KR102552781B1

KR102552781B1 - 항산화 활성을 갖는 신규한 미생물 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이 ht-2 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102552781B1
Application number: KR1020160125612A
Authority: KR
Inventors: 김은미; 황경환; 이영란; 박준성
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2023-07-10
Also published as: KR20180035480A

Abstract

본 명세서에는 항산화 활성을 갖는 신규한 미생물 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이 HT-2 및 이의 용도가 개시된다. 상기 미생물은 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 항산화 물질을 생산하여 DPPH 라디칼을 소거하는 효과가 있다. 또한, 본 명세서는 크로모박테리움 아쿠아티쿰 (Chromobacterium aquaticum) 균주, 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

Description

항산화 활성을 갖는 신규한 미생물 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이 HT-2 및 이의 용도{NOVEL CHROMOBACTERIUM AQUATICUM DOLSONGI HT-2 HAVING ANTIOXIDANT ACTIVITY AND USE THEREOF}

본 명세서에는 항산화 활성을 갖는 신규한 미생물 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이 HT-2 및 이의 용도가 개시된다.

노화를 촉진하는 원인들은 여러 가지가 있으나 그 중에서도 활성산소계 (ROS: Reactive Oxygen species)가 상당히 주요한 원인 중 하나인 것으로 받아들여지고 있다. 이러한 활성산소는 에너지 대사과정, 면역 반응 등에서 필수 불가결하게 생성되며, 외부의 유해 환경에 의해서도 유발되는 피할 수 없는 요소이다. 활성산소는 반응성이 매우 커서 체내에서 DNA 변성, 과도한 신호전달 유발 및 단백질 변성 등을 초래하여 건강에 해로운 영향을 누적하는 일련의 반응을 일으키게 된다. 이러한 유해한 반응들은 생체 내에 존재하는 항산화 물질 (uric acid, vit.C, vit.E 등) 또는 항산화 효소 (Glutathione peroxidase, superoxide dismutase, catalse 등)에 의해 정교하게 그 항상성을 유지하도록 되어 있다.

그러나, 내인성 노화에 따른 항산화 시스템의 노쇠와 지속적인 유해 자극에 의한 활성산소의 집적은 이러한 균형을 깨뜨려 건강을 해치게 되며, 노화를 촉진시키고 피부 질환, 피부암, 동맥경화 및 혈전과 같은 각종 질병을 유발하기도 한다 (Laure Rittie et al., Ageing Research Reviews, 1, 705-720, 2002; Cutler RG, Annals of the New York Academy of Sciences, 1055, 93-135, 2005).

따라서, 활성산소계의 형성을 억제하거나, 형성된 활성산소계를 제거하는 항산화 물질에 대한 관심이 날로 증가하고 있다. 천연물 중 항산화성 물질로는 페놀성 화합물, 플라본 유도체, 토코페롤, 아스코르빈산, 아미노산, 펩티드, 셀레늄 등이 있으며, 합성 항산화제로는 BHT (butylated hydroxytoluene), BHA (butylated hydroxyanisole), PG (propyl gallate), TBHQ (t-butylhydroquinone) 등이 있다. 그러나 합성 항산화제의 경우 세포독성 (Valentao P et al., 2002), 발암성, 고농도시 간 비대증 유발 (Lee KH et al., 2006) 등의 문제점을 지녀 새로운 친환경적인 소재를 필요로 하고 있어 천연 항산화제의 개발은 매우 중요한 산업적 과제이다.

최근에는 각종 생약, 식용 식물 추출물 등에서 보다 안전하고 항산화 효과가 뛰어난 천연 항산화제를 개발하기 위한 많은 연구가 활발히 이루어지고 있다. 또한, 항산화 효과가 뛰어난 미생물 유래 항산화 물질에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 일부 곰팡이, 세균 유래의 배양액에서 항산화 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

한국 공개특허공보 제10-2012-0023480호

일 측면에서, 본 명세서는 항산화 활성을 갖는 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 크로모박테리움 아쿠아티쿰 균주로부터 항산화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 균주 (기탁번호 : KCCM11884P)를 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 항산화 물질을 생산하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 항산화 물질은 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크로모박테리움 아쿠아티쿰 (Chromobacterium aquaticum) 균주, 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM11884P인 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2)일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 배양물은 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 배양된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 분획물은 부탄올 분획물 또는 물 분획물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 물 분획물은 헥세인 (Hexane), 메틸렌 클로라이드 (Methylene Chloride), 에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate) 및 부탄올 (Butanol)의 순차적인 분획물이 제거된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 항산화 활성을 갖는 신규한 미생물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크로모박테리움 아쿠아티쿰 균주로부터 항산화용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2)의 16S rDNA 부분 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 배양물에 대한 항산화 활성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 배양물의 분획물에 대한 항산화 활성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 배양물의 분획물에 대한 항산화 활성 시험 결과 사진을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 따른 미생물은 본 발명이 속한 기술분야에서 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 배양물은 본 명세서에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액 (여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소 (lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 측면에서, 상기 배양물은 세포를 파쇄하여 수득한 물질이 아닌, 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액이 바람직할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 부탄올 분획물은 헥세인 (Hexane), 메틸렌 클로라이드 (Methylene Chloride), 에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate) 및 부탄올 (Butanol)로 순서로 순차적으로 분획하여 얻은 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 물 분획물은 헥세인 (Hexane), 메틸렌 클로라이드 (Methylene Chloride), 에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate) 및 부탄올 (Butanol)의 순서로 순차적으로 분획하여 얻은 헥세인 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸 아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 제거된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 분획물은 부탄올 분획물과 물 분획물의 혼합물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 유효성분은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 유효성분 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 분말, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.

상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유효성분의 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일 측면에서 상기 조성물 1 ㎍/kg 내지 200 mg/kg, 다른 일 측면에서 50 ㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약학 조성물은 피부 외용제일 수 있으며, 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭으로서 다양한 제형의 의약품이 여기에 포함될 수 있다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.

상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다.

상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 다른 측면에서 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 다양할 수 있으나, 본 명세서에 개시된 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

시험예 1.항산화 활성을 갖는 미생물의 분리

수자원으로부터 항산화 활성을 갖는 미생물을 선별하기 위해, 한국 제주도 돌송이 차밭의 지하수로부터 항산화 활성을 갖는 미생물을 분리하였다.

미생물 배양에 일반적으로 사용되는 LB (Luria-Bertani), NB (Nutrient Broth), BHI (Brain heart infusion), YPD (Yeast extract-peptone-Dextrose) 고체 배지에 수자원으로부터 얻은 미생물을 도말하여 30 ℃ 또는 37 ℃ 정치 배양기에서 배양하였다. 배양 후 고체 배지에서 성장한 다양한 미생물을 액체 배지 (3 ml)에서 24 시간 동안 배양한 후, 원심분리기를 통해 세포를 제거하고 배양액을 얻었다. 얻어진 배양액을 DPPH assay를 통해 항산화력을 측정하였다.

이에 따라, 미생물을 배양하여 DPPH assay를 통해 항산화 활성이 높은 미생물을 선별할 수 있었다. 유기 용매에 녹인 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼은 515 nm에서 최대 흡광도를 가지게 되는데, 항산화 물질은 DPPH 라디칼을 소거하여 고유의 색을 잃고 투명하게 변화시킨다.

본 명세서에서 DPPH assay는 다음과 같다. DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 100 μM과 처리할 물질의 시료 준비하고, 준비된 시료를 DPPH 용액과 1:20의 비율로 섞어 30분간, 37 ℃에서 보관하였다. 이후, 반응이 끝난 시료를 Spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 낮을수록 항산화력이 높은 것을 의미한다.

시험예 2. 분리된 미생물의 동정

상기 시험예 1에서 분리한 항산화 활성을 갖는 미생물을 동정하기 위해, 미생물의 16S ribosomal RNA 부분 서열을 암호화하는 DNA 서열을 분석하여 그 종과 속명을 파악하였다.

미생물을 액체 배지에서 배양시킨 후, 미생물로부터 genomic DNA를 추출하여 일반적으로 박테리아 동정에 사용되는 27F/1492R 프라이머를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 증폭시키고 이의 서열을 분석하였다.

염기서열 분석 결과, Chromobacterium aquaticum strain CC-SEYA-1 (BCRC 17769; Sequence accession no. (16S rRNA) EU109734) 16S ribosomal RNA 부분 서열과 99%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.

이에, 본 명세서에서 분리 및 배양된 신규한 미생물 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통하여 크로모박테리움 아쿠아티쿰 (Chromobacterium aquaticum) 종임을 확인하였으며, 이를 크로모박테리움 아쿠아티쿰 (Chromobacterium aquaticum) Dolsongi-HT2로 명명하고, 상기 신규한 미생물 균주를 2016년 09월 01일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11884P로 기탁하였다. 서열번호 1의 Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2 16S rDNA partial sequence는 도 1에 나타내었다.

시험예 3. 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 ( Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 배양물의 특성 분석

상기 시험예 2에서 동정한 신규한 균주를 1% 글루코즈를 포함하는 M9 배지 (CaCl₂ 0.015 g/L, Na₂HPO₄ 6.78 g/L, KH₂PO₄ 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH₄Cl 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, Glucose 1%(w/v))에서 15시간 동안 배양한 후, 배양물을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액은 DPPH assay를 통해 항산화 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 상기 신규한 균주의 배양물은 항산화능이 있는 것으로 알려져 있는 ascorbic acid을 1.25 내지 5 ppm의 농도로 포함하고 있는 시료들 (AA-5, AA-2.5, AA-1.25)과 대비하여 유사한 효과 내지는 더욱 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다.

시험예 4. 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 ( Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 배양물로부터 얻은 분획물의 특성 분석

상기 시험예 3에서 수득한 배양물, 즉 배양물로부터 균주를 제거하기 위해 배양물을 원심분리한 배양 상등액으로부터 4가지 용매 (n-Hexane (Hex), Methylene Chloride (MC), Ethyl Acetate (EA), n-Butanol (BuOH))를 이용하여 Hex, MC, EA, BuOH의 순서로 순차적으로 분획물을 제조하였다.

구체적으로, 시료와 동일한 양 (1:1 (v/v))의 용매를 섞은 후, 약 3시간 동안 정치하여 층분리를 하였다. 층분리된 시료의 물 분획 부분과 용매 분획 부분을 각각 분리한 후, 물 분획 부분에 다시 다음 순서의 용매를 동일한 양으로 섞어 앞의 방법을 반복하여 총 5개의 분획물 (Hex, MC, EA, BuOH, water)을 획득하였다. 분리된 분획물은 진공회전농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 용매를 휘발시키고 건조된 상태로 농축하였다. 이와 같이 준비된 시료는 DPPH assay를 통해 항산화 효능 비교 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 배양 상등액의 부탄올 분획물 및 물 분획물은 항산화능이 있는 것으로 알려져 있는 ascorbic acid을 2.5 내지 10 ppm의 농도로 포함하고 있는 시료들 (AA-10, AA-5, AA-2.5)과 대비하여 유사한 효과 내지는 현저하게 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 배양 상등액으로부터 얻은 부탄올 분획물 및 유기용매 분획 후 얻어진 수용액층인 물 분획물에는 항산화 물질이 다량 함유되어 있음을 알 수 있었다.

한편, 도 4를 참조하면, 부탄올 분획물은 옅은 노란색을 띠고 있어 천연 색소를 함유하지 않는 것을 유추할 수 있고, DPPH 라디칼이 항산화 활성을 갖는 부탄올 분획물과 반응하여 노란색을 띠게 된 반면, 헥세인 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물 및 에틸 아세테이트 분획물은 DPPH 라디칼이 소거되지 않아 여전히 보라색을 띠고 있음을 알 수 있었다.

본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 유연화장수(스킨로션)

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 2] 영양화장수(밀크로션)

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 3] 영양크림

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 4] 마사지크림

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 5] 팩

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	적량
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터

KCCM11884P

20160901

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> NOVEL CHROMOBACTERIUM AQUATICUM DOLSONGI HT-2 HAVING ANTIOXIDANT ACTIVITY AND USE THEREOF <130> 16P506/IND <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1163 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2 <400> 1 gctttttggg gaacagcaaa taccatgcaa gtcgaacggt aacagggtgc ttgcaccgct 60 gacgagtggc gaacgggtga gtaatgcatc ggaatgtacc gtgtaatggg ggatagctcg 120 gcgaaagccg gattaatacc gcatacgccc tgagggggaa agtgggggac cgaaaggcct 180 cacgttatac gagcagccga tgtctgatta gctagttggt gaggtaaagg ctcaccaagg 240 cgtcgatcag tagcgggtct gagaggatga tccgccacac tgggactgag acacggccca 300 gactcctacg ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagcc 360 atgccgcgtg tctgaagaag gccttcgggt tgtaaaggac ttttgtccgg gagcaaatcc 420 tagtggttaa taaccgctgg gtctgagagt accggaagaa taagcaccgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540 gtgcgcaggc ggttgtgcaa gtctgatgtg aaagccccgg gcttaacctg ggaacggcat 600 tggagactgc acgactagag tgcgtcagag gggggtagaa ttccgcgtgt agcagtgaaa 660 tgcgtagaga tgcggaggaa taccgatggc gaaggcagcc ccctgggatg acactgacgc 720 tcatgcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa 780 cgatgtcaac tagctgttgg gggtttgaat ccttggtagc gtagctaacg cgagaagttg 840 accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca 900 agcggtggat gatgtggatt aattcgatgc aacgcgaaaa accttacctg gtcttgacat 960 gtaacgaacg ctgcagagat gtggtggtgc ccgaaaggga gcgttaacac aggtgctgca 1020 tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tgccattagt tgccatcatt aagttgggca ctctaatggg actgccggtg acaaaccgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtcc atc 1163

Claims

크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 균주 (기탁번호 : KCCM11884P).
제 1항에 있어서,
상기 균주는 항산화 활성을 갖는 것인, 균주.
제 1항에 있어서,
상기 균주는 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 항산화 물질을 생산하는 것인, 균주.
제 3항에 있어서,
상기 항산화 물질은 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것인, 균주.
기탁번호가 KCCM11884P인 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 균주, 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 배양물은 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 배양된 것인, 항산화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액인, 항산화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 분획물은 부탄올 분획물 또는 물 분획물인, 항산화용 화장료 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 물 분획물은 헥세인 (Hexane), 메틸렌 클로라이드 (Methylene Chloride), 에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate) 및 부탄올 (Butanol)의 순차적인 분획물이 제거된 것인, 항산화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 조성물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것인, 항산화용 화장료 조성물.
기탁번호가 KCCM11884P인 크로모박테리움 아쿠아티쿰 돌송이-HT2 (Chromobacterium aquaticum Dolsongi-HT2) 균주, 이의 배양물 또는 상기 배양물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 배양물은 1%(w/v)의 글루코즈를 포함하는 배양 배지에서 배양된 것인, 항산화용 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액인, 항산화용 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 분획물은 부탄올 분획물 또는 물 분획물인, 항산화용 식품 조성물.
제 14항에 있어서,
상기 물 분획물은 헥세인 (Hexane), 메틸렌 클로라이드 (Methylene Chloride), 에틸 아세테이트 (Ethyl Acetate) 및 부탄올 (Butanol)의 순차적인 분획물이 제거된 것인, 항산화용 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 조성물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것인, 항산화용 식품 조성물.