KR20190103061A

KR20190103061A - 열안정성이 우수한 락토바실러스 루테리 lr4 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20190103061A
Application number: KR1020190023481A
Authority: KR
Inventors: 유승일; 이재구; 박병철; 윤철희
Original assignee: 주식회사 씨티씨바이오
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2019-09-04

Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 균주 및 이를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다. 상기 균주는 열안정성이 우수하다.

Description

열안정성이 우수한 락토바실러스 루테리 LR4 및 이를 포함하는 조성물{Lactobacillus reuteri LR4 having excellent thermal stability, and composition comprising the same}

본 발명은 락토바실러스 루테리 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 락토바실러스 루테리의 신균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱스 유산균 중에서 영유아에게 가장 뛰어난 효과를 발휘하는 것으로 잘 알려진 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 내생균 유산균으로 위와 장에 정착성이 높으며, 유해균증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 생균으로서 다른 유산균이 위산에 쉽게 파괴되는 반면, 위산에 거의 영향을 받지 않고, 내산성 및 내담즙성이 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 락토바실러스 루테리도 일반적인 다른 유용 미생물의 경우와 마찬가지로 50~80℃사이에서 1% 정도의 생존율을 보이고 있다.

가축 사료를 제조하는 과정에서, 사료를 펠렛팅하는 열처리 공정이 포함되는데, 이러한 열처리 공정에 의해 유용 미생물의 생존율이 급감하여 실제 가축이 섭취하는 생균의 함량은 제조 시점보다 급격히 감소될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 사료첨가제로 사용할 수 있고, 열 안정성이 높은 유용 미생물을 찬기 위해 노력한 결과, 신규한 락토바실러스 루테리 균주를 분리하고, 상기 균주의 열 안정성을 확인하여, 우수한 생균제로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 열안정성이 우수한 락토바실러스 루테리 신균주를 제공하고자 한다.

본 발명은 열안정성이 우수한 락토바실러스 루테리 신균주의 새로운 용도를 제공하고자 한다.

본 발명은 열안정성이 우수한 락토바실러스 루테리 신균주 또는 이의 배양물을 포함하는 생균제 또는 사료 첨가제를 제공하고자 한다.

본 발명은 기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4를 제공한다.

상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4의 상기 16S rRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함한다.

상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4는 열안정성이 우수하며, 바람직하게 70℃에서 3분간 열처리 하였을 때 60% 이상의 생존율을 가질 수 있다.

바람직하게 상기 균주는 60℃-80℃의 온도 조건에서 1 내지 10분간 처리하였을 때, 99% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 또는 80% 이상의 생존율을 가질 수 있다. 이러한 효과는 일반적으로 유용 미생물이 고온에서 안정적으로 생존할 수 없는 것과 비교할 때, 매우 높은 생존율이라고 할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4는 고온에서 처리하더라도 생존율이 높다는 특징이 있고, 상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물은 생균제로 사용되거나, 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "배양물"은 락토바실러스 루테리 LR4가 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상청액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심 분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.

일 실시예에 따르면 본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 균주의 배양물은 미생물 배양에 사용되는 배지 중에서 통상의 기술자가 목적에 따라 용이하게 선택한 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 배양에 사용되는 통상적인 배지를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 균주의 배양물은 상기 미생물 배양 배지에 본 발명의 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양 방법(예를 들어, 정치배양 등)에 따라 제조할 수 있다. 상기 LR4 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물은 당업계에 공지된 미생물 또는 배양액의 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 균주는 독립적으로 또는 가축이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있으며, 다른 유용한 프로바이오틱 미생물 및 프리바이오틱과 함께 첨가하여 사용될 수 있다. 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물에는 안정제 및 부형제, 캡슐화제 등이 포함될 수 있으며 동결건조 과정을 거쳐 얻어지는 조성물, 예를 들어 동결건조 분말, 펠렛 등의 형태로 제공될 수 있다.

상기 조성물은 말토덱스트린, 트레할로스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 이 경우 동결건조 과정에서 미생물의 사멸 정도를 감소시킬 수 있고 높은 수율을 기대할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 락토바실러스 루테리 LR4를 다가 알코올을 포함하는 배지에서 배양시켜 사용할 수 있다. 이 경우 미생물의 수율을 더욱 증대시킬 수 있다. 바람직하게 상기 다가 알코올은 솔비톨, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 프로판디올, 에칠헥산디올, 1,2-헥산디올, 피이지/피피지/폴리부틸렌글리콜-8/5/3글리세린(PEG/PPG/POLYBUTYLENE GLYCOL-8/5/3 GLYCERIN) 및 펜틸렌글리콜을 포함하는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 글리세린, 프로필렌글리콜, 에칠헥산디올, 프로판디올, 1,3-부틸렌글리콜, 솔비톨 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 솔비톨 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게 조성물 총 중량 대비 상기 말토덱스트린은 5 내지 15 중량%, 상기 트레할로스는 5 내지 15 중량%, 상기 카르복시메틸 셀룰로오스는 0.5 내지 5 중량% 포함될 수 있으며, 더 바람직하게 말토덱스트린은 7 내지 12 중량%, 트레할로스는 7 내지 12 중량%, 카르복시메틸 셀룰로오스는 1 내지 3 중량% 포함될 수 있다. 상기 함량 범위에서 가장 우수한 미생물 수율을 기대할 수 있다. 통상적으로 사료 첨가제에 포함될 수 있는 다른 성분들도 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 갈락토만난, 수용성 전분, 글루코오스, 락토스, 덱스트란, 소듐클로라이드, 효모 추출물, 펩톤 등을 포함할 수 있으며, 이러한 첨가제는 조성물 총 중량대비 0.1 내지 50 중량% 포함될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 수율이라 함은, 최초 준비된 미생물 생존율 대비 마지막 동결건조 또는 열처리 후 생존한 미생물의 생존율을 비교하는 것으로, 마지막 동결건조 또는 열처리 후 생존한 미생물의 생존율이 높을수록 수율이 높거나 우수하다고 말할 수 있다.

이러한 사료용 생균제는 사료에 첨가되어 가축에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 가축에게서 소화기계 관련 질환에 대한 감염 억제와 유해 미생물의 생장을 억제함으로써 대장균 및 살모넬라와 같은 세균에 의한 장염, 설사 등과 같은 소화기계 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 생균제란 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 균의 정착 및 증식을 예방하고, 치료할 수 있는 것을 말한다.

특히 본 발명의 균주는 사료를 펠렛화하거나 동결건조 분말로 제조하는 과정에서 고온이 처리될 때에도 생존율이 높다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 항균성이 우수하다. 항균성이란 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 말한다. 바람직하게 Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli F41, Escherichia coli K88, Escherichia coli K99, Escherichia coli F18, Pasteurella multosida, Streptococcus suis, Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, 및 Edwardsiella tarda 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 미생물에 대해 우수한 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 우수한 내산성 및 내담즙성을 가질 수 있으며, 따라서 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

본 발명의 균주는 열안정성이 우수하다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 우수한 내담즙성 및 내산성을 가질 수 있고, 가축 사료 첨가제 또는 생균제로 이용될 수 있다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 우수한 항균성을 갖는다.

도 1은 본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 내산성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 내담즙성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 열안정성을 나타낸 그래프이다. 70℃의 고온에서 다른 Lactobacillus reuteri 균주인 LRT 보다 생존율이 더 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 균주인 LR4와 다른 Lactobacillus reuteri 균주인 LRT의 열안정성을 80℃에서 비교한 그래프이다. 80℃의 고온에서 다른 Lactobacillus reuteri 균주인 LRT 보다 생존율이 더 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 지시균 15종에 대한 Lactobacillus reuteri LR4의 항균활성을 나타낸 사진이다. 생육환 억제 효과가 뚜렷이 나타났다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.

실시예 1. 유산균의 탐색 및 순수분리

유아 분변 1 g에 인산염완충액 (pH 7.2) 9 mL을 넣고 37℃에서 2시간 진탕배양하였다. MRS 배지 30 mL에 상기 진탕액 0.3 mL을 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 BCP 고체배지에 배양액을 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. Colony 주위에 노란색을 나타내는 균주를 선발하여 분리하고 분리된 균주의 균락을 BCP 고체배지에 streaking 방법으로 3회 계대배양하여 순수 분리하였다.

실시예 2. 분리 균주의 동정

실시예 1에서 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였다. 균주의 16S rRNA 유전자 서열분석을 위해 분리 균주로부터 genomic DNA를 추출한 다음 PCR을 통하여 16S rRNA에 대한 DNA 단편을 증폭하였다. PCR을 위한 primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. 증폭된 단편의 염기서열을 분석한 후, 결정된 염기서열은 NCBI의 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 BLAST 프로그램을 이용하여 상동성 검사를 실시하였다. 그리고 분리된 균주의 당이용성을 확인하기 위하여 API 50 CHL kit을 사용하여 확인하였다.

실시예 3. 분리 균주의 내산성 확인

본 발명의 균주(LR4)를 MRS 배지 30 mL에 접종하고 37℃에서 16시간 배양한 후 원심분리(5,000 rpm, 10분, 4℃)하여 펠렛을 인산염완충액 (pH 7.2)으로 2번 세척하였다. 세척된 펠렛 부유액 2 mL에 인산염완충액 18 mL을 넣어 균수가 8.7 Х log CFU/mL인 샘플을 준비하였다. 5N 염산을 이용하여 샘플의 pH를 각각 3.0과 2.5로 조절하고 37℃에서 배양하면서 일정 시간마다 샘플을 채취하여 10배 단계 희석법 (10 fold serial dilution)으로 희석한 후 MRS 고체배지에 도말하여 생균수를 측정하였다.

실시예 4. 분리 균주의 내담즙성 확인

본 발명의 균주 (LR4)를 MRS 배지 30 mL에 접종하고 37℃에서 16시간 배양한 후 배양액을10배 단계 희석법 (10 fold serial dilution)으로 희석하고 Oxgall의 최종농도가 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0% 되도록 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다.

실시예 5. 분리 균주의 열안정성 확인

유산균의 준비

본 발명의 균주 (LR4)를 MRS 배지 30 mL에 접종하고 37℃에서 16시간 배양한 후 원심분리(5000 rpm, 10분)하여 펠렛을 인산염완충액 (pH 7.2)으로 2번 세척하였다. 세척된 펠렛에 인산염완충액 (pH 7.2) 10 mL을 넣어 부유액을 준비하였다.

열안정성 조사

15 mL tube에 인산염완충액 (pH 7.2) 9 mL을 넣고 70℃ 또는 80℃로 셋팅된 heat block에서 10분간 pre-incubation 시켜준 후 준비된 유산균 부유액 1 mL을 넣어 heat block에서 incubation시켰다. 일정 시간마다 샘플을 채취하여 10배 단계 희석법 (10 fold serial dilution)으로 희석하고 MRS 고체배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였다.

실시예 6. 분리 균주의 항균활성 확인

유산균의 준비

지시균의 준비

지시균은 다음과 같이 15종을 준비하였다. Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli F41, Escherichia coli K88, Escherichia coli K99, Escherichia coli F18, Pasteurella multosida, Streptococcus suis, Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda 상기 유해 미생물들은 각각에 맞는 성장액체배지를 사용하여 37℃에서 15시간 배양하여 준비하였다.

항균활성 조사

MRS 고체배지에 준비된 Lactobacillus reuteri LR4 부유액 5 uL를 점적한 후 37℃에서 혐기 조건으로 18시간 배양하였다. 0.8% Top-agar 배지 (각각의 병원균에 맞는 배지) 4 mL에 준비된 유해 미생물 배양액을 100 uL씩 넣고 유산균이 배양된 MRS 고체배지에 부어서 잘 흔들어 준 후 상온에서 정치시켜 주었다. Top-agar 배지가 굳고 난 후 각각의 병원균에 맞는 성장온도에서 15시간 배양한 이후 형성된 투명환의 크기를 측정하였다.

실시예 7. Lactobacillus reuteri LR4을 포함하는 동결건조 분말 제조

Lactobacillus reuteri LR4 배양

본 발명의 균주 (LR4)를 MRS 배지 40 mL에 접종하여 37℃에서 혐기조건으로 16시간 배양하여 seed를 준비하였다. 5 L jar에 Glucose 40 g/L, Yeast extract 15 g/L, Soy peptone 10 g/L, Dipotassium phosphate 2 g/L, Sodium citrate 2 g/L, Sodium acetate 5 g/L, Magnesium sulfate 0.1 g/L, Manganese sulfate 0.05 g/L, Tween 80 1 g/L 조성으로 이루어진 액체배지 4 L를 넣고 121℃에서 15분간 멸균시킨 다음, 준비된 seed 유산균을 접종하고 37℃, 100 rpm 조건에서 배양을 진행하였고 배양 14시간째 100 mM Glycerol을 첨가한 후 4시간 더 배양하였다.

Lactobacillus reuteri LR4 동결건조

Lactobacillus reuteri LR4 배양액을 원심분리 (8,000 rpm, 10분, 4℃)하여 유산균을 회수하고 유산균 무게 대비 10% Maltodextrin, 10% Trehalose, 2% CMC로 조성된 동결건조보호용액 200 mL에 유산균을 분산시켰다. 유산균과 동결건조보호용액을 잘 섞어 준 후 -80℃에서 동결시킨 후 -80℃ 조건에서 동결건조를 진행하였다.

결과

동정 결과

분리된 균주 LR4를 동정하기 위하여 16S rRNA gene으로부터 1427bp의 염기서열(서열번호 1의 염기서열)을 분석하고 결정하여 NCBI의 Genbank database와 비교한 결과 분리 균주인 LR4은 Lactobacillus reuteri DSM 20016와 99.7%의 상동성을 나타내었다. 또한 분리 균주 LR4의 당이용성 결과는 표 1과 같았다.

이상의 결과로부터 본 발명에서 분리한 균주는 Lactobacillus reuteri로 동정됨에 따라 Lactobacillus reuteri LR4로 명명하였으며, 장기간 안정적으로 보관하기 위하여 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 배양한 후 50% glycerol에 현탁하여 -80℃에 보관하였다.

내산성 및 내담즙성 확인

생균제를 가축에게 경구급여 할 경우, 위산에 의한 낮은 pH에 견딜 수 있어야 하며, 소화기관에서 분비되는 담즙에도 견딜 수 있어야 한다. 따라서 본 발명에서는 선별된 균주의 내산성 및 내담즙성을 조사하였다.

본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 내산성을 확인한 결과, 도 1에서와 같이 pH 3.0, pH 2.5에서 총 3시간 동안 각각 0, 1, 2, 3시간 배양시 균주의 생존율이 모두 90% 이상으로 나타나 내산성이 우수한 것으로 확인되었다. 또한 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1.0% Oxgall이 첨가된 조건에서도 99%의 생균수를 유지하는 것으로 확인되어 우수한 내담즙성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

가축사료용 생균제로 개발되는 균주들은 내산성 및 내담즙성이 반드시 요구되는데, 이는 강산성 조건(pH 3.0 이하)의 위장을 통과하여, 소장으로 이동 후 생존해야 하기 때문이다. 내산성을 보인 본 발명의 균주는 십이지장에서 분비되는 비교적 산성이 강한 담즙에 대해서도 내담즙성을 나타내는 특성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 사용된 균주는 가축의 장내 조건에서 충분히 증식할 수 있고, 우수한 생균제로 사용될 수 있는 특성을 지니고 있는 것이다.

열안정성 확인

사료를 펠렛팅 할 때 열처리 공정이 포함되어 있기 때문에 생균제를 펠렛 사료에 적용하기 위해서는 열안정성이 어느 정도 확보되어야 한다. 따라서 본 발명자들은 선별된 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 열안정성을 조사하였다. 본 발명의 균주인 LR4는 Lactobacillus reuteri LRT 균주와 70℃ 및 80℃에서 열안정성을 비교하였을 때, 우수한 생존율을 나타낸 것으로 보아 다른 Lactobacillus reuteri 균주보다 고온에서 안정성을 갖는다는 것을 알 수 있었다(도 3 및 4 참조).

항균능력 확인

본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4의 항균능력을 평가하기 위해서 Agar spot test 방법에 따라 Lactobacillus reuteri LR4를 MRS 고체배지에 배양한 후 다양한 지시균주 (Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli F41, Escherichia coli K88, Escherichia coli K99, Escherichia coli F18, Pasteurella multosida, Streptococcus suis, Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda)를 Top agar로 이용하여 억제환의 크기를 관찰함으로써 항균능력을 평가하였다. 그 결과, Lactobacillus reuteri LR4는 다양한 병원균에 대하여 고르게 항균능력을 가지는 것으로 확인되었다 (표2 및 도5 참조).

No.	병원성 균주	Cell	Inhibition size (mm)
1	Salmonella typhimurium	+++	16
2	Salmonella gallinarum	+++	18
3	Salmonella dublin	+++	16
4	Salmonella choleraesuis	+	5
5	Salmonella enteritidis	+++	16
6	Staphyloccoccus aureus	++	15
7	Escherichia coli F41	++	15
8	Escherichia coli K88	++	15
9	Escherichia coli K99	++	13
10	Escherichia coli F18	++	13
11	Pasteurella multosida	+++	16
12	Streptococcus suis	+	6
13	Streptococcus parauberis	+	7
14	Streptococcus iniae	+++	18
15	Edwardsiella tarda	+++	16
Inhibition size= radius of clearing zone (A) - radius of colony (B)
-: Not detected
+: Inhibition size ≤ 10 mm
++: 10 mm < Inhibition size ≤ 15 mm
+++: Inhibition size > 15 mm

동결건조 분말 제조 결과

본 발명의 균주인 Lactobacillus reuteri LR4를 사료첨가제로 사용하기 위하여 동결건조 분말을 제조하였다. 동결건조 전·후의 수율을 확인하기 위하여 4가지 조성의 동결건조 보호용액을 사용하였으며, 그 결과 표 3에서와 같이 10% Maltodextrin, 10% Trehalose, 2% CMC를 사용하였을 때 수율이 36.7% 가장 높게 나타났다. 그러나 이는 다른 Lactobacillus 속 균주들에 비하여 동결건조 수율이 낮은 편에 속하므로 Lactobacillus reuteri LR4 배양시, 중간에 glycerol을 첨가하는 방법으로 동결건조 수율을 개선하였다. 표 4에서 보는 바와 같이 배양중에 glycerol을 첨가하였을 때 동결건조 전·후 수율이 73%로 개선된 것을 확인할 수 있었다.

Lactobacillus reuteri LR4의 동결건조보호제 조성에 따른 동결건조 전·후 수율은 하기 표 3과 같다.

No.	동결건조 보호제	수율 (%)
1	10% skim milk	2.0
2	10% skim milk, 10% MD	23.0
3	10% MD, 10% Trehalose	25.3
4	10% MD, 10% Trehalose, 2% CMC	36.7

(MD: Maltodextrin, CMC: carboxymethyl cellulose)

Lctobacillus reuteri LR4 배양시 glycerol 첨가에 따른 동결건조 전·후 수율

No.	Glycerol 첨가 유·무	동결건조 보호제	수율 (%)
1	Glycerol 무첨가	10% MD, 10% Trehalose, 2% CMC	36.7
2	Glycerol 첨가	10% MD, 10% Trehalose, 2% CMC	73.0

상기 결과로부터 사료 첨가용 조성물은 말토덱스트린, 트레할로스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하며, 글리세롤 첨가 배지에서 배양된 LR4를 포함하는 경우, 열에 더 안정하고, 수율을 높일 수 있음을 확인하였다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC18669P

수탁일자 : 20180223

<110> CTC BIO, INC. <120> Lactobacillus reuteri LR4 having excellent thermal stability, and composition comprising the same <130> P18-071 <150> KR 10-2018-0024031 <151> 2018-02-08 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1427 <212> RNA <213> Lactobacillus reuteri <400> 1 taaaggttag gccaccgact ttgggcgtta caaactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt 60 acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccgac 120 ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa cggctttaag agattagctt 180 actctcgcga gcttgcgact cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 240 taaggggcat gatgatctga cgtcgtcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc 300 actagagtgc ccaacttaat gctggcaact agtaacaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360 taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acgaccatgc accacctgtc attgcgtccc 420 cgaagggaac gccttatctc taaggttagc gcaagatgtc aagacctggt aaggttcttc 480 gcgtagcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 540 gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctccggcac 600 tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ctcatcgttt acggcatgga ctaccagggt 660 atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agcctcagcg tcagttgcag accagacagc 720 cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca catggagttc 780 cactgtcctc ttctgcactc aagtcgcccg gtttccgatg cacttcttcg gttaagccga 840 aggctttcac atcagaccta agcaaccgcc tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga 900 taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tgactttctg 960 gttggatacc gtcactgcgt gaacagttac tctcacgcac gttcttctcc aacaacagag 1020 ctttacgagc cgaaaccctt cttcactcac gcggtgttgc tccatcaggc ttgcgcccat 1080 tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtatgg accgtgtctc agttccattg 1140 tggccgatca gtctctcaac tcggctatgc atcatcgcct tggtaagccg ttaccttacc 1200 aactagctaa tgcaccgcag gtccatccca gagtgatagc caaagccatc tttcaaacaa 1260 aagccatgtg gcttttgttg ttatgcggta ttagcatctg tttccaaatg ttatcccccg 1320 ctccggggca ggttacctac gtgttactca cccgtccgcc actcactggt gatccaacgt 1380 caatcaggtg caagcaccat caatcagttg ggccagtgcg tacgact 1427

Claims

기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4.
제1항에 있어서, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4의 상기 16S rRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리 LR4.
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4는 열안정성이 우수한, 락토바실러스 루테리 LR4.
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리 LR4는 70℃에서 3분간 열처리 하였을 때 60% 이상의 생존율을 갖는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 루테리 LR4.
기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 또는 이의 배양물을 포함하는 생균제 조성물.
기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LR4 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 첨가용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 말토덱스트린, 트레할로스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하며,
상기 기탁번호 KCTC18669P을 갖는 락토바실러스 루테리 LR4는 다가 알코올 첨가 배지에서 배양된 것을 특징으로 하는, 사료 첨가용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 사료 첨가용 조성물은 조성물 총 중량 대비 상기 말토덱스트린은 5 내지 15 중량%, 상기 트레할로스는 5 내지 15 중량%, 상기 카르복시메틸 셀룰로오스는 0.5 내지 5 중량% 포함되는, 사료 첨가용 조성물.