KR101591879B1 - 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제 - Google Patents

가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제 Download PDF

Info

Publication number
KR101591879B1
KR101591879B1 KR1020140004616A KR20140004616A KR101591879B1 KR 101591879 B1 KR101591879 B1 KR 101591879B1 KR 1020140004616 A KR1020140004616 A KR 1020140004616A KR 20140004616 A KR20140004616 A KR 20140004616A KR 101591879 B1 KR101591879 B1 KR 101591879B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
enterococcus faecium
livestock
feed additive
prebiotics
Prior art date
Application number
KR1020140004616A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150084516A (ko
Inventor
박찬수
김용호
김지희
강대경
채종표
Original Assignee
주식회사 이지바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 이지바이오 filed Critical 주식회사 이지바이오
Priority to KR1020140004616A priority Critical patent/KR101591879B1/ko
Publication of KR20150084516A publication Critical patent/KR20150084516A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101591879B1 publication Critical patent/KR101591879B1/ko

Links

Images

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Birds (AREA)

Abstract

본 발명은 엔테로코커스 페시움과 락툴로오스를 함유하는 신바이오틱스 가축사료 첨가제를 가축에게 급여함으로써, 가축의 장내 균총을 조절하여 일당 증체량이 증진되어 성장을 개선시키는 가축용 사료 첨가제에 관한 것이다.

Description

가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제{Synbiotic feed additive affecting gut microbiota and growth performance of livestock}
본 발명은 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 제조된 가축 사료 첨가제, 락툴로오스와 상기 엔테로코커스 페시움 균주의 혼합물을 시험관 내에서 돼지의 인공소화액에 처리하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 페시움 단독 처리에 비해 엔테로코커스 페시움 균주의 생장을 증가시키는 방법, 상기 가축 사료 첨가제를 돼지에게 투여하여 돼지 분변에서 메타게놈(metagenome) DNA를 분리하는 단계 및 상기 분리된 DNA를 이용하여 파이로 시퀀싱(pyro-sequencing)을 수행하는 단계를 포함하는 돼지 분변 내의 루미노코카세아에과(Ruminococcaceae) 균총 및 프레보텔라세아에과(Prevotellaceae) 균총을 동정하는 방법에 관한 것이다.
2011년 7월부터 가축의 사료 내 성장촉진용 항생제 사용이 금지됨에 따라, 동물산업에서 소비자 및 생산자 모두를 위해 가축 및 인체에 무해한 항생제 및 항균제를 대신할 수 있는 안정성이 확보된 후보 물질의 연구 개발 및 효능 연구가 이루어지고 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 인간 및 동물에 투여되어 장내 미생물 균총의 균형을 개선하여, 성장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거하는 미생물로 간주되고 있으며, 이유자돈에서 프로바이오틱스의 공급은 성장과 사료효율을 개선시킨다는 보고가 있다. 프로바이오틱스에 사용되는 균들은 주로 건강한 사람의 장에서 흔하게 발견되는 상주균들로 락토바실러스와 비피더스균이 주종을 이룬다(Fuller, R. Probiotics in man and animals, 1989, J. Appl. Microbiol. 66:365-378). 프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.
축산용 프로바이오틱스의 경우에도 이미 바실러스, 효모, 유산균 등 다양한 프로바이오틱스 제품들이 판매되고 있으나 경제성만 고려하여 급여하거나 작용기작 및 효능이 불분명한 경우가 많으며 항생제와 혼용시 효과가 저감되거나 사료가공단계(예: 펠렛팅이나 고온 및 고압 공정 등)에서 프로바이오틱스의 안정성이 낮아지는 경우가 많았다. 또한 기존 시장은 여러 가지 제품들이 난립되면서 과학적이며 객관적인 판단기준이 없어 가격이 저렴한 제품들만 선택하려는 시장의 반응에 따라 제품의 품질도 점점 낮아져 가고 있는 상태이다. 하지만 최근 친환경 축산에 대한 관심 증대와 배합사료 내 항생제 사용금지가 시행되면서 프로바이오틱스의 역할과 중요성이 다시 인식되고 있다.
2000년 초부터 메타게노믹스(Metagenomics) 분야의 연구기술이 발전되면서 사람의 장내 세균에 대한 과학적인 연구가 많이 진행되고 있으며 장내 미생물 분포가 사람의 비만, 질병, 면역 및 심지어 성격까지 관여한다는 연구결과들이 계속 소개되고 있다. 메타게놈(Metagenome)을 분석하는 연구의 발전은 특정 환경에서 기존의 배양 가능한 미생물만 분석하는 것이 아니라 배양이 어려운 절대 혐기성균까지 DNA 수준에서 분포를 분석하여 미생물들의 상호작용에 대한 다양한 연구를 수행할 수 있게 되었다. 이러한 연구 결과들은 식품, 의학 및 의약 산업 등에 적용하려는 다양한 시도로 진행되고 있으며 특히 장내 미생물의 분포를 분석하고 개인의 신체적인 특성에 따라 적합한 프로바이오틱스와 프로바이오틱스 촉진물질인 프리바이오틱스(prebiotics) 등을 처방하여 장내 환경을 개선시켜 궁극적으로 질병 예방 및 치료 등을 기대하는 맞춤형 기능성 유용 소재개발 연구에 활용되고 있으며, 동물자원 산업에서도 최근 메타게노믹스 연구기술을 활용한 가축의 장내 미생물 분석에 대한 연구들이 시작되고 있으나, 아직까지 축종별 장내 미생물 분포 분석 수준의 연구만 간혹 진행되고 있으며 사료 및 사료첨가제 급여시 장내 미생물 분포의 변화와 생산성의 관계를 규명한 연구들은 거의 진행되지 않았고 초기 연구단계 수준이다.
본 발명에서는 동물자원 산업에 적합한 프로바이오틱스 기준(사료 가공시 안정성, 장내 안정성 및 유용물질 분비 등)에 따라 균주를 선발하고 이에 적합한 프리바이오틱스를 탐색 및 개발하여 각 축종(돼지, 닭)의 장내 환경을 고려한 축산용 신바이오틱스(synbiotics) 제품을 개발하고자 한다. 개발하려는 축산용 신바이오틱스는 축산에 적합한 프로바이오틱스와 프리바이오틱스의 합제를 의미하며 가축의 장내 고위험 병원성 미생물의 생장을 억제하고 소화촉진 및 장내 환경을 개선하여 면역증진, 질병예방 등 생산성 향상을 목표로 한다. 특히 본 발명에서는 첨단 연구기술인 인공 소화장기 모델 시스템과 메타게노믹스 파이로 시퀀싱(metagenomics pyro-sequencing) 기술 등을 적용하여 분석 및 개발된 프로바이오틱스와 프리바이오틱스 소재 및 신바이오틱스 제품 등을 급여한 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성 등에 대한 상관관계를 입증하고자 하였다.
한국등록특허 제0445292호에는 '다기능 프로바이오틱 능력을 가지는 신규 엔테로코카스페시움 유비티-엠'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0010648호에는 '프로 바이오틱 사료 및/또는 음용수 첨가제 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 신바이오틱스로서 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 가축 사료 첨가물을 제조하였다. 특히, 본 발명에서는 상기 가축 사료 첨가물을 투여한 돼지의 분변에서 메타게놈(metagenome) DNA를 분리하고, 파이로 시퀀싱을 수행하여 루미노코카세아에과(Ruminococcaceae) 균총 및 프레보텔라세아에과(Prevotellaceae) 균총을 동정한 결과, 장내 유해 균총(Enterobacteriaceae)은 감소하고 유익 균총이 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 가축 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은
락툴로오스와 본 발명의 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주의 혼합물을 시험관 내에서 돼지의 인공소화액에 처리하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 페시움 단독 처리에 비해 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주의 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 가축 사료첨가제를 돼지에게 투여하여 돼지 분변에서 메타게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 DNA를 이용하여 파이로 시퀀싱(pyro-sequencing)을 수행하는 단계를 포함하는 돼지 분변 내의 루미노코카세아에과(Ruminococcaceae) 균총 및 프레보텔라세아에과(Prevotellaceae) 균총을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 가축 사료에 프로바이오틱스로서 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 프리바이오틱스로서 락툴로오스를 배합하여 제조한 신바이오틱스를 첨가하여 급여하고 가축 분변 내의 균총을 조사하여, 일당 증체량과 사료섭취량의 증가 및 장내 균총의 증가를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 가축 사료 첨가제는 가축의 장관 면역을 높여 가축의 성장을 개선시키고 사료효율을 증가시켜, 사료비 및 가축생산비의 절감효과가 있으므로, 산업적으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히, 첨단 연구기술인 돼지와 닭의 소화기관을 시험관 내에서 연구할 수 있는 인공소화액 처리 실험 및 최근 생명공학 연구에서 화제가 되고 있는 메타게노믹스 파이로 시퀀싱을 통한 장내 미생물 변화와 가축의 생산성 관계 검증은 차별화된 기술력 확보로서 가치가 있다.
도 1은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 포함한 프로바이오틱 유산균들을 MRS 배지에 배양하여 배양시간별 생장율을 분석한 결과이다.
도 2는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 포함한 프로바이오틱 유산균들을 pH 3, pH 2로 조절한 MRS 또는 LB 배지에 배양하여 생존한 균 수를 계측한 결과이다.
도 3은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 포함한 프로바이오틱 유산균들을 옥스갈(Oxgall) 담즙산염을 0.3% 함유하는 MRS 배지 또는 LB 배지에 배양하여 생존한 균 수를 계측한 결과이다.
도 4는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 일정 온도에서 시간별로 샘플을 채취하여 37℃에서 12시간 혐기 배양 후 균수를 측정하여 열 안정성을 확인한 결과이다. (A); 측정한 균의 log10(CFU) 값, (B); 측정한 균의 상대성장률(%).
도 5는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 각 온도에 저장하여 일별로 채취한 샘플을 37℃에서 12시간 혐기 배양 후 균수를 측정하여 상대성장률(%)을 계산하여 저장 안정성을 확인한 결과이다.
도 6은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 포함한 프로바이오틱 유산균들을 다양한 프리바이오틱스 탄수화물이 포함된 MRS 배지에 배양하여 성장촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 다양한 농도의 락툴로오스가 포함된 MRS 배지에 프로바이오틱스 균주를 배양하여 락툴로오스 농도 대비 프로바이오틱스 균주의 생장 촉진을 확인한 결과이다. (A); 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01, (B); 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus) EB04, (C); 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus) EB05.
도 8은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 락툴로오스를 각각 일정비율로 단독 또는 혼합하여 시험관 내(in vitro) 돼지의 인공소화액 처리 실험을 수행한 후, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 배양하여 균주의 생장을 확인한 결과이다.
도 9는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 락툴로오스를 각각 일정비율로 단독 또는 혼합하여 시험관 내(in vitro) 돼지의 인공소화액 처리 실험을 수행한 후, 대표적인 병원성 균에 대한 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주의 억제력을 확인한 결과이다. (A); 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) K88, (B); 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium),(C); 바실러스 세레우스(B. cereus).
도 10은 이유자돈 분변 내 미생물 균총의 16S rRNA 유전자서열 분석을 통하여 미생물 군집을 분석한 결과이다.
도 11은 선발된 프로바이오틱 균주인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 프리바이오틱스인 락툴로오스를 이용하여 사료첨가제를 제조하는 공정을 도식화한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 가축 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예의 가축 사료 첨가제에서, 상기 프로바이오틱스는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 펜토서스( Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans)로부터 선택된 하나일 수 있고, 바람직하게는 엔테로코커스 페시움, 락토바실러스 펜토서스, 바실러스 코아귤란스일 수 있고, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2013년 12월 6일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC91915P).
상기 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주는 pH 2에서 내산성, 내담즙성, 열안정성, 저장안정성, 가공안정성 및 병원성 미생물 억제 활성을 나타내는 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
내산성 관련하여, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 펜토서스( Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans)에 대해 내산성을 조사한 결과, pH 3에서는 모두 생존하였으나, pH 2에서는 엔테로코커스 페시움, 락토바실러스 펜토서스 및 바실러스 코아귤란스 균주만이 생존하여 본 발명의 엔테로코커스 페시움 EBS-P01 균주가 내산성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 균주들에 대해 담즙성을 조사한 결과, 본 발명의 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주가 가장 높은 내담즙성을 보여주었다.
또한, 본 발명의 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주의 열안정성을 조사한 결과, 80℃에서 30분 처리 후에도 생존율이 거의 감소되지 않아 열안정성이 매우 높았으며, 저장안정성을 조사한 결과, 60℃에서 28일 동안 저장 후에도 생존율이 거의 감소되지 않아 저장안정성이 매우 높았다.
또한, 본 발명의 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주의 가공안정성 관련하여, 본 발명의 균주를 시료펠렛기(온도 55℃, 압력 1.8기압, 건식 스팀 방식)에 적용시킨 후 펠렛 가공 전후의 생존율을 조사한 결과, 펠렛 후에도 생존율이 거의 96%를 보여 가공안정성이 매우 높음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01의 병원성 미생물 억제 활성 관련하여, 문헌에 의거한 인공소화액 처리 실험을 수행한 후 각각의 병원성 균주에 대한 선택 배지를 이용하여 37℃에서 12시간 배양 후 병원성 균주의 균수를 확인한 결과, 대표적인 병원성균인 에셰리키아 콜라이(E. coli), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium), 바실러스 세레우스(B. cereus) 모두 대장 조건에서 첨가한 프로바이오틱스와 프리바이오틱스의 농도가 높을수록 억제 정도가 커지는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 일 구현 예의 가축 사료 첨가제에서, 상기 프리바이오틱스는 락툴로오스, 락티톨, 프락토올리고당, 만난올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 락툴로오스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예의 가축 사료 첨가제에서, 상기 프리바이오틱스와 프로바이오틱스의 혼합비는 중량비로 0.1~2:0.1~2일 수 있고, 바람직하게는 0.8~1.2:0.8~1.2일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예의 가축 사료 첨가제에서, 상기 가축은 돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 락툴로오스와 본 발명의 엔테로코커스 페시움 균주의 혼합물을 시험관 내에서 돼지의 인공소화액에 처리하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 페시움 단독 처리에 비해 엔테로코커스 페시움 균주의 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예의 엔테로코커스 페시움 균주의 생장을 증가시키는 방법에서, 상기 혼합물은 중량비로 엔테로코커스 페시움 균주 0.1~2%와 락툴로오스 0.1~2%를 혼합한 것일 수 있고, 바람직하게는 엔테로코커스 페시움 균주와 락툴로오스를 각각 1%로 혼합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예의 엔테로코커스 페시움 균주의 생장을 증가시키는 방법에서, 상기 돼지의 인공소화액에 처리하는 단계는 0.18N 염산 용액 2㎖을 섞은 펩신 3,000 unit을 처리하여 75분 동안 39℃에서 배양하는 인공 위소화액 처리 단계 및 상기 위소화액 처리물에 0.24 mg/㎖의 판크레틴을 포함하는 1M 중탄산소다(NaHCO3) 0.65㎖으로 섞고, 0.1M 수산화나트륨을 포함하는 0.05M 석시네이트 버퍼(succinate buffer) 100㎖(pH 6)가 포함된 투석배지에서 39℃에서 1~5시간 동안 투석하는 인공 장소화액 처리 단계로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 가축 사료 첨가제를 돼지에게 투여하여 돼지 분변에서 메타게놈(Metagenome) DNA를 분리하는 단계; 및 분리된 DNA를 이용하여 파이로 시퀀싱(pyro-sequencing)을 수행하는 단계를 포함하는 돼지 분변 내의 루미노코카세아에과(Ruminococcaceae) 균총 및 프레보텔라세아에과(Prevotellaceae) 균총을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 가축 사료 첨가제는 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움과 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합한 것으로, 혼합비는 중량비로 0.1~2:0.1~2일 수 있고, 바람직하게는 0.8~1.2:0.8~1.2일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 가축 사료 첨가제는 가축용 사료에 첨가하여 가축에게 급여함으로써, 가축의 장내 유익 균총 증가, 장내 유해균총(Enterobacteriaceae) 감소 및 증체량이 증진되는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 가축은 돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프로바이오틱 균주 효능 검증
<1-1> 균주 생장 분석
본 발명에 사용된 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주를 포함한 프로바이오틱 유산균들의 생장 패턴을 분석하기 위해 유산균 배양 배지인 MRS에 37℃에서 12시간 증균배양된 것을 사용하여 흡광도(O.D.600nm) 값을 분석하였다. 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) EB03 균주가 가장 높은 생장율을 보였으며 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주는 29시간 이후 눈에 띄게 증균되는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
<1-2> 소화액 내성 분석
시험관 내(in vitro)에서 상기 균주들이 위의 낮은 pH 및 생리적 담즙산염 함량을 견딜 수 있는지 확인하였다.
pH에 대한 내성을 확인하기 위하여, 염산을 이용하여 pH 3, pH 2로 조절한 MRS 및 LB 액체배지를 제조하였다. 증균배양한 시험 균주들은 모두 1%씩 pH 내성 시험용 액체배지에서 37℃에서 3시간 동안 배양 후 각각의 균주에 적합한 배지를 사용하여 살아있는 미생물의 수를 계측하였다(도 2). 상기 균주들은 pH 3에서는 생존력을 유지하였으나, pH 2에서는 락토바실러스 펜토서스(L. plantarum) EB03, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01, 바실러스 코아귤란스 (B. coagulans) EB01 균주들만이 생존하였다.
담즙산염에 대한 내성을 확인하기 위하여, 상기 균주들을 옥스갈(Oxgall) 담즙산염을 0.3% 함유하는 MRS 및 LB 액체배지를 제조하였다. 각각의 유산균들의 증균배양물을 MRS 및 LB 액체배지에 1%씩 접종하여 37℃에서 8시간 배양 후 측정한 흡광도(O.D.600nm) 값을 통해 살아있는 세포수 함량을 계측하였다(도 3). 전반적으로 모든 균주가 상기 처리시 우수하게 생존하는 것을 확인하였으며, 특히, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주가 가장 높은 담즙내성을 보였다.
<1-3> 젖산 생산능 확인
상기 선별된 유산균들이 프로바이오틱 균주로서 적용가능성을 확인하기 위하여 젖산 생성능을 확인하였다. 확보된 유산균을 11% skim milk 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한 후, 커드 형성 유무를 확인하였으며 상등액을 취해 HPLC를 이용하여 아래와 같은 조건(표 1)으로 젖산 함량을 분석하였다. 락토바실러스 속 균주들이 젖산 분비능이 높았으며, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 및 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) EB01 균주 또한 일정량의 젖산을 분비하는 것으로 확인되었다(표 2).
HPLC 조건
Column Supelcogel C610
Temperature 30℃
Mobile phase 20mM H2SO4
Flew rate 0.5ml/min.
Detector UV detector(210nm)
Injection volume 20μl
젖산 함량 분석 결과
균주명 젖산 생성 유무 젖산 함량(mg/ml)
Lactobacillus pentosus EB04 ++ 5.87
L. acidophilus EB05 ++ 5.51
L. plantarum EB03 ++ 6.12
Enterococcus faecium EBS-P01 + 3.78
Bacillus coagulans EB01 + 4.66
L. reuteri EB06 +/- 5.24
<1-4> 항균력 확인
프로바이오틱 균주로서 항균활성을 확인하기 위해, 확보된 유산균을 각각 37℃에서 12시간 동안 정치배양 또는 진탕배양한 후 배양액을 취해 액상에서 최소억제농도 테스트(minimal inhibitory concentration, MIC test)를 진행하였다(표 3). 항균력을 확인하기 위해 사용된 지시균은 대표적인 병원성 미생물인 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli ) K88, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 3종을 사용하였다.
항균력 확인(MIC test) 단위: 최종 희석 배수
샘플 Escherichia coli K88 Salmonella typhimurium Bacillus cereus
균주명 진탕배양 정치배양 진탕배양 정치배양 진탕배양 정치배양
Lactobacillus pentosus EB04 1/8이상 1/8이상 1/8이상 1/16이상 1/8이상 1/8이상
L. acidophilus EB05 1/8이상 1/8이상 1/8이상 1/16이상 1/8이상 1/8이상
L. plantarum EB03 1/8이상 1/16이상 1/8이상 1/16이상 1/8이상 1/16이상
Enterococcus faecium EBS-P01 1/4이상 1/4이상 1/4이상 1/4이상 1/4이상 1/4이상
Bacillus coagulans EB01 1/4이상 1/4이상 1/4이상 1/8이상 1/4이상 1/4이상
L. reuteri EB06 1/4이상 1/8이상 1/4이상 1/8이상 1/8이상 1/8이상
<1-5> 저장 및 가공안정성 확인
사료첨가제용 신바이오틱 조성물을 사료 내 첨가시 사료제조 공정상의 가공안정성을 확인하기 위한 시험관 내(In vitro) 실험을 진행하였다. 상기 균주들을 각 온도(40℃, 60℃, 80℃)에서 시간별(0분, 10분, 20분, 30분) 샘플을 취해 적정량 희석하여 MRS 배지에 도말하고, 37℃에서 12시간 혐기배양한 후 균수를 측정하였다.
상기 균주들에 대한 저장안정성을 확인하기 위하여, 각각의 균주들을 일정 온도 조건(25℃, 40℃, 50℃, 60℃)에서 28일간 저장하면서 각각 샘플을 취해 적정량 희석하여 MRS 배지에 도말한 후, 37℃에서 12시간 동안 혐기배양한 후 균수를 측정하였다.
사료제조 공정상의 열 및 가공에 안정한 프로바이오틱 균주를 확보하기 위하여 상기 균주들을 대상으로 당사 공장 내 시료펠렛기(온도 55℃, 압력 1.8기압, 건식 스팀 방식)에 적용시킨 후 펠렛 가공 전후 샘플을 취해 적정량 희석하여 MRS 배지에 도말하고, 37℃에서 12시간 동안 혐기배양한 후 균수를 측정하였다.
프리바이오틱 균주들 중 열 안정성 및 저장안정성, 가공안정성이 가장 높은 균주는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주였으며(표 4, 도 4, 도 5), 상기 효능검정 결과 가장 우수한 균주로 확인되어 프로바이오틱스로 선별하여 신바이오틱 조성물을 제조하였다.
가공안정성
CFU/g log 10 CFU/g Relative growth(%)
::log10 CFU/g대비
펠렛 전 펠렛 후 펠렛 전 펠렛 후 펠렛 전 펠렛 후
1 8.1E+06 4.0E+06 6.9 6.6 100.0 95.6
2 7.4E+06 4.1E+06 6.9 6.6 100.0 96.3
3 6.1E+06 3.3E+06 6.8 6.5 100.0 96.1
4 7.3E+06 3.9E+06 6.9 6.6 100.0 96.0
평균 7.2E+06 3.8E+06 6.9 6.6 100.0 96.0
실시예 2: 프로바이오틱 조합물에 적합한 프리바이오틱스의 선택
<2-1> 다양한 프리바이오틱 탄수화물 상에서의 프로바이오틱스의 성장
MRS 배지에 함유되어 있는 2% 글루코오스를 대신해 프리바이오틱스 소재로 사용될 수 있는 올리고당 락툴로오스, 락티톨, 프락토올리고당, 만난올리고당, 덱스트린을 2% 첨가하는 배지를 제조하였다. 각각의 프리바이오틱스를 포함하는 배지에 프로바이오틱스 소재인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주를 포함한 7가지 상용의 프로바이오틱스 균주를 37℃에서 12시간 배양하였다. 이후 600nm의 흡광도에서 균체량을 측정하였다. 상기 균주들에 있어서 가장 우수한 성장촉진 효과를 나타내는 프리바이오틱스는 락툴로오스 첨가 배양물이였다(도 6).
<2-2> 프로바이오틱 균주에 대한 농도 별 생장 촉진효과 확인
상기 결과를 토대로 락툴로오스의 농도 대비 프로바이오틱스의 생장 촉진 효과를 확인하였다. MRS 액체배지상의 포도당 성분을 제외한 후, 50% 함량의 액상 락툴로오스를 일정량(0.1, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001%) 첨가 후 0시간부터 24시간까지의 균수 생장율을 흡광도(O.D. 600nm)를 측정하여 확인하였다. 균체량 측정결과, 락툴로오스가 프로바이오틱스의 생장을 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한 락툴로오스의 농도에 비례하여 프로바이오틱스의 생장이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 3: 시험관 내( in vitro ) 인공소화액 처리 실험을 통한 프로바이오틱 균주 생장촉진효과 확인
돼지의 인공소화액 처리에 관한 연구는 기존 문헌(J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 2612-2617)을 참고하여 당사에서 직접 개발해서 활용중인 분석시스템으로 돼지와 닭의 소화기관(위, 소장, 대장)을 인공적으로 시뮬레이션할 수 있는 장치이다. 이를 이용하여, 기확보된 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스를 다양한 조건에서 조합하여 연구를 수행하고 동물사양실험 전에 효능을 예측하기 위한 도구로 사용하였다.
<3-1> 시험관 내 돼지의 인공소화액 처리 실험을 통한 생장 확인
선별된 프로바이오틱 균주인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 프리바이오틱스 소재인 락툴로오스를 각각 일정비율(1%)로 단독 또는 혼합하여 인공소화액 처리를 거친 후 균수를 MRS 배지에 37℃에 12시간 동안 배양하여 확인하였다. 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 단독 처리시 소장까지 약 10% 정도 증가하는 패턴을 보이며 대장 조건에서는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주 수가 90% 이상 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 프로바이오틱스와 프리바이오틱스 혼합 처리시 단독 처리시 보다 대장 조건에서 약 10% 정도 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주의 생장이 증가하였다(도 8).
<3-2> 시험관 내 돼지의 인공소화액 처리 실험을 통한 병원성 미생물 억제력 확인
선별된 프로바이오틱 균주인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주와 프리바이오틱스 소재인 락툴로오스를 각각 일정비율(프로바이오틱스: 0.04%, 프리바이오틱스: 1%, 0.1%)로 단독 또는 혼합하여 대표적인 G(-), G(+) 병원성 균주(E. coli K88, S. typhimurium, B. cereus)를 지시균으로 접종하여 면역성검사(challenge test)를 진행하였다. 인공소화액 처리를 거친 후 각각의 병원성 균주에 대한 선택배지를 이용하여 37℃에서 12시간 배양 후 병원성 균주의 균수를 확인하였다. 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01 균주의 경우 각각의 대표적인 병원성균인 에셰리키아 콜라이(E. coli) K88, 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium), 바실러스 세레우스(B. cereus) 모두 대장 조건에서 첨가한 프로바이오틱스와 프리바이오틱스의 농도가 높을수록 억제 정도가 커지는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
실시예 4: 양돈 사양시험
<4-1> 시험동물 및 시험설계
28일령의 3원 교잡종(Landrace×Yorkshire×Duroc) 이유자돈 105두를 공시하였으며, 시험 개시시의 체중은 6.7±0.1kg이었으며 총 5주(35일)간 실시하였다. 시험기간은 단계 1(0~14일)과 단계 2(15~35일)로 나누어 실시하였으며, 전기사료 급여 10일 후 후기사료 적응기간 4일 후부터 후기사료와 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스를 급여하였다.
각 기간의 사료는 옥수수-대두박 위주로 하였으며 처리구는 대조구(일반사료) 및 1) 프로바이오틱스 조성물을 0.1% 첨가한 처리구, 2) 프로바이오틱스 조성물 0.5% 첨가한 처리구, 3) 프리바이오틱스 조성물 0.2% 첨가한 처리구, 4) 프리바이오틱스 조성물 0.5% 첨가한 처리구, 5) 신바이오틱스(프로바이오틱스 조성물 0.1%와 프리바이오틱스 Pre 0.2%)를 첨가한 처리구, 6) 신바이오틱스(프로바이오틱스 조성물 0.5%와 프리바이오틱스 조성물 0.5%) 첨가한 처리구로 각각의 처리구는 4반복, 반복당 5두씩 완전임의 배치하였다.
<4-2> 시험사료와 사양관리
시험사료의 영양소 수준은 미국의 국가연구위원회(National Research Council, NRC) 사양 표준(1998)에 제시된 요구량을 충족하거나 초과하도록 배합한 옥수수-대두박 위주의 사료로서 가루형태로 자유 채식하도록 하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유롭게 먹을 수 있도록 조절하였다.
<4-3> 조사항목 및 방법
체중 및 사료 섭취량은 2주, 5주(종료시)에 각각 측정하여 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율을 계산하였다(유의수준 P값 0.05 이하).
이유자돈 사료내 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 신바이오틱스 첨가가 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율에 미치는 영향은 하기의 표 5에 나타내었다. 각각의 처리구는 일반사료를 급여한 처리구와 비교하여 증체량과 사료섭취량이 향상되었다(표 5).
항목 대조구 처리구1) 처리구2) 처리구3) 처리구4) 처리구5) 처리구6) 표준오차
체중(kg)
개시체중 6.7 6.7 6.7 6.7 6.6 6.6 6.6 0.1
2주령 11.6 11.8 11.9 11.6 11.7 11.6 11.7 0.2
5주령 23.3b 25.3a 25.0a 0.4
단계1(1-14일령)
일당증체량(g) 353 366 370 358 367 361 368 10
일당사료섭취량(g) 420 421 423 428 422 424 432 13
사료효율 0.840 0.869 0.875 0.836 0.870 0.851 0.852 0.04
단계2(15-35일령)
일당증체량(g) 551b 643a 636a 631a 652a 651a 652a 12
일당사료섭취량(g) 939 938 931 940 935 934 946 24
사료효율 0.587b 0.686a 0.683a 0.671a 0.697a 0.697a 0.689a 0.03
전체(1-35일령)
일당증체량(g) 475b 529a 532a 524a 539a 534a 543a 8
일당사료섭취량(g) 731 731 728 735 730 730 740 15
사료효율 0.650b 0.724a 0.731a 0.713a 0.738a 0.732a 0.734a 0.02
실시예 5: 파이로 시퀀싱( pyro - sequencing )을 이용한 이유자돈의 장내 균총 분석 및 변화 확인
<5-1> 분변 채취
프로바이오틱스와 프리바이오틱스, 신바이오틱스를 급여한 자돈의 장내 균총 변화를 분석하기 위해 대조구 15두, 프로바이오틱스(처리구 2) 15두, 프리바이오틱스(처리구 4) 15두, 신바이오틱스(처리구 6) 15두를 무작위로 선별하였다.
분변 채취는 사양시험 개시일, 14일, 35일에 실시하였으며, 항문 마사지 법으로 분을 채취한 뒤, 곧바로 아이스박스에 넣어 10℃이하 저온상태를 유지하며 실험실로 이동하였다.
<5-2> 메타게노믹 ( Metagenomic ) DNA 의 추출
취한 이유자돈의 분변에서 원래의 군집 구조를 그대로 반영할 수 있는 DNA를 얻기 위해 분변 채취 후 한시간 이내에 물리적 파괴를 이용하는 UltraClean
Figure 112014003804891-pat00001
Fecal DNA Isolation Kit를 사용하여 분변 내 미생물의 메타게노믹 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 아가로스 겔상의 전기영동을 통하여 DNA의 상태를 확인한 뒤, 파이로 시퀀싱(pyro-sequencing)을 실시하여 장내 균총 분포 분석을 진행하였다.
<5-3> 이유자돈 분변 내 미생물균총의 16S rRNA 유전자서열 분석 및 미생물 군집 분석
프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 신바이오틱스의 급여가 이유자돈의 장내균총 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 16S rRNA 유전자의 높은 효율의 분석기법인 파이로 시퀀싱(pyro-sequencing) 기술을 이용하였다. 추출한 DNA 시료는 Roche 454 GS FLX Titanium 장비를 이용하여 자돈 장관내 균총의 16S rRNA 유전자서열을 분석하였다. 총 48두의 이유자돈 장내 미생물 균총 16S rRNA 유전자 서열분석을 진행하였으며, 얻어진 자료는 파이로 시퀀싱 비주얼라이제이션 소프트웨어(pyro-sequencing visualization software)인 CLcommunity™를 이용하여 분석하였다. 분석결과 락툴로오스와 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) B07 균주 첨가 급여 시, 장내 유해균총(Enterobacteriaceae)은 감소하며, 장내 유익 균총인 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 및 엔테로코카시아에(Enterococcaceae) 계통이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 사양성적과 비교하였을 때, 대조구 대비 처리구에서 높은 증체량 및 사료효율을 보이며, 장내 균총 또한 유익균이 증가하는 것을 보여준다(도 10).
실시예 6: 신바이오틱 ( Synbiotic ) 조합물의 제품화
상기 선발된 프로바이오틱 균주인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) EBS-P01과 프리바이오틱스인 락툴로오스를 표 6과 같은 배합비 조건으로 제조하였으며, 제조 공정은 도 11 과 같다.
제조 배합비
원료 부형제 Mixture 왕겨 조합물(Pro+Pre) 물
비율(배합비) 80 20 50 30
농업생명공학연구원 KACC91915P 20131206

Claims (8)

  1. pH 2에서 내산성, 내담즙성, 40~80℃에서 열안정성, 저장안정성 및 가공안정성을 나타내며, 기탁번호 KACC91915P로 기탁된 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 돼지의 장내 유해균인 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium) 및 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주는 감소시키고, 장내 유익균인 엔테로코카시아에과(Enterococcaceae) 균총을 증가시키는 효과를 갖는 돼지 사료첨가제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주 및 락툴로오스의 혼합비는 중량비로 0.8~1.2:0.8~1.2인 것을 특징으로 하는 돼지 사료첨가제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. pH 2에서 내산성, 내담즙성, 40~80℃에서 열안정성, 저장안정성 및 가공안정성을 나타내며, 기탁번호 KACC91915P로 기탁된 프로바이오틱스인 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 균주 및 프리바이오틱스인 락툴로오스를 혼합하여 제조한 사료첨가제를 돼지에게 급여하여 돼지의 장내 유해균인 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium) 및 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주는 감소시키고, 장내 유익균인 엔테로코카시아에과(Enterococcaceae) 균총을 증가시키는 방법.
  8. 삭제
KR1020140004616A 2014-01-14 2014-01-14 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제 KR101591879B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140004616A KR101591879B1 (ko) 2014-01-14 2014-01-14 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140004616A KR101591879B1 (ko) 2014-01-14 2014-01-14 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150084516A KR20150084516A (ko) 2015-07-22
KR101591879B1 true KR101591879B1 (ko) 2016-02-04

Family

ID=53874451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140004616A KR101591879B1 (ko) 2014-01-14 2014-01-14 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101591879B1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101722857B1 (ko) * 2015-10-22 2017-04-04 연세대학교 산학협력단 전기방사에 의한 자발적 다층구조 형성방법
KR102174589B1 (ko) * 2018-08-03 2020-11-05 부경대학교 산학협력단 뱀장어 사료내 항생제 대체를 위한 신바이오틱스 개발
WO2021261626A1 (ko) * 2020-06-25 2021-12-30 주식회사 인실리코 다당류 나노입자를 포함하는 장내 균총 개선용 신바이오틱스 조성물
KR102368481B1 (ko) * 2020-09-10 2022-02-28 주식회사 피드업 식물성 오일 및 대두박의 발효물을 포함하는 사료 조성물 및 이의 제조방법
KR102567095B1 (ko) * 2021-09-15 2023-08-16 대한민국 쉬땅나무에서 분리된 신규 락토바실러스 종 균주
KR102623909B1 (ko) * 2022-11-09 2024-01-12 (주)진바이오텍 Escherichia coli 유래 가축 장내 바이오 필름 억제능을 가지는 미생물 균주
CN117025474B (zh) * 2023-08-21 2024-01-26 广东海洋大学 一株屎肠球菌cd6、微生物菌剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150084516A (ko) 2015-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101591879B1 (ko) 가축들의 장내 미생물 변화와 생산성에 영향을 주는 신바이오틱스 가축사료 첨가제
Roto et al. An introduction to the avian gut microbiota and the effects of yeast-based prebiotic-type compounds as potential feed additives
Ruiz Sella et al. Bacillus subtilis natto as a potential probiotic in animal nutrition
Kazemi et al. Evaluating two multistrain probiotics on growth performance, intestinal morphology, lipid oxidation and ileal microflora in chickens
Cui et al. Effect of dietary Bacillus subtilis on proportion of Bacteroidetes and Firmicutes in swine intestine and lipid metabolism
EP2900805B1 (en) Probiotic and prebiotic compositions
Ripamonti et al. Screening of species-specific lactic acid bacteria for veal calves multi-strain probiotic adjuncts
Bogucka et al. Microstructure of the small intestine in broiler chickens fed a diet with probiotic or synbiotic supplementation
Upadhaya et al. Probiotics in Salmonella-challenged Hy-Line brown layers
Wang et al. Assessment of probiotic properties of Lactobacillus plantarum ZLP001 isolated from gastrointestinal tract of weaning pigs
Ren et al. Screening of host specific lactic acid bacteria active against Escherichia coli from massive sample pools with a combination of in vitro and ex vivo methods
Moarrab et al. Effect of synbiotic on performance, intestinal morphology, fecal microbial population and blood metabolites of suckling lambs.
Hosseindoust et al. Dietary Bacillus subtilis B2A strain in laying hens challenged with Salmonella gallinarum: effects on egg production, egg quality, blood haptoglobin and targeted intestinal Salmonella shedding
KR20160026280A (ko) 무항생제 가축용 단미 펠렛 사료
KR101197203B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플랜타럼 균주, 그 균주를 포함하는 항균 및 항산화 활성을 가지는 조성물 및 그 용도
Agboola et al. Dietary supplementation of probiotics and synbiotics on intestinal microbial populations and gut morphology of turkey poults
EP2166083A1 (en) Novel Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SG96, a bacteriostatic composition containing the same and use thereof
KR20190047756A (ko) 유산균 생균제 조성물 및 이를 포함하는 기능성 사료첨가제
Puphan et al. Screening of lactic acid bacteria as potential probiotics in beef cattle
Zhang et al. In vitro characterisation of two Lactobacillus strains and evaluation of their suitability as probiotics for growing-finishing pigs
Jiao et al. Dietary medium-chain fatty acid and Bacillus in combination alleviate weaning stress of piglets by regulating intestinal microbiota and barrier function
El-Sayed et al. Characterization, encapsulation and evaluation of the newly isolated Enterococcus faecium as a probiotic for ruminants
Joysowal et al. Comparative effect of probiotics (swine and dairy origin) on growth performance, nutrient digestibility, blood biochemical profile, immune status and faecal microbial count of earlyweaned grower-finisher crossbred pigs
Liu et al. Effect of a liquid culture of Enterococcus faecalis CGMCC1. 101 cultivated by a high density process on the performance of weaned piglets
Dhruw et al. Effect of Live Lactobacillus acidophilus NCDC 15 and CURD as probiotics on blood biochemical profile of early weaned piglets

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190102

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191220

Year of fee payment: 5