KR102516429B1 - 바실러스 속 균주와 이를 이용한 금화규 발효물의 용도 - Google Patents

바실러스 속 균주와 이를 이용한 금화규 발효물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 양태로서 제공하는 기탁번호 KCTC18811P의 바실러스(Bacillus) 속 균주는 종래에 보고되지 아니한 신규 균주로서, 고온 환경과 높은 염 농도 환경에서도 모두 생존할 수 있다는 특수한 생물학적 성질을 가지며, 아밀라아제와 프로테아제 활성이 높은 특징이 있다.
본 발명의 일 양태로서 제공하는 금화규 발효물은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 금화규를 포함하는 것으로서, 비접종 금화규 배양물 처리시 대비 항산화 활성과 항염증 활성이 매우 높다.
본 발명의 일 양태로서 제공하는 화장료 조성물, 식품 조성물 및 약학적 조성물은 상기 발효물을 포함하고 있어, 항산화 용도 또는 항염증 용도로 사용할 수 있다.

Description

바실러스 속 균주와 이를 이용한 금화규 발효물의 용도{Bacillus genus strain and use of fermented Aurea helianthus using the same}
본 발명은 바실러스 속 균주와 이를 이용한 금화규 발효물의 용도에 관련된 것이다.
바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물은 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성혐기성 간균으로서 탈질, 철환원,　망간산화 등에 관여한다. 환경조건에 따라 균체 내에 구조적 변화가 생겨　포자(아포자)를 형성한다. 포자는 열, 방사선, 화학물질 등에 대한 저항성이 강하고, 영양세포에는 존재하지 않는 디피코인산의　칼슘염을 다량 함유한다.
균체의 크기, 포자의 형태와 균체 내에서의 위치, 당의 이용과 생성물, 질산환원 유무, 고식염농도하에서의 생장 유무 등의 성질에 따라 여러 종으로 분류된다. 대표 종은 고초균(Bacillus　subtilis), 탄저병균, 세레우스균(식중독의 원인균) 등이다. 일반적인 용어로 간균, 또는　세균　전체를 뜻하기도 한다.
한편,　금화규(Aurea Helianthus)는 진귀한 약용식물인 일년생 초본식물로 금화규의 꽃과 잎은 물론 꽃대와 뿌리에도 콜라겐이 풍부하고 해열, 해독, 항염증, 진통 효과 등 다양한 악성 통증 치료에 이용된다고 한다. 또한 천연 식물성 에스트로겐이 풍부하여 갱년기 증후군을 감소시키는데 도움을 준다. 그러나, 이의 바실러스 속 미생물을 이용하여 발효시킨 발효물의 용도에 대해서 연구된 바는 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신규한 바실러스 속 균주를 확인하였고, 이를 이용한 금화규 발효물의 용도를 개발하였다.
한국등록특허 제1783469호
본 발명은 바실러스 속 균주와 이를 이용한 금화규 발효물의 용도를 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명의 일 양태로서, 기탁번호 KCTC18811P의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 제공한다.
상기 균주는 종래에 보고되지 아니한 신규 균주로서, 고온에서 생존이 가능하고, 높은 염(예를 들어, NaCl) 농도에서도 생존이 가능하며, 높은 아밀라아제 활성 또는 높은 프로테아제 활성을 나타내는 균주일 수 있다.
상기 균주는 보다 구체적으로 바실러스 리체니포르미스(Bacillus Licheniformis)일 수 있다.
상기 균주의 보다 구체적인 특성은 하기 실시예들을 참조하여 해석될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 균주를 이용하여 발효시킨 금화규를 포함하는, 금화규(Aurea helianthus) 발효물을 제공한다.
상기 발효물은 상기 균주를 이용하여 당업계에 알려진 통상의 발효방법에 따라 발효된 것일 수 있고, 특별한 제한은 없으나, 1% 금화규 건조 분말, 3% Nacl 및 0.1% 효모추출물을 포함하는 배지에 상기 균주를 접종한 후 진탕배양하여 발효된 것일 수 있다.
상기 발효물은 보다 구체적으로 30 ~ 40 ℃의 온도에서 발효시킨 것일 수 있고, 바람직하게는 35 ~ 38 ℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효물은 보다 구체적으로 0.5 내지 10, 0.5 내지 9.5, 0.5 내지 9, 0.5 내지 8.5, 0.5 내지 8, 0.5 내지 7.5, 0.5 내지 7, 0.5 내지 6.5, 0.5 내지 6, 0.5 내지 5.5, 0.5 내지 5, 0.5 내지 4.5, 0.5 내지 4, 0.5 내지 3.5, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 2, 0.5 내지 1.5, 4 내지 10, 4 내지 9.5, 4 내지 9, 4 내지 8.5, 4 내지 8, 4 내지 7.5, 4 내지 7, 4 내지 6.5 또는 4 내지 6일 동안 발효시킨 것일 수 있고, 바람직하게는 금화규를 발효하여 원물 대비 성분변화를 효과적으로 유도하면서도, 금화규 내 유효 단백질의 과도한 분해를 억제하는 측면에서 0.5 내지 7일 동안 발효시킨 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 금화규 원물이 갖는 세포독성을 억제하면서 항산화/항염증 효능을 증진시키는 측면에서 4 내지 6일 동안 발효시킨 것을 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효물은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 금화규 발효물을 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 추출물은 열수 추출물, 냉침 추출물, 환류 추출물, 용매 추출물, 수증기 증류 추출물, 초음파 추출물, 용출물 또는 압착 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 발효물을 포함하는 항산화용 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물에는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분이 추가로 포함될 수 있고, 이들은 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 특별한 제한없이 포함 가능하다.
상기 화장료 조성물에는 또한 통상의 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수도 있다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
상기 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.
상기 보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
상기 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.
상기 계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
상기 유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.
상기 유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.
상기 자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
상기 살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.
상기 산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.
상기 pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.
상기 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.
또한 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또 상기 어느 성분도 상기 화장료 조성물의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 ~ 3 중량%로 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 발효물 또는 추출물 이외에 화장료에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.
상기 화장료 조성물 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 발효물을 포함하는 항산화용 또는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 상기 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 이외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 상기 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
상기 식품 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 발효물을 포함하는 항산화용 또는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 '항산화' 또는 '항염증'은 약학 분야의 당업계 통상의 기술자라면 명확하게 이해할 수 있는 기재로서, '항산화'는 ABTS, DPPH 등의 소거능에 기반한 실험적 기술효과, '항염증'은 ROS, NO 등의 소거능에 기반한 실험적 기술효과로부터 각각 도출될 수 있는 관련 질환의 약학적 예방 또는 치료용도에 관련된 기재로서, 당업계 통상의 기술자가 구체적인 약학적 용도를 명확하게 파악할 수 있는 것임은 자명할 것이다.
상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
나아가 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 항산화 또는 항염증 제제와 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 항산화 또는 항염증 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
상기 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 항산화 또는 항염증을 목적하는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보다 효과적인 흡수경로를 선택한다는 관점에서 바람직하게는 구강투여를 택할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01 ~ 1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1 ~ 500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 그 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 발효물 또는 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서 제공하는 기탁번호 KCTC18811P의 바실러스(Bacillus) 속 균주는 종래에 보고되지 아니한 신규 균주로서, 고온 환경과 높은 염 농도 환경에서도 모두 생존할 수 있다는 특수한 생물학적 성질을 가지며, 아밀라아제와 프로테아제 활성이 높은 특징이 있다.
본 발명의 일 양태로서 제공하는 금화규 발효물은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 금화규를 포함하는 것으로서, 상기 균주를 접종하지 않았으나 동일한 배양과정의 금화규 배양물 처리시 대비 항산화 활성과 항염증 활성이 매우 높다.
본 발명의 일 양태로서 제공하는 화장료 조성물, 식품 조성물 및 약학적 조성물은 상기 발효물을 포함하고 있어, 항산화 용도 또는 항염증 용도로 사용할 수 있다.
도 1은 분리 및 동정한 438 바실러스 속 균주를 속에 따라 분류한 결과이다.
도 2는 분리 및 동정한 438 바실러스 속 균주를 종에 따라 분류한 결과이다.
도 3은 분리 및 동정한 438 바실러스 속 균주의 배양 특성을 분석한 결과이다.
도 4는 분리 및 동정한 438 바실러스 속 균주의 효소 활성능을 분석한 결과이다.
도 5는 금화규 원물에 상기 균주와 다른 바실러스 속 균주들을 각각 처리하여 발효시킨 발효물 내 단백질 총량을 정량한 결과이다.
도 6은 금화규 원물에 상기 균주와 다른 바실러스 속 균주들을 각각 처리하여 발효시킨 발효물의 ABTS 라디칼 소거능을 평가한 결과이다.
도 7은 기탁번호 KCTC18811P의 바실러스(Bacillus) 속 균주(CP-6)의 유전정보 분석 결과를 도식화한 것이다.
도 8은 비접종 금화규 배양물과, 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과이다.
도 9는 비접종 금화규 배양물과, 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 10은 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 항염 효능을 세포의 형태학적 변화를 통해 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 11a는 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 ROS 소거능을 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 11b는 상기 도 11a의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 12a는 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 NO 소거능을 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 12b는 상기 도 12a의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 13은 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 COX-2와 iNOS의 발현 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 14는 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 염증 촉진성 싸이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 15는 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 NF-κB 활성과 관련된 단백질의 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 16은 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 MAPK 활성과 관련된 ERK1/2, JNK1/2 인산화 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 17은 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 MAPK 활성과 관련된 p38의 인산화 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 18a는 금화규 원물에 상기 균주를 처리하여 발효시킨 발효물의 MAPK 활성 억제를 평가한 결과이다(Normal cell: 정상세포; LPS 1μg/ml: 정상세포에 LPS 1μg/ml 처리군; LPS+Con(1D): 정상세포에 비접종 금화규 배양물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군; LPS+CP-6(1D): 정상세포에 CP-6 금화규 발효물 처리한 후, 1μg/ml LPS 처리군).
도 18b는 상기 도 18a의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 19는 금화규 원물에 CP-6 균주를 처리하여 발효시킨 발효물을 LC MS/MS로 측정한 크로마토그램이다.
도 20은 금화규 원물에 CP-6 균주를 처리하여 발효시킨 발효물(CP6-1D)의 LC MS/MS 질량스펙트럼(A) 및 이소큐엘세틴(isoquercetin) 표준품의 LC MS/MS 질량스펙트럼(B)이다.
도 21은 이소큐엘세틴(isoquercetin)의 구조식이다.
이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예는 예시적인 것으로, 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 금화규의 성분 분석
금화규 발효 균주 선정 조건을 확립하기 위하여 금화규 꽃잎 및 꽃 받침대 분말의 5대 영양소 분석을 진행하였다. 열량, 탄수화물, 지방, 콜레스테롤, 단백질의 분석 결과는 하기 표 1과 같다. 꽃잎과 꽃받침의 열량 및 탄수화물은 비슷한 함량을 함유하고 있었으며, 콜레스테롤은 모두 검출되지 않았고 꽃잎의 지방 함량은 2.15 g/100 mL로 꽃 받침대의 지방 함량 보다 1.34배 높았으며 꽃 받침대의 단백질 함량이 8.15 g/100 mL로 꽃잎의 단백질 함량보다 1.76배 더 많이 함유하고 있었다.
영양소 함량
꽃잎 열량 353 (Kcal/100 ml)
탄수화물 78.84 (g/100 ml)
지방 2.15 (g/100 ml)
콜레스테롤 Not detected
단백질 4.62 (g/100 ml)
영양소 함량
꽃 받침대 열량 348 (Kcal/100 ml)
탄수화물 75.16 (g/100 ml)
지방 1.6 (g/100 ml)
콜레스테롤 Not detected
단백질 8.15 (g/100 ml)
실시예 2. 균주 분리/동정 및 특성 분석
1. 균주 분리 및 동정
갯벌, 토양(대저, 삼천포, 여수, 순천만, 서천, 밀양, 부산 감천항, 제주도 등), 발효 산물(곰소밴댕이 젓, 갈치속젓, 주먹밥 된장, 미소된장, 조개맛 오이 등), 염전(에티오피아 화산지역 염전, 신안 토판 염전, 곰소 염전 등), 온천(동래, 충주 등), 해수(통영, 여수, 부산, 다대포, 서귀포, 완도 등), 민물(대저, 삼락 생태 공원 등), 참숯 등 특이 환경 유래의 바실러스 균주 분리를 위해 시료를 전처리하였다. 각 시료 1 ml 또는 1 g씩 멸균된 0.85% 생리 식염수 9 ml에 첨가하여 현탁하였다. 10배 희석법(10 fold serial dilution method)에 따라 단계별 10-1 ~ 10-4배로 희석하였다. 상기 희석액을 일반 증식 배지로 pH 4, 7, 9 또는 NaCl 3~15% 함유된 MB(Marine Broth) 평판 배지(BD, USA)를 사용하였으며, 200 μl씩 도말하여 25~60 ℃에서 1-7일간 배양하여 생육 여부를 관찰하였다. 상기 배양 과정에서 생긴 콜로니를 각각의 평판 배지 상에 나타나는 균의 색깔, 크기, 모양 등의 형태학적 특성에 따라 유의적으로 선별하여 동일한 평판 배지에 획선 도말법으로 단일 콜로니를 순수 분리하였다. MB 평판 배지에 순수 분리된 호기성 균주들의 분자생물학적 동정을 위해 ㈜마크로젠에 16S rRNA 염기 서열의 분석을 의뢰하였다. 분석된 16S rRNA 염기서열은 NCBI의 진뱅크 데이타베이스(Genbank database)의 블라스트 프로그램(Blast program; http://www.-blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)과 ㈜천랩에서 사용하는 이지바이오클라우드(Ezbiocloud)의 블라스트 검색 프로그램(Blast search program; https://www.ezbiocloud.net/)을 사용하여 기보고되어 있는 표준 균주와 가장 높은 염기서열 유사도를 나타내는 근연 균주를 확인하였다.
분리된 바실러스균은 총 438주로, 21개의 속과 92개의 종으로 분류되었다. 분류한 균주의 중복 비율은 속은 1:20.9이며, 종은 1:4.8로 다양한 미생물을 분리/확보하였다. 이는 도 1, 2에 나타내었다.
분리/동정된 438 균주는 중온균(25~37 ℃) 84.2%, 고온균(45~60 ℃) 15.8%, 호중성균(pH 5~8)은 93.2%, 호염기성균(pH 9)은 6.8%의 균이 분리되었고, 모두 호염성균이었다. 이러한 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
온도
온도(℃) 25 37 45 50 60
균주 수 75 294 38 29 2
pH
pH 5 5.5 6 7 8 9
균주 수 36 8 39 277 48 30
NaCl
NaCl(%) 3 5 10 15
균주 수 264 45 55 74
2. 균주 특성 확인
분리/동정된 438 균주를 MB(Marine Broth) 평판 배지(BD, USA)의 pH 4, 7, 9와 NaCl 농도(0~20%) 및 배양 온도(10~65 ℃)에서 배양 특성을 분석하여 도 3에 나타내었다. 온도, pH, NaCl에 따른 배양 특성 분석 결과, 다양한 환경에서 생육이 가능한 것을 확인하였다.
또한 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 카르복시메틸셀룰라아제(carboxymethylcellulase, CMCase)의 세포 외 분해 효소 활성 실험을 진행한 결과를 분석하여 도 4에 나타내었다.
효소 활성능을 확인한 결과, 아밀라아제 활성이 있는 균주는 306주, 카르복시메틸셀룰라아제 활성이 있는 균주는 4주, 리파아제 활성이 있는 균주는 70주, 프로테아제 활성이 있는 균주는 50주로 확인되었다.
효소 활성능 결과를 통해 아밀라아제 또는 프로테아제 활성이 우수함과 동시에, 아밀라아제, 리파아제, 프로테아제, 카르복시메틸셀룰라아제의 활성을 최소 1개 이상 동시에 보유한 60 균주를 선정하였고, 상기 60 균주에서 금화규를 포함한 배지에서 생육 가능한 7 균주를 (CP-6, CP-7, CP-35, CP-37, CP-39, CP-42, CP-43) 선정하였다.
실시예 3. 금화규 발효 균주 선정
1. 금화규 발효물의 단백질 분해능 분석
금화규 배지에서 생육이 확인된 7균주(CP-6, CP-7, CP-35, CP-37, CP-39, CP-42, CP-43)의 발효 과정 중 수용성 단백질 성분 함량의 변화를 피어스 BCA 단백질 분석 키트(Pierce BCA Protein Assay kit, ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 0 ~ 5일간 금화규 발효 상등액의 수용성 단백질 농도를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
CP-6를 이용하여 발효시킨 군에서 총 단백질의 함량이 현저히 감소함을 확인할 수 있는데, 다른 바실러스 속 미생물(CP-6, CP-7, CP-35, CP-37, CP-39, CP-42, CP-43) 대비 금화규의 발효능이 월등히 우수하고 지속적으로 유지됨을 나타내는 것이다.
2. ABTS 소거능 분석
금화규 배지에서 생육이 확인된 7균주(CP-6, CP-7, CP-35, CP-37, CP-39, CP-42, CP-43)의 0-5일간의 금화규 발효 상등액의 항산화 활성의 변화를 ABTS 라디칼 소거활성 측정을 통해 평가하였다.
구체적으로, 7 mM ABTS와 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate) 용액을 1/1(v/v)로 혼합하여 16시간 동안 암실에 방치하여 ABTS 라디칼을 형성시킨 후, 734 nm에서 흡광도 값이 0.7 ± 0.02이 되도록 증류수로 희석한 후, 희석된 ABTS 시료 180 μl와 발효물 20 μl를 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Epoch, BioTek, USA)로 734 nm에서 흡광도를 측정하여 ABTS 라디칼 소거능을 계산하여 도 6에 나타내었다. 이때, 표준물질로는 아스코르브산(L-ascorbic acid)을 사용하였다.
CP-6를 이용하여 발효시킨 군에서 ABTS 라디칼 소거능이 1~3일째까지 대조군에 비해 월등히 높고, 유지되는 것을 확인할 수 있는데, 이는 다른 바실러스 속 미생물(CP-6, CP-7, CP-35, CP-37, CP-39, CP-42, CP-43) 대비 CP-6의 월등히 우수한 항산화능을 나타내는 것이다.
따라서 7균주 중 발효능이 우수하고 항산화능이 우수한 CP-6를 금화규 발효 균주로 선정하였다.
실시예 4. CP-6 균주의 특성 분석
1. 배양 특성 및 효소 활성 분석
선정된 CP-6 균주를 MB(Marine Broth) 평판 배지(BD, USA)의 pH 4, 7, 9와 NaCl 농도(0 ~ 20%) 및 배양 온도(10 ~ 55 ℃)에서 배양 특성을 분석하고, 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 카르복시메틸셀룰라아제(carboxymethylcellulase, CMCase)의 세포 외 분해 효소 활성 실험을 진행하여 하기 표 3에 나타내었다. CP-6는 고온(55 ℃), 호염, 및 pH 7/9 조건에서 잘 자라며, 아밀라제와 프로테아제의 활성이 우수하지만 리파아제와 카르복시메틸셀룰라아제의 활성을 보이지 않았다.
학명 Bacillus licheniformis
균주 번호 CP6
서식지 통영 해수
배양특성 온도(℃) 20-55
NaCl (%) 3-20
pH 7-9
효소활성 분석 Amylase +++
Lipase -
Protease +++
CMCase -
2. CP-6 유전체 분석
㈜천랩에 CP-6(기탁번호 KCTC18811P) 균주의 유전자 분석을 의뢰하였고, 방법을 하기 표 4에 나타내었다. 분석 결과를 표 5, 6에 나타내었고, 이를 도 7에 도식화하였다.
분석 플랫폼(Method) PacBio_20K
분석 리드 수(Method reads) 51425
분석 범위(Methods coverage) 151.9
어셈블러(Assembler) SMRT 2.3.0(HGAP2)
범위(Coverage) 151.9
N50 4,316,909
EzTaxon-2 이름 Bacillus sp.
계통(strain) L001
원명(original name) Bacillus sp.
EzGenome 등록번호 45940.L001.1
유전체 크기(Genome size) 4,316,909 bp
GC 비율(GC ratio) 46.00 %
염색체 수(Number of chromosomes) 0
플라스미드 수(Number of plasmids) 0
콘티그 수(Number of contigs) 1
스캐폴드 수(Number of scaffolds) N/A
rRNA 유전자 수(Number of rRNA genes) 24
tRNA 유전자 수(Number of tRNA genes) 81
ORF 수(Number of ORF) 4,404
유전자의 역할 유전자의 수 비율(%)
번역, 리보솜 구조 및 생합성(Translation, ribosomal structure and biogenesis) 168 4.29
전사(Transcription) 329 8.41
복제, 재조합 및 수리(Replication, recombination and repair) 158 4.04
세포주기 조절, 세포 분열, 염색체 분할(Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning) 38 0.97
번역 후 변형, 단백질 반전, 샤페론(Posttranslational modification, protein turnover, chaperones) 115 2.94
세포벽/막/외피 생성(Cell wall/membrane/envelope biogenesis) 206 5.27
세포 운동성(Cell motility) 42 1.07
무기 이온 수송 및 대사(Inorganic ion transport and metabolism) 226 5.78
신호 전달 메커니즘(Signal transduction mechanisms) 150 3.83
에너지 생산 및 전환(Energy production and conversion) 185 4.73
탄수화물 수송 및 신진대사(Carbohydrate transport and metabolism) 327 8.36
아미노산 수송 및 신진대사(Amino acid transport and metabolism) 314 8.03
핵산 수송 및 신진대사(Nucleotide transport and metabolism) 85 2.17
코엔자임 수송 및 신진대사(Coenzyme transport and metabolism) 108 2.76
지질 수송 및 신진대사(Lipid transport and metabolism) 89 2.28
이차 대사산물 생합성, 수송 및 이화(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism) 58 1.48
일반적 기능 예측(General function prediction only) 0 0.00
알려지지 아니한 기능(Function unknown) 1314 33.59
총계(Total) 3912 100
실시예 5. 금화규 발효 추출물의 제조
건조된 금화규의 암술 및 수술을 제거한 뒤 금화규 꽃잎 및 꽃 받침대를 건조기에서 48시간 동안 추가 건조한 다음, 후드 믹서로 분쇄하여 준비하였고, CP-6 균주를 3% NaCl을 함유한 NB(Nutrient Broth) 액체 배지에 접종하여, 16시간 동안 37 ℃, 180 rpm의 조건에서 진탕하여 준비하였다. 1% 금화규 건조분말(꽃잎, 꽃 받침대), 3% NaCl, 및 0.1% 효모 추출물을 포함한 금화규 배지를 121 ℃에서 15분간 멸균하여 제조하였다. 배양한 균주를 상기 금화규 배지의 흡광도(Optical Density, O.D) 0.1에 해당하는 양을 접종하여, 37 ℃, 180 rpm 조건에서 진탕 배양하여 0 ~ 5일간 발효를 진행하였다. 발효물의 10배 중량의 70% 에탄올을 가하여 상온에서 12시간씩 총 3회 교반 추출하였다. 추출물은 와트만 여과지(whatman NO. 2 filter paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과 후 회전증발농축기(rotary evaporator)로 감압 농축한 다음, 동결 건조하여 -80 ℃의 초저온 냉동고(deep freezer)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
실시예 6. 금화규 발효 추출물의 생체외( in vitro) 생리활성 효능
1. 금화규 발효물의 항산화 활성 평가: DPPH 라디칼 소거능 분석
DPPH(Sigma, USA) 100μg/ml에 CP-6를 이용하여 1일 동안 발효시킨 금화규 발효물(CP6-1D)과 비접종 금화규 배양물(C-1D)을 농도별로 처리하여 30분간 암실에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Epoch, BioTek, USA)로 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거능을 분석하여 도 8에 나타내었다. 이때 표준물질로는 알파-토코페롤(α-tocopherol)을 사용하였다.
비접종 금화규 배양물과 금화규 발효물의 농도가 높아질수록 라디칼 소거능은 증가하는 것으로 나타나 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가함을 확인하였다. 특히 1000 μg/ml의 농도에서 라디칼 소거능이 76%로 표준물질로 사용한 알파-토코페롤(50 μg/ml)의 라디칼 소거능 73.3%와 비슷한 항산화 능력을 보였다.
2. 금화규 발효물의 항염증 활성
1) 세포독성 평가
세포 독성 확인을 위해 세포 생존율을 MTT 분석을 통해 실시하였다. 세포는 Raw 264.7를 사용하였다. 상기 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 2×104 개/ml로 접종하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 24시간 동안 세포를 배양하고, 비접종 금화규 배양물(C-1D)과 CP-6를 이용하여 1일 동안 발효시킨 금화규 발효물(CP6-1D)을 각각 100 μg/ml, 500 μg/ml로 처리한 뒤, 20시간 뒤에 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 측정하여 도 9에 나타내었다.
100μg/ml 농도에서는 비접종 금화규 배양물과 금화규 발효 추출물 모두 세포독성이 나타나지 않았으나, 500 μg/ml 농도에서는 비접종 금화규 배양물의 경우 세포생존율이 약 93.08%로 일부 세포 독성이 확인되었으나, 금화규 발효 추출물에서는 세포 독성이 확인되지 않았다. 이는, 천연물인 금화규 자체가 가지고 있는 독성을 CP-6 균주가 발효를 통해 감소시킬 수 있음을 제시하는 것이다. 이후 세포 실험은 비접종 금화규 배양물과 금화규 발효 추출물이 세포 독성을 나타내지 않는 100 μg/ml의 농도에서 실험을 진행하였다.
2) LPS에 의해 유도된 염증반응에 대한 항염증 활성
2-1) 세포의 형태학적 변화 분석
Raw 264.7 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1×106 개의 세포를 접종 후, 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 배양하면서 광학현미경을 통해 세포의 형태를 분석하여 도 10에 나타내었다.
LPS에 의해 염증이 유발된 RAW 264.7 세포는 바닥 면에 넓게 부착되고 위족(pseudopodia)과 유사한 형태를 보이며 세포질 내 소과립이 증가되어 있는 양상을 보였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 일부 세포에서 위족 형성 및 세포질 내 소과립의 생성이 확인되었지만, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시 정상세포(normal cell)와 유사한 형태를 유지하였다. 이러한 결과는 배양 발효 조성물로서 매우 강력한 항염효과로 판단된다.
2-2) ROS 스트레스 분석
ROS(Reactive Oxygen Species) 수치는 산화 스트레스 키트(oxidative stress kit, Luminex co., Austin, TX, USA)의 매뉴얼에 따라 유세포 분석기(Flow cytometry)로 측정하였다. Raw 264.7 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1 ×106 개의 세포를 접종 후, 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 산화 스트레스 워킹 솔루션(oxidative stress working solution)을 처리하여 37℃에서 30분 배양하였다. ROS 수치를 구아바 뮤즈 세포 분석기(Guava Muse cell analyzer)와 뮤즈 분석 소프트웨어(Muse analysis software, Luminex co., Austin, TX, USA)를 이용하여 분석하여 도 11a 및 도 11b에 나타내었다.
LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 NO 수치를 측정한 결과 유도된 ROS+ 세포의 비율은 79.22%로 정상세포(normal cell)의 22.9%에 비해 71.1% 증가하였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 ROS+ 세포의 비율은 56.03%로 LPS 처리군에 비해 29.3% 감소했으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시 ROS+ 세포의 비율은 23.73%로 LPS 처리군에 비해 70.1% 감소하였다. 비접종 금화규 배양물보다 CP6 금화규 발효물의 ROS 생성 억제 효과가 약 40% 더 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과는 배양 발효 조성물로서 매우 강력한 항염효과로 판단된다.
2-3) NO 스트레스 분석
NO(Nitric oxide) 수치는 뮤즈 NO 키트(muse nitric oxide kit, No. MCH100112)를 사용하여 매뉴얼에 따라 유세포 분석기(Flow cytometry)로 측정하였다. Raw 264.7 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1 ×106 개의 세포를 접종 후, 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, NO가 발생한 세포의 비율을 구아바 뮤즈 세포 분석기(Guava Muse cell analyzer)로 분석하여 도 12a 및 도 12b에 나타내었다.
LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 NO 수치를 측정한 결과 NO+ 세포의 비율이 38.51%로, 정상세포(normal cell)의 15.5%에 비해 59.7% 증가하였으나, 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 NO+ 세포의 비율이 32.71%로 LPS 처리군에 비해 15.1% 감소했으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시 NO+ 세포의 비율이 28.17%로 LPS 처리군에 비해 26.1% 감소하였다. 비접종 금화규 배양물보다 CP6 금화규 발효물의 NO 생성 억제 효과가 약 11% 더 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과는 배양 발효 조성물의 강력한 항염효과로 판단된다.
2-4) iNOS 및 COX-2 발현량 분석
iNOS 및 COX-2는 대표적인 염증 유발에 관여하는 효소로 CP-6 금화규 발효물에 의해 상기 염증 유발 효소가 감소하는지 확인하였다.
Raw 264.7 세포를 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 세포의 단백질을 추출하여 웨스턴블롯(Western blot)을 통해 iNOS와 COX-2의 발현량을 분석하여 도 13에 나타내었다. LPS에 의해 iNOS와 COX-2의 발현량이 증가하였지만 비접종 금화규 배양물(Con-1D)과 CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리시 발현량이 감소하였다. 특히, 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 보다 CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시 iNOS 및 COX-2의 발현량이 현저히 감소하였다. 이러한 결과는 배양 발효 조성물의 강력한 항염효과로 판단된다.
2-5) 염증 촉진성 싸이토카인(pro-inflammatory cytokines) 발현량 분석
염증 반응에서 염증 촉진성 싸이토카인들의 분비에 미치는 CP-6 금화규 발효물의 효과를 확인하였다.
Raw 264.7 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1 ×106 개의 세포를 접종 후, 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 배지를 수거해서 엘라이자 키트(ELISA kit,R&D systems Inc., MN, USA)로 싸이토카인 함량을 측정하여 도 14에 나타내었다.
IL-1β의 경우, LPS 처리군이 대조군보다 약 74% 높은 분비량을 보였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 약 18%의 억제율을 보였으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시에는 약 41%의 억제율을 확인하였다. IL-6의 경우, LPS 처리군이 대조군보다 약 67% 높은 분비량을 보였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리시 약 49%의 억제율을 보였으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시에는 약 61%의 억제율을 확인하였다. TNF-α의 경우, LPS 처리군이 대조군보다 약 70%의 높은 분비량을 보였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 약 9% 억제율을 보였으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시에는 약 27%의 억제율을 보였다. 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 보다 CP6 금화규 발효물(CP6-1D)이 IL-6, IL-1β, TNF-α의 생성에 대한 억제 효과가 현저히 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과는 배양 발효 조성물의 강력한 항염효과로 판단된다.
2-6) NF-κB 활성 분석
NF-κB는 인간의 염증 및 면역을 위해 중요한 역할을 하는 전사인자이다. 정상 상태에서 NF-κB는 p65와 p50의 헤테로다이머(Heterodimer)형태로 세포질에 존재하며, IκBα와 같은 단백질과 복합체를 이루어 불활성화 상태를 유지한다. LPS와 같은 외부 자극으로 IκBα의 인산화를 유도하는 p-IKKα/β가 활성화되면 IκBα가 인산화가 되고, IκBα/NF-κB 복합체는 분리되어 NF-κB가 핵으로 이동되어 염증 관련 매개 인자(iNOS, COX-2, Pro-inflammatory cytokine 등)의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 CP-6 금화규 발효물의 항염효과가 NF-κB 신호전달 기전에 의한 것인지 확인하였다.
Raw 264.7 세포를 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 세포의 단백질을 추출하여 NF-κB 활성을 조절하는 p-IKKα/β, p-IKBα, IKBα, NF-κB p65의 인산화 및 분해에 미치는 단백질 발현량을 웨스턴블롯(Western blot)을 통해 도 15에 나타내었다.
RAW 264.7 세포에서 LPS 처리에 의해 IKKα/β가 인산화되어 IKBα가 분해되었지만 CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리에 의해 IKKα/β의 인산화 억제로 IKBα의 분해가 억제되었다. 또한 LPS 처리에 의해 IKBα의 인산화가 유발되었으나, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리에 의해 IKBα의 인산화가 억제되어 결과적으로 NF-κB p65의 핵 내 이동이 감소하였다. 이러한 결과를 통해 CP6 금화규 발효물에 의한 항염효과는 NF-κB 활성을 억제하는 기전에 의한 것을 확인하였다.
2-7) MAPKs 인산화 분석
MAPKs 신호전달계의 활성화는 COX-2와 iNOS 발현이 조절 및 IκB의 인산화 조절을 통한 NF-κB 활성에도 관여하며 세포의 증식, 분화, 외부 자극, 면역 등에 대한 반응을 조절하는 중요한 인자이다. 따라서 CP6 금화규 발효 추출물(CP6-1D)에 의한 NF-κB의 억제 효과가 MAPK 신호전달 기전에 의한 것인지 확인하였다.
Raw 264.7 세포를 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 세포의 단백질을 추출하여 MAPK 신호 전달 경로에 관련된 ERK1/2, JNK1/2, p38의 인산화를 웨스턴블롯(Western blot)을 통해 도 16, 17에 나타내었다. LPS에 의해 증가한 p-ERK, p-JNK, p-p38의 발현이 CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리에 의해 현저하게 감소하였다.
또한 MAPK 활성(p-ERK1/2, ERK1/2)을 MAPK 활성 듀얼 검출 분석 키트(MAPK activation dual detection assay kit, Luminex co., Autsin, TX, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 유세포 분석기(Flow cytometry)로 측정하였다. Raw 264.7 세포를 6웰 플레이트에 웰당 1 ×106 개의 세포를 접종 후, 24시간 배양하고, 100 μg/ml 농도의 비접종 금화규 배양물과 CP-6 금화규 발효물을 처리하여 2시간 배양하고, LPS를 1μg/ml 농도로 처리하여 20시간 배양한 후, 고정 버퍼(Fixation buffer)를 사용하여 세포를 고정한 후, 막투과 버퍼(permeabilization buffer)를 처리하고, p-ERK1/2와 ERK1/2 항체를 처리한 뒤, 구아바 뮤즈 세포 분석기(Guava Muse Cell Analyzer)와 뮤즈 분석 소프트웨어(Muse analysis software, Luminex co., Austin, TX, USA)를 MAPK 활성을 분석하여 도 18a 및 도 18b에 나타내었다. LPS 처리시 MAPK 신호 전달 체계가 활성화된 세포의 비율이 53.1% 증가하였고, 비접종 금화규 배양물(Con-1D) 처리 시 약 47.1%의 억제율을 보였으며, CP6 금화규 발효물(CP6-1D) 처리 시에는 약 51.7%의 억제율을 확인하였다.
이러한 결과들을 통해 CP6 금화규 발효물은 MAPK 인산화를 억제하여 LPS로 유도된 염증반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 금화규 발효 추출물의 성분 분석: LC MS/MS 분석
금화규 발효 추출물을 메탄올에 용해하고, ESI MS가 연결된 U3000-LTQ XLion trap MS(Thermo Scientific, USA)를 분석에 사용하였다. 화합물의 크로마토그래피 분리는 0.3 ml/min의 유속에서 워터스 HSS T3 C18 컬럼(Waters HSS T3 C18 column, 2.1×150 mm; 2.5 μm)을 사용하였다. 이동상으로 0.1% 포름산(formic acid)을 함유하는 증류수(A)와 아세토니트릴(B) 두 용매를 기울기 용리하였다. 구배 용출은 선형 구배로 5-100% B의 경우 0-15분, 100% B의 경우 5분의 조건에서 수행되었다. 질량 분석기의 이온화 방식은 ESI(electrospray ionization)로 이온화 장치에 주입되는 질소 가스의 온도는 275°C, 이온화 전압은 5,000 V로 설정하였다. MS/MS 스펙트럼은 엑스칼리버 시스템(Xcalibur system, version 4.0; Thermo Scientific) 및 매스 프론티어(Mass Frontier) 7.0 프로그램으로 분석하여 도 19, 20에 나타내었다.
금화규 발효 추출물의 스펙트럼 분석 결과 이소큐엘세틴(isoquercetin)이 확인되었다. 이소큐엘세틴(Isoquercetin)의 구조식은 도 21과 같다. 이소큐엘세틴(Isoquercetin)은 큐엘세틴(quercetin)의 3번 위치에 글루코즈(glucose)가 하나 결합한 배당체로 천연에는 미량만이 존재하며 여러 식물에서 분리되고 있다. 이소큐엘세틴(Isoquercetin)의 항산화, 항염증, 항고혈압, 항알레르기, 항암 작용 등을 한다고 알려져 있다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 당업계 통상의 기술자는 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC18811P 20200401

Claims (11)

  1. 기탁번호 KCTC18811P의 바실러스(Bacillus) 속 균주.
  2. 청구항 1의 균주를 이용하여 발효시킨 금화규를 포함하는, 금화규(Aurea helianthus) 발효물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 발효물은 30 ~ 40 ℃에서 발효시킨 것인 발효물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 발효물은 0.5 내지 10일 동안 발효시킨 것인 발효물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 발효물은 금화규 발효물을 추출한 추출물인 것인 발효물.
  6. 청구항 2의 발효물을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
  7. 청구항 2의 발효물을 포함하는, 항염증용 화장료 조성물.
  8. 청구항 2의 발효물을 포함하는, 항산화용 식품 조성물.
  9. 청구항 2의 발효물을 포함하는, 항염증용 식품 조성물.
  10. 삭제
  11. 청구항 2의 발효물을 포함하는, 항염증용 약학적 조성물.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105105142A (zh) 2015-07-25 2015-12-02 朱民生 一种金花葵生物排毒保健口服液及其制备方法
KR101783469B1 (ko) 2015-09-07 2017-09-29 청양포포나무농장영농조합법인 금화규로부터 콜라겐을 추출하는 방법

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류지혜, "금화규 추출물이 in vitro 및 in vivo 실험에서 골 형성에 미치는 영향 연구", 석사학위논문, 신라대학교, 2021.02, 페이지 1-66

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