KR100822038B1 - 위액 및 담즙에 내성이 있고 인터루킨 1α 생산하는락토바실러스 애시도필러스 Ａ12 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 닭 분변으로부터 분리한 위액 및 담즙산에 대한 내성이 있고 인터루킨-1α 생산력이 우수한 신규한 프로바이오틱 유산균 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명 프로바이오틱 락스바실러스 애시도필러스 A12(Lactobacillus acidophilus A12, 기탁번호 KCCM 107971P)는 닭 분변으로부터 분리된 신규한 균주로써 위액 및 담즙산에 대한 내성이 있고 면역조절 물질 중 하나인 인터루킨-1α의 생산력이 있는 뛰어난 효과가 있다.
위액, 담즙산, 락토바실러스 애시도필러스, 프로바이오틱, 인터루킨-1α

Description

위액 및 담즙에 내성이 있고 인터루킨 1α 생산하는 락토바실러스 애시도필러스 Ａ12 및 그의 용도{Lactobacillus acidophilus A12 having gastric juice-resistance, bile acid-resistance and producing interleukin 1αand its use}
도 1은 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12(기탁번호 KCCM 107971P)의 위액에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12(기탁번호 KCCM 107971P)의 담즙산에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 마우스 IL-1 알파 엘라이자 키트의 인터루킨-1α의 스탠다드 커브를 나타낸 것이다
본 발명은 위액 및 담즙산에 대한 내성이 있고 인터루킨-1α를 생산하는 신규한 프로바이오틱스 락토바실러스 애시도필러스 A12에 관한 것이다.
미생물에 의해 유발되는 가축 전염병의 확산은 국가 경제에 치명적이다. 특히 사스(Severe Acute Respiratory Syndrom; SARS)와 같은 바이러스성 전염병은 특효약이 전무하고 특히 돌연변이에 의한 인간에의 전염이 세계적 문제가 되고 있다. 국내에 조류독감(가금 인플루엔자)이 발생한 것은 1996년 3월부터 8월 사이 경기도 화성, 전북 정읍, 경북 영천 등에서 처음 발생하였으며 이후 2002년까지 66건이 발생하였다.
최근 2003년 12월 25일에 5개 닭 농장과 7개 오리 농장에서 발생한 것은 국내 처음으로 고병원성 조류독감이 발생하였다. 이러한 전염병의 예방을 위하여 항생제가 광범위하게 사용되고 있으며 항생제의 과다 사용은 새로운 내성균의 출현 및 인체의 항생제 내성을 유발시킨다.
면역능력의 강화를 통한 병원균에 의한 감염 예방은 내성균의 유발을 막을 수 있는 유일한 방법이다. 면역능력의 강화는 기존의 화학적으로 합성된 물질의 제공을 통한 면역증진 방법보다는 식용 가능한 미생물체에서 대량생산되는 천연 면역능력 강화 물질을 제공하는 것이 더욱 효율적이다. 프로바이오틱스 생균제는 이미 동물체에 제공할 경우 면역 능력이 향상된다는 보고가 있으며 이러한 결과로부터 현재 많은 분야에서 면역증진 효과를 시험하고 있으며 새로운 사료첨가제로서 가치가 매우 높다.
프로바이오틱스는 정장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거할 수 있는 미생물로 알려져 있다.
프로바이오틱 생균제로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면인 생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성(antigenotoxic) 활성, 병성성 세균의 억제능 등이 있고, 기술적 측면으로 관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조 과정 중의 생존성 등이 있다.
최근 프로바이오틱스의 면역증진 연구로 조사되고 있는 인터루킨-1α는 T-세포의 생산을 증가시키고 B-세포의 활성화 및 항체생산을 증가시키는 등 생체 내 여러 면역 기능 조절에 관여하는 면역조절물질 중의 하나이다.
종래 프로바이오틱 유산균으로는 본 발명자 등에 의하여 한국인 분변으로부터 위액 및 담즙산에 대한 내성이 높으며 장내 생존력이 우수한 락토바실러스 퍼멘텀 HY701(Lactobacillus fermentum HY701)이 대한민국 특허등록 2003-0064030호로 공지된 바 있다.
따라서 본 발명의 목적은 닭 분변으로부터 분리된 위액 및 답즙산에 대한 내성 있고 인터루킨-1α을 생산하는 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 A12(기탁번호 KCCM 10791P)를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 닭 분변으로부터 락토바실러스 애시도필러스 균주를 분리하고 API 50CHL 키트로 동정한 후 위액, 담즙산, 항생물질에 대한 내성 측정 및 인터루킨-1α 생성능을 측정하므로써 완성하였다.
본 발명은 위액 및 담즙산에 대한 내성이 우수하며 인터루킨-1α 생산능이 있는 락토바실러스 애시도필러스 A12(Lactobacillus acidophilus A12, 기탁번호 KCCM 10791P)을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 애시도필러스 A12를 유효성분으로 하는 사료첨가용 조성물을 제공한다..
발명은 닭 분변으로부터 균주를 분리하는 단계; 상기 분리된 균주를 동정하는 단계; 상기 균주의 위액에 대한 내성을 측정하는 단계; 상기 균주의 담즙산에 대한 내성을 측정하는 단계; 상기 균주의 항생물질에 대한 내성을 측정하는 단계 및 상기 균주의 인터루킨-1α 생성능을 측정하는 단계로 구성된다.
실시예1 . 균주의 분리 및 배양
본 발명은 프로바이오틱 유산균을 분리하기 위하여 닭 분변으로부터 200여 개의 균을 분리하고 그 중에서 락토바실러스 속의 형태적 특성을 갖는 균주를 선발하였다. 상기 선발된 균주 중에서 베타-갈락토시다제 활성이 강한 균주를 선발하여 유산균 전용 배양배지 엠알에스(lactobacilli MRS, Difco Laboratories, USA)를 사용하여 37℃에서 12시간 배양하였다.
실시예2 . 균주의 동정
상기 실시예1에서 선발된 균주를 동정하기 위하여 API 50CHL 키트를 이용하여 동정한 결과, 표 1과 같으며 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와 99.9%의 유의성을 나타내었다.
상기 선발된 균주를 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) A12로 명명하였으며, 2006년 11월 2일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 10791P으로 기탁하였다.
[표 1] 락토바실러스 애시도필러스 A-12의 API 50CHL 결과
탄수화물 A12 탄수화물 A12 탄수화물 A12
대조구 - 만니톨 - 베타-베타젠티비오스 -
글리세롤 - 소르비톨 - 디-튜란노스 -
에리스리톨 - 에스큘린 + 디-라이소스 -
디-아라비노오스 - 살리신 - 디-타가토스 +
엘-아라비노오스 - 셀로비오스 - 디-푸코오스 -
리보스 - 말토스 + 엘-푸코오스 -
디-크실로오스 - 락토스 + 알파-메틸-D-만노시드 -
엘-크실로오스 - 멜리비오스 - 알파-메틸-디-글루코시드 -
아도니톨 - 사카로오스 + 엔-아세틸 글루코사민 +
베타-메틸-크실로시드 - 트레할러스 - 아미그달린 -
갈락토즈 + 인슐린 - 아르부틴 -
디-글루코스 + 멜레지토스 - 디-아라비톨 -
디-플락토스 + 디-라피노오스 + 엘-아라비톨 -
디-만노즈 + 아미돈 + 글루코네이트 -
엘-소르보스 - 글리코겐 - 2-케토글루코네이트 -
람노즈 - 자일리톨 - 5-케토글루코네이트 -
+: 양성, -: 음성
실험예1 . 본 발명 균주의 인공위액에 대한 내성
상기 실시예1에서 분리된 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인공위액에 대한 내성을 측정하였다.
인공위액은 코바야시 등의 방법에 따라 5 N HCl을 사용하여 pH 2.5, pH 4.0으로 조정한 액상배지에 1% 펩신을 첨가하여 사용하였다. 영양세포의 인공위액에 대한 내성을 알아보기 위해 본 발명 균주의 12시간 배양액 1 mL을 인공위액 9 mL에 넣어 배양하면서 0, 1, 2시간 간격으로 상기 배양액을 수득하여 엠알에스 아가 플레트를 이용하여 총 균수를 측정하였다.
내생포자의 인공위액에 대한 내성을 확인하기 위해서는 3일 배양된 배양액을 80℃에서 10분간 열처리하여 4,000 X g에서 10분간 원심분리한 후 배양상등액을 버리고 균체를 회수하여 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.
대조구는 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12를 pH를 조절하지 않고 펩신을 첨가하지 않은 액상 배지에 상기와 같은 방법으로 하였다.
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12를 pH 2.5와 pH 4.0으로 조정된 인공위액에서의 실험결과, 도 1과 같이 시간이 경과 후 각각 99.00와 96.16%의 생존률을 나타내었다.
실험예2 . 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인공담즙산에 대한 내성
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인공담즙산에 대한 내성은 살균된 액체 배지에 멸균한 0.3% 옥스갈을 첨가하여 사용하였다.
인공담즙산 내성을 확인하기 위해서 인공위액을 거친 배양액을 인공담즙산이 있는 시험관에 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생존력을 조사하기 위해서 상기 인공위액과 마찬가지로 총 균수 및 총 아포균수를 측정하였다.
대조구는 옥스갈이 첨가되지 않은 액상배지에 상기와 같은 방법으로 하였다.
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인공담즙산에 대한 내성을 확인한 결과, 도 2와 같이 98.09%의 생존률을 나타내었다.
실험예3 . 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 효소생산성
실시예1에서 선발된 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 효소생산성을 측정하기 위해서 균 배양액을 원심분리하여 균체만을 회수하여 멸균수로 2회 반복 하여 세척한 후 멸균수에 현탁하여 106 CFU/mL의 농도가 되도록 하였다. 이 현탁액을 API ZYM 키트(bioMerieux Co., France)에 접종하여 어두운 곳에서 37℃의 조건으로 4시간 배양하였다. 표현활성 증가와 용해를 돕기 위해 ZYM A, B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨리고 밝은 곳에서 약 5분간 반응시킨 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소활성을 측정하였다.
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 효소생산성을 API ZYM 키트를 통해 확인한 결과, 표 2와 같이 발암효소인 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)가 생산되지 않음을 확인할 수 있었다. 그리고 예비적 발암물질을 발암물질로 변환시키는 베타-글루쿠로니다제(β-glucosidase)의 활성도 없는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과는 프로바이오틱 생균으로 인해 발생할 수 있는 발암 유발의 위험성이 없다는 사실을 뒷받침하는 것이다.
[표 2] 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 효소활성
효소 A12 효소 A12
대조구 0 알파-키모트립신 0
알카라인 포스파타제 0 산 포스파타제 3
에스테라제(C4) 0 나프톨-AS-BI-포스포하이드라제 5
이스테라제 리파제(C8) 0 알파-갈락토시다제 2
리파제(C14) 0 베타-갈락토시다제 5
루신 아릴라미다제 4 베타-글루쿠로니다제 0
바린 아릴라미다제 0 알파-글루코시다제 2
크리스틴 아릴라미다제 3 베타-글루코시다제 4
트립신 0 엔-아세틸-베타-글루코사미다제 4
알파-만노시다제 0 알파-푸우코시다제 0
0: 0 nmol, 1: 5 nmol, 2: 10 nmol, 3: 20 nmol, 4: 30 nmol, 5: ≥40 nmol
실험예4 . 항생물질에 대한 내성
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 항생물질 내성을 측정하기 위해서 페이퍼 디스크 방법을 사용하였다. 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12 최적의 온도에서 12시간 배양하고, 엠알에스 소프트 아가 플레트(0.75% agar)에 배양액을 100㎕접종하였다. 상기 소프트 아가 플레트에 페이퍼 디스크를 멸균된 핀셋으로 올려놓고, 상기 페이퍼 디스크에 각 농도별의 항생물질을 10㎕씩 떨어뜨린 후 12시간 배양하여 항생물질 내성을 측정하였다.
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 항생물질에 대한 내성 결과는 표 3과 같이, 스트립토마이신(streptomycin), 록시트로마이신(roxithromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)에 대해서 200㎍/mL에서 생육 저해를 받는 감수성이 나타났고, 오마이신(neomycin)에서는 5㎍/mL 이상의 농도에서 생육 저해를 받는 감수성을 나타내었으며, 니신(nisin), 젠타마이신(gentamycin), 및 에리트로마이신(erythromycin)은 200㎍/mL이상의 농도에서 저해를 받지 않는 내성을 나타내었다.
[표 3] 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 항생물질에 대한 내성
항생제(㎍/mL) A12 항생제(㎍/mL) A12
니신 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + + 클로람페니콜 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + -
시트립토마이신 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + - 젠타마이신 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + +
네오마이신 2.5 25.0 50.0 100.0 - - - - 리팜피신 2.5 25.0 50.0 100.0 - - - -
록시트로마이신 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + - 에리트로마이신 2.5 25.0 50.0 100.0 + + + +
+: 성장, -: 성장 저해
실험예5 . 본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인터루킨-1α 생성능 측정
본 발명 락토바실러스 애시도필러스 A12의 인터루킨-1α의 생성능을 측정하기 위하여 마우스 IL-1 알파 엘라이자 키트 (Koma biotech inc., Korea)를 사용하여 생성능을 측정하였다.
100㎕의 레콘스티튜어 캡쳐 안티바디 (0.5㎍/mL)를 96 웰 플레트에 넣고, 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 세척액으로 3 내자 5회 세척하고, 각 웰에 200㎕의 블로킹 솔루션을 첨가한 후 실온에서 1시간 이상 반응시킨 다음 제거하였다. 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척한 후 레콘스티튜트 스탠다드를 2,500pg/mL에서 16pg/mL로 단계적으로 희석하고, 100㎕씩 첨가하였다.
나머지 다른 웰에 본 발명 균주의 배양액을 100㎕씩 첨가하고 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 세척액으로 3 내지 5회 세척한 후 100㎕의 100㎍/mL의 레콘스티튜트 디텍션 안티바디를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척하고 2,000배 희석한 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 다시 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후 제거하였다. 또 다시 세척액으로 3 내지 5회 세척하고 발색기질용액(50㎕ TMB 용액과 100㎕ 기질용액)을 각 웰에 첨가하고 5 내지 10분간 실온에 반응시켰다. 그리고 50㎕ Stop solution (2M H2SO4)를 각 well에 첨가한 후 마이크로타이터 플레트 리더로 450nm에서 측정하였다.
상기 측정은 도 3의 마우스 IL-1 알파 엘라이자 키트의 스탠다드 커브와 비교하여 인터루킨-1α 생성능을 측정한 결과, 20배 에탄올 농축하였을 때, 156pg/mL을 생산하였다. 이에 반해, 대조구로 사용된 액체 배지에서는 그 활성을 확인할 수 없었다.
이와 같이 락토바실러스 애시도필러스 A12(기탁번호 KCCM 10791P)는 프로바이오틱스로써 정장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거할 수 있는 미생물로써 통상의 방법에 따라 면역 증가 효과를 갖는 사료 첨가제로 사용할 수 있다.
이상 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 프로바이오틱 락토바실러스 애시도필러스 A12(Lactobacillus acidophilus A12, 기탁번호 KCCM 10791P)는 위액 및 담즙산에 대한 내성이 매우 우수하고 인터루킨 1-α 생산능이 뛰어난 효과가 있으므로 프로바이오틱스로써 정장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거할 수 있는 미생물로써 통상의 방법에 따라 면역 증가 효과를 갖는 사료 첨가제로 사용할 있기 때문에 축산산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 닭분변 유래의 하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 A12 균주(Lactobacillus acidophilus A12, 기탁번호 KCCM 10791P).
    (a) 위액 및 담즙산에 대한 내성;
    (b) 인터루킨 1-α 생산;
    (c) β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)를 생산하지 않으며,β-갈락토시다제, α-글루코시다제, β-글루코시다제 및 엔-아세틸-베타-글루코사미다제를 생산;
    (d) 니신(nisin), 젠타미이신(gentamycin) 및 에리트로마이신(erythromycin)에 대한 내성.
  2. 제 1항의 락토바실러스 애시도필러스 A12를 유효성분으로 함을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
KR1020060111142A 2006-11-10 2006-11-10 위액 및 담즙에 내성이 있고 인터루킨 1α 생산하는락토바실러스 애시도필러스 Ａ12 및 그의 용도 KR100822038B1 (ko)

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