JPH11246429A - 薬用植物由来の抗腫瘍性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍細胞に対し選択的増殖抑制活性を有する
抗腫瘍性物質の提供。 【解決手段】 薬用植物（例えば、ヨモギ、セイヨウタ
ンポポ、ツクシ、スギナ、オオシマザクラ、ソメイヨシ
ノ、ワラビ）由来の抗腫瘍性物質である。高分子活性物
質は、透析膜による測定で分子量が３，５００以上であ
り、９０％硫酸アンモニウムによって塩析され、加熱処
理によって活性が低下する。低分子活性物質は、透析膜
による測定で分子量が３，５００以下であり、有機溶媒
抽出され、中性または酸性物質であり、ＨＰＴＬＣによ
り適当な溶媒系で展開して分離できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、腫瘍細胞に対する選択的増殖抑制活性を有す
る薬用植物由来の抗腫瘍性物質およびそれを含む医薬に
関する。

【０００２】背景技術 植物の抗腫瘍性物質に関する研究は多く行われ、また、
これに関する報告がなされている（V.L.Sparnins et al
., Carcinogenesis , 9 ,131(1988); M.J.Wargovich e
t al ., Cancer Research ,48 ,6872(1988); M.Murakos
hi et al ., Cancer Research ,52 ,6583-6587(1992);
G.D.Stoner et al ., Cancer Research,51 ,2063(199
1); Y.Zhang et al ., Proc . Natl. Acad. Sci . USA
,91 ,3147(1994) など）。その種類は多岐に渡り、様
々な有機化合物が報告されている。それらの作用もイン
ビボ、すなわち担癌マウスを用いた試験法により評価さ
れるところの宿主仲介性の働きによるものであった。

【０００３】一方、最近では、インビトロでの培養細胞
を用いた試験法で腫瘍細胞に直接細胞毒性を示す植物も
知られている。例えば、高分子性物質としてはホウレン
ソウ（Spinacia oleacea L. ）の高分子画分（M.Kobori
et al ., Biosci .Biotech.Biochem.,57,1951(1993)）
などであり、低分子性物質としては、トウモロコシ（Ze
a mays L. ）の１３−ヒドロキシ−１０−オキソ−ト
ランス−１１−オクタデセン酸（１９９３年度日本農芸
化学会要旨集）や沢ワサビ（Eutrema wasabiMaxim. ）
の６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナート
（日本食品工学学会誌４３（１９９６）１０９２−１０
９７）などである。

【０００４】また、ＳＶ４０形質転換細胞を用いて腫瘍
細胞選択的増殖抑制活性が確認されたものとしては、純
コーン酢の抗腫瘍性画分（１９８９年度日本農芸化学会
要旨集）があるが、物質の特定はされていない。

【０００５】更にまた、熊本女子大学学術紀要,vol.46,
pp95-105&pp189-196(1994)にはツクシ由来の低分子化合
物（例えば、フラボノイド）が抗腫瘍活性を有すること
が報告されているが、高分子画分に関してはそのような
報告はなされていない。また、Jeong J. Y. et al., Ar
ch Pharmacal. Res., Vol.14, No.1, pp68-72(1991)に
はタンポポ由来の抗腫瘍性物質が記載されているが、こ
れは多糖類であった。

【０００６】

【発明の概要】本発明者らは、今般、ツクシ（Equisetu
m arvense）、スギナ（Equisetum a rvense）、ワラビ
（Pteridium aquilinum）、セイヨウタンポポ（Taraxa
cum o fficinale ）の花の水性抽出物中、またはヨモギ
（Artemisia princeps ）、オオシマザクラ（Prunus
donarium）の葉、ソメイヨシノ（Prunus yedoensis ）
の葉、ワラビ（Pteridium aquilinum）の有機溶媒抽出
物中に高い抗腫瘍活性および腫瘍細胞に対する選択的増
殖抑制活性を有する物質を見い出した。本発明はかかる
知見に基づくものである。

【０００７】従って、本発明は、高い選択性を有する抗
腫瘍性物質、該抗腫瘍性物質を含む医薬組成物、および
該抗腫瘍性物質の製造法の提供をその目的とする。

【０００８】そして、本発明による抗腫瘍性物質のうち
高分子活性物質は、下記の性質（１）〜（３）を有する
薬用植物由来の物質である： （１）透析膜による測定で分子量が３，５００以上であ
る、（２）９０％硫酸アンモニウムにより塩析される、
（３）加熱処理により活性が低下する。

【０００９】本発明による抗腫瘍性物質のうち低分子活
性物質は、下記の性質（４）〜（７）を有する薬用植物
由来の物質である： （４）透析膜による測定で分子量が３，５００以下であ
る、（５）有機溶媒により抽出される、（６）中性また
は酸性物質である、（７）高性能薄層クロマトグラフィ
ー（ＨＰＴＬＣ）により適当な溶媒系で展開して、分離
できる。

【００１０】本発明による抗腫瘍性物質のうち高分子活
性物質はタンパク質性物質であり、低分子活性物質は中
性または酸性の有機化合物であると考えられ、これらは
いずれも優れた抗腫瘍活性を有する。従って、本発明に
よる化合物は医薬として有用である。

【００１１】

【発明の具体的説明】抗腫瘍性物質 本発明による抗腫瘍性物質は薬用植物を起源とする。本
発明において、「薬用植物」とは、医薬あるいは農薬の
原料となりうる草木をいう。

【００１２】薬用植物は、ユリ科、キク科、トクサ科、
オオバコ科、バラ科、ウラボシ科、またはユキノシタ科
の植物であることができる。良好な抗腫瘍活性を示す画
分を有する植物としては、例えば、キク科植物（例え
ば、ヨモギ（Artemisia princ eps ）、セイヨウタンポ
ポ（Taraxacum officinale ））、トクサ科植物（例え
ば、ツクシ（Equisetum arvense）、スギナ（Equisetu
m arvense））、バラ科植物（例えば、オオシマザクラ
（Prunus donarium）、ソメイヨシノ（Prunus yedoensi
s ））、ウラボシ科植物（例えば、ワラビ（Pteridium
aquilinum））が挙げられる。

【００１３】本発明による抗腫瘍性物質のうち透析膜に
よる測定で分子量が３，５００以上のものを高分子画分
または高分子活性物質と、透析膜による測定で分子量が
３，５００以下のものを低分子画分または低分子活性物
質と、それぞれいう。

【００１４】本発明による高分子活性物質は、水性溶媒
により薬用植物から抽出される。ここで、水性溶媒と
は、水、およびＰＢＳ溶液のような適当な無機酸塩また
は有機酸塩を含む緩衝液などを含む。

【００１５】本発明による高分子活性物質は、９０％硫
酸アンモニウム（好ましくは、４０〜８０％硫酸アンモ
ニウム）により塩析される。

【００１６】本発明による高分子活性物質は、ゲル濾過
法による推定分子量が約１００，０００であることがで
きる。

【００１７】本発明による高分子活性物質は、加熱処理
により抗腫瘍活性が低下する。従って、高分子活性物質
はタンパク質性であることが推定される。

【００１８】本発明による低分子活性物質は、有機溶媒
により抽出される。有機溶媒は、酢酸エチル、ｎ−ヘキ
サン、エーテル、クロロホルム、１−ブタノール、メタ
ノール、エタノールなどであることができる。

【００１９】本発明による低分子活性物質は、中性物質
または酸性物質である。ここで、「中性物質」とは、ｐ
Ｈ２〜４の酸性溶液およびｐＨ９〜１２のアルカリ性溶
液中に抽出されないものをいい、「酸性物質」とは、ｐ
Ｈ２〜４の酸性溶液中に抽出されないものをいう。

【００２０】中性物質である低分子活性物質は、高性能
薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）により酢酸エチ
ル：ｎ−ヘキサン＝９３：７で展開した場合、ＨＰＴＬ
ＣによるＲｆ値が０．６０、０．８５、および０．９５
であることができる。また、有機溶媒は、酢酸エチル、
ｎ−ヘキサン、エーテル、クロロホルム、メタノール、
またはエタノールであることができる。中性物質である
低分子活性物質は、キク科植物（例えば、ヨモギ）由来
であることができる。

【００２１】酸性物質である低分子活性物質は、高性能
薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）により酢酸エチ
ル：メタノール：酢酸＝８：１：１で展開した場合、Ｈ
ＰＴＬＣによるＲｆ値が０．７０〜０．９５、好ましく
は、０．９２、であることができる。また、有機溶媒
は、１−ブタノール、メタノール、またはエタノールで
あることができる。酸性物質である低分子活性物質は、
バラ科植物（例えば、オオシマザクラ、ソメイヨシノ）
由来であることができる。

【００２２】本発明の抗腫瘍活性は、後述するようにマ
ウス正常細胞（例えば、胎児由来繊維芽細胞）をＤＮＡ
腫瘍ウィルス（例えば、パポーバウィルス科）で形質転
換した細胞（腫瘍細胞）を用い、腫瘍細胞に対する選択
的増殖抑制活性を測定することによって確認できる。こ
こで、「抗腫瘍活性を有する」とは、腫瘍細胞に対して
増殖抑制活性を示し、かつ正常細胞よりも腫瘍細胞に対
して増殖抑制活性を示すことをいう。

【００２３】ヨモギ、セイヨウタンポポ、ツクシ、スギ
ナ、オオシマザクラ、ソメイヨシノ、ワラビ由来の物質
は高い抗腫瘍活性を示し、選択比が２．０以上である。
特に、高分子活性物質のＢＡＬＢ系細胞における選択比
は７０以上であり、Ｓｗｉｓｓ系細胞における選択比は
９以上であることができる。また、低分子活性物質のＳ
ｗｉｓｓ系細胞における選択比は３．０以上であること
ができる。正常細胞のＩＣ₅₀値を腫瘍細胞のＩＣ₅₀値で
除した値を「選択比」とし、これを選択性の指標とし
た。選択比の大きさは副作用の低さの指標となる。

【００２４】抗腫瘍性物質の製造法 本発明による抗腫瘍性物質の取得は、高分子活性物質の
場合、基本的には薬用植物を水性溶媒抽出に付し、硫酸
アンモニウムにより塩析し、透析により分子量３，５０
０以上の画分を回収することで得ることができる。低分
子活性物質の場合、基本的には薬用植物を水性溶媒抽出
に付し、透析により分子量３，５００以下の画分を回収
し、さらに有機溶媒（例えば、酢酸エチル、１−ブタノ
ール）で抽出することで目的物を得ることができる。

【００２５】抽出の対象となる薬用植物は、抽出効率を
考慮すれば抽出材料としては細かく破砕したものである
ことが好ましい。

【００２６】本発明による抗腫瘍性物質の製造法は、下
記のようにして行うことができる。まず、生、もしくは
冷凍した薬用植物（冷凍したものの場合は解凍する）を
ホモジナイザーなどで破砕し、これを適当量（好ましく
は３倍量程度）の水性溶媒を加えて適当な時間、例えば
数分間程度氷冷下で撹拌抽出する。この場合、「水性溶
媒」とは水を主体とした溶媒であり、水あるいはＰＢＳ
溶液のような適当な無機酸塩または有機酸塩を含む緩衝
液（好ましくはｐＨ７程度）を指す。抽出物を低温下
（好ましくは４℃程度）で遠心分離（通常１０，０００
〜４０，０００×ｇ、１０〜４５分の条件）し、粗抽出
液を得る。

【００２７】高分子活性物質の場合、この粗抽出液につ
いて硫酸アンモニウムを適当量（好ましくは９０％飽
和）加えて溶解して塩析し、遠心分離（通常１０，００
０〜４０，０００×ｇ、１０〜４５分の条件）により沈
殿物を得る。この沈殿物を少量の水性溶媒に懸濁させ、
分画分子量３，５００〜１０，０００程度の透析膜（好
ましくは約３，５００）を用いて低温下（好ましくは４
℃程度）で水性溶媒に対して適当な時間、好ましくは一
昼夜程度外液を交換しながら透析する。この透析内容物
を回収して目的物を得ることができる（図１参照）。

【００２８】低分子活性物質の場合、粗抽出物について
分画分子量３，５００の透析膜を用いて、低温下（好ま
しくは１〜１０℃程度）で水に対して適当な時間、好ま
しくは一昼夜程度外液を数回交換しながら透析する。透
析外液を、例えば、真空ポンプとロータリーエバポレー
ターにより常温下（好ましくは３５℃以下）で減圧濃縮
し、低分子画分を得る。

【００２９】この低分子画分を塩酸で酸性（好ましくは
ｐＨ３程度）にし、分液漏斗に移して酢酸エチルで抽出
し、水相に含有の塩基性物質が混入しないようにして酢
酸エチル相を得る。この酢酸エチル相からアルカリ性水
溶液（好ましくはｐＨ９程度の炭酸水素ナトリウム水溶
液およびｐＨ１２程度の水酸化ナトリウム水溶液）で酸
性物質を抽出し、再び塩酸で酸性（好ましくはｐＨ３ま
たはｐＨ６程度）にして酢酸エチルまたは１−ブタノー
ルで抽出し、この酢酸エチルまたは１−ブタノールを留
去して目的物（強・弱酸性画分）を得ることができる。
また、このアルカリ性水溶液で酸性物質を抽出して残っ
た酢酸エチル相について、酢酸エチルを留去して、目的
物（中性画分）を得ることができる（図２参照）。

【００３０】さらに、これらの中性画分または強・弱酸
性画分を高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）
に供試し、適当な有機溶媒（中性画分の場合、好ましく
は酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９３：７の溶液、強・弱
酸性画分の場合、好ましくは酢酸エチル：メタノール：
酢酸＝８：１：１の溶液）で適当な距離（好ましくは６
ｃｍ程度）だけ展開し、波長２５３６オングストローム
または３６５０オングストロームの紫外線を照射して検
出してＲｆ値（目的物の展開距離を展開に使用した有機
溶媒の展開距離で除した値）を求め、そのＲｆ値を示す
検出物を掻き取り、適当な有機溶媒（好ましくはメタノ
ール）で抽出してその有機溶媒を留去し、目的物を得る
ことができる（図３参照）。

【００３１】これらの目的物は、必要に応じてカラムク
ロマトグラフィーなどの精製手段によって更に純度を増
加させることができる。

【００３２】このようにして得られる目的物は、前記し
たような（１）〜（７）の物理化学的性質を有し、抗腫
瘍活性を有している（後記実施例参照）。

【００３３】抗腫瘍活性の測定は、一般的に行われてい
る方法、例えば腫瘍を移植したマウスを用いる方法（Ki
kuo Nomoto,Chikao Yoshikumi,Kenichi Matunaga,Takay
oshiFujii and Kenji Takeya “Restoration of Antibo
dy-forming Capacities byPS-K in Tumor-bearing Mic
e”Gann 66 (1975)365-374 ）によってインビボで行う
ことができる。しかし、腫瘍ウィルスで形質転換させた
動物細胞を用いてインビトロで細胞増殖抑制活性を測定
することにより、研究に要する設備、費用あるいは時間
などの点においてインビボ法と比較して著しく有利とな
る。インビトロでの細胞増殖抑制活性の測定方法の好ま
しい例は、実施例２に記載される。

【００３４】なお、本発明による抗腫瘍性物質を後記の
抗腫瘍剤として使用する場合、通常は、高分子活性物質
として、薬用植物の水性抽出物から硫酸アンモニウムに
よる塩析により得たものを用い、低分子活性物質とし
て、薬用植物の水性抽出物から透析により低分子画分を
回収し、酢酸エチル抽出したもの、あるいは高性能薄層
クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）により得たものを用
いる。しかし、必要があれば、高分子活性物質として、
薬用植物の水性抽出物から透析により高分子画分を回収
して得たもの、低分子活性物質として、薬用植物の水性
抽出物から酢酸エチルまたは１−ブタノールで抽出した
もの、あるいはその抽出物から、高性能薄層クロマトグ
ラフィー（ＨＰＴＬＣ）または薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）により得たものを用いることができる（後記
実施例参照）。後者は大量精製の観点から有利である。

【００３５】用途／医薬組成物 以上のように、本発明による抗腫瘍性物質は、腫瘍細胞
に対する選択的増殖抑制活性を有する。従って、本発明
の他の面によれば、この抗腫瘍性物質を含む医薬組成物
が提供される。

【００３６】本発明による医薬組成物は、悪性腫瘍（例
えば、子宮頚がん、外陰がん、陰茎がん、喉頭がん、お
よび皮膚がんなど）の治療に用いることができる。

【００３７】本発明による医薬組成物は、また、経口ま
たは非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投与、直腸
投与、経皮投与、経鼻投与、舌下投与など）することが
でき、薬剤として経口または非経口投与に適した種々剤
型で、ヒトおよびヒト以外の動物に使用される。薬剤と
して直接患部に到達させる方法（例えば、局所的に溶解
する錠剤、塗布、注射など）が有効であると考えられる
が、これらに限定されるものではない。

【００３８】本発明による抗腫瘍性物質は、例えば、そ
の用途に応じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸
剤、細粒剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注
などの注射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤な
どのいずれかの製剤に処方することができる。これらの
各種製剤は、賦形剤（例えば、増量剤および充てん
剤）、補助剤（例えば、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表
面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、および溶解補助
剤）、および添加剤（例えば、保存剤、矯味矯臭剤、無
痛化剤、安定化剤、着色剤、および甘味剤）を用いて常
法により製造することができる。

【００３９】種々の治療のための投与量は、用法、患者
の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜決定でき
る。

【００４０】

【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４１】実施例１：試験物質の抽出 採取した薬用植物１１種（１４部分、表１参照）それぞ
れ３０ｇをホモジナイザーで破砕し、これに３倍量の蒸
留水を加え数分間撹拌抽出した。破砕液を低温下（４
℃）で遠心分離（３６，０００×ｇ、１５分）し、粗抽
出液を得た（第一次スクリーニング用試料）。

【００４２】この粗抽出液について、分画分子量３，５
００の透析膜（スペクトラ／ポア３、ＳＰＥＣＴＲＵＭ
社製）を用いて低温下（４℃）で水に対して８時間、２
回透析した。透析外液を真空ポンプとロータリーエバポ
レーターを用いて常温下（３０℃）で減圧濃縮し、低分
子画分を得た（第二次スクリーニング用試料）。透析内
液はそのまま回収して高分子画分とした（第二次スクリ
ーニング用試料）。

【００４３】＜高分子画分の分離操作＞第二次スクリー
ニングの結果、高分子画分に活性が存在することが判明
した薬用植物（ツクシ、スギナ、ワラビ、セイヨウタン
ポポの花）の粗抽出液に硫酸アンモニウムを９０％飽和
となるように溶解し、遠心分離により沈殿を得た。これ
を分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ／ポア
３、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製）を用いて、低温下（４℃）
で水に対して一昼夜透析し、硫酸アンモニウムを除き、
硫安沈殿画分を得た。

【００４４】ツクシについては、更に次の操作を行っ
た。粗抽出液に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよ
うに溶解し、遠心分離により沈殿（０−４０％飽和硫安
沈殿画分）と上清を得た。この上清に硫酸アンモニウム
を８０％飽和となるように溶解し、遠心分離により沈殿
（４０−８０％飽和硫安沈殿画分）を得た。それぞれの
沈殿を分画分子量３，５００の透析膜（スペクトラ／ポ
ア３、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製）を用いて、低温下（４
℃）で水に対して一昼夜透析し、硫酸アンモニウムを除
き、硫安沈殿画分を得た。

【００４５】＜低分子画分の分離操作＞第二次スクリー
ニングの結果、低分子画分に活性が存在することが判明
した薬用植物（ヨモギ、オオシマザクラの葉、ソメイヨ
シノの葉、ワラビ）について、それらの低分子画分を塩
酸で酸性（ｐＨ３）にし、分液漏斗に移して酢酸エチル
で抽出し、酢酸エチル相（酸性画分、中性画分）を得
た。このとき得られた水相を１０％水酸化ナトリウム水
溶液でアルカリ性（ｐＨ１２）にし、酢酸エチルで抽出
して水相（両性画分）と酢酸エチル相（塩基性画分）を
得た。一方、酢酸エチル相（酸性画分、中性画分）から
アルカリ性水溶液（５％炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐ
Ｈ９））で強酸性画分を分離し、更に、５％水酸化ナト
リウム水溶液（ｐＨ１２）で弱酸性画分を分離し、それ
ぞれ塩酸で酸性にした後、酢酸エチルまたは１−ブタノ
ールで抽出し、その酢酸エチルまたは１−ブタノールを
留去して強・弱酸性画分を得た。最後に残った酢酸エチ
ル相の酢酸エチルを留去して中性画分を得た。溶媒抽出
による分画は図２に示される通りである。

【００４６】ヨモギの中性画分をエタノールに溶解し、
高性能薄層プレート（ＨＰＴＬＣプレート シリカ ゲ
ル ６０ Ｆ₂₅₄ 、サイズ１０ｃｍ×１０ｃｍ、ＭＥＲ
ＣＫ社製）を用いた高性能薄層クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＴＬＣ）にかけ、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９３：
７（v/v ）の有機溶媒で６ｃｍ展開し、風乾した後、２
５３６オングストロームまたは３６５０オングストロー
ムの紫外線を照射して検出してＲｆ値を求め、そのＲｆ
値を示す検出物を掻き取り、メタノールで抽出してその
メタノールを留去し、ＨＰＴＬＣ分離サンプルとした。
ＨＰＴＬＣの結果は図５に示される通りであった。

【００４７】オオシマザクラの葉、ソメイヨシノの葉の
弱酸性画分およびソメイヨシノの葉の強酸性画分を５０
％エタノール水溶液に溶解し、上記と同様にＨＰＴＬＣ
にかけ、酢酸エチル：メタノール：酢酸＝８：１：１
（v/v ）の有機溶媒で６ｃｍ展開し、風乾した。その
後、２５３６オングストロームまたは３６５０オングス
トロームの紫外線を照射してＲｆ値を求め、そのＲｆ値
を示す検出物を掻き取り、メタノールで抽出してそのメ
タノールを留去し、ＨＰＴＬＣ分離サンプルとした。Ｈ
ＰＴＬＣの結果は図６に示される通りであった。

【００４８】実施例２：薬用植物由来の各種抽出物の抗
腫瘍活性測定 マウス胎児繊維芽細胞３Ｔ３（３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ ａ
ｌｂｉｎｏ、スイスアルビノマウス由来、理研ジーンバ
ンク（理化学研究所内））、ＢＡＬＢ／３Ｔ３（ＢＡＬ
Ｂ／３Ｔ３ ｃｌｏｎｅ Ａ３１、ＢＡＬＢ／ｃマウス
由来、理研ジーンバンク）、およびこれらをパポーバウ
ィルス ＳＶ４０で形質転換させた３Ｔ３−ＳＶ４０
（理研ジーンバンク）、ＢＡＬＢ／３Ｔ３−ＳＶ４０
（理研ジーンバンク）を１０％仔ウシ血清含有の培地
（ダルベッコ改変イーグル培地）に２×１０⁴ 個／ｍｌ
となるように蕃種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ₂ 下
に培養した。ここに、実施例１で調製した各薬用植物抽
出物の水溶液または１０％エタノール水溶液を加えてさ
らに４８時間培養し、このときの細胞数を前記のＭＴＴ
法により測定した。

【００４９】ＭＴＴ法は、下記のように行った。まず、
測定の４時間前に細胞にＭＴＴ（３−（４，５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラ
ゾリウム臭素）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ溶
液：１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，８．
１ｍＭ リン酸一水素ナトリウム，１．５ｍＭ リン酸
二水素カリウム（ｐＨ７．３〜７．６））を加えて更に
４時間培養した。次いで、培養上清を除いた後に塩酸酸
性（０．０４Ｎ）イソプロパノール−３％ＳＤＳ水溶液
を加えて生細胞のミトコンドリアの作用により生成した
ホルマザンを溶解した後、溶液の５９５ｎｍの吸光度
（対照６５５ｎｍ）を測定した（Tim Mosmann “Rapid
Colorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva
l: Application to Proliferation and Cytotoxity Ass
ays ”Journal of Immunological Methods 65 (1983)55
-63; Lora M.Green,Jeanne L.Reade and Carl F.Ware
“RapidColormetric Assay for Cell Viability: Appli
cation to the Quantitation ofCytotoxic and Growth
Inhibitory Limphokines”Journal of Immunological M
ethods 70 (1984)257-268 を参照）。

【００５０】試験物質の試料濃度を数点とり、コントロ
ールの細胞数に対し５０％の増殖阻害を示す試料濃度を
ＩＣ₅₀値として表した。更に、正常細胞のＩＣ₅₀値を腫
瘍細胞のＩＣ₅₀値で除した値（選択比）を抗腫瘍活性の
評価の指標とした。試料濃度はタンパク質濃度または乾
固重量濃度として表した。抗腫瘍性試験の結果は、表１
〜６に示される通りであった。

【００５１】

【表１】 第一次スクリーニングの結果を示す。野草１１種類１４
部分のうち７種類７部分において抗腫瘍活性が認められ
た。

【００５２】

【表２】 第二次スクリーニングの結果を示す。ツクシ、スギナ、
ワラビ、およびセイヨウタンポポ（花）由来の高分子画
分（分子量３，５００以上）並びにヨモギ、オオシマザ
クラ（葉）、ソメイヨシノ（葉）、およびワラビ由来の
低分子画分（分子量３，５００以下）において高い選択
性が認められた。

【００５３】

【表３】 ツクシ、スギナ、ワラビ、およびセイヨウタンポポ
（花）由来の硫安沈殿物の抗腫瘍活性を示す。ツクシ、
スギナ、ワラビ、およびセイヨウタンポポ（花）由来の
硫安沈殿物は、スイスアルビノ系、ＢＡＬＢ／ｃ系のい
ずれかにおいて腫瘍細胞に対する増殖抑制活性および
２．０を超える高い選択比を示した。

【００５４】

【表４】 ツクシ由来の４０−８０％飽和硫安沈殿画分の抗腫瘍活
性を示す。ツクシ由来の４０−８０％飽和硫安沈殿画分
は、スイスアルビノ系、ＢＡＬＢ／ｃ系の両細胞におい
て腫瘍細胞に対する増殖抑制活性および９．０を超える
極めて高い選択比を示した。

【００５５】

【表５】 ヨモギ、オオシマザクラ、ソメイヨシノ、およびワラビ
由来の低分子画分の抗腫瘍活性を示す。ヨモギ由来の中
性画分、オオシマザクラ（葉）由来の弱酸性画分、ソメ
イヨシノ（葉）由来の強・弱酸性画分、ワラビ由来の弱
酸性画分は、スイスアルビノ系、ＢＡＬＢ／ｃ系のいず
れかにおいて腫瘍細胞に対する増殖抑制活性および１．
０を超える選択比を示した。

【００５６】

【表６】 ヨモギ、オオシマザクラ、およびソメイヨシノ由来の低
分子画分を更にＨＰＴＬＣ分離したサンプルの抗腫瘍活
性を示す。ヨモギ由来の中性画分、オオシマザクラ由来
の弱酸性画分、ソメイヨシノ由来の強・弱酸性画分のＨ
ＰＴＬＣ分離サンプルは、スイスアルビノ系において
１．８以上の高い選択比を示した。

【００５７】実施例３：薬用植物由来の硫安沈殿画分の
加熱処理による影響 実施例１に記載のように分離した由来の硫安沈殿画分を
沸騰水中で１０分間加熱し、冷却後、ＢＡＬＢ系細胞
（ＢＡＬＢ／３Ｔ３ ｃｌｏｎｅ Ａ３１およびＢＡＬ
Ｂ／３Ｔ３−ＳＶ４０）またはＳｗｉｓｓ系細胞（３Ｔ
３−Ｓｗｉｓｓａｌｂｉｎｏおよび３Ｔ３−ＳＶ４０）
を用いて実施例２に記載のように細胞増殖抑制活性を測
定した。その結果、各薬用植物の硫安沈殿画分の活性
は、加熱処理により著しく低下した。

【００５８】実施例４：ツクシ由来の硫安沈殿画分のゲ
ル濾過による分子量測定 薬用植物由来の硫安沈殿画分の中で最も活性の強かった
ツクシ由来の硫安沈殿画分について、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル濾過を行った。活性
成分の分子量を推定するための標準タンパク質として、
チログロブリン（分子量６６９，０００）、アルコール
脱水素酵素（分子量１５０，０００）、ウシ血清アルブ
ミン（分子量６７，０００）、オボアルブミン（分子量
４５，０００）、リボヌクレアーゼＡ（分子量１４，０
００）を用い、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ_XLカラ
ム（東ソー社製）にて分画した。各フラクションを実施
例２に記載のようにＢＡＬＢ系細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３
ｃｌｏｎｅ Ａ３１およびＢＡＬＢ／３Ｔ３−ＳＶ４
０）またはＳｗｉｓｓ系細胞（３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓａｌ
ｂｉｎｏおよび３Ｔ３−ＳＶ４０）を用いて細胞増殖抑
制活性を測定した。その結果、強い活性が分子量約１０
０，０００のフラクションに見いだされた。このことか
ら、抗腫瘍性物質の分子量は約１００，０００と推定さ
れた。

【図面の簡単な説明】

【図１】薬用植物からの硫安塩析物の分離法の概略を示
した図である。

【図２】低分子画分からの酢酸エチル抽出分画物の分離
法の概略を示した図である。

【図３】ＨＰＴＬＣ分離サンプルの調製法の概略を示し
た図である。

【図４】抗腫瘍活性の測定法の概略を示した図である。

【図５】薬用植物から酢酸エチル抽出した中性画分をＨ
ＰＴＬＣにかけた結果を示した図である。黒く塗りつぶ
した部分はＳｗｉｓｓ系細胞において抗腫瘍活性を有す
るスポットを示す。左側の数字はＲｆ値を示し、右側の
数字は選択比を示す。展開溶媒として酢酸エチル−ｎ−
ヘキサン（９３：７）を用いた。

【図６】薬用植物からブタノール抽出した強・弱酸性画
分をＨＰＴＬＣにかけた結果を示した図である。黒く塗
りつぶした部分はＳｗｉｓｓ系細胞において抗腫瘍活性
を有するスポットを示す。左側の数字はＲｆ値を示し、
右側の数字は選択比を示す。展開溶媒として酢酸エチル
−メタノール−酢酸（８：１：１）を用いた。Ａ：オオ
シマザクラ弱酸性画分、Ｂ：ソメイヨシノ弱酸性画分、
Ｃ：ソメイヨシノ強酸性画分。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 本 間 順 子 埼玉県春日部市赤沼堂面410 株式会社桃 屋研究所内

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の性質（１）〜（３）を有する薬用植
   物由来の抗腫瘍性物質： （１）透析膜による測定で分子量が３，５００以上であ
   る、（２）９０％硫酸アンモニウムにより塩析される、
   （３）加熱処理により活性が低下する。
2. 【請求項２】４０〜８０％硫酸アンモニウムにより塩析
   される、請求項１に記載の抗腫瘍性物質。
3. 【請求項３】ゲル濾過法による推定分子量が約１００，
   ０００である、請求項１に記載の抗腫瘍性物質。
4. 【請求項４】薬用植物が、トクサ科植物、ウラボシ科植
   物、およびキク科植物からなる群から選択される、請求
   項１に記載の抗腫瘍性物質。
5. 【請求項５】薬用植物が、ツクシ（Equisetum arvens
   e）、スギナ（Equisetum arvense）、ワラビ（Pteridi
   um aquilinum）、およびセイヨウタンポポ（Taraxacum
   off icinale ）からなる群から選択される、請求項１
   に記載の抗腫瘍性物質。
6. 【請求項６】薬用植物がツクシ（Equisetum arvense）
   である、請求項１に記載の抗腫瘍性物質。
7. 【請求項７】ＢＡＬＢ系細胞における選択比が７０以上
   であり、Ｓｗｉｓｓ系細胞における選択比が９以上であ
   る、請求項１に記載の抗腫瘍性物質。
8. 【請求項８】ＤＮＡ腫瘍性ウイルスにより形質転換され
   たマウス胎児繊維芽細胞に対して抗腫瘍活性を示す、請
   求項１に記載の抗腫瘍性物質。
9. 【請求項９】下記の性質（１）〜（４）を有する薬用植
   物由来の抗腫瘍性物質： （１）透析膜による測定で分子量が３，５００以下であ
   る、（２）有機溶媒によって抽出される、（３）中性物
   質である、（４）高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ
   ＴＬＣ）により酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９３：７で
   展開して、分離できる。
10. 【請求項１０】ＨＰＴＬＣによるＲｆ値が０．６０、
    ０．８５、および０．９５である、請求項９に記載の抗
    腫瘍性物質。
11. 【請求項１１】有機溶媒が、酢酸エチル、ｎ−ヘキサ
    ン、エーテル、クロロホルム、メタノール、およびエタ
    ノールからなる群から選択される、請求項９に記載の抗
    腫瘍性物質。
12. 【請求項１２】ｐＨ２〜４の酸性水溶液およびｐＨ９〜
    １２のアルカリ性水溶液中に抽出されない、請求項９に
    記載の抗腫瘍性物質。
13. 【請求項１３】薬用植物が、キク科植物である、請求項
    ９に記載の抗腫瘍性物質。
14. 【請求項１４】薬用植物が、ヨモギ（Artemisia princ
    eps ）である、請求項９に記載の抗腫瘍性物質。
15. 【請求項１５】Ｓｗｉｓｓ系細胞における選択比が３．
    ０以上である、請求項９に記載の抗腫瘍性物質。
16. 【請求項１６】ＤＮＡ腫瘍性ウイルスにより形質転換さ
    れたマウス胎児繊維芽細胞に対して抗腫瘍活性を示す、
    請求項９に記載の抗腫瘍性物質。
17. 【請求項１７】下記の性質（１）〜（４）を有する薬用
    植物由来の抗腫瘍性物質： （１）透析膜による測定で分子量が３，５００以下であ
    る、（２）有機溶媒によって抽出される、（３）酸性物
    質である、（４）高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ
    ＴＬＣ）により酢酸エチル：メタノール：酢酸＝８：
    １：１で展開して、分離できる。
18. 【請求項１８】ＨＰＴＬＣによるＲｆ値が０．７０〜
    ０．９５である、請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
19. 【請求項１９】ＨＰＴＬＣによるＲｆ値が０．９２であ
    る、請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
20. 【請求項２０】有機溶媒が、１−ブタノール、メタノー
    ル、およびエタノールからなる群から選択される、請求
    項１７に記載の抗腫瘍性物質。
21. 【請求項２１】ｐＨ２〜４の酸性水溶液中に抽出されな
    い、請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
22. 【請求項２２】薬用植物が、バラ科植物である、請求項
    １７に記載の抗腫瘍性物質。
23. 【請求項２３】薬用植物が、オオシマザクラ（Prunus d
    onarium ）またはソメイヨシノ（Prun us yedoensis）で
    ある、請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
24. 【請求項２４】Ｓｗｉｓｓ系細胞における選択比が３．
    ０以上である、請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
25. 【請求項２５】ＤＮＡ腫瘍性ウイルスにより形質転換さ
    れたマウス胎児繊維芽細胞に対して抗腫瘍活性を示す、
    請求項１７に記載の抗腫瘍性物質。
26. 【請求項２６】請求項１〜２５のいずれか一項に記載の
    抗腫瘍性物質を含む医薬組成物。
27. 【請求項２７】悪性腫瘍の治療に用いられる、請求項２
    ６に記載の医薬組成物。