KR101799837B1

KR101799837B1 - 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스

Info

Publication number: KR101799837B1
Application number: KR1020160067983A
Authority: KR
Inventors: 박승춘; 장승희; 박지용; 이승진; 박나혜; 김해중
Original assignee: (주)크린바이오; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2017-11-21

Abstract

본 발명은 돼지 장내에서 분리된 신규한 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다. 상세하게는 pH 내성, 내산성, 내답즘성 및 항생제 내성을 갖는 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다. 또한 본 발명의 균주는 살모넬라균에 대한 억제능을 갖는다.

Description

신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 {NOVEL STRAIN OF ENTEROCOCCUS FAECALIS AND PROBIOTICS COMPRISING THE SAME}

본 발명은 돼지 장내에서 분리된 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다. 상세하게는 pH 내성, 내산성, 내답즘성 항살모넬라 활성 및 항생제 내성을 갖는 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 숙주에서 이로운 작용을 나타내는 살아있는 미생물로서 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있으므로 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당한다[Fuller, R.(1989) Probiotics in man and animal. J. Appl . Bacteriol., 66, 365-378, Shahani, K. M. and A. D. Ayebo. 1980. Role of dietary lactobacilli in gastrointestinal microecology. Am. J. Clin . Nutr. 33: 2448-2457]. 이러한 프로바이오틱스의 유용한 효과는 주로 사람과 가축에 대한 실험 보고 내용이 대부분을 차지하고 있고, 개발된 프로바이오틱스들도 사람과 가축에 적용되는 제품들이다[Tournut, J. 1989. Applications of probiotics to animal husbundary. Rev. Sci . Tech. Off. Int . Epiz. 8: 551-566.].

일반적으로 프로바이오틱스에 사용하는 유산균은 그람양성간균, 비운동성, 비포자성, 및 카탈라제(Catalase) 음성인 세균으로서, 자연계에 널리 분포하고 있을 뿐만 아니라 동물의 장이나 발효식품 등에서도 쉽게 발견된다[Ringo, E. and F. J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture. 160: 177-203.]. 이들 유산균이, 항균활성 등에 의해 장내균총을 개선시키는 중요한 미생물이라는 것은 이미 많이 알려져 있으며 이러한 유산균의 항균활성 인자는 유기산과 과산화수소 및 bacteriocin[Piard, J. C. and M. Desmazeaud. 1992. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 2. Bacteriocins and other antibacterial substances. Lait. 72: 113-142]등에 의한다. 또한 유산균은 장내 상피세포에 부착하여 정착함으로써 병원균의 감염과 성장을 억제하게 된다. 유산균의 병원성 세균에 대한 항균활성에 대한 연구는 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 안귀라움(Vibrio anguillarum)등의 미생물에 대한 항균활성이 있다고 보고되어 있다.

또한 프로바이오틱스가 지속적인 항균작용과 유익한 효과를 갖기 위해서는 pH가 낮은 위와 담즙 그리고 여러 가지 소화 효소 등의 환경 조건에서도 생존하여야 한다. 즉, 프로바이오틱스 균주가 갖추어야 할 또 다른 중요한 조건은 내산성 및 내담즙성 그리고 항생제에 대한 적절한 내성을 작고 있어야 한다는 점이다〔Verschuere L., G. Rombaut, P. Sorgeloos, and W. Verstraete. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol . Mole. Biol . Rev. 64: 655-656.].

본 발명은 돼지 장내에서 직접 분리된 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 상기 균주를 질석에 흡착하여 제조된 질석-프로바이오틱스를 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명은 pH 내성, 내산성, 내답즘성 및 항생제 내성을 갖고 살모넬라균 억제활성이 있는 프로바이오틱스를 제공함으로써, 세균성 질병 예방 혹치료 효과를 통해 축산 산업의 효율성을 증대시키고자 한다.

상기한 과제는, pH 내성, 내산성, 내답증성, 항생제 내성을 갖고, 그람양성균이고, 가축용 프로바이오틱스로 사용가능한, 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7(수탁번호:KCCM11681P) 균주에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 균주는 돼지에서 분리된 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 균주는 살모넬라균 억제활성을 갖는다.

또한, 상기한 과제는, 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7(수탁번호:KCCM11681P) 균주 및 팽창질석을 포함하는 가축용 프로바이오틱스에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 프로바이오틱스는 100,000,000 CFU/g 이상의 생균 함량을 갖고, 전체 프로바이오틱스 중량에 대하여 0.5 내지 10 중량%의 팽창질석을 포함한다.

또한, 바람직하게는, 상기 팽창질석은 질석원석을 700~800℃에서 30 내지 60분간 열처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 가축용 프로바이오틱스

본 발명에서 제조된 신규한 엔테로코커스 페칼리스 균주 및 이를 질석에 흡착하여 제조된 질석-프로바이오틱스는 우수한 pH 내성, 내산성, 내답즘성 및 항생제 내성을 갖고 있어 동물의 사료 첨가제 및 치료 약제로 유용하게 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 프로바이오틱스는 살모넬라 억제능을 갖는다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 돼지 장내에서 분리된 신규한 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주에 대한 48시간 배양 중 pH 변화(A), 48시간 배양 중 용존 산소량(B), 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀, C), 48시간 배양 중 세균수(D)를 나타낸 그래프이다. 또한, 본 발명에 따른 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주 단독의 산 내성을 측정한 결과(E)와 본 발명에 따른 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 팽창질석에 흡착시킨 프로바이오틱스의 산 내성을 측정한 결과(F)를 도시한다.
도 3a는 본 발명에 따른 신규한 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주의 주사전자현미경 사진이다.
도 3b는 본 발명에 따른 프로바이오틱스의 일성분인 팽창질석 (Vermiculite)의 주사전자현미경 사진이다.
도 3c는 본 발명에 따른 프로바이오틱스인, 팽창질석에 신균주 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주를 흡착한 샘플의 주사전자현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주의 살모넬라 균(Salmonella typhimurium)에 대한 억제 활성을 측정한 결과를 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 신규한 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주에 대한 Genbank 정보 및 염기서열이다(수탁번호:KCCM11681P).

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. 용어 약이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, 포함하다 및 포함하는 이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 돼지 장내에서 직접 분리된 신규한 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신균주 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7를 질석에 흡착하여 제조된 프로바이오틱스(Probiotics)에 관한 것이다.

본 발명의 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주는 효소활성, 내산성 및 내담즙성 등이 우수한 생리활성을 갖고, 다음의 분리 및 동정과정을 통해 얻어졌다:

돼지는 3원 교잡종 거세돼지(Landrace X Large White X Duroc종)를 사용하였다. 돼지로부터 분리한 균주는 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol purple)을 함유한 Lactobacilli MRS agar (BCP)로 도말하여 37℃에서 24 시간 혐기 배양 한 후, 균체 주변을 노란색으로 변색시키거나 균체가 푸른색으로 변화는 균주 25 여주를 1 차 분리하였다. 분리된 균주를 Lactobacilli MRS 배지에 접종하여 2 차 분리하고 균주 중 섬유소분해력이 높은 균주를 분리하기 위해 Screening 배지를 이용하여 clear zone의 확인을 통한 효소분비 여부를 파악하였다. 이 중 효소활성이 가장 우수한 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 분리하여 본 발명의 신규 균주로 하였다.

신규 균주 PSCT3-7의 형태학적 특성

상기 방법으로 최적 생육배지(MRS agar)에서 배양한 균주를 그람염색을 행한 결과는 그람 양성균이었다. 형태학적 분석을 위해 주사전자현미경 (SEM) 이미지 촬영하여 도 3a에 나타내었다. 도 3a를 보면, 엔테로코커스의 전형적인 형태인 타원형과 그 중간을 양분하는 선이 관찰되었다.

신규 균주 PSCT3-7의 동정

상기에서 분리된 균주의 형태적 특성을 분석한 결과, 본 발명의 균주는 엔테로코커스 균주에 속하는 미생물이며, 분리한 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. Genomic DNA extraction kit (Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 추출한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') set를 사용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 50 pmole primer, 50 ng template DNA, 10Tay DNA polymerase buffer 5㎕, Taq DNA polymerase (Takara, Japan) 1U가 포함된 PCR mixture를 95에서 5분간 변성시킨 후에 95에서 1분, 55~60에서 1분, 72에서 1분간 30 cycle을 반복함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1(Novagen, USA)에 클로닝 한 다음, BigDyeTM-terminator sequencing Kit과 ABI PRISM377 sequencer(Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)와 99% 유사한 것으로 판명되었다. 본 발명이 균주에 대한 염기서열은 Genebank에 신균주로 등록되어 KT276328 번호를 부여받았다(도 5 참조).

본 발명은 상기 신규한 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 팽창질석에 흡착시켜서 제조된 질석-프로바이오틱스를 제공한다.

도 3b는 본 발명에 따른 프로바이오틱스의 일성분인 팽창질석(Vermiculite)의 주사전자현미경 사진이다. 도 3b를 보면, 팽창질석은 다공성이고 라멜라구조를 갖는 실리케이트 클레이인 것을 알 수 있다. 도 3c는 본 발명에 따른 프로바이오틱스인, 팽창질석에 신균주 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7 균주를 흡착한 샘플의 주사전자현미경 사진이다. 본 발명은 신규한 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 캡슐화하거나, 담체 배지(carrier medieum)인 팽창질석에 흡착시켜서 균주의 안정성 및 보존기간(longevity)를 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 사용된 팽창질석은 질석 원석은 전자로에 열처리하여 팽화시킨 것이다. 상기 열처리는 700~800℃의 온도에서 30분 내지 60분간 처리하는 것이 바람직하다. 팽화 온도가 800℃를 초과하면 질석이 소화되어 다공성이 없어지고, 700℃ 미만에서는 가열시간이 증가하여도 충분한 팽화가 일어나지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

제조예 1: 팽창질석의 제조

충남 홍성에 위치한 ㈜GFC로부터 질석원석(골드)을 공급받아 실험에 사용하였다. 질석의 전처리를 위하여 전자로(Wisetherm™ Muffle Furnaces, Korea)를 활용하였다. 전처리를 위한 가열 조건은 500℃, 600℃, 700℃, 800℃, 900℃, 1000℃로 설정하였고, 가열 시간은 15분, 30분, 45분, 60분으로 설정한 후 총 24가지 방법으로 질석을 전처리하였다. 그 결과 새로운 사실을 발견하였다. 질석 팽화온도는 700℃ 내지 800℃ 사이에서 최고의 다공성을 보였다. 팽화 온도가 800℃를 초과하면 질석이 소화되어 다공성이 없어지므로, 팽창질석은 700~800℃ 사이에서 제조하였다. 또한, 가열시간은 30분 내지 60분인 것이 바람직하다.

가열 온도 및 가열 시간에 따른 질석의 팽화 정도를 아래 표 1에 나타내었다. 아래 표 1은 질석 전처리 조건별로 제조된 팽창 질석의 SEM 사진(x 1,000)이다.

제조예 2: 본 발명의 균주 팽창질석 프로바이오틱스 제조

본 발명의 균주를 5L 발효조에 넣고 37℃에서 24시간 배양하여 균체를 얻고, 이를 다시 50L 발효조에서 24시간 배양하여 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 준비하였다. 24 시간동안 PSCT3-7 균주를 배양 후에 제조예 1의 팽창질석(700℃에서 45분 팽화시킴) 1%을 첨가하고 24시간 추가배양 한다. 제조예 1에서 얻은 팽창질석 1%와 상기 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 혼합하여 24 시간 배양 후에 건조과정을 거친 후에 PSCT3-7 흡착 팽창질석 프로바이오틱스를 제조하였다. 제조된 프로바이오틱스의 주사전자현미경 사진을 도 3c에 나타내었다. 도 3c를 보면, 팽창질석의 표면 및 기공 내부에 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 T3-7 균주가 잘 흡착되어 있는 것을 확인할 수 있다.

실시예 1

상기에서 분리된 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주를 Lactobacilli MRS 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 도 2에 배양 중 pH 변화(A), 용존 산소량(B), 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀, C), 세균수(D)를 측정하여 나타내었다.

또한, 엔테로코커스 페칼리스 T3-7 균주 단독의 산 내성을 측정하여 도 2의 (E)에 나타내고, 제조예 2의 프로바이오틱스의 산 내성을 측정한 결과를 도 2의 (F)에 도시하였다.

도 2에서, pH 변화를 보면, 48시간 배양하는 동안 pH가 서서히 감소하였다(A). 용존 산소량은 초기 12시간 동안 17 mg/l에서 5.3 mg/l까지 급격히 저하되었으나, 이후 증가하여 48시간에 18 mg/l까지 도달하였다(B). OD₆₀₀은 초기에 급격히 증가하여 12시간에 최고점에 도달하고, 48시간까지 안정하게 높은 상태를 유지하였다(C). OD₆₀₀ 변화와 유사하게, 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 T3-7 균주는 초기에는 폭발적인 성장을 나타내고 이후 정지상을 나타냈다(D).

엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주 단독의 산 내성에 대하여 pH를 2 내지 8로 조절하여 측정하였고, 담즙산에 대한 내성은 배지에 담즙염 0.3%( Sigma, St. Louis, MO, USA)를 추가하여 측정하였다. 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주는 pH 3에 대해 내성을 갖고 있고 pH 3 내지 8에서 2시간 동안 잘 성장하였다. 장 기생 함량 또는 사료 매트릭스는 프로바이오틱스 박테리아가 담즙산에 노출되는 것을 막을 수 있고 이로 인해 위장관에서 유기체의 생존 및 작용을 증가시킨다.

실시예 2

본 발명에서 소화효소를 생성하는 균주를 선별하기 위하여 건강한 돼지의 분변과 사료를 제한한 분변을 1차 선별 소재로 사용하여 23개의 소화효소 분비 균주를 찾았다. 실험은 다음과 같이 실시하였다. 프로테아제(Protease) 활성을 알기 위해서 MRS 아가(agar)에 0.5% skim milk을 첨가하였고, 셀룰라아제(Cellulase) 활성을 알기 위해서는 MRS 아가에 0.2% 메틸 셀룰로즈(Methyl cellulose)를 첨가하였고, α-아밀라아제(α-amylase) 활성을 알기 위해서 MRS 아가에 0.2% 옥수수 전분(corn starch)를 넣었으며, 피타아제(Phytase) 활성을 알기 위해 0.5% Ca-phytate을 첨가하였다.

각각 첨가된 배지에 대해서 유산균을 배지에 접종(streaking)한 후 24시간 배양 한 후 관찰하였다.

α-아밀라아제와 셀룰라아제 활성은 24시간 배양 한 배지에 2% 콩고 레드(congo red) 시약을 처리한 후 1M NaCl을 이용하여 세척한 후 색깔 여부에 의해 분해효소여부를 관찰하였다.

결과 판정은 투명환의 여부에 의해 효소분해 능을 확인하였다. 이는 다음 표 1에 요약하였다. 이중에서 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주가 탄수화물, 단백질, 인을 분해할 수 있는 효소를 생성하는 최종균주로 선정하였다. 아래 표 2에 1차 분변에서 선별한 후보 유산 균주의 효소활성을 나타내었다.

균주 No.	37℃에서의 효소 활성
균주 No.	Skim milk (프로테아제)	메틸 셀룰로오스 (셀룰라아제)	옥수수 전분 (α-아밀라아제)	Ca-phytate (피타아제)	CMC
I 1	-	-	-	-	-
I 3	-	-	-	-	-
I 4	-	-	-	-	-
I 5	-	-	-	-	-
I 6	-	-	-	-	-
F 6	-	-	-	-	-
I 7	-	-	-	-	-
F 8	-	-	-	-	-
T3-1	-	-	-	+	-
T3-5	+	-	-	+	+
T4-2-2	-	-	+	+	+
T3-6-1	-	-	+	+	+
T3-3	+	-	+	+	+
T4-2-1	-	-	-	-	-
T4-2-4	-	-	-	+	-
T3-6-2	+	-	+	+	-
T3-2	-	-	+	+	+
T4-2-6	-	-	-	+	-
T4-1-2	++	-	-	+	-
T3-7	++	-	+	+	+
T4-2-3	-	-	-	+	-
T3-4	-	-	+	+	+
T4-2-3	-	-	-	+	+

+, 양성; -, 음성

실시예 3

내산성 프로바이오틱스 균주를 위해 5ml의 MRS 브로스(broth)에 1N HCl와 NaOH를 첨가하여 pH 2,3,5,7,8로 조절한 후, 본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주(10⁷의 접종 세균수(FU/ml))를 접종하고 0시, 0.5시, 1시, 2시 간격으로 성장을 확인하였다. 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주가 생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3 이하의 조건인 위를 통과하여야 한다. 1N HCl로 pH 2, 3, 5, 7, 8로 각각 조정한 MRS 액체배지에 PSCT3-7균주를 접종한 후에 37℃에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰하였다. pH 3, 5, 7, 8에서는 2시간의 배양시간까지 두 실험군 모두 생존하였다. 또한 pH 3에서는 균이 증식 되지 않았지만 유지되는 것을 볼 수 있다. 강산성인 pH 2에서는 PSCT3-7은 30분 이내에 사멸하였지만, 질석을 넣은 실험군에선 30분까지 균의 생존을 확인하였다. 이것은 사료의 섭취량이나 종류에 따라 차이가 있겠지만 위를 통과하는데 2~3시간이 소요되며 위산의 pH가 2~3으로 희석되는 점을 고려할 때 내산성을 가진 PSCT3-7이 실제로 위를 통과한 이후의 생존률은 본 실험 보다 더 높을 가능성이 있으며, 한편 팽창질석에 흡착된 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7은 팽창질석에 흡착된 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7은 산에 대한 저항성을 높여주는 것으로 사료된다. 내산성 측정 결과를 아래 표 3에 나타내었다.

실시예 4

생균제의 조건으로서의 가장 중요한 요인은 담즙성에 대한 내성이다. 이를 위해 담즙산염 0%, 0.1%, 0.3%, 1%를 MRS 액체배지 10ml에 넣고 각각의 유산균 10⁶CFU/ml으로 희석된 균주를 넣고 0시, 1시, 3시, 6시 간격으로 균수 측정하여 성장을 확인하였다.

37℃에서 매시간 균수를 측정한 결과를 다음 표 4에 요약하였다. 그 결과 담즙염 0.1%, 0.3%, 1%의 농도에서 PSCT3-7 단일군은 거의 대부분 사멸하였지만 PSCT3-7 흡착 팽창질석을 첨가한 실험군은 6 시간까지 10⁴CFU/ml가 생존하였다. 이를 통해 PSCT3-7 흡착 팽창질석은 미생물에게 담즙에 대한 저항성도 높여주는 것으로 판단된다.

*BA: 담즙산(Bile Acid)

실시예 5

생균제로 사용하기 위해서는 동물에 사용하는 항생제에 저항을 보여야 한다. 항생제의 저항을 조사하기 위하여 하룻밤 배양한 PSCT3-7을 10¹⁴ CFU/ml로 조절한 후, 100㎕를 96well plate에 넣고, 미리 희석된 시험하고자 하는 항생제를 100㎕ 첨가한 다음, 37 인큐베이터에 넣고 24시간 후에 균의 생육을 조사하여 최소발육 억제농도를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 5에 나타내었으며, 대부분의 항생제에 대하여 저항을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 이미 기존의 유산균들과 항생제의 저항성을 비교한 결과 동등하거나 보다 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 신균주를 항생제가 포함된 사료에 사용해도 프로바이오틱스로서의 효과를 가질 수 있다는 중요한 사실을 말해준다.

실시예 6

본 발명의 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주의 살모넬라균(Salmonella enterica serotype Typhimurium (Salmonella Typhimurium, KCTC 2515)에 대한 억제 활성을 확인하였다. 살모넬라균의 초기 접종 밀도는 10³ 또는 10⁶CFU/ml 이었다. 이를 위해 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주(10⁰CFU/ml, 10³CFU/ml, 10⁶CFU/ml 또는 10⁹CFU/ml)와 살모넬라균을 37℃에서 공배양(co-culture)을 실시하여 PSCT3-7과 살모넬라 균수를 측정하여 PSCT3-7에 대한 효력을 비교하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 보면, 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주는 6시간까지 농도 의존적으로 살모넬라균의 성장을 억제하였다(A 및 B). 배양 12시간 후에 살모넬라균을 단독 접종한 경우에는 살모넬라균 수가 10¹⁰CFU/ml이상 도달하였으나, 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주와 공배양한 경우에는 살모넬라균 수가 10⁹CFU/ml이었고, 이것은 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주가 살모넬라균의 성장을 억제한다는 것을 보여준다. 살모넬라균의 성장을 50%까지 억제하는데 요구되는 엔테로코커스 페칼리스 PSCT3-7 균주의 최소 수준(IC₅₀)은, 살모넬라균 10³ 및 10⁶ CFU/ml 접종에 대하여 각각 1.39 x 10⁸ 및 2.39 x 10⁸ CFU/ml으로 측정되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11681P

20150402

Claims

돼지에서 분리되고,
pH 3에서 2시간 동안 생존할 수 있는 내산성을 갖고, 내담즙성을 갖고, 스트렙토마이신(Streptomycin), 티로신(Tylosin), 스펙티노마이신(Spectinomycin) 및 콜리스틴(Colistin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖고, 그람양성균이고, 살모넬라 티피뮤리움에 대한 억제 활성을 갖고, 가축용 프로바이오틱스로 사용가능한, 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7(수탁번호:KCCM11681P) 균주.
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돼지에서 분리되고,
pH 3에서 2시간 동안 생존할 수 있는 내산성을 갖고, 내담즙성을 갖고, 스트렙토마이신(Streptomycin), 티로신(Tylosin), 스펙티노마이신(Spectinomycin) 및 콜리스틴(Colistin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖고, 그람양성균이고, 살모넬라 티피뮤리움에 대한 억제 활성을 갖고, 가축용 프로바이오틱스로 사용가능한, 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) PSCT3-7(수탁번호:KCCM11681P) 균주 및 팽창질석을 포함하고,
상기 팽창질석은 질석원석을 700~800℃에서 30 내지 60분간 열처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 가축용 프로바이오틱스.
제4항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 100,000,000 CFU/g 이상의 생균 함량을 갖고, 전체 프로바이오틱스 중량에 대하여 0.5 내지 10 중량%의 팽창질석을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축용 프로바이오틱스.
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