CN101294142A - 粘膜发酵菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种粘膜发酵菌剂及其制备方法。该粘膜发酵菌剂包括基料、辅料和菌种，其中基料包含预先还原的厌氧细菌培养基、葡萄糖、氮化物、以及还原剂；菌种为选自于乳酸杆菌、乳酸片球菌、粪链球菌、枯草杆菌、双歧杆菌中的一种或者其多种的组合。该制备粘膜发酵菌剂方法主要包含：步骤一，从无特定性病原菌感染的动物体内取出一部分肠道并彻底清洗；步骤二，在厌氧环境中，从清洗过的肠道上切取一段肠粘膜；步骤三，将所取得的肠粘膜置于一种特定的厌氧培养基中进行初级培养；步骤四，将步骤三获得的培养物置于一系列厌氧培养基中进行多级次培养以分离杂菌并获得所需菌种。本发明方法有利地获得了具有稳定抗菌作用和产品性能的新粘膜发酵菌剂。

Description

粘膜发酵菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物用生物制品及其制备方法，特别是指一种动物用的粘膜发酵菌剂及其制备方法。

背景技术

在传统的畜禽生产过程中，需要大量地使用抗生素来促进动物的生长和防病治病。作为预防性用药，饲料厂或养殖户一般按1％～2％的比例将抗生素添加到饲料中。其作用主要有：削弱胃肠内有害微生物；抑制、杀死致病菌，增强抗病能力；同时，使动物肠壁变薄，有利于养分的渗透和吸收，提高饲料利用率；增进食欲，同时刺激动物脑下垂体分泌激素，促进机体生长发育，从而加快增重速率。大量研究证明，这种传统的饲养方法导致了严重的药物残留的危害。目前，在动物饲料中普遍加入头孢、土霉素、四环素类药物，实际上等于持续低剂量用药，有利于致病微生物的获得性抵抗力或“先天性抵抗力”的产生，成为抗药菌株。长期食用有抗生素残留的畜禽产品，可造成人体中一些非致病菌的死亡，使菌群平衡失调或引起核黄素缺乏症和紫癜性损伤，从而对人类的生命健康产生威胁。

近年来，世界范围内屡屡发生大规模的食品安全事件，如：疯牛病、猪口蹄疫、禽流感、以及在多国流行的具有多重抗药性的伤寒沙门氏菌病等。这一系列突发事件涉及的国家范围，危及健康的人群，以及给相关食品国际间贸易带来的危机使食品安全问题受到了历史上空前的关注。

时常摄入含有抗生素的食品，可使某些菌株产生耐药性，耐药菌株又能将耐药因子传递给其他敏感细胞，使其他异种菌株变成耐药菌株，从而带来预防与治疗某些人畜疾病的困难，如，人感禽流感和人类非典型性肺炎等。

另一方面，目前世界各国人类食源性疾病的发生均呈上升趋势。其主要分为两类，一类是由食品中的生物或化学因素引起的食物中毒，另一类是由于食品中的生物因素引起的感染性腹泻。发达国家每年约有30％的人深受其害。而在发展中国家，该问题更加普遍。食源性疾病按其病原分类，主要分为微生物性(细菌、真菌、病毒、寄生虫)，化学性和有毒动植物性。无论是国际或国内的资料都表明，食品中微生物的污染所引起的急性食物中毒是食品安全中最重要的公共卫生问题。

我国食用畜禽肉、禽蛋类产品较多，以沙门氏菌导致的食物中毒最多。近年来，国际报道并关注较多的病原菌主要有出血性大肠杆菌O157:H7，单增李斯特氏菌，多重耐药性沙门氏菌，空肠弯曲菌。已报道的食源性疾病致病因子有250种之多，其中肠道致病菌(约10种)是食源性疾病中最常见的生物致病因素，感染后可引起细菌性食物中毒和多种感染性腹泻。沙门氏菌(禽、畜肉)是我国生物性食物中毒事件中最常见的重要致病菌之一。防范人类食源性疾病要从农产品的源头做起，对于消费者来说，健康的生活方式和良好的饮食习惯也很重要。

针对上述问题，目前我国正在全面致力于实施“无公害食品行动计划”，加大农产品源头污染的治理力度，推进农产品标准化生产区的建设，开展多种形式的农产品质量安全监管。努力构建从农田到餐桌的食品安全法律法规体系。深入开展禽畜产品违禁药物滥用、药物残留专项整治，基本解决“餐桌污染”问题。因此，如何在畜禽生产过程中在减少抗生素使用的同时，又减少人类食原性疾病的发生率，已经成为世界范围内亟待解决的重要研究课题之一。

近年来，粘膜性竞争性排斥剂对病原菌的抑制作用在很多公开的文献中都有描述。例如，美国专利第5,451,400号所公开的一种用于保护家禽免受沙门氏菌和空肠弯曲菌感染的竞争性排斥剂的方法，其具有抑制沙门氏菌和空肠弯曲菌在家禽肠道内的增值作用。运用这种粘膜性竞争性排斥剂来降低禽肉、蛋产品中人类食源性疾病致病菌的污染，已成为一种有效的解决方案。但是因为该方法取得的仍然是不确定的动物粘膜组合物(undefined animal mucosalmixture)，无法明确分离功能菌和杂菌，因此无法明确主要菌群的组成以及其比例，产品的稳定性较差，会明显导致小动物肠道的应激反应，比如腹泻等现象。

由于目前该技术运用领域内尚存在若干需要解决的问题，例如，产品抗菌作用的稳定性，产品的质量稳定性，以及保证产品的发挥最佳抗菌作用所对应的、具体的产品使用方法等，因此，需要针对现有技术中存在的问题开发一种抗菌作用稳定性高，产品质量稳定性高，不会导致小动物肠道应激反应的，能促进动物生长的，能保证畜禽产品的食品安全的新产品及其生产工艺。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有稳定的抗菌作用和产品性能的动物用生物制剂，具体来讲即一种粘膜发酵菌剂，可替代常规用于畜禽的饲养和保健的抗生素，既改善畜禽的整体健康，又降低畜禽产品上的人类食源性疾病的发生率，并减少药物残留的对人类的危害，以保障消费者的食品安全。

为实现上述发明目的，本发明所提供的粘膜发酵菌剂，包括基料、辅料和菌种，其特征在于所述基料包含预先还原的厌氧细菌培养基、葡萄糖、氮化物、以及还原剂；所述菌种为选自于乳酸杆菌、乳酸片球菌、粪链球菌、枯草杆菌、双歧杆菌中的一种或者其多种的组合，其中的乳酸杆菌还可以包含选自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的一种或者其多种的组合。

本发明的粘膜发酵菌剂的优点在于，基于其所包含的正常菌种在肠道中的优先占位和底物竞争的原理，起到了排斥其他病原菌的定植的效果，并通过细菌间的相互作用产生了相应的抑菌性，更为有利的是，本发明的粘膜发酵菌剂还分离去除了部分影响其抗菌作用稳定性的杂菌，从而保证了抗菌作用及产品性能的稳定性。

根据本发明的一个方面，所述粘膜发酵菌剂的辅料中还包括用于防止病原菌交叉感染的抑制剂，所述抑制剂优选的是天然细菌素(bacteriocin)，通过天然细菌素的抑菌作用对菌群的平衡起到均衡作用，从而稳定产品的性能以及抗菌作用。

根据本发明的另一个方面，所述粘膜发酵菌剂还包括挥发性脂肪酸，其选自于丁酸、乙酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、戊酸、和异己酸中的一种或者其多种的组合。有利的是，所述挥发性脂肪酸可以改变肠道内环境的酸碱度，以达到抑制细菌定植的作用。

本发明的另一个目的是提供了一种制备所述粘膜发酵菌剂的方法，包含如下步骤：步骤一，从无特定性病原菌感染的动物体内取出一部分肠道，并进行清洗去除肠道内容物；步骤二，在厌氧环境中，从清洗过的肠道上切取一段肠粘膜；步骤三，将所取得的肠粘膜置于预先还原的厌氧培养基中进行初级培养；其特征在于步骤四，将步骤三获得的培养物置于一系列厌氧培养基中进行多级次培养以分离杂菌和获得菌种。其中所述多级次培养步骤可包括：将步骤三培养的混合物置于马血浆培养基中进行培养以分离杂菌；将步骤三培养的混合物置于MRS培养基中进行培养以分离出乳酸菌、乳酸片球菌；以及将步骤三培养的混合物顺序置于SBA培养基、血琼脂和bileesculin琼脂等进行多级次培养。

根据本发明的粘膜发酵菌剂的制备方法，有利地对培养物进行了多级培养，通过在一系列不同的次级培养基中进行次培养分别分离掉了杂菌、获取了所需的有用菌种，从而防止了病源菌交叉感染，使菌种的比例更为平衡和稳定，抗菌作用得以提高。

具体实施方式

本发明提供了一种粘膜发酵菌剂，用于在畜禽饲养过程中代替抗生素的使用，其成分主要包括基料、辅料和用于抑制病原菌的正常菌种。其中所述基料主要包含预先还原的厌氧细菌培养基、葡萄糖、氮化物以及还原剂等，该培养基可以是预先还原的心脑浸液的提取物，该提取液可以在市场上购得。

根据本发明的粘膜发酵菌剂，所述菌种选自于乳酸杆菌、乳酸片球菌、粪链球菌、枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、戊糖片球菌中的一种或者其组合。其中所述乳酸杆菌还可以包含选自于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的一个或者其组合。根据本发明粘膜发酵菌剂的一个优选实施例，其中至少包含六种以上所述菌种的组合。

根据本发明粘膜发酵菌剂的又一个实施例，该辅料中还可以加入其他添加剂，例如用于调节菌群比例稳定性的添加剂，以及防止病原菌交叉感染的抑制剂等。所述抑制剂包括，但不仅限于，天然细菌素(bacteriocin)，如尼生素(nisin)、小球菌素(pediocin)等经证明可应用于食品的细菌素。最新研究表明，细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，虽然细菌素是抵抗诸如单核细胞增生李斯特氏菌(L.monnocytogenes)等病原菌的抑菌剂，它们并不同于青霉素等抗生素；传统的多肽抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的，不存在结构基因，而细菌素由基因编码，可以通过基因工程的手加以改造。它们的合成及作用模式与临床使用的抗生素不同。而且对抗生素显示抗性的微生物通常不对细菌素显示交叉抗性，且与抗生素的抗性不一样，细菌素抗性通常不是由遗传决定的。经证明天然细菌素具有特定的抗菌活性，本发明利用其特定的抗菌作用，在制备过程中调节主要细菌组成成分的平衡。与此同时，本发明还利用了天然细菌素的抗菌活性，有效的抑制了特定病原菌的污染，如单核细胞增生李斯特氏菌。

优选的是，本发明的粘膜发酵菌剂中还包括挥发性脂肪酸，该挥发性脂肪酸由丁酸、乙酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、戊酸、异己酸中的一个或者其组合组成。挥发性脂肪酸在本发明的粘膜发酵菌剂中所起到的作用在于改变肠道内环境的酸碱度，以达到抑制细菌定植的作用。

另外，本发明的粘膜发酵菌剂中还包括其他辅料，举例来说，所述辅料中可以加入适当的改善肠道功能的糖类，如：寡糖(oligosaccharides)；又如还可以加入适当用于防止菌剂在速冻过程中被破坏的冷冻保护剂等。

试验证明，将本发明的粘膜发酵菌剂运用于畜禽饲养中，对畜禽的细菌性肠道和呼吸道病原菌的定植和增长具有抑制作用，改善了畜禽的整体健康，改善了畜禽的生产指标，降低了畜禽的生产成本，促进了养殖业的发展，同时，降低畜禽产品上的人类食源性疾病的发生率，减少药物残留的对人类的危害，保障了消费者的食品安全。其基本的作用机制是利用细菌间的占位和底物竞争的原理来排斥病原菌的定植，并且通过增加肠道内挥发性脂肪酸的含量，从而降低内环境的酸减度，以及通过细菌间的相互作用产生相应的抑菌性。

下面通过本发明的一些实验实例来说明其产品性能、抗菌作用及其稳定性：

实验实例一

方法

一日龄的雏鸡从商品孵化厂运送到实验室，放在27立方英尺带金属丝底的隔离鸡笼中，地面平养，正压通风并过滤空气。用来运鸡的纸垫都进行了细菌培养，以验证没有携带来源于孵化厂的沙门氏菌。每个鸡笼放8-12只雏鸡，自由采食饮水，室温维持在摄氏35度，5天的试验期内持续光照。鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，蒙得维的亚沙门氏菌(S.montevideo)和加里福尼压沙门氏菌(S.california)的耐萘啶酸菌株经过24小时培养，然后取同量的培养物混合，供攻毒使用。这些菌株都是在家禽上已知的可定植菌。试验分四个组，三个处理组和一个正对照组；每试验组有三个重复小组，每个小组有12只鸡。每组鸡隔离饲养。三个处理组包括：1)用全自动喷雾箱对鸡进行均匀喷雾；2)直接强饲到鸡的嗉囊中；3)两者结合使用。小鸡到达实验室后，在一个小时内用粘膜发酵菌剂处理。再过4个小时，就用沙门氏菌对每只鸡进行攻毒。第五天把试验鸡的盲肠被无菌摘取，把盲肠及其内容物溶解在缓冲溶液中。将样品稀释后，涂布在含萘啶酸的BG Sulfa琼脂(BGSN)表面，在摄氏37度培养20小时，计算菌落数。使用SAS统计软件中的一般线性模型和最小二乘法来检验数据，处理内的误差作为随机误差，显著性为P＜0.05。

实验结果

粘膜发酵菌剂对于小鸡的沙门氏菌定植频率和保护系数的影响

注解：

^ab肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)

¹沙门氏菌阳性样品/总的检测样品数量

²保护系数＝将对照小鸡的IF*值除以每个处理的IF值

*IF＝一个处理中所有鸡的每克盲肠内容物中的沙门氏菌数量的几何平均数

实验实例二

方法

一日龄的小公鸡从商品孵化厂运送到实验室，地面平养，正压通风，过滤空气。用来运送鸡只的纸垫都进行了细菌培养，以验证没有携带来源于孵化厂的沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，蒙得维的亚沙门氏菌(S.montevideo)和加里福尼压沙门氏菌(S.california)的耐萘啶酸菌株经过24小时培养的次培养菌作为攻毒菌株。饲料由乔治亚大学家禽科学系配制并提供的。本试验使用的是标准的肉鸡开食料(破碎料)和中雏料(颗粒料)，分别在孵化后的前三周和接下来的三周使用，自由采食。每个鸡笼大小为2.1米×2.4米，安装无缝钢板壁和门。试验开始前，饲养笼全面消毒，并在不锈钢地面上铺上大约10厘米厚的松木屑。舍温由正压过滤的循环空气来调控。日光灯持续照明，直到试验结束。随机选择108只小鸡，在到达后一小时内用粘膜发酵菌剂处理。处理方法是采用喷雾和在第一次饮水中添加的方法。喷雾时，平均剂量为0.5毫升/只。处理组和对照组的小鸡分开运送。一个处理组占两个鸡笼，每笼54只。用自来水将粘膜发酵菌剂稀释后装在一个消过毒的塑料壶中，放在处理组鸡笼的地上，六个小时后取走。以后就通过乳头饮水器自由饮用自来水。两个独立的鸡笼分别用来隔离和饲养24只接种鸡和12只未接种的鸡。接种鸡是在一日龄时用沙门氏菌进行攻毒的。攻毒24小时后，粘膜发酵菌剂处理组和正对照组的每个鸡笼中都放入6只接种过的鸡。所以，每笼中就有同日龄的鸡60只。每个负对照组的鸡笼中则放入6只未接种过的鸡。为了加以区别，这些鸡都作了颜色标记。攻毒4天后，用棉拭在泄殖腔取样分析，以确定所有的接种过的鸡都定植了沙门氏菌。通过在第7天和第42天的粪样分析来确定各组是否定植了沙门氏菌。42天时，对每笼鸡逐个称重，并按笼结料，计算每组的平均体重和平均饲料效率。饲料效率等于每笼鸡的总体重与总耗料量的比值。分别在第7天和第42天时，随机在每个鸡笼的地面上取10个粪样，用含萘啶酸的BG Sulfa琼脂选择性分离三种耐萘啶酸的沙门氏菌，并计算其数量。使用一般线性模型进行变量分析，试验使用完全随机的分组设计，用以检验粘膜发酵菌剂对体重和饲料转化率的主要作用。处理内的误差作为随机误差，显著性为P＜0.05。

实验结果

第7天和第42天各组的沙门氏茵定植水平(log₁₀)

注解：^ab肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)

第42天各组鸡的平均体重和饲料效率(体重/耗料量)

注解：

^*MCE处理组＝用MCE处理过的处理

正对照组＝只用沙门氏茵攻毒过的处理

负对照组＝没有经过以上两种处理的处理

^**标准差

^ab肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)

实验实例三

方法

入雏数量：34800只，分六栋饲养。粘膜发酵菌剂使用方法：在入雏前三天投服常规抗生素；停药后12个小时内，饮水使用粘膜发酵菌剂。防疫程序：

1日龄：ND+AI-K颈皮下注射；ND+IB-L喷雾；

9日龄：ND+IB-L饮水；

15日龄：IBD-L饮水；

20日龄：ND+IB饮水。

用药程序：

1日龄：头孢注射；

1-3日龄：普杆仙；

10-12日龄：增效梅里米先；

22-24日龄：慢呼快好。

实验结果

交鸡成绩

入雏数量	34800只	交鸡数量	33992只	成活率	97.68％
						只均重	2.12公斤	料肉比	1.91	饲养天数	39天
只均药费	0.71元	全场利润	61366	只均利润	1.81元

在本次饲养过程中没有发生过任何肠道疾病，也没有使用任何防治肠道疾病的药物。因此，粘膜发酵菌剂的使用对预防肠道疾病的发生起到了明显的效果，增强了鸡群体质，提高了鸡群的抗病能力，减少了抗生素及其他药物的使用，减轻了工作人员的工作强度。通过减少药物使用，降低了该场的生产成本。

下面介绍本发明的粘膜发酵菌剂产品的具体制备方法。根据本发明，该粘膜发酵菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：以无菌的方法，从无特定性病原菌感染的雄性动物体内取出一段小肠，并用生理盐水彻底清洗去除肠道内容物；

步骤二：在厌氧环境中，用特制粘膜刮取器从清洗过的肠道上刮取一段的粘膜层组织；

步骤三：将所取得的肠粘膜置于一种特定的厌氧培养基中进行初级培养，该特定的厌氧培养基为预先还原的心脑浸液的提取物。

步骤四：将步骤三培养的混合物置于一系列相应的厌氧培养基中进行次级培养、进行杂菌分离并获取所需菌种；

步骤五：将步骤四所获得的培养物在厌氧环境中，在摄氏30到40度下培养6至12个小时，优先的是在摄氏38度下培养8小时左右；

步骤六：在步骤五获得的培养物中添加适量的辅料和其它添加剂；

步骤七：将步骤六获得的产物在厌氧环境里进行速冻、保存。

在上述生产工艺过程中，无特定性病原菌感染的雄性动物是指三代内没有感染过特定性病原菌(如，沙门氏菌、空场弯曲菌、产气梭菌、溶血性大肠杆菌等)的成年雄性动物，比如公鸡。

可选择的是，在步骤四中，可将步骤三培养的混合物置于马血浆培养基中进行培养以分离杂菌，还可以将步骤三培养的混合物置于MRS培养基中进行培养以分离乳酸菌、乳酸片球菌，以及还可以将步骤三培养的混合物顺序置于SBA培养基、血琼脂和bileesculin琼脂中培养以分离粪链球菌。有利的是，通过这一系列次级培养，可以在分离所需菌种的同时有效地去除培养物中的病原性或非病原性微生物及有害物质，从而保证产品的抗菌作用和产品性能的稳定性。

在进行步骤五之前，每次培养均需要对培养物先进行化验，以防出现沙门氏菌，空肠弯曲菌等病原菌。可以使用现有的所有有效的微生物学方法来进行，比如，系列特定培养基的稀释法等。

在步骤六中，添加适量的辅料包括寡糖类和有机酸等，有利于减少小动物肠道的应激反应，保护小动物肠道的正常功能。所添加剂还可以包括防腐剂和抗冻剂等，防腐剂可有利于防止生产过程中的杂菌污染，防冻剂可以防止在产品冷冻保存过程中破化菌种的活性。特别是，还可以包括特殊的天然添加剂，天然细菌素，有利于稳定和平衡产品的细菌比例。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同更换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种粘膜发酵菌剂，包括基料、辅料和菌种，其特征在于

所述基料包含预先还原的厌氧细菌培养基、葡萄糖、氮化物和还原剂；以及

所述菌种为选自于乳酸杆菌、乳酸片球菌、粪链球菌、枯草杆菌、双歧杆菌中的一种或者其多种的组合，其中的乳酸杆菌还可以包含选自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)中的一种或者其多种的组合。

2.根据权利要求1所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述粘膜发酵菌剂的辅料包括用于防止病原菌交叉感染的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述抑制剂为天然细菌素(bacteriocin)。

4.根据权利要求1所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述粘膜发酵菌剂还包括挥发性脂肪酸。

5.根据权利要求4所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述挥发性脂肪酸选自于丁酸、乙酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、戊酸、和异己酸中的一种或者其多种的组合。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述粘膜发酵菌剂的辅料包括能改善肠道功能的糖类。

7.根据权利要求6所述的粘膜发酵菌剂，其特征在于所述糖类为寡糖(oligosaccharides)。

8.一种制备粘膜发酵菌剂的方法，包含以下步骤：

步骤一：从无特定性病原菌感染的动物体内取出一部分肠道，并彻底清洗去除肠道内容物；

步骤二：在厌氧环境中，从清洗过的肠道上切取一段肠粘膜；

步骤三：将所取得的肠粘膜置于预先还原的初级厌氧培养基中进行初级培养以得到初级混合物；其特征在于

步骤四：将步骤三培养的初级混合物置于一种以上次级厌氧培养基中进行次培养以分离杂菌并获得菌种。

9.根据权利要求8所述的制备粘膜发酵菌剂的方法，其特征在于所述次培养步骤包括：

将步骤三培养的初级混合物置于马血浆培养基中进行培养以分离杂菌。

10.根据权利要求8所述的制备粘膜发酵菌剂的方法，其特征在于所述次培养步骤包括：

将步骤三培养的初级混合物置于MRS培养基中进行培养以分离出乳酸菌、乳酸片球菌。

11.根据权利要求8所述的制备粘膜发酵菌剂的方法，其特征在于所述次培养步骤包括：

将步骤三培养的混合物顺序置于SBA培养基、血琼脂和bileesculin琼脂中培养以分离出粪链球菌。

12.根据权利要求8至11所述的任意一项的制备粘膜发酵菌剂的方法，其特征在于还包括下面步骤：

将步骤四所获得的培养物在厌氧环境中在摄氏30到40度的温度下培养6至12个小时。