KR100791609B1

KR100791609B1 - 면역기능이 우수한 프로바이오틱 바실러스아밀로리케페이션스 ｋｕ801 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100791609B1
Application number: KR1020060111141A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 이나경; 강창원; 윤철원; 장효일; 김승욱
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2008-01-04

Abstract

본 발명은 닭 분변으로부터 분리한 면역활성 및 발암물질에 의한 DNA 손상억제효과가 우수한 프로바이오틱스 생균 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명 프로바이오틱스 생균 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P)은 면역기능조절에 관여하는 인터루킨-1α 생산 및 암예방에 뛰어난 효과가 있다.

프로바이오틱, 바실러스 아밀로리케페이션스, 면역기능, 인터루킨-1α, 암예방

Description

면역기능이 우수한 프로바이오틱 바실러스 아밀로리케페이션스 ＫＵ801 및 그의 용도{Probiotic Bacillus amyloliquefaciens KU801 with higher ability of immunity and its use}

도 1은 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 16S rDNA 염기서열 분석의 계통학적 분류를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 지방산 분석을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 영양세포의 인공위액에 대한 내성을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 아포세포의 인공위액에 대한 내성을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 영양세포의 인공담즙산에 대한 내성을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 아포세포의 인공담즙산에 대한 내성을 나타낸 것이다.

도 7은 마우스 인터리킨-1α 엘라이자 키트의 스탠다드 커브를 나타낸 것이다

도 8은 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 영양세포의 DNA 손상억제효과를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 10792P)의 아포세포의 DNA 손상억제효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 닭 분변으로부터 분리한 면역활성효과가 우수한 프로바이오틱 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801에 관한 것이다.

사스(Severe Acute Respiratory Syndrom; SARS) 바이러스성 전염병은 특효약이 전무하고 특히 돌연변이에 의한 인간에의 전염이 세계적 문제가 되고 있다. 국내에 조류독감(가금 인플루엔자)이 발생한 것은 1996년 3월부터 8월 사이 경기도 화성, 전북 정읍, 경북 영천 등에서 처음 발생했다. 이후 2002년까지 66건이 발생하였지만 이때까지 발생한 것은 모두 약병원성으로 H9계열이었다. 최근 2003년 12월 25일에 5개 닭 농장과 7개 오리 농장에서 발생한 것은 국내 처음으로 고병원성 조류독감이 발생하였다.

이러한 전염병의 예방을 위하여 항생제가 광범위하게 사용되고 있으며 항생제의 과다 사용은 새로운 내성균의 출현 및 인체의 항생제 내성을 유발시킨다. 가축의 면역능력 강화를 통한 미생물에 의한 감염에 대한 저항성 증진은 축산업의 질 적, 양적 성장 및 인간에게의 전염도 막을 수 있는 방법으로 사료된다.

프로바이오틱스는 동물체에 제공할 경우 면역 능력이 향상된다는 보고가 있으며 이러한 결과로부터 현재 많은 분야에서 면역증진 효과를 시험하고 있으며 새로운 사료첨가제로서 가치가 매우 높다.

면역증진기능을 지닌 기능성물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체물질로서 이용이 가능하다. 따라서 프로바이오틱스의 기능을 가지고 면역세포 활성능을 가진 미생물을 분리하여 사료첨가제로 이용함으로서 가축을 전염병으로부터 예방하여 농가의 수입증대에 기여할 수 있으리라 사료된다.

인터루킨-1α는 T-세포의 생산을 증가시키고 B-세포의 활성화 및 항체생산을 증가시키는 등 생체 내 여러 면역 기능 조절에 관여하고 있는 면역 조절 물질 중의 하나이다.

프로바이오틱스의 면역기능 활성에 대한 종래 기술는 대한민국 등록번호 10-0574527, 10-0588521호 등으로 공지된 바 있다.

따라서 본 발명은 목적은 닭 분변으로부터 분리한 면역기능이 우수한 프로바이오틱스 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P)을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 닭 분변으로부터 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스KU801 (Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P)을 분리하고 위액, 담즙산, 항생물질에 대한 내성, 항균활성을 확인하고 인터루킨-1α 생성능 및 발암물질에 대한 DNA 손상억제효과을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 인터루킨-1α 생성능이 있고 발암억제 효과를 가지는 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801(Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801을 유효성분으로 하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명은 닭 분변으로부터 프로바이오틱스 바실러스 아밀로리케페이션스KU801 (Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P)를 분리하고 동정하는 단계; 바실러스 아밀로리케페이션스의 인공위액과 인공담즙산에 대한 내성을 측정하는 단계; 바실러스 아밀로리케페이션스의 효소생산성을 측정하는 단계; 바실러스 아밀로리케페이션스의 항생물질에 대한 내성을 측정하는 단계; 바실러스 아밀로리케페이션스의 인터루킨1-α 생성능을 측정하는 단계 및 바실러스 아밀로리케페이션스의 발암물질에 의한 DNA 손상억제효과를 측정하는 단계로 구성된다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801는 트립틱 소이 브로스(Tryptic Soy broth; TSB, Difco Lacboratories) 배지를 사용하여 37℃에서 교반속도 150rpm으로 12시간 배양하였다.

실시예1 . 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 분리 및 동정

본 발명은 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801을 분리하기 위하여 닭 분변으로부터 200여개의 균을 분리하였다. 상기 분리된 균주들 중에서 위액, 담즙산에 대한 내성이 우수하고 효소생산이 뛰어난 균주를 선별하여 API 50 CHB 키트를 이용하였고 16S rDNA의 염기서열, 균체지방산 성분을 분석하여 동정하였다.

상기와 같이 닭 분변으로부터 분리 및 동정한 결과, 본 발명 균주는, 표 1에 나타낸 것과 같이 API 50 CBH 키트 결과 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 42.5%, 바실러스 리체니포미스(B. licheniformis) 39.9%, 바실러스 아밀로리케페이션스(B. amyloliquefaciens) 17.5%의 유사성을 나타내었다.

16S rDNA 염기서열은 97%의 유사성으로 바실러스 아밀로리케페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)와 일치하였다(도 1참조).

본 발명 균주의 균체지방산 성분은, 도 2과 같이 12-메틸테트라데카노익 산(15:0 안테이소-Cn)와 13-메틸테트라데카노익 산(15:0 이소 Cn) 성분이 주성분으로 바실러스 속에서 볼 수 있는 특징을 가지고 있었으며 안테이소-C15 산과 이소-C15 산이 각각 41.9%, 32.75%였다. 그리고 데이터베이스를 이용한 검색결과, 바실러스 서브틸러스(B. subtilis) 42.3%, 바실러스 아밀로리케페이션스(B. amyloliquefaciens) 32.8%, 바실러스 플렉서스(B. flexus) 29.9%의 유사성을 나타내었다.

이상 표 1 및 도 1 내지 2에 나타난 결과, 본 발명 균주는 바실러스 아밀로리케페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)으로 판명되었고 KU801로 명명하였으며, 2006년 11월 2일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 10792P으로 기탁하였다.

[표 1] 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 API 50CHL 결과

탄수화물	KU801	탄수화물	KU801	탄수화물	KU801
대조구	-	만니톨	+	베타-베타젠티비오스	-
글리세롤	+	소르비톨	+	디-튜란노스	-
에리스리톨	-	에스큘린	+	디-라이소스	-
디-아라비노오스	-	살리신	+	디-타가토스	-
엘-아라비노오스	+	셀로비오스	+	디-푸코오스	-
리보스	+	말토스	+	엘-푸코오스	-
디-크실로오스	-	락토스	+	알파-메틸-D-만노시드	-
엘-크실로오스	-	멜리비오스	-	알파-메틸-디-글루코시드	+
아도니톨	-	사카로오스	+	엔-아세틸 글루코사민	-
베타-메틸-크실로시드	-	트레할러스	+	아미그달린	+
갈락토즈	-	인슐린	-	아르부틴	+
디-글루코스	+	멜레지토스	-	디-아라비톨	-
디-플락토스	+	디-라피노오스	+	엘-아라비톨	-
디-만노즈	+	아미돈	+	글루코네이트	-
엘-소르보스	-	글리코겐	+	2-케토글루코네이트	-
람노즈	-	자일리톨	-	5-케토글루코네이트	-
+: 양성, -: 음성

실험예1 . 인공위액에 대한 내성

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인공위액에 대한 내성은 코바야시 등의 방법에 따라 5N HCl을 사용하여 pH 2.5, pH 4.0으로 조정한 액체 배지에 펩신을 1% 첨가하여 사용하였다.

영양세포의 인공위액에 대한 내성을 확인하기 위해 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 12시간 배양된 배양액 1 mL을 테스트 튜브의 인공위액 9 mL에 넣어 배양하면서 0, 0.5, 1, 1.5, 2시간 간격으로 실험군을 채취하여 TS 아가 플레트를 이용하여 총 균수를 측정하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 영양세포의 인공위액에 대한 내성을 확인한 결과 도 3와 같이 pH 2.5와 pH 4.0으로 조정된 인공위액에서 2시간 경과 후 영양세포는 각각 0.002와 28.09%의 생존률을 나타내었다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 아포세포의 인공위액에 대한 내성을 확인하기 위해서 3일 배양된 배양액을 80℃에서 10분간 열처리하여 6,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 배양상등액을 제거하고 균체를 회수하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였다. 대조구로는 pH를 조절하지 않고 펩신을 첨가하지 않은 액체배지에 상기와 같은 동일한 방법을 사용하여 실험하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 아포세포의 인공위액에 대한 내성을 확인한 결과 도 4와 같이 pH 2.5와 pH 4.0으로 조정된 인공위액에서 2시간 경과 후 내생포자는 각각 40.78과 74.47%의 높은 생존률을 나타내었다.

실험예2 . 인공담즙산에 대한 내성

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인공담즙산 내성을 확인하기 위해서 살균된 액체배지에 멸균한 0.3% 옥스갈(oxgall, Difco)을 첨가하여 사용하였다. 인공위액을 거친 배양액을 인공담즙산이 있는 시험관에 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생존력을 확인하기 위해서 상기 실험예1의 인공위액과 마찬가지로 총 균수 및 총 아포세포 균수를 측정하였다. 대조구는 옥스갈이 첨가되지 않은 액체배지에 상기와 같은 방법으로 하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인공담즙산에 대한 내성을 확인한 결과 영양세포의 경우에는 도 5과 같이 pH 4.0의 위액을 처리한 실험군에서 93.29%의 생존률을 나타내었으며 아포세포에서는 도 6과 같이 인공담즙산에 대한 내성을 가질 뿐만 아니라, 인공담즙산이 함유되지 않은 대조구(1.45×10⁷ CFU/mL)보다 균수(1.50×10⁷ CFU/mL)가 더 많이 증식되었다.

실험예3 . 효소생산성

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 효소생산성을 측정하기 위해서 균주 배양액을 원심분리하여 균체만을 회수하여 멸균수로 2회 반복하여 세척한 후 멸균수에 현탁하여 1.0×10⁶ CFU/mL의 농도가 되도록 하였다. 이 현탁액을 API ZYM 키트(bioMerieux Co., France)에 접종하여 어두운 곳에서 37℃의 조건으로 4시간 배양하였다. 표현활성 증가와 용해를 돕기 위해 ZYM A, B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨리고 밝은 곳에서 약 5분간 반응시킨 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소활성을 측정하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 효소생산성을 API ZYM kit를 이용하여 확인한 결과, 표 2와 같이 발암효소인 베타-글루쿠로니다아제가 생산되지 않음을 확인할 수 있었다. 그리고 예비적 발암물질을 발암물질로 변환시키는 베타β-글루코시다제의 활성 역시 없는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 결과는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 생균으로 인해 발생할 수 있는 발암 유발의 위험성이 없음을 알 수 있다.

[표 2] 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 효소활성

효소	KU801	효소	KU801
대조구	0	알파-키모트립신	0
알카라인 포스파타제	2	산 포스파타제	2
에스테라제(C₄)	4	나프톨-AS-BI-포스포하이드라제	5
이스테라제 리파제(C₈)	5	알파-갈락토시다제	0
리파제(C₁₄)	1	베타-갈락토시다제	0
루신 아릴라미다제	0	베타-글루쿠로니다제	0
바린 아릴라미다제	0	알파-글루코시다제	2
크리스틴 아릴라미다제	0	베타-글루코시다제	0
트립신	0	엔-아세틸-베타-글루코사미다제	0
알파-만노시다제	0	알파-푸우코시다제	0
0: 0 nmol, 1: 5 nmol, 2: 10 nmol, 3: 20 nmol, 4: 30 nmol, 5: ≥40 nmol

실험예 4. 항생물질에 대한 내성

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 항생물질 내성을 측정하기 위해서 페이퍼 디스크 방법을 사용하였다. 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801을 최적온도에서 12시간 배양하고, TS 소프트 아가(0.75% 아가)에 배양액을 100㎕ 접종하여 아가 플레트에 오버레이하였다. 오버레이된 플레트에 페이퍼 디스크를 멸균된 핀셋으로 올려놓고, 페이퍼 디스크에 각 농도별의 항생물질을 10㎕씩 떨어뜨린 후 12시간 배양하여 항생물질 내성을 측정하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 항생물질 내성을 측정한 결과 표 3과 같이 20㎕/mL 이상의 농도에서 생육 저해를 받는 감수성을 나타내었으며, 스트렙토마이신(streptomycin), 네오마이신(neomycin), 록시트로마이신(roxithromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 젠타마이신(gentamycin)은 20㎕/mL이상의 농도에서 저해를 받지 않는 내성을 나타났으며, 니신(nisin)은 100㎕/mL의 농도에서도 저해를 받지 않은 내성을 나타내었다.

[표 3] 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 항생물질 내성

항생제(㎍/mL)		KU801	항생제(㎍/mL)		KU801
니신	0 25 50 100	+ + + +	Chlo클로람페니콜	0 5 10 20	+ + + +
스트렙토마이신	0 5 10 20	+ + + +	젠타마이신	0 5 10 20	+ + + +
네오마이신	0 5 10 20	+ + + +	리팜피신	0 5 10 20	+ + + +
록시트로마이신	0 5 10 20	+ + + +	에리트로마이신	0 5 10 20	+ + + -
+: 성장, -: 성장 저해

실험예5 . 항균물질에 대한 내성

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 병원성균에 대한 항균활성을 측정하기 위해 박 등(2003)의 방법을 사용하였다. 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801과 병원성균으로 사용된 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 에쉴리키어 콜라이(Escherichia coli) O157:H7을 TSB 배지를 사용하여 37℃에서 12시간 배양한 후, 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 배양액을 TS 아가 플레트에 3㎕ 접종하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 그 다음 TS 소프트 아가에 병원성균을 100㎕ 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 항균활성도(mm)를 측정하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 병원성균에 대한 내성을 측정한 결과 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 에쉴리키어 콜라이(Escherichia coli) O157:H7에 대한 항균활성도는 각각 2mm, 3mm의 저해능을 나타내었다.

실험예6 . 인터루킨-1α의 생성능 측정

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인터루킨-1α 생성능은 마우스 IL-1 알파 엘라이자 키트 (Koma biotech Inc., Korea)를 사용하여 측정하였다.

100㎕의 레콘스티튜어 캡쳐 안티바디 (0.5㎍/mL)를 96 웰 플레트에 넣고, 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 세척액(Washing solution)으로 3 내지 5회 세척한 다음 각 웰에 200㎕의 블로킹 솔루션을 첨가하고, 다시 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거한 후 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척하였다. 레콘스티튜어 스탠다드를 2,500pg/mL에서 16pg/mL로 단계적으로 희석하고, 100 ㎕씩 첨가하였다. 그리고 나머지 다른 웰에 100㎕ 샘플을 첨가하고 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척한 다음 100㎕의 100㎍/mL의 레콘스티튜트 디텍션 안티바디를 각 웰에 첨가하고, 다시 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 그리고 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척한 후 2,000배 희석한 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 100㎕를 첨가한 다음 다시 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 또 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척하였다. 발색기질용액(50㎕ TMB 용액과 100㎕ 기질 용액)을 각 well에 첨가하고 5 내지 10분간 실온에 반응시켰다. 그리고 50㎕ 스탑 솔루션 (2M H₂SO₄)를 각 well에 첨가한 후, 마이크로타이터 플레트 리더로 450nm에서 측정하였다. 스탠다드 커브와 비교하여 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인터루킨-1α 생성능을 확인하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 인터루킨-1α 생성능를 마우스 IL-1α 엘라이자의 도 7의 스탠다드 커브와 비교하여 측정한 결과, 22배 에탄올 농축하였을 때 444 pg/mL을 생산하였다. 이에 반해, 대조구로 사용한 TS 액체배지에서는 그 활성을 확인할 수 없었다.

실험예7 . DNA 손상억제 활성

건강한 성인 남성(20-25세, 비흡연자)으로부터 채혈하여 헤파린 처리된 튜브에 담아 전혈로부터 히스토파크 1077을 이용해 임파구만을 분리한 후 본 발명에 사용하였다. 직접 발암원인 메틸화학제(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine; MNNG, Fluka, Germany)는 4℃에 냉장 보관하였고 매 실험 직전에 HBSS 완충용액에 녹여 발암원으로 사용하였다.

영양세포(vegetative cell), 아포세포(spore cell)는 각각 10, 25, 50 mg/mL의 농도로 HBSS 완충용액에 현탁시키고 직접 발암원인 MNNG(5㎎/mL)을 HBSS 완충용액에 최종농도가 50㎍/mL이 되도록 10㎕를 첨가하였다. 상기 MNNG가 있는 완충용액을 37℃ 진탕항온기에서 150rpm의 속도로 30분간 전처리시켰다.

음성대조구로는 1mL의 HBSS 완충액에 10㎕의 PBS 완충용액을 첨가하였고 양성대조구로는 1mL HBSS 완충액에 10㎕의 MNNG(5㎎/mL)를 첨가하여 최종농도가 50㎍/mL가 되도록 한 후 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 현탁액과 마찬가지로 진탕항온기에서 30분간 전처리시켰다. 전처리가 끝난 다음 음성 또는 양성 대조구 및 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 현탁액을 11,000rpm에서 10분 간 원심분리하고 이중 상등액 10㎕(MNNG 최종농도 0.5㎍/ml)를 수득하여 인체 임파구에 처리한 다음 37℃ 진탕항온기에서 30분간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 임파구는 다시 PBS 완충용액으로 2회 세척한 다음 20㎕를 수득하여 트리판 블루(trypan blue) 20㎕와 섞어 헤마사이토메터를 이용하여 현미경으로 관찰하여 모든 처리구에서 세포 생존율이 95% 이상인 것을 확인하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 코메트 분석(Comet assay)는 풀-조벨의 방법을 수정 및 보완하여 실시하였다. 코메트 분석를 위하여 임파구 현탁액 중 20㎕을 채취하여 75㎕의 0.5% 아가로스 젤과 섞은 후 1.0% 아가로스 젤이 프리코팅된 슬라이드 위로 세포 부유물과 0.5% 아가로스 젤의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버 글라스로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 커버 글라스를 벗기고 그 위에 다시 0.7% 아가로스 젤 용액 75㎕로 한 겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 알카리 라이시스 버퍼(2.5M NaCl, 100mM Na₂ EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% 트립톤 X-100을 섞은 후 slide를 담가 저온, 암실에서 1시간 침지시켜 DNA의 더블 스트랜드를 풀었다. 라이시스가 끝난 슬라이드를 일렉트로포시스 탱크에 배열하고 전기영동 4℃의 차가운 버퍼(300mM NaOH, 10 mM Na₂ EDTA, pH>13)를 채워 40분 동안 반응시켜 DNA의 알카리 라빌 사이트가 드러나게 한 후 25V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 탱크를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4M 트리스 완충용액 (pH 7.4)에 10분씩 담가 세 척하는 과정을 3회 반복하여 슬라이드를 건조시켰다. 20㎕/㎖ 농도의 에티디움 브로미드로 핵을 염색하여 커버 글라스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD 카메라(Nikon, Japan)를 이용하여 보내진 각각의 세포핵 이미지는 코메트 4.0 코메트 이미지 아날리징 시스템(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. CHO-K1 세포의 MNNG에 의한 DNA 손상 및 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801에 의한 손상억제정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분내 DNA % 함량(% Tail DNA)으로 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 slide를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801의 영양세포 및 아포세포의 DNA 손상 억제 효과를 확인한 결과 도 8 내지 9과 같이 직접 발암원인 MNNG를 0.5㎍/mL 농도로 임파구에 처리했을 때 핵으로부터 떨어져 나간 손상된 DNA의 상대적 양은 약 81%로 PBS 완충용액을 처리한 음성대조구의 6%에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타나 0.5㎍/mL의 MNNG에 의한 DNA 손상을 확인하였다. MNNG 처리에 의해 손상된 DNA는 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801과 MNNG를 미리 반응시켜 세포에 처리하였을 경우 DNA 손상정도가 유의적으로 감소한 것으로 나타나 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801에 의한 DNA 손상 억제 효과를 확인하였다.

본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 영양균의 경우 균의 농도를 10, 25, 50㎎/mL로 하여 MNNG와 전반응시킨 후 세포에 처리하였을 때 형광발광 (%) DNA가 각각 79, 21, 4%로 10㎎/mL 처리군을 제외하고는 양성대조구인 MNNG 처리군의 81%에 비해 유의적으로 DNA 손상정도를 감소시켰다. 아포세포의 경우 10, 25, 50㎎/mL의 형광발광 (%) DNA가 각각 58, 51, 21%로 양성 대조구에 비해 유의적으로 DNA 손상을 감소시켰다.

상기와 같은 결과를 종합해 볼 때 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801는 영양세포 및 아포세포는 정도의 차이는 있지만 공통적으로 발암물질인 MNNG과 반응하여 MNNG이 DNA를 손상시키는 기전을 처단함으로써 발암억제 또는 암예방 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

이와같이 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801는 면역세포 활성능을 가진 프로바이오틱스 생균제로써 통상의 방법에 따라 사료첨가제로 사용할 수 있다.

이상 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 (기탁번호 KCCM 70972P)는 생체 내 면역기능조절에 관여하는 면역조절물질 중의 하나인 인터루킨-1α의 생성능이 우수하고 발암억제 또는 암예방 효과가 있으므로 프로바이오틱스 생균제로써 통상의 방법에 따라 사료첨가제로 사용할 수 있기 때문에 축산산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

인터루킨-1α 생성능이 있고 발암억제 효과를 가지는 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801 균주(Bacillus amyloliquefaciens KU801, 기탁번호 KCCM 10792P).
제 1항의 상기 바실러스 아밀로리케페이션스 KU801을 유효성분으로 함을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.