나타냈다. C18-SM 의 레벨은 변화되지 않았다. 또한, HL60 세포의 증식은 미역 포자엽 엑기스 첨가군에서는 대조군에 비교하여 유의하게 억제되었다. 또한, 이 세포로부터 ApopLadder Ex (다카라바이오사 제조) 를 사용하여 DNA 를 추출하고, 1% 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동에 제공하여 에티듐브로마이드로 염색한 결과, 미역 포자엽 엑기스 첨가군의 세포에서는 단편화된 DNA 의 래더가 검출되고, 세포가 아포토시스를 일으키고 있는 것이 분명해졌다. 이들 결과로부터, 미역 포자엽 엑기스의 세라미다아제 저해 효과에 의해 세포내 세라미드량이 증가하고, 세포 증식이 저해되고, 세포가 아포토시스를 일으킨 것이 분명해졌다.
Figure 112006045973963-PCT00005
실시예 8 인공 배양 피부에 있어서의 세라미다아제 저해제의 효과
시판되고 있는 정상 인간 피부 3 차원 배양 모델 (쿠라보사 제조, EPI-100) 을 사용하여 피부 세포에 대한 세라미다아제 저해제의 효과를 측정하였다. 먼저, 각 웰에 EPI-100 용 유지 배지 (겐타마이신프리 배지) 2mL 를 넣은 6well 배양 플레이트의 각 웰내에 EPI-100 의 미니컵을 넣어 37℃, 5% CO2 환경 하에서 72 시간 배양하였다. 배지를 새로운 배지 4mL 로 교환하고 나서, 미니컵에 실시예 1 에서 얻은 미역 포자엽 에탄올 엑기스의 희석액 50μL 를 첨가하였다. 미역 포자엽 에탄올 엑기스는 일단 용매를 증발기로 제거한 후, 추출물의 농도가 0.05% ∼ 0.001% (w/v) 가 되도록 비히클 (0.5% 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유를 포함하는 80% 프로필렌글리콜) 에 재용해한 것을 사용하였다. 비히클만을 첨가한 것을 대조군으로 하였다. 37℃, 5% CO2 환경 하에서 24 시간 배양한 후 배지를 교환하고, 미니컵에 에탄올 엑기스를 첨가하여 24 시간 배양을 계속하였다. 또한 추가 1 회의 배지 교환과 에탄올 엑기스를 첨가하여 24 시간 배양한 후, 미니컵을 꺼내 피부 세포 중의 세라미드를 측정하였다. 먼저, 컵을 생리 식염수로 세정한 후, 핀셋으로 배양 피부를 꺼내고, 스크류 캡이 부착된 유리 시험관에 옮겨 동결 건조시켰다. 이것에 클로로포름/메탄올 (2 : 1) 2mL 를 첨가하여 때때로 교반하면서 실온에서 2 시간 세라미드 획분을 추출하였다. 2,000rpm 으로 5 분간 원심한 후, 상청을 별도의 유리 튜브에 옮겼다 (상청 1). 침전은 농축 원심 장치로 건조시킨 후, 다시 클로로포름/메탄올 (2 : 1) 2mL 로 추출 조작하고, 원심 분리로 상청을 얻었다 (상청 2). 상청 1 과 2 를 합쳐 용매를 제거하고, 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석용 샘플로서 분석할 때까지 -30℃ 에서 보존하였다. TLC 분석은 실시예 6 과 동일한 방법으로 행하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 도면 중 흑색 그래프는 Non-hydroxyceramide 를, 백색 그래프는 Hydroxyceramide 를 나타낸다. 미역 포자엽 에탄올 엑기스 첨가군에서는 대조군에 비해 인공 배양 피부 중의 Non-hydroxyceramide, Hydroxyceramide 모두 첨가한 엑기스 농도에 의존하여 유의하게 증가하였다. 또, 도 3 중의 * 는 대조군에 대한 t-검정에 있어서의 p < 0.05, ** 는 p < 0.005 를 나타낸다.
실시예 9 인공 배양 피부에 있어서의 녹농균 감염 모델에 대한 세라미다아제 저해제의 효과
아토피성 피부 환자의 피부 표면에서는 각층 세포의 세포간을 메우는 세라미드가 감소하고 있는 것, 그 감소가 피부 배리어 기능 부전, 즉 외계로부터 체내로의 용이한 항원 침입과 체외로의 과잉의 수분 상실을 야기하고, 나아가서는 본 증상의 발증과 악화에 관여할 가능성이 지적되고 있다. 최근 큐슈 대학의 이토 등에 의해 아토피성 피부염 환자의 피부로부터 세라미다아제를 생산하는 세균이 통계상 유의하게 높은 빈도로 검출되는 것, 이들 세균의 대부분이 녹농균인 것이 보고되어 있다 [J. Biol. Chem., 273, 14368-14373 (1998) 및 Clinc. Diagnost. Lab. I㎜un., 6, 101-104 (1999)]. 한편, 아토피성 피부염 환자의 피부에는 높은 빈도로 황색포도구균의 감염이 보이는 것이 잘 알려져 있다. 마찬가지로 이토 등에 의해 세라미다아제 생산균이 황색포도구균을 용해하는 프로테아제를 생산하는 것, 용해된 황색포도구균으로부터 세라미다아제를 활성화하는 카르디오리핀이나 포스파티딜글리세롤 등의 음이온성 글리세로린 지질이 용출하는 것이 보고되어 있다 [Biochem. J., 362, 619-626 (2002)]. 이들로부터 세라미다아제 분비균인 녹농균이 아토피성 피부염 환자 피부에 감염되면, 황색포도구균을 용해하고, 그곳으로부터 용출된 글리세로린 지질이 세라미다아제를 활성화하고, 피부 각질층의 세라미드 레벨이 저하된다는 가능성을 생각할 수 있다.
그래서, 정상 인간 피부 3 차원 배양 모델 (EPI-100) 에 녹농균을 감염시킨 계에 세라미다아제 저해제를 첨가하여 그 효과를 평가하였다.
먼저, 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa AN17 주) 을 L-broth (다카라바이오사 제조) 를 사용하여 30℃ 에서 배양하고, A660㎚ 의 값이 0.6 이 되었을 때 배양을 종료하여 균체를 회수하였다. 이것을 PBS 로 세정하고, 4 × 107cfu/mL 이 되도록 PBS 에 현탁하였다. 한편, 황색포도구균 (Staphylococcus aureus) 도 L-broth, 30℃ 에서 액체 배양하고, A660㎚ 의 값이 0.6 이 되었을 때 배양을 종료하여 균체를 회수하였다. 균체를 PBS 로 세정한 후, 20 × 107cfu/mL 이 되도록 PBS 에 현탁한 것을 100℃, 5 분간 처리하여 사균을 조제하였다. 이 황색포도구균 사균 현탁액을 PBS 로 5 배로 희석한 것과, 녹농균의 PBS 현탁액을 사용하기 직전에 등량씩 혼합하여 사용하였다. 각 웰에 EPI-100 용 유지 배지 (겐타마이신프리 배지) 0.9mL 를 넣은 6well 배양 플레이트의 각 웰내에 EPI-100 의 미니컵을 넣어 37℃, 5% CO2 환경 하에서 2 시간 예비 배양하였다. 새로운 유지 배지 2mL 로 교환하고 나서, 미니컵에 50μL 의 박테리아 현탁액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 72 시간 배양하였다. 새로운 유지 배지 4mL 로 교환하고 나서 실시예 8 에서 사용한 미역 포자엽 에탄올 엑기스 희석액을 50μL 첨가하였다. 또한, 비히클만을 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다. 37℃, 5% CO2 환경 하에서 24 시간 배양한 후 배지를 교환하고, 미니컵에 에탄올 엑기스를 첨가하여 24 시간 배양을 계속하였다. 또한, 추가 1 회의 배지 교환과 에탄올 엑기스를 첨가하여 24 시간 배양한 후, 미니컵을 꺼내 피부 세포 중의 세라미드를 측정하였다. 먼저, 컵을 생리 식염수로 세정한 후, 핀셋으로 배양 피부를 꺼내고, 스크류 캡이 부착된 유리 시험관에 옮겨 동결 건조시켰다. 이것에 클로로포름/메탄올 (2 : 1) 2mL 를 첨가하여 때때로 교반하면서 실온에서 2 시간 세라미드 획분을 추출하였다. 2,000rpm 으로 5 분간 원심한 후, 상청을 별도의 유리 튜브에 옮겼다 (상청 1). 침전은 농축 원심 장치로 건조시킨 후, 다시 클로로포름/메탄올 (2 : 1) 2mL 로 추출 조작하고, 원심 분리로 상청을 얻었다 (상청 2). 상청 1 과 2를 합쳐 용매를 제거하고, 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석용 샘플로서 분석할 때까지 -30℃ 에서 보존하였다. TLC 분석은 실시예 6 과 동일한 방법으로 행하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. 도면 중 흑색 그래프는 Non-hydroxyceramide 를, 백색 그래프는 Hydroxyceramide 를 나타낸다. 0.05% 미역 포자엽 에탄올 엑기스 첨가군에서는 대조군에 비해 인공 배양 피부 중의 Non-hydroxyceramide 는 유의하게 증가하고, Hydroxyceramide 에 관해서도 증가 경향이 보였다. 또한, 0.05% 미역 포자엽 에탄올 엑기스 첨가군에서는 세라미드 레벨이 녹농균을 첨가하고 있지 않은 실시예 8 의 대조군 (도 3 참조) 의 세라미드 레벨보다 증가하고 있으므로, 미역 포자엽 엑기스에는 녹농균의 세라미다아제에 의한 피부 각층 세라미드 감소를 회복시키고, 또한 피부 각층 중의 세라미다아제도 저해함으로써 각층 중의 세라미드량을 더욱 증가시키는 효과가 있는 것이 나타났다. 또, 도 4 중의 * 는 대조군에 대한 t-검정에 있어서의 p < 0.05 를 나타낸다.
실시예 10 인공 배양 피부에 있어서의 녹농균 감염 모델에 대한 세라미다아제 저해제의 효과
실시예 9 와 동일한 방법으로 각종 식물 유래의 추출물의 효과를 평가하였다. 미역 포자엽 에탄올 엑기스는 실시예 1 에서 얻은 것으로부터 용매를 제거한 후, 추출물의 농도가 0.05% (w/v) 가 되도록 비히클 (0.5% 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유를 포함하는 80% 프로필렌글리콜) 에 재용해한 것을 사용하였다. 참다시마 엑기스는 실시예 2 에서 얻은 것으로부터 용매를 제거한 것을 추출물의 농도가 0.05% (w/v) 가 되도록 비히클로 희석하였다. 동아 엑기스는 실시예 3 에서 얻은 것으로부터 용매를 제거하고, 추출물 농도가 0.5% (w/v) 가 되도록 비히클로 희석하였다. 오렌지 오일 (야마모토 향료사 제조) 은 비히클로 1000 배로 희석한 것을 사용하였다. 그레이프후르츠 엑기스 (80% 프로필렌글리콜 추출, 야마모토 향료사 제조) 는 원액을 그대로 사용하였다. 또한, 비히클만을 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다. 그 밖의 방법은 실시예 9 와 동일하다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 도면 중 흑색 그래프는 Non-hydroxyceramide 를, 백색 그래프는 Hydroxyceramide 를 나타낸다. 미역 포자엽 엑기스 첨가군, 참다시마 엑기스 첨가군, 동아 엑기스 첨가군, 오렌지 오일 첨가군에서는 대조군에 비교하여 인공 배양 피부 중의 Non-hydroxyceramide 량은 유의하게 증가하고, Hydroxyceramide 에 관해서도 증가 경향이 보였다. 또한, 그레이프후르츠 엑기스 첨가군에 대해서도 세라미드량의 증가 경향이 보였다. 또, 도 5 중의 * 는 대조군에 대한 t-검정에 있어서의 p < 0.05, ** 는 p < 0.005 를 나타낸다.
실시예 11 미역 포자엽 엑기스로부터의 세라미다아제 저해 물질의 정제
(1) 스테인리스제 용기에 건조 미역 포자엽 칩 10㎏ 과 20L 의 에탄올을 첨가하여 조용히 수회 교반하고, 그대로 하루 정치하였다. 이것을 여과, 에탄올로 세정하여 미역 포자엽 에탄올 추출액 34.4L 를 얻었다.
(2) 미쓰비시화학 제조 DIAION HP20 을 유리제 칼럼에 채우고 (2.5L), EtOH 로 세정한 후, 50% EtOH 로 평형화하였다. 여기에 미역 포자엽 에탄올 추출액 34.4L 에 동량의 물을 첨가하여 50% EtOH 용액 (68.8L) 을 흘렸다. 전량 어플라이한 후에 50% EtOH, 12.5L 로 세정, 25L 의 EtOH 로 용출하였다. 그대로 세정, 용출의 각 획분의 저해 활성을 측정한 결과, EtOH 용출 획분에 활성이 관찰되었기 때문에, 이 획분을 농축하여 EtOH 를 제거하였다. 수량 136g 이었다.
(3) Silica Gel 60 (Merk 사 제조) 을 유리 칼럼에 충전하고 (3.5 × 37㎝, 350mL), 1L 의 n-Hexane 으로 평형화하였다. (2) 의 활성 획분에 n-Hexane 을 첨가하여 300mL 로 하고, 칼럼에 첨가하였다. 500mL 의 n-Hexane 과 1L 의 클로로포름으로 세정한 후, C/M = 9 : 1, C/M = 8 : 2 각각 1L 로 용출하였다. 저해 활성의 약 80% 가 C/M = 9 : 1 의 프랙션에 용출하였다.
(4) Ultrapack Silica Gel 60 (Yamazen 사 제조, 37 × 300㎜, 322mL) 을 유속 10mL/min 으로 1L 의 n-Hexane 으로 세정후 1L 의 클로로포름으로 평형화한 후 (3) 의 활성 획분 (용매를 증발 건고시킨 후 클로로포름에 용해하여 50mL 로 한 것) 을 어플라이하였다. 1.5L 의 클로로포름으로 세정한 후, 클로로포름으로부터 아세트산에틸로 구배 용출하였다 (0 ∼ 100% 아세트산에틸/150 min). 마지막으로 500mL 의 아세트산에틸로 세정하였다. 저해 활성은 2개의 프랙션으로 나뉘어 용출하였다.
각 프랙션을 모아 용매를 증류 제거하였다.
프랙션 Ⅰ : 수량 1925㎎
프랙션 Ⅱ : 수량 440㎎
(5) 상기 실리카 겔 크로마토그래피로 얻은 프랙션 Ⅰ 을 추가로 역상 HPLC 로 정제하였다. 최초에 Cosmosil 5C18AR (10㎜ × 250㎜, 나카라이테스크사 제조) 을 사용하였다. 프랙션 Ⅰ 을 50% 이소프로판올 10mL 에 용해하여 5 회로 나눠 크로마토그래피를 행하였다. 용출 용매로서 용매 A (50% 이소프로판올) 와 용매 B (100% 이소프로판올) 를 사용하고, 용매 B 의 비율을 0 분에서 20 분까지 0%, 20 분에서 60 분까지 0 ∼ 100% 까지 변화시키고, 60 분에서 80 분까지 100% 그대로 유지하였다. 유량은 2mL/분으로 용출액을 1 분마다 분취하였다. 각 프랙션의 세라미다아제 저해 활성을 참고예 1 의 방법 (최종농도 0.02mM 의 NBD-C12-Ceramide 를 사용, 이하 동일) 에 의해 측정하였다. 저해 활성은 프랙션 51 ∼ 70 에 검출되었다. 활성 획분을 모아 용매를 제거하였다. 수량 450㎎ 이었다.
(6) 상기 (5) 에서 얻은 획분의 3/10 을 YMC AM-322 (10㎜ × 150㎜, YMC 사 제조) 를 사용하여 정제를 계속하였다. 샘플은 이소프로판올에 용해하였다. 용출 용매로서 용매 A (50% 이소프로판올) 와 용매 B (100% 이소프로판올) 를 사용하고, 용매 B 의 비율을 0 분에서 10 분까지 0%, 10 분에서 50 분까지 0 ∼ 100% 까지 변화시키고, 50 분에서 55 분까지 100% 그대로 유지하였다. 유량은 2mL/분으로 샘플 주입후 20 분부터 용출액을 1 분마다 분취하였다. 각 프랙션의 세라미다아제 저해 활성을 참고예 1 의 방법에 의해 측정하였다. 저해 활성은 프랙션 15 ∼ 35 에 검출되었다. 활성 획분을 모아 용매를 제거하였다. 수량 32㎎ 이었다.
(7) 상기 (6) 에서 얻은 획분을 XTerra RP18 (4.6㎜ × 150㎜, 워타즈사 제조) 을 사용하여 정제를 계속하였다. 샘플은 이소프로판올에 용해하여 2 회로 나눠 크로마토그래피를 행하였다. 용출 용매로서 용매 A (50% 이소프로판올) 와 용매 B (100% 이소프로판올) 를 사용하고, 용매 B 의 비율을 0 분에서 10 분까지 0%, 10 분에서 50 분까지 0 ∼ 100% 까지 변화시키고, 50 분에서 55 분까지 100% 그대로 유지하였다. 유량은 1mL/분으로 샘플 주입후 20 분에서 용출액을 30 초마다 분취하였다. 각 프랙션의 세라미다아제 저해 활성을 참고예 1 의 방법에 의해 측정하였다. 저해 활성은 획분 Ⅰ (프랙션 13 ∼ 20) 과 획분 Ⅱ (프랙션 21 ∼ 25) 의 2 획분으로 검출되었다. 활성 획분을 모아 용매를 제거하였다. 수량 획분 Ⅰ : 10㎎, 획분 Ⅱ : 6㎎ 이었다.
(8) 상기 (7) 에서 얻은 획분 Ⅰ 을 Sy㎜etry Shield RP18 (4.6㎜ × 150㎜, 워타즈사 제조) 을 사용하여 정제를 계속하였다. 샘플은 클로로포름/에탄올 (1 : 1) 에 용해하였다. 용출 용매로서 용매 A (50% 이소프로판올) 와 용매 B (100% 이소프로판올) 를 사용하고, 용매 B 의 비율을 0 분에서 30 분까지 30 ∼ 70%, 30 분에서 35 분까지 100% 그대로 유지하였다. 유량은 1mL/분으로 검출은 220㎚, 샘플 주입후 10 분부터 용출액을 15 초마다 분취하였다. 각 프랙션의 세라미다아제 저해 활성을 참고예 1 의 방법에 의해 측정하였다. 저해 활성은 획분 Ⅰ-Ⅰ (프랙션 26 ∼ 29), 획분 Ⅰ-Ⅱ (프랙션 30 ∼ 35) 와 획분 Ⅰ-Ⅲ (프랙션 36 ∼ 42) 의 3 획분에 검출되었다. 활성 획분을 모아 용매를 제거하였다. 획분 Ⅰ-Ⅲ (수량 3.3㎎) 에 대하여 NMR 분석과 질량 분석에 의한 구조 해석을 하였다.
(9) 상기 (8) 에서 얻어진 획분 Ⅰ-Ⅲ 에 대하여 이온스프레이형 질량 분석기 (API-Ⅲ, 어플라이드바이오시스템즈사 제조) 를 사용하여 질량 분석하였다. 측정 용매로서 0.1% 포름산을 포함하는 80% 아세토니트릴을 사용하고, 포지티브 모드로 측정하였다. 그 결과, m/z 565 (M+H)+ 의 시그널을 검출하였다. 도 6 에 질량 스펙트럼을 나타낸다. 또한, 이 이온을 친이온으로 하여 MS/MS 분석한 결과, 딸이온으로서 m/z 547 과 m/z 338 의 시그널을 검출하였다. 도 7 에 MS/MS 분석의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 6 및 도 7 에 있어서, 횡축은 m/z 값, 종축은 시그널의 상대 강도를 나타낸다.
또한, 핵자기 공명 (NMR) 스펙트럼 분석 장치 (Bruker 사 제조) 를 사용하여 각종 NMR 스펙트럼을 측정하고, 구조 해석하였다. 이하에 각종 NMR 의 신호를 나타낸다.
1H-NMR : δ
Figure 112006045973963-PCT00006
단, 1H-NMR 에서 샘플은 중클로로포름에 용해하고, 중클로로포름 중의 잔류 프로톤의 화학 시프트값을 7.24ppm 으로 나타냈다. 도 8 에 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 8 에 있어서, 횡축은 화학 시프트값, 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
13C-NMR : δ
Figure 112006045973963-PCT00007
단, 13C-NMR 에서 샘플은 중클로로포름에 용해하고, 중클로로포름 중의 잔류 프로톤의 화학 시프트값을 77.0ppm 으로 나타냈다. 도 9 에 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 9 에 있어서, 횡축은 화학 시프트값, 종축은 시그널의 강도를 나타낸다.
이상의 결과로부터, 세라미다아제 저해 물질로서 추정할 수 있는 화합물 중, 일례로서 이하의 식 (1) 로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112006045973963-PCT00008
정제물의 세라미다아제 저해 활성을 참고예 1 의 방법에 의해 측정한 결과, 본 물질은 5μM 의 저농도로 래트 뇌 유래 중성/알칼리성 세라미다아제 활성을 50% 저해하였다. 한편, 종래부터 세라미다아제 저해제로서 시판되고 있는 D-e-MAPP 는 5mM 의 농도에서도 저해율은 28% 이었다.
본 발명에 의해 세라미다아제 활성 저해제, 그 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 의약품, 의약 부외품, 화장료, 식품이 제공되었다.

Claims (20)

  1. 은행 나무과 식물, 참외과 식물, 귤과 식물, 다시마과 식물, 도금양과 식물 및 국화과 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 식물 유래의 처리물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성 저해제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    은행 나무과 식물이 은행 나무이고, 참외과 식물이 월과, 오이, 동아 및 여주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 귤과 식물이 오렌지, 그레이프후르츠 및 라임으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 다시마과 식물이 개다시마, 참다시마 및 미역으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개이고, 도금양과 식물이 유칼리이고, 국화과 식물이 쑥인 세라미다아제 활성 저해제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미드량 조절제.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품.
  5. 제 4 항에 있어서,
    의약품이 피부 외용제인 의약품.
  6. 제 4 항에 있어서,
    의약품이 세포 증식 억제를 필요로 하는 질환에 대한 치료제 또는 예방제인 의약품.
  7. 제 4 항에 있어서,
    의약품이 암의 치료제 또는 예방제인 의약품.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 부외품.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품.
  11. 하기 이화학적 성질을 갖는 화합물, 그 유도체, 또는 약학적으로 허용되는 그들의 염.
    (1) 질량 스펙트럼 : m/z 565(M+H)+
    (2) MS/MS 분석 : 상기 (1) 을 친이온으로 했을 때의 딸이온이 m/z 547, m/z 338
    (3) 1H-NMR (중클로로포름) : δ
    Figure 112006045973963-PCT00009
    (4) 13C-NMR (중클로로포름) : δ
    Figure 112006045973963-PCT00010
  12. 제 11 항에 기재된 화합물, 유도체 및 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 세라미다아제 활성 저해제.
  13. 제 12 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하 는 세라미드량 조절제.
  14. 제 12 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품.
  15. 제 14 항에 있어서,
    의약품이 피부 외용제인 의약품.
  16. 제 14 항에 있어서,
    의약품이 세포 증식 억제를 필요로 하는 질환에 대한 치료제 또는 예방제인 의약품.
  17. 제 14 항에 있어서,
    의약품이 암의 치료제 또는 예방제인 의약품.
  18. 제 12 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 부외품.
  19. 제 12 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료.
  20. 제 12 항에 기재된 세라미다아제 활성 저해제를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품.
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