KR102623909B1 - Escherichia coli 유래 가축 장내 바이오 필름 억제능을 가지는 미생물 균주 - Google Patents
Escherichia coli 유래 가축 장내 바이오 필름 억제능을 가지는 미생물 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Escherichia coli 유래 가축 장내 바이오 필름 억제능을 가지는 미생물 균주를 개시한다.
Description
본 발명은 Escherichia coli 유래 가축 장내 바이오 필름 억제능을 가지는 미생물 균주에 대한 것으로서, 보다 구체적으로 고생산성 돼지 분변에서 분리된 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주와 멧돼지 분변에서 분리된 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종에 관한 것으로서, 상기 균주 2종의 미생물의 경우 소화기 질병 유발 균주인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli) 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)의 바이오 필름 형성 억제 및 제거능을 갖는다. 본 발명에 따르면 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주는 소화기 질병 유발 균주인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli) 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 가지고 있어 프로바이오틱스 등 사료 및 사료첨가제에 활용이 가능하다.
바이오필름은 미생물들의 복합체로서, 스스로 만들어진 EPS(Extracelluar Polymeric Substances) 내에 함유된다. 따라서, 바이오필름은 그 매트릭스 안에 둘러 싸여져서 상호 간 또는 표면에 고착되거나 상호 교류하는 미생물군이라고 말할 수 있다.
미생물에 의하여 형성된 바이오필름은 다양한 표면에 강하게 부착되어 있어 제거하기가 힘들고, 부유생활을 할 때에 비하여, 가혹한 환경 (pH, 온도, 영양분의 고갈 등)과 항생제들의 공격 등에 대하여 훨씬 강한 저항력을 가지기 때문에 멸균, 소독이 힘들다.
바이오필름은 세균, 효모, 곰팡이 등 미생물이 특정조건에서 동물(피부, 구강, 치아 등) 등의 표면에 필름처럼 부착되어 있는 미생물의 집합체라 할 수 있으며, 그 자체가 미생물의 서식처로도 제공되어 균의 서식을 가속화하기도 한다.
특히 질병 유발 균주들의 바이오필름은 축산업계 및 의학계 전반에서 심각한 문제를 일으킬 수 있으므로, 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 바이오필름 형성을 억제하는 방법 등에 대한 연구가 요구되는 상황이다.
바이오필름(생물세균막) 및 식품 안전 (바이오필름 솔루션 제안), 2019, 5 (Vol.8, No.1), pp. 8~13
본 발명의 목적은 소화기 질병유발 균주 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력이 우수한 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
일 양태에서, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주를 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 개시한다.
본 발명에 따른 고생산성 돼지 및 멧돼지 분변에서 분리한 2종의 균주 중 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli) 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 가지고 있어 프로바이오틱스 등 사료 및 사료첨가제에 활용 가능한 이점이 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 이하에서 설명할 내용으로부터 통상의 기술자에게 자명한 범위 내에서 다양한 효과들이 포함될 수 있다.
도 1은 In-vivo 바이오필름 억제능 평가 결과를 400배 배율로 장 융모를 이루는 상피세포의 내강측 표면 부위를 나타낸 결과이다.
도 2은 In-vivo 바이오필름 억제능 평가 결과를 400배 배율로 장 융모를 이루는 상피세포의 내강측 표면 부위를 개체당 5개 단면에서 관찰하고 병변을 점수화 한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli (KCCM 11234)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli(E.coli K88)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli(E.coli F18)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 In-vivo 바이오필름 억제능 평가 결과를 400배 배율로 장 융모를 이루는 상피세포의 내강측 표면 부위를 개체당 5개 단면에서 관찰하고 병변을 점수화 한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli (KCCM 11234)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli(E.coli K88)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주의 Escherichia coli(E.coli F18)에 대한 항균활성 평가를 위한 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 발명자들은, 돼지 질병 예방을 위한 유용 미생물을 선발하기 위해 연구 개발하던 중, 사료 등의 기준 및 규격'의 제 5조 '보조사료의 범위'에 명시된 균주의 허용 범위에 따라 분류하여 축산 사료로 이용할 수 있는 22종의 후보 미생물을 선발하였고, 이 중에서 소화기 질병유발 균주 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력이 우수한 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(
Escherichia coli
; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 균주
본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어, 「바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans)」란, 충남지역 양돈장의 고생산성 육성돈(3원 교잡([LxY]xD)) 분변에서 채취한 균주로, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P)를 의미한다.
또한, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어, 「엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)」란, 경남 및 전남지역 야생 멧돼지 분변에서 채취한 균주로, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P)을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)는 KCCM 11234, E.coli K88 또는 E.coli F18 중에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(
Escherichia coli
; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 균주를 포함하는 사료용 조성물
본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 사료용 조성물은 사료 또는 사료 첨가제일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 「사료」란, 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 「사료첨가제」란, 배합사료에 첨가되어 소화력 향상, 병원균 저감, 지방 대사 개선, 항산화 효과, 독성 물질 제거 등의 효과를 나타내며, 종류에는 보존제, 아미노산제, 비타민제, 생균제, 효소제 등이 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 신규 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주와 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주는 본 발명에 따른 사료용 조성물의 총 중량에 대해 0.001중량% 내지 50중량% 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.01중량% 내지 20중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업자의 사용 목적에 따라 용이하게 변경할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 동물(우제류), 닭, 오리, 거위, 꿩 등 조류, 장어, 광어 등 어류, 또는 개, 고양이 등의 반려동물 중 어느 하나 이상의 사료용일 수 있으며, 구체적으로는 육계 사료, 양돈 사료 또는 축우 사료일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 있어서, 「부형제」는 약제에 적당한 굳기나 형상을 주기 위해서, 또는 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정 용량, 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 성분을 의미한다. 상기 부형제는 사료용 조성물의 일 예인 사료 또는 사료첨가제의 제조에 있어서 통상적으로 사용되는 것을 포함할 수 있고, 이에 한정되지는 않으나, 밀기울(wheat bran), 옥수수 분말, 곡류 전분, 실리카분말, 규조토 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 사료 등 기준 및 규격(농림축산식품부 고시 제2014-106호)에서 인정하고 있는 부형제 등을 포함할 수 있다. 부형제는 전체 사료용 조성물 100 중량부에 대해 50 내지 99 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 사료용 조성물은 당업계의 통상적인 제형으로 제조될 수 있으며, 분말 또는 소정의 형태를 가진 펠릿 형상으로 구현될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 체내 흡수를 증진시키기 위해 나노화되거나, 소장에서의 항균 활성을 강화하기 위해 지방코팅 제형으로 제조될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
위에서 기술된 균주에 관한 내용은 서로 모순되지 않는 한 상기 사료용 조성물에 모두 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예로서 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예.
이하 실시예에서 사용하는 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주는 2022년 11월 01일 자로 한국미생물보존센터(국내)에 기탁하여 수탁번호(KFCC11948P)를 받은 균주이고, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주는 2022년 11월 01일 자로 한국미생물보존센터(국내)에 기탁하여 수탁번호(KFCC11946P)를 받은 균주이다.
실시예 1. 미생물 스크리닝을 통한 최종 후보 미생물 선발
1. 미생물 스크리닝
(1) 멧돼지 분변, 돈사 주변 환경 등에서 미생물 분리
본 발명에서는 돼지 질병 예방을 위한 유용 미생물을 선발하기 위해 충남 및 경기도 지역의 양돈장 분변, 경남 및 전남 지역의 야생 멧돼지 분변 및 음식물 쓰레기를 비롯한 식품 등에서 샘플을 채취하였고, 채취한 샘플로부터 150여종의 미생물을 분리하였다. 미생물의 분리는 LB 배지(Tryptone, 10 g/L; Yeast extract, 5 g/L; Sodium chloride, 10 g/L; Agar, 15 g/L), MRS 배지(Proteose Peptone No.3 10 g/L; Beef Extract 10 g/L; Yeast Extract 5 g/L; Dextrose 20 g/L; Polysorbate80 1 g/L; Ammonium Citrate 2 g/L; Sodium Acetate 5 g/L; Magnesium Sulfate 0.1 g/L; Manganese Sulfate 0.05 g/L; Dipotassium Phosphate 2 g/L; Agar 15 g/L) 및 PDA 배지(Potato starch, 4 g/L, Dextrose, 20 g/L, Agar, 15 g/L)를 이용하였다. 순수 분리된 미생물은 각각의 증식 배지를 이용하여 33℃ 에서 24시간 이상 배양 후 15% glycerol stock 과 1:1 비율로 혼합하여 -70℃ depp freezer에 보관하였다.
(2) 미생물의 유전학적 동정
선발한 미생물들의 명확한 동정을 위하여 16S rRNA sequencing을 진행하였다. 순수 분리된 균주는 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하여 16S rRNA sequencing을 통해 동정하였으며, NCBI GenBank database의 염기 서열 비교를 통해 미생물을 확인하였다.
확인된 150여종의 미생물들은 행정규칙 ‘사료 등의 기준 및 규격‘의 제 5조 ‘보조사료의 범위' 에 명시된 균주의 허용 범위에 따라 분류하여 축산 사료로 이용할 수 있는 22종의 후보 미생물을 선발하였다. 이들은 혐기성 미생물 17종, 호기성 미생물 5종으로 구성되어있다 (표 1 참조).
| GBD1 (Bacillus coagulans GB-BC-2022, KFCC11948P) |
Bacillus coagulans |
| GBD5 | Enterococcus faecium |
| GBD8 | Lactobacillus plantarum |
| GBD11 | Lactobacillus reuteri |
| GBD27 | Lactobacillus paracasei |
| GBD28 | Lactobacillus plantarum |
| GBD31 | Lactobacillus reuteri |
| GBD32 | Bacillus coagulans |
| GM3 | Pediococcus pentosaceus |
| GM8 | Lactoplantbacillus plantarum |
| GM9 (Enterococcus faecium GB-EF-2022, KFCC11946P) |
Enteroccocus faecium |
| GM11 | Enteroccocus faecium |
| GM13 | Enterococcus faecium |
| GM15 | Enteroccocus faecium |
| GM21 | Enterococcus faecium |
| GM22 | Lactoplantbacillus plantarum |
| GM24 | Enterococcus faecium |
| GL26 | Bacillus subtilis |
| GL27 | Bacillus subtilis |
| GL28 | Bacillus subtilis |
| GL29 | Bacillus licheniformis |
| GL30 | Bacillus subtilis |
2. 미생물의 특성
(1)
In-vitro
바이오필름 억제능 평가
선발된 22종의 미생물들의 소화기 질병유발 균주 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력을 확인하기 위하여 Biofilm Formation Assay Kit(Dojindo)를 이용하였다.
- 바이오필름 억제능 평가(Biofilm inhibition test) 방법
i) 바이오필름 생성 균주(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18) 각각을 루리아-버타니(Luria-Bertani) broth (LB broth)를 이용하여 33℃, 24~48시간 배양 후 O.D 0.2(600 nm)로 희석한다.
ii) 희석한 바이오필름 생성 균주 배양액을 96-well plate에 180 μl를 분주한 후 48시간 배양하여 바이오필름을 생성시킨다.
iii) 바이오필름 생성 균주 배양액에 담겨있던 lid를 멸균 식염수로 3번 세척한다.
iv) 선발된 22종의 미생물의 균주 배양액(O.D 0.2(600 nm))을 96-well plate에 180 μl를 분주한 후 세척된 lid를 넣고 24~48시간 배양한다. 이 때, 균주 배양액은 유산균의 경우 MRS broth, 바실러스 균의 경우 루리아-버타니(Luria-Bertani) broth (LB broth)를 이용하여 33℃, 24~48시간 배양하여 준비한다.
v) 선발된 22종의 미생물의 균주 배양액에 담겨있던 lid를 멸균 식염수로 3번 세척 후 crystal violet solution을 이용하여 30분간 염색시킨다.
vi) 염색된 lid를 멸균식염수로 3번 세척한다.
vii) 바이오필름만 남은 세척된 lid를 에탄올(ethanol)을 이용하여 15분간 녹인 후 590 nm에서 흡광도를 측정하여 바이오필름 생성 정도를 확인한다.
- 바이오필름 억제능 평가 결과
상기 방법을 통해 실험한 결과, 본 발명에 따른 신규한 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종의 미생물이 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대하여 바이오필름 억제 및 제거에 70% 이상 효과가 있는 것으로 확인되었다 (표 2 참조).
특히, 선발된 22종의 미생물 균주 중에서, 본 발명에 따른 신규한 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종의 미생물이 바이오필름 억제 및 제거에 있어서 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.
| Escherichia.coli F18 | Escherichia.coli K88 | Escherichia.coli KCCM 11234 | |
| GBD1 (Bacillus coagulans GB-BC-2022, KFCC11948P) |
75.3% | 77.7% | 81.3% |
| GBD5 (Enterococcus faecium) |
71.7% | 68.1% | 66.9% |
| GBD8 (Lactobacillus plantarum) |
20.3% | 23.7% | 27.0% |
| GBD11 (Lactobacillus reuteri) |
24.4% | 27.6% | 25.7% |
| GBD27 (Lactobacillus paracasei) |
67.0% | 70.7% | 64.9% |
| GBD28 (Lactobacillus plantarum) |
62.4% | 58.3% | 47.7% |
| GBD31 (Lactobacillus reuteri) |
51.5% | 40.9% | 45.2% |
| GBD32 (Bacillus coagulans) |
68.4% | 59.9% | 71.4% |
| GM3 (Pediococcus pentosaceus) |
2.7% | 19.1% | 15.8% |
| GM8(Lactoplantbacillus plantarum) | 21.8 | 27.9% | 25.0% |
| GM9 (Enterococcus faecium GB-EF-2022, KFCC11946P) |
71.7% | 79.8% | 76.3% |
| GM11 (Enteroccocus faecium) |
15.9% | 9.3% | 19.1% |
| GM13 (Enterococcus faecium) |
28.0% | 38.7% | 42.0% |
| GM15 (Enteroccocus faecium) |
9.4% | 6.0% | 5.7% |
| GM21 (Enterococcus faecium) |
8.6% | 8.3% | 9.3% |
| GM22 (Lactoplantbacillus plantarum) |
74.2% | 71.5% | 72.4% |
| GM24 (Enterococcus faecium) |
65.4% | 62.3% | 62.6% |
| GL26 (Bacillus subtilis) |
75.3% | 77.8% | 71.4% |
| GL27 (Bacillus subtilis) |
66.6% | 61.6% | 64.9% |
| GL28 (Bacillus subtilis) |
77.3% | 66.6% | 64.9% |
| GL29 (Bacillus licheniformis) |
70.1% | 64.2% | 68.1% |
| GL30 (Bacillus subtilis) |
70.9% | 61.4% | 58.4% |
(2)
In-vivo
바이오필름 억제능 평가
바이오필름을 유도하지 않고 유용미생물도 투여하지 않은 음성대조군(negative control; NC)과, 바이오필름을 유도하고 유용미생물은 투여하지 않은 양성대조군(positive control; PC), 바이오필름을 유도하고 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 각각 투여한 2개 군(G3 및 G4)으로 총 4개의 군에 군당 8마리의 C57BL/6(수컷, 6주령) 마우스로 실험하였다 (표 3 참조). 여기서 유용미생물이라 함은 본 발명에 따른 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주를 의미한다.
-
In-vivo
바이오필름 억제능 평가 방법
i) C57BL/6 마우스에 5x10^9 cfu/ml 농도의 Escherichia coli(KCCM 11234) 200ul씩 D0와 D6에 각 1회씩, 총 2회 bid 투여하여 바이오필름을 유도한다.
ii) 바이오필름이 유도된 C57BL/6 마우스에 주 1회 2주간 유용미생물을 5x10^9 cfu/ml 농도로 준비하여 마리당 200ul씩 D8부터 D23까지 오전 10시와 4시에 약 6시간 간격을 두고 1일 2회 bid 투여하여 바이오필름 억제 및 제거 효능을 확인한다.
-
In-vivo
바이오필름 억제능 평가 결과
바이오필름 억제 효과는 조직병리학적 분석을 통해 평가하였으며 평가 체계는 400배 배율로 장 융모를 이루는 상피세포의 내강측 표면 부위를 개체당 5개 단면에서 관찰하고 병변을 점수화하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 점수화 기준으로는, 바이오필름이 관찰되지 않는 경우 0점, 바이오필름이 세균체의 형태를 보이는 경우 1점, 바이오필름이 선형으로 관찰되는 경우 2점, 바이오필름과 병변이 동반되는 경우 3점으로 처리하였다. 도 1을 참조하면, 상기 실험 결과 본 발명에 따른 신규한 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종의 미생물 모두 양성대조군(G2, PC)과 비교하여 바이오필름 억제 측면에서 통계적으로 유의한 결과가 관찰되어 Escherichia coli에 대하여 바이오필름 억제 및 제거에 유의적인 효과가 있는 것으로 확인되었다(도 1 참조, 도 1에서, P- value < 0.05인 경우 유의성이 있다고 판단했을 때 양성대조군(PC) 처리구, 그리고 음성대조군(NC) 처리구 간 유의적 차이를 확인할 수 있으며, 각 처리구 간 유의성은 superscript (*, + or none)으로 표기하였음).
[표 3]
(표 3에서, a와 b는 다음과 같다. a: negative control, b: positive control, 상기 표 3에서 투여량(μl)이라 함은, 바이오필름 유도물질 및 미생물 투여량은 마우스의 권장 투여 용량을 참고하여 선정한 것으로서, 본 실험에서는 미생물의 효과만 확인한 것임.)
(3) 항균 활성 평가
항균 활성 평가 방법
바이오필름 억제 및 제거 능력이 있는 2종의 미생물의 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 항균활성을 최저생장저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험을 통하여 분석하였다. 최저생장저해농도 시험은 병원성 균주인 E. coli 3종 (KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18) 각각을 LB 배지에 접종하고 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 다음 분광광도계를 이용하여 630 nm에서 흡광도 값이 0.2±0.03이 되도록 희석하여 준비하였다. 그리고 나서, 본 발명에 따른 신규한 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종 각각을 MRS 및 LB배지 50 mL에 각각 1%씩 접종한 다음 35℃, 130 rpm 조건으로 24시간 동안 진탕배양하고 원심분리기를 이용하여 4000 rpm에서 10분 간 원심분리 하였다. 피펫을 이용하여 상등액 5 mL을 분리한 다음 0.2 μm 시린지 필터(syringe filter)에 여과하여 샘플을 준비하였다. 96 well plate에 여과된 배양액과 병원성 균주 배양액을 1:1 비율로 혼합하여 분주하고 37℃ 진탕배양기에서 48시간 동안 발효를 진행하였다. 발효 24시간, 48시간 차에 흡광도값을 측정하여 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었으며, 양성 대조군(Postive control; PC)는 병원성 균주 배양액과 미생물이 들어있지 않은 LB 배지를 1:1로 혼합하여 분주하였고, 음성 대조군(Negative control; NC)은 멸균 증류수와 미생물이 들어있지 않은 LB배지를 1:1로 혼합하여 분주하였다.
항균 활성 평가 결과
상기 방법을 통해 진행된 실험 결과를 참조하면, 본 발명에 따른 신규한 균주인 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 균주 2종의 미생물이 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대하여 항균활성을 나타내었다 (도 3 내지 도 5 참조).
그러나, 양성 대조군(G2)의 경우, 24시간, 48시간에서 O.D값이 증가하여 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)이 성장한 것을 확인할 수 있었고 이는 항균활성이 없는 것을 나타내었다.
3. 결론
본 발명은 환경 및 멧돼지 분변에서 분리한 균주 중 바실러스 코아귤런스 GB-BC-2022 (Bacillus coagulans, GB-BC-2022, 수탁번호: KFCC11948P) 균주, 엔테로코커스 페시움 GB-EF-2022 (Enterococcus faecium, GB-EF-2022, 수탁번호: KFCC11946P) 2종은 소화기 질병 유발 균주 Escherichia coli 3종(KCCM 11234, E.coli K88, E.coli F18)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 가지고 있어 프로바이오틱스 등 사료 및 사료첨가제에 활용 가능할 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.
Claims (8)
- 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 수탁번호 KFCC 11948P로 기탁된 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) GB-BC-2022 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)는 KCCM 11234, E.coli K88 또는 E.coli F18 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 따른 소화기 질병 유발 균주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)에 대한 바이오필름 억제 및 제거 능력과 이들 소화기 질병 유발 균주들에 항균활성을 갖는 수탁번호 KFCC 11948P로 기탁된 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) GB-BC-2022 균주를 포함하는 사료용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 사료용 조성물은 사료 또는 사료첨가제인 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.
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