KR101197203B1 - 신규한 락토바실러스 플랜타럼 균주, 그 균주를 포함하는 항균 및 항산화 활성을 가지는 조성물 및 그 용도 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플랜타럼 균주, 그 균주를 포함하는 항균 및 항산화 활성을 가지는 조성물 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균 및 항산화 활성을 가지는 생균제 및 그 용도에 관한 것으로 더욱 상세하게는 발효 양파로부터 선별된 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SK1990 및 그 균주를 포함한 생균제 조성물, 그 균주의 배양 배지 조성 및 그 배양방법에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 플랜타럼 균주, 그 균주를 포함하는 항균 및 항산화 활성을 가지는 조성물 및 그 용도{(A novel Lactobacillus plantarum, Composition with antibacterial and antioxidant activity comprising the same and use of thereof}
본 발명은 항균 및 항산화 활성을 가지는 생균제 및 그 용도에 관한 것으로 더욱 상세하게는 발효 양파로부터 선별된 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SK1990 및 그 균주를 포함한 생균제 조성물, 그 균주의 배양 배지 조성 및 그 배양방법에 관한 것이다.
가축은 사육하는 동안 스트레스를 받으면 장내 병원성 미생물이 증가하고 유익균수가 감소한다. 유해균이 생성한 독소는 장점막의 활성을 둔화시켜 사료의 효율을 떨어뜨리고 독소에 의한 장점막 괴사로 질병발생의 원인이 된다. 상기와 같은 원인을 제거하고 가축의 생산성을 높이기 위하여 생균제가 이용되고 있다.
생균제는 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존하면서 특정 병리적 상태를 예방하거나 치료하여 유익한 효과를 주는 미생물을 말한다. 이 생균제는 장내 유익한 미생물의 균수와 활성을 증가시켜 장내 균총을 정상으로 회복시키기는 역할을 한다.
오늘날과 같이 가축 사육시 항생제와 각종 합성 약제의 사용이 범람하고 있는 시대에 가축을 건강하게 사육하기 위하여는 생균제와 같은 사료첨가제가 필요하며, 이에 대한 연구가 진행되고 있다.
특허 제381726호(명칭: 양식용 사료첨가제로서의 감귤 발효액)에는 감귤 발효액을 이용하여 양식어류용 사료첨가제에 대하여 개시되어 있다.
특허공개 제1999-0046622호(명칭: 축산용 무화과사료 및 이의 제조방법)에는 무화과 잎과 열매를 이용하여 축산용 사료를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
특허 제336411호(명칭: 고온 혐기성 유산발효 혼합사료 제조 방법)에는 40~70℃의 고온에서 혐기성 유산발효하여 사료를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
상기한 종래기술로는 사료 내에 함유된 병원성 미생물의 성장을 억제하는 데에 한계가 있었고 또한 가축의 육질을 개선하는 데에도 한계가 있었다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 가축의 생산성 향상에 도움이 되는 생균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항균 및 항산화 활성을 가지는 생균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 배지 및 배양 조건을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 양파로부터 선발된 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SK1990 KACC91579P를 제공한다.
본 발명의 상기 균주는 대한민국 수원시 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 8월 23일에 수탁번호 KACC91579P로 기탁하였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 균주는 항균 또는 항산화 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 배양 배지에 있어서, 양파즙 또는 양파 추출물을 포함하는 락토바실러스 플랜타럼 배양 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 배양 배지 조성물은 설탕 및 효모 추출물을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 양파즙 또는 양파 추출물은 전체 조성물에서 40%～60%, 설탕은 0.5～3%(w/v) 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 배양 방법에 있어서, 배지에 양파즙 또는 양파 추출물을 전체 배양에서 40%～60%(w/v)포함하여 발효하는 단계를 포함하는 락토바실러스 플랜타럼 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 제제는 항산화 및 항균 갖는 수의학적 제제 및 식품/사료 첨가제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "식품 또는 사료 첨가제" 는 사람에게 사용하기 위한 식품 첨가제 또는 영양학적 첨가제, 또는 기타 사육 동물 뿐만 아니라 가축 및 가금류에 사용되는 사료첨가제 또는 영양학적 첨가제를 의미하는 것이다.
이하 본 발명을 설명한다.
먼저 본 발명은 축산용 유용 생균제 균주의 생물학적 활성 평가 및 균주 선발하였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명은 가축의 생산성 향상에 도움이 되는 생균제 개발을 위하여 유용 균주를 스크리닝하였으며,
발효된 양파를 대상으로 유용 세균을 스크리닝하였고 생리활성 (소화효소활성, 항균활성)을 선발 기준으로 하였다(표 1).
또한 본 발명은 가축 병원성 세균인 Clostridium perfringens , Escherichia coli, Burkholderia sp., Mannheimia heamolytica를 대상으로 후보 균주들의 항균활성 능력을 평가하였으며(표 1), 후보 균주 중에서 선발된 11종의 균주에 대하여 배양성과 배양액의 항산화활성을 평가하였고(표 2), 선발균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 통하여 동정결과를 분석하였다(표 3).
이를 통하여 본 발명은 최종적으로 SK1990을 유용 생균제 균주로 선발하였다.
또한 본 발명은 경제적 배지 선발을 위한 양파즙의 첨가 농도를 결정하였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 일련의 실험과정을 통하여 항균활성, 항산화활성 그리고 배양적 특성을 고려하여 최종적으로 선발된 SK1990 균주 (Lactobacillus plantarum)의 경제적 배지 선발을 위하여 양파를 주요 탄소원으로 결정할 경우, 사용이 가능한 양파즙의 첨가농도를 결정하기 위하여 본 발명을 수행하였다.
이에 대한 배양조건은 Working volume: 50ml/200ml, Incubation temperature: 30, Incubation time: 24 hours, Agitation: 150 rpm이었으며, 배양에 사용된 기본배지인 MRS배지와 양파즙 그리고 물의 비율(MRS:양파즙:물)은 100:0:0 (Run1), 20:0:80 (Run2), 20:20:60 (Run3), 20:40:40 (Run4), 20:60:20 (Run5)로 하였다.
분석항목은 항균활성으로 agar well diffusion assay (African Health Science 2009, 9:S42-46)를 이용하였으며, 테스트 병원균으로는 Salmonella typhimurium ATCC 35150, Listeria monocytogens KACC 10550 및 Streptococcus suis ATCC 700794를 사용하였으며,
항산화활성은 DPPH 방법(Natural Product Research, 2010, 24:804-812)을 이용하였고, 총균수는 viable cell counts를, Total quercetin equivalent flavonoid content (Food Microbiology, 2010, 27:586-591)를 통하여 수행하였다.
또한 본 발명은 L. plantarum SK1990을 이용한 양파발효의 최적화를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 최적 배지조성의 탐색을 위한 탄소원으로 sucrose와 onion juice를 사용하였고, 질소원으로는 yeast extract를 사용하였다.
배지성분들간의 효과를 분석하고 최적배지를 도출하기 위하여 3가지 변수에 대한 full factorial design을 설계하였고, 24시간동안 배양한 후에 viable cell count와 DPPH를 이용한 항산화활성을 조사하였다(표 5).
1) 배지성분들이 선발균주 L. plantarum SK1990의 성장에 미치는 효과
결과로 얻어진 viable cell count들의 분산분석을 수행한 결과 선발된 균주의 성장에 있어서는 yeast extract가 유의성 있는 주효과로 나타내었다(표 6).
또한 양파를 포함하는 배지에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 성장에 미치는 요인들의 주효과를 분석한 결과, 모든 요인들이 positive effect를 나타내었으며, sucrose의 경우에서는 곡률효과가 나타내었다 (도 5).
또 양파를 포함하는 배지에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 성장에 있어 각 요인들의 상호작용을 분석한 결과 양파와 sucrose간에 상호효과가 있는 경향이 관찰되었으며, 양파를 600 g/L 까지 사용할 경우 sucrose는 15 g/L를 사용하는 것이 효율적인 것으로 나타내었다 (도 6).
2) 배지성분들이 선발균주 L. plantarum SK1990의 항산화활성에 미치는 효과
결과로 얻어진 항산화활성들의 분산분석을 수행한 결과, 선발된 균주의 항산화활성에 있어서는 onion juice가 유의성 있는 주효과로 나타내었다(표 7).
또 양파를 포함하는 배지에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 성장에 미치는 요인들의 주효과를 분석한 결과, sucrose를 제외한 onion juice와 yeast extract에서 positive effect를 나타났으나, yeast extract는 미약한 효과를 나타내었다 (도 7).
또한 양파를 포함하는 배지에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 항산화활성에 있어 각 요인들의 상호작용을 분석한 결과 sucrose와 yeast extract간에 상호효과가 있는 경향이 관찰되었으며, sucrose를 15 g/L를 적용하였을 경우에 yeast extract 소요량을 최소화할 수 있었다 (도 8).
3) 양파를 포함하는 최적배지조성의 도출 및 발효성상 분석
상기와 같은 일련의 결과를 통하여 표 8과 같은 최적배지조성을 도출하였다.
5L jar fermenter를 이용하여 최적조건의 배지조성에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 발효성상을 분석한 결과 도 9와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명에서 선별된 신규한 균주 L. plantarum SK1990의 경우, 항균 및 항산화 활성을 가지고 있어서 이 균주를 식품 또는 사료 첨가제용 생균제로 사용할 수 있다.
도 1은 배지에 여러 농도의 양파 즙에 대한 L. plantarum SK1990의 성장 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 2는 배지에 여러 농도의 양파 즙에 대한 L. plantarum SK1990의 항산화 활성 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 3은 Salmonella typhimurium (A), Listeria monocytogens (B) and Streptococcus suis (C)에 대한 여러 수준의 양파 즙으로 배양된 L. plantarum SK1990의 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 여러 수준의 양파 즙을 가진 L. plantarum SK1990의 배양에서 퀘르세틴 균등물 전체 플라보노이드 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 5는 L. plantarum SK1990의 세포 성장에 대한 변수들의 주된 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Lactobacillus plantarum SK1990의 세포 성장에 대한 변수들의 상호작용을 나타낸 그래프이다.
도 7은 Lactobacillus plantarum SK1990의 항산화 활성에 대한 변수들의 주된 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 Lactobacillus plantarum SK1990의 항산화 활성에 대한 변수들의 상호작용을 나타낸 그래프이다.
도 9는 양파즙을 함유한 적정화된 배지에서 Lactobacillus plantarum SK1990의 발효 프로파일을 나타낸 그래프이다. pH는 10N NaOH를 사용하여서 5.0을 최소범위로 하여 6.0으로 조절되었다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 유용 균주의 스크리닝 방법
유용균주의 스크리능을 위하여 경북울진군에서 재배된 국내산 양파를 분쇄기 (Philips HR2860, Netherlands)로 곱게 갈은 양파즙에 토양을 인위적으로 섞고 상온에서 자연적으로 발효될 수 있도록 하였다. 이때에 세균의 원활한 증식을 위하여 MRS, LB, PD (Difco, USA)를 1:2 (양파즙:배지)의 비율로 첨가하였다. 자연발효의 진행이 완료된 발효양파액을 첨가한 배지와 동일한 조성의 평판배지에 도말하여 서로 형태가 다른 집락을 분리하였다.
분리된 균주들의 생리활성을 알아보기 위하여 소화효소활성과 균활성 정도를 평가하였다. 소화효소의 종류로는 전분분해효소, 단백질 분해효소, 섬유소 분해효소 그리고 지방분해효소 등을 평가하였으며, 각각 soluble starch, skim milk, carboxymethyl cellulose 그리고 tributirin을 평판배지에 1.0%씩 혼합하여 제조하였고 선발균주를 도말하여 배양하여 분비된 소화효소에 의해 형성된 투명대의 크기로 활성정도를 평가하였다. 전분분해효소의 투명대는 KI (0.2%)와 iodine (0.2%)를 혼합한 용액으로 염색하여 관찰하였고, 섬유소분해효소는 congo red (0.2%)로 염색하여 관찰하였다. 단백질과 지방분해효소는 배양 후 자연적으로 발생된 투명대를 관찰하였다.
항균활성은 가축병원성 세균들을 대상으로 중층배지를 이용한 agar well diffusion assay 방법을 사용하였다.
Figure 112010070497912-pat00001
Figure 112010070497912-pat00002
표 1은 분리된 균주의 소화 효소 및 항균 활성을 나타낸 표이다.
실시예 2:선발된 균주에 대한 배양성과 배양액의 항산화활성을 평가
상기 표로부터 선정된 11종의 균주에 대한 배양조건은 Working volume: 50ml/200ml, Incubation temperature: 30, Incubation time: 24 hours, Agitation: 150 rpm이었으며,
분석항목은 항균활성으로 agar well diffusion assay(African Health Science 2009, 9:S42-46)를 이용하였으며, 테스트 병원균으로는 Salmonella typhimurium ATCC 35150, Listeria monocytogens KACC 10550 및 Streptococcus suis ATCC 700794를 사용하였으며,
항산화활성은 DPPH 방법(Natural Product Research, 2010, 24:804-812)을 이용하였고, 총균수는 viable cell counts를, Total quercetin equivalent flavonoid content (Food Microbiology, 2010, 27:586-591)를 통하여 수행하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같다.
Figure 112010070497912-pat00003
표 2는 선정된 균주들의 자유 래디컬 소거 활성 및 그들의 성장 특성을 나타낸 표이다.
실시예 3: 선발균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석
상기 선발균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 통하여 동정결과를 분석하였다(표 3).
Strain No. Identity, %
SK1968 Delftia tsuruhatensis 99
SK1969 Enterobacter ludwigii 100
SK1974 Stenotrophomonas maltophilia 100
SK1976 Pseudomonas putida 99
SK1977 Lactococcus lactis 100
SK1978 Lactococcus lactis 100
SK1979 Pseudomonas plecoglossicida 100
SK1982 Pseudomonas plecoglossicida 100
SK1983 Bacillus simplex 99
SK1984 Leuconostoc citreum 99
SK1990 Lactobacillus plantarum 99
표 3은 선발 균주들의 16S rRNA 유전자 서열과 NCBI의 BLAST에 의한 호모로지 서치 결과이다.
실시예 4: 본 발명의 균주 배양을 위한 배지 조성에서 적정 양파 즙 농도 결정
상기에서 본 발명의 균주로 선별된 L. plantarum SK1990의 배양을 위한 배지 조성에서 적정 양파 즙 농도의 선택을 위한 실험 디자인을 하기 표 4에 기재된 것과 같이 디자인하였다.
조성 처리구1)
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5
MRS broth,% 100 20 20 20 20
양파즙,% 0 0 20 40 80
증류수,% 0 80 60 40 0
전체,% 100 100 100 100 100
1)처리구: 배지(MRS):양파즙:물의 비율 Run1, 100:0:0; Run2, 20:0:80; Run3, 20:20:60; Run4, 20:40:40; Run5, 20:60:20.
표 4는 L. plantarum SK1990의 배양을 위한 배지 조성에서 적정 양파 즙 농도의 선택을 위한 실험 디자인을 나타낸 표이다.
실시예 5: 배지 성분들 간의 효과 분석 및 최적 배지 도출
L. plantarum SK1990의 배양을 위한 배지성분들간의 효과를 분석하고 최적배지를 도출하기 위하여 3가지 변수에 대한 full factorial design을 설계하였고, 24시간동안 배양한 후에 viable cell count와 DPPH를 이용한 항산화활성을 조사하였다(표 5).
또한 결과로 얻어진 viable cell count들의 분산분석을 수행한 결과 선발된 균주의 성장에 있어서는 yeast extract가 유의성 있는 주효과로 나타내었다(표 6).
또한 결과로 얻어진 항산화활성들의 분산분석을 수행한 결과, 선발된 균주의 항산화활성에 있어서는 onion juice가 유의성 있는 주효과로 나타내었다 (표 7).
Runs 양파즙 Sucrose 효모 추출물 세포 수율,
Log10(cfu/mL)		 자유 래디컬 소거 활성, %
g/L
1 400 5 1 8.82 38.1
2 400 5 5 8.95 40.7
3 400 15 1 8.78 39.2
4 400 15 5 9.15 38.8
5 400 30 1 9.05 36.6
6 400 30 5 8.99 39.7
7 600 5 1 8.82 47.0
8 600 5 5 8.97 47.2
9 600 15 1 9.09 47.5
10 600 15 5 8.94 42.7
11 600 30 1 8.73 44.9
12 600 30 5 9.15 47.9
13 400 5 1 8.90 37.7
14 400 5 5 8.88 40.3
15 400 15 1 8.64 38.2
16 400 15 5 8.98 36.6
17 400 30 1 8.90 35.3
18 400 30 5 8.88 38.9
19 600 5 1 8.78 44.2
20 600 5 5 8.82 44.8
21 600 15 1 8.94 50.5
22 600 15 5 9.05 45.7
23 600 30 1 9.00 44.8
24 600 30 5 9.02 49.5
표 5는 Lactobacillus plantarum SK1990의 자유 래디컬기 소거 활성 및 성장에 대한 인자의 효과를 평가하기 위한 전체 요소 디자인의 형태를 나타낸 표이다.
인자 DF SS MS F P
양파 1 0.00600 0.00600 0.59 0.458
Sucrose 2 0.04092 0.02046 2.01 0.177
효모 추출물 1 0.07526 0.07526 7.38 0.019
양파ⅹSucrose 2 0.02647 0.01323 1.30 0.309
양파ⅹ효모 추출물 1 0.00079 0.00079 0.08 0.786
Sucroseⅹ효모 추출물 2 0.01028 0.00514 0.50 0.616
양파ⅹSucroseⅹ효모 추출물 2 0.10679 0.05339 5.24 0.023
Error 12 0.12230 0.01019
전체 23 0.38880
표 6은 Lactobacillus plantarum SK1990의 성장에 대한 효소들의 효과에 대한 분산분석표이다.
인자 DF SS SS MS F P
양파 1 0.0390347 0.0390347 0.0390347 224.30 0.000
Sucrose 2 0.0000337 0.0000337 0.0000169 0.10 0.908
효모 추출물 1 0.0003334 0.0003334 0.0003334 1.92 0.192
양파ⅹSucrose 2 0.0006865 0.0006865 0.0003433 1.97 0.182
양파ⅹ효모 추출물 1 0.0004929 0.0004929 0.0004929 2.83 0.118
Sucroseⅹ효모 추출물 2 0.0043908 0.0043908 0.0021954 12.62 0.001
양파ⅹSucroseⅹ효모 추출물 2 0.0004376 0.0004376 0.0002188 1.26 0.319
Error 12 0.0020884 0.0020884 0.0001740
전체 23 0.0474980
표 7은 Lactobacillus plantarum SK1990의 자유 래디컬 소거 활성에 대한 분산분석표이다.
실시예 6: 양파를 포함하는 최적배지조성의 도출 및 발효성상 분석
상기와 같은 일련의 결과를 통하여 표 8과 같은 최적배지조성을 도출하였다.
5L jar fermenter를 이용하여 최적조건의 배지조성에서 선발균주 L. plantarum SK1990의 발효성상을 분석한 결과 도 9와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
조성 Content, g/L
양파 즙 600
Sucrose 15
효모 추출물 5
K2HPO4 0.2
MgCl2 0.02
CH3COONa 1
표 8은 L. plantarum SK1990로 양파 발효의 항산화 활성의 개량을 위한 배지 조성물의 최적 조성을 나타낸 표이다.
농업생명공학연구원 KACC91579 20100823

Claims (8)

  1. 양파즙 또는 양파 추출물을 전체 배지 조성물에서 40%～60%(w/v) 포함하는 배지에서 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) KACC91579P를 배양하여 그 균주의 항산화 활성을 개선하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 설탕 및 효모 추출물을 더욱 포함하는 항산화 활성을 개선하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 설탕은 0.5～3%(w/v)포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 개선하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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