이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 미생물들의 분리과정은 다음과 같았다.
토양시료(충북 제천의 산림의 부숙토)를 60℃에서 30분 동안 열처리한 후 막자사발에서 곱게 갈아 준비해 둔 다음, 시료 1g을 취하여 0.85 % NaCl 9㎖에 현탁 한 후, 100 내지 10-7로 희석한다. 각각의 희석 현탁액 100 ㎕를 TSA, BL, BBL 배지(DIFCO 사)에 도말하여 28℃에서 배양하고, 혐기성 균주를 동정하기 위하여 ANAEROGENTM COMPACT (OXOID 제품)을 사용하여 배양한다. 배양된 균주는 콜로니 형태가 다른 것들을 선발하여 TSA 배지에서 적어도 3회 이상 계대배양하여 단일콜로니로 분리한 후, 분리된 균주는 액체 배양하고 게노믹 DNA(genomic DNA)를 순화하여 16S RNA의 프라이머를 이용하여 증폭한 뒤, 증폭된 부분을 주형(template)으로 하고 519r과 785r 프라이머(primer)를 사용하여 서열을 시퀀싱(sequencing)하는 과정을 거쳐 분리할 수 있다.
상기 과정에 의한 결과물을 NCBI DB에서 조사하여 종을 동정하였는 바, 16S RNA로 균을 동정하는 데 사용된 프라이머 세트는 "Nucleic acid techniques in bacterial systematics (John Wiley and Sons, England)"와 "nucleic acid research (2000) 28(1):173-174를 참고하였다.
이와 같이 분리된 본 발명에 사용되는 미생물은 한국유전자은행 (대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재)을 기탁기관으로 하여, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus-amyloliquefaciens) KS-4는 KCTC 11186BP, 바실러스-아가라다에렌스(Bacillus-agaradhaerens) KS-5는 KCTC 11187BP, 파에니바실러스 렌티모부스(Paenibacillus-lentimorbus) KS-6는 KCTC 11188BP, 바실러스 라에볼락티쿠스(Bacillus-laevolacticus) KS-7는 KCTC 11189BP, 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) KS-9는 KCTC 11190BP, 쿠르시아 시비리 카(Kurthia-sibirica) KS-13은 KCTC 11191BP 및 스핑고박테리움 스피리티보럼-GC 서브그룹 B(플라보박테리움)(Sphingobacterium-spiritivorum-GC subgroup B(Flavobacterium) KS-18은 KCTC 11192BP로서 2007.09.04일자로 각각 기탁되어 있다.
상기와 같은 미생물 들을 이용하여 본 발명에 따른 미생물 제제를 함유하는 사료첨가제는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 미생물 제제는 상기 미생물 혼합종균 0.001 내지 0.02중량%와, 쌀겨 2 내지 5중량%, 당밀 2 내지 4중량% 및 황설탕 2 내지 4중량%에 나머지 물을 혼합하여 100중량%가 되도록 하여 혼합한 후 온도 20 내지 25℃를 유지하며 2 내지 6시간 간격으로 5 내지 10㎥/h의 공기를 1 내지 3시간 동안 폭기하는 과정을 일일 2 내지 6회 반복적으로 수행하며 15 내지 21일간 배양하여 제조할 수 있다. 상기 폭기 등의 조건은 본 발명자의 연구결과 최적화된 결과이며, 당업자라면 상기 조건에 다소의 변형을 가할 수 있으나 그러한 변형이 본 발명의 권리범위를 벗어나지 않는다는 것도 알 것이다.
이와 같은 복합 미생물 액제를 제조한 후에는, 쌀겨, 농산물 부산물 및 농임산물 건조분말로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 배양원료 20 내지 30중량% 및 상기 복합미생물 액제 70 내지 80중량%로 구성된 혼합원료를 제조한 후, 상기 본 발명에 따른 미생물 혼합종균 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 접종단계를 수행할 수 있다. 본 발명의 미생물제제는 배양원료로서 비교적 구하기 용이하고 원가부담이 적은 쌀겨, 농산물 부산물 또는 농임산물 등을 사용할 수 있다. 상기 배양원 료는 상기 쌀겨, 농산물 부산물 또는 농임산물 단독으로 또는 조합되어 사용되어도 무방하나, 바람직하게는 35 내지 45중량%의 쌀겨, 25 내지 35중량%의 농산물 부산물, 20 내지 30중량%의 농임산물의 조성비로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 배양원료는 미리 100메쉬 정도로 분쇄하여 분말상으로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 혼합, 분쇄된 원료 들을 직화배양기에 넣고 미생물 발효에 적절한 환경을 유지하기 위해 액상의 복합미생물제로 수분을 조절한 다음, 바실러스 속 균주 또는 유산균을 포함하는 혼합종균을 접종할 수 있다. 상기 혼합종균은 계절적, 환경적 다양성이 존재하는 토양의 미생물상을 인위적인 여과 없이 그대로 채취하여 천연물배지상에서 6개월간 환경적응과정을 거치면서 유해성을 제거하여 분말상으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물제제의 제조시에는 상기 혼합종균을 원료 총중량의 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 것이 더 바람직하다.
상기 접종단계를 수행한 후에는, 상기 접종된 혼합원료를 80 내지 85℃에서 2 내지 8시간동안 배양시키는 고온 배양단계를 거치게 된다. 본 발명의 미생물제제 제조방법은 전술한 바와 같이, 80℃ 이상의 초고온에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 보통의 미생물배양은 20 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 일반적인 것임을 고려하면, 본 발명의 미생물제제는 초고온의 조건에서 수행된다는 것을 알 수 있다. 특히, 본 발명의 일실시예에서는 상기 복합종균이 접종된 배양원료는 80 내지 85℃에서 2 내지 8시간 동안 30 내지 80rpm/min의 속도로 교반하면서 초고온 배양시켰다. 이때 배양온도는 불필요한 미생물의 증식을 억제하기 위해 80℃ 이상에서 수행하나, 본 발명에 따른 미생물 복합균의 활성도를 유지하기 위해 85℃이하에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 고온배양단계 후, 선택적으로 상기 배양된 혼합원료를 상온까지 냉각한 후 상기 혼합원료 100중량부에 대해 상기 복합미생물 액제 10 내지 15중량부를 첨가하여 성형기를 이용하여 성형하는 성형단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 고온 배양 후 본 발명의 미생물제제는 어느 정도의 수분을 함유하고 있기는 하지만 고온배양의 영향으로 성형에는 적합하지 않은 분말상으로 존재하게 된다. 이를 그대로 건조되거나 분쇄과정을 거쳐 건조되어 분말상으로 제조될 수도 있으나, 필요에 따라 선택적으로 성형과정을 거칠 수 있기 때문에 성형을 위하여 수분을 공급하는 것이다. 상기 성형과정은 특별한 제한은 없으며, 본 발명의 일실시예에서는 배양된 미생물제제를 펠렛형으로 가공할 경우 시간당 800 내지 1,000kg 처리용량의 성형기를 이용 하여 성형하였다.
상기 고온배양 또는 성형 단계 후에는 상기 배양된 미생물제제를 건조하는 건조단계를 수행하게 된다. 상기 건조는 미생물 제제가 열변형 등의 우려가 없는 범위에서 공지의 건조방법 모두 사용가능하며 특별한 제한은 없다. 본 발명의 일실시예에서는 50 내지 80℃ 범위에서 열풍건조를 수행하였다.
상기 과정에 의해 얻어지는 본 발명에 따른 미생물제제는 동물의 사료첨가제 또는 각 동물에 따라 시판되는 사료조성물에 위 사료첨가제를 첨가한 형태의 사료조성물의 형태로서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 사료첨가제 또는 사료조성물을 급여할 수 있는 동물에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 돼지, 닭과 같은 단위동물이나, 소와 같은 반추위 동 물에게도 급여될 수 있다.
사료에 첨가되는 미생물 복합제제의 첨가량은 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 예를 들어 동물에 따라 시판되는 사료에 균주의 총수가 1×105 ∼ 1×1012 cfu/g 정도 함유하도록 첨가하면 된다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 이해를 위한 예시에 불과할 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석하여서는 아니됨에 유의해야 한다.
<실시예 1> 복합미생물 균주의 배양
미생물이 함유된 토양시료(충북 제천의 산림의 부숙토)를 60℃에서 30분 동안 열처리한 후 막자사발에서 곱게 갈아 준비해 둔 다음, 시료 1g을 취하여 0.85 % NaCl 9㎖에 현탁한 후, 100 내지 10-7로 희석하였다. 각각의 희석 현탁액 100 ㎕를 TSA, BL, BBL 배지(DIFCO 사)에 도말하여 28℃에서 배양하여 토양미생물 복합종균을 배양하였다. 상기 토양미생물 혼합종균을 분리동정한 결과 바실러스 속 균주 또는 유산균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12), 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) 및 페디오코커스 펜 토사세이스 스트레인 LM2632(Pediococcus pentosaceis strain LM2632) 등으로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2> 미생물제제의 제조
상기와 같이 배양된 토양미생물 종균 0.01kg, 쌀겨 4kg, 당밀 2kg 및 황설탕 4kg을 음용수 기준에 적합한 물과 혼합하여 무게가 100kg이 되도록 혼합한 후 20 내지 25℃를 유지하며 4시간 간격으로 10㎥/h의 공기를 2시간 동안 폭기하는 과정을 일일 4회 반복적으로 수행하며 21일간 배양하여 복합미생물 액제를 제조하였다. 상기 복합미생물 액제는 총균수 4.3 x 109 cfu/g였다.
이와는 별도로, 미리 분쇄한 65kg의 쌀겨, 35kg의 농산물부산물을 혼합기능이 있는 배양기에 넣고 30분간 혼합하였다. 혼합된 원료에 상기 복합미생물 액제 30kg을 넣어 수분농도 70%로 조절한 다음, 상기 본 발명에 따른 미생물 혼합종균을 배양원료 전체중량의 0.01%로 접종하였다. 접종된 배양원료를 외기온도 300℃, 배양기 내부온도 80 내지 85℃,30 내지 80rpm/min으로 교반하면서 초고온 배양을 4시간 진행하였다.
<실시예 3> 미생물의 동정
상기와 같이 제조한 미생물제제 중 콜로니 형태가 다른 것들을 선발하여 TSA 배지에서 적어도 3회 이상 계대배양하여 단일콜로니로 분리한 후, 분리된 균주는 액체 배양하고 지노믹 DNA(genomic DNA)를 순화하여 16S RNA의 프라이머를 이용하여 증폭한 뒤, 증폭된 부분을 주형(template)으로 하고 519r과 785r 프라이머(primer)를 사용하여 서열을 시퀀싱(sequencing)하였다. 그 결과물을 NCBI DB에서 조사하여 종을 동정하였는 바, 16S RNA로 균을 동정하는 데 쓰인 프라이머 세트는 "Nucleic acid techniques in bacterial systematics (John Wiley and Sons, England)"와 "nucleic acid research (2000) 28(1):173-174를 참고하였다.
또한, 상기 16s RNA 시퀀싱 외에 GC-MIDI분석, BIOLOG 분석을 더해 동정을 하였다. 상기 16s RAN 시퀀싱 결과와 GC-MIDI의 결과가 상이한 경우에는 GC-MIDI의 결과를 따르는 방향으로 동정하였다. 하기 표 1은 상기 16s RNA 시퀀싱 결과와 GC-MIDI 및 Biolog 분석 결과를 통해 확인된 본 발명의 미생물제제에 포함된 신규한 균주에 대한 동정결과를 나타낸 것이다. 하기 표 1에 나타난 것과 같이, 본 발명의 미생물제제는 식물성 병원균에 대하여 길항작용을 갖는 총 8종의 신규한 균주를 포함한다. SEQ NO 1∼8은 각각 하기 신규한 균주에 대한 16s RNA 분석결과이다.
<표 1>
|
GC 분석 |
16s RNA sequencing |
Biolog 분석 |
No.1 |
유사도 |
|
|
|
ks-3 |
0.914 |
Bacillus
-
subtilis
|
Bacillus
subtilis
|
Bacillus amyloliquefaciens B |
ks-4 |
0.769 |
Bacillus-amyloliquefaciens |
← |
← |
ks-5 |
0.761 |
Bacillus
-
agaradhaerens
|
Bacillus sp. |
Bacillus subtilis C |
ks-6 |
0.789 |
Paenibacillus
-
lentimorbus
|
← |
← |
ks-7 |
0.794 |
Bacillus
-
laevolacticus
|
Bacillus
sonorensis
|
Bacillus
licheniformis
|
ks-9 |
|
Leuconostoc paramesenteroides |
Leuconostoc paramesenteroides |
ks-13 |
0.294 |
Kurthia
-
sibirica
|
Bacillus
oleronius
|
Streptococcus
iniae
|
ks-18 |
0.674 |
Sphingobacterium
-
spiritivorum
|
Uncultured bacterium PE02 |
Sphingobacterium
spiritovorum
|
<실시예 4> 분말상 미생물제제의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 액상의 미생물제제를 실온(20 내지 25℃)으로 냉각한 다음 열풍건조(60℃)의 과정을 거쳐 수분함량 12%의 미생물제제 92kg을 제조하였다.
<실시예 5> 양돈 사료조성물
본 발명에 따른 미생물 제제를 함유하는 실험 사료의 효과를 이를 포함하지 않는 대조군 사료와 비교되었다. 120일간 돼지 100마리에게는 대조군 사료를 먹이고, 다른 100마리에게는 실험사료를 급여하였다. 사료 조성물은 이유자돈 사료(슈퍼젖돈 M;(조단백 19.0%, 조지방 3.0%, 칼슘 0.8%, 인 0.6%, 조섬유 5.5%, 조회분 8.0%, 라이신 1.2% 함유, 수원축협 제품) 및 육성돈 사료(슈퍼육성돈M; 조단백 16.0%, 조지방 3.0%, 칼슘 0.8%, 인 0.6%, 조섬유 5.5%, 조회분 8.0%, 라이신 0.88% 함유; 수원축협 제품)에 실험군의 경우 본 발명에 따른 미생물 제제를 1×1010 cfu/g 가 되는 양으로 하여 첨가하였다.
실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 표 2로부터, 실험 사료를 먹인 돼지는 상당히 낮은 사료 요구율을 가진다는 것을 알 수 있었다. 이는 돼지의 소화능력을 향상시키는 것으로 추정된다.
<표 2>
|
대조군 |
실시예 |
돈수 |
20 |
20 |
초기생중량(Kg) |
25.1 |
25.15 |
최종생중량(Kg) |
108.4 |
110.2 |
성장률(g/일) |
694 |
708 |
사료섭취량(Kg/일) |
1.92 |
1.90 |
사료요구율 |
2.77 |
2.68 |
육류비율 |
57.2 |
57.5 |
또, 상기 실시예에서 얻어진 미생물 제제의 사료첨가에 따른 대장균 억제 효과에 대해 실험하였다. 급여 방법으로서는 상기 미생물 제제를 농장에서 사용하고 있는 종돈용 및 포유기 새끼 돼지용 사료에 중량 비율로 0. 5% 첨가하는 방식으로 수행하였다.
미생물 제제의 사료첨가 개시전 및 개시 40일 후에 약 40~50일령의 새끼 돼지로부터 직장편을 채취하고, 분변내의 대장균수(CFU/g log 환산)를 계수하였다. 계수 결과를 표 3에 나타냈다. 실험결과에서 첨가 개시전과 첨가 개시 40일 후의 경향에 의미가 있는 차이가 인정되었다. (p<0. 05)
<표 3>
상기 결과에 의하면 본 발명에 의해 대장균의 증식을 경감시킬 수 있다는 것이 명백하였다.
<실시예 6> 비육우 사료조성물
비육우용 사료조성물을 제조하였다. 기본사료는 미가공옥수수 5kg, 면실피 펠렛 1.5kg, 생미강 0.5kg, 소맥피 1.5kg, 면실박 0.45kg, 대두박 1.0kg, 소금 0.1kg, 석회석 0.15kg, 당밀 0.25kg, 미량광물질 0.05kg으로 조제되었다. 본 발명 실시예에는 미생물 제제를 1×1010 cfu/g 가 되는 양으로 하여 첨가하였다. 이렇게 조제된 사료는 기타 조사료 (볏집)의 사용없이 가축에게 급여하였다.
실시예 및 비교예(본 발명에 따른 미생물 제제를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조성으로 하였다)를 대상으로 대사성 질환의 발생률을 측정하였다. 300kg 정도의 거세우(n=250마리/군)에 실시예와 비교예의 사료를 150여일간 급여하면서 건물섭취량과 일당중체를 관찰하여 얻은 결과를 하기 표에 나타내었다. 간 농양 발생비율은 비육이 끝난 대상우(A군)를 도축하여 간의 상태를 기준으로 판단하였고, 반추위 융모파괴도는 대상우 (B군)를 도축하여 반추위의 융모상태를 육안으 로 조사하여 판단하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
<표 4>
체중 60-100kg에 이르는 홀스타인 수소 10두를 이용하여 2개 군으로 분리(5두/군)하여 사양실험을 실시하였다. 체중이 약550kg에 이르는 시점을 기준으로 도축(비교예의 경우는 사료섭취량의 급격한 저하로 550kg에 달하기 전에 도축)을 하여 비육기간 동안 일당증체, 사료섭취량을 측정하여 사료효율(kg 중체당 소요된 사료량)을 구하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
<표 5>
|
비교예 |
실시예 |
개시체중(kg) |
65 |
68 |
종료체중(kg) |
501 |
505 |
총증체량(kg) |
436 |
437 |
비육기간(일) |
358 |
310 |
일당증체(kg/일) |
1.22 |
1.41 |
사료섭취량(kg) |
농후사료 |
2850 |
2598 |
사료효율 |
6.54 |
5.95 |
상기 결과에 의하면 본 발명에 의한 사료급이 가축의 경우 대사성 질병발생률도 적고, 높은 영양의 사료섭취로 인하여 가축이 비육효율(일당 중체)이 크게 증가될 뿐만 아니라, kg중체에 소요되는 사료의 양도 적어 전체적으로 사료효율이 증가된다.
<실시예 7> 산란계용 사료조성물
본 발명에 따른 복합미생물 제제를 시판 산란계용 사료(디럭스 산란(제품명), 부국사료, 한국)에 일정량 첨가하여 복용시켰다. 사료의 급여는 본 발명에 따른 미생물 제제를 첨가하여 산란계에 복용시켰다.
20만 마리의 산란계에 대해 복용시켜 폐사율과 평균산란율을 측정한 결과는 아래와 같았으며, 복용량은 시중에서 판매하는 사료에 본 발명에 따른 미생물 제제가 1×1010 cfu/g 함유하도록 하여 복용시킨 결과이다.
그 결과 하기 표 6과 같이 본 발명에 따른 사료를 복용하기 전의 폐사율이 21.2% 인데 비하여 복용 후의 폐사율은 1.52%를 보여 19.68%의 폐사율을 줄였고, 평균산란율도 복용 전의 산란율이 72.52%에서 92.30%로 개선되어 19.78% 증가된 산란율을 보여주었다. 또한 산란율 90% 이상을 유지한 일수도 연속적으로 16주를 보이는 효과를 나타내었다.
<표 6>
|
복용전 |
복용후 |
폐사율(%) |
21.2 |
1.52 |
산란율(%) |
72.52 |
92.30 |
산란율 90% 유지일수 |
- |
연속 16주 |
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.