KR102279105B1 - 대추나무 뿌리 추출물을 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

대추나무 뿌리 추출물을 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

대추나무 뿌리 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 대추나무 뿌리 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 조성물은 신장세포 손상 물질로부터 신장세포 사멸을 억제할 수 있어, 상기 추출물을 활용하면 효과적으로 신장 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있으므로, 상기 추출물을 유효물질로 포함하면 약학 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다. 또한, 상기 추출물의 분획물에 포함된 3-디하이드록시시노테트릭 산(dehydroxyceanothetric acid) 2-메틸 에스테르 화합물을 유효성분 역시 신장세포 보호 활성이 나타나므로, 상기 화합물을 포함하면 약학적 소재 또는 건강기능성 식품 소재로 효과적으로 활용이 가능하다.

Description

대추나무 뿌리 추출물을 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating renal disease comprising Zizyphus jujuba MILL extract}
대추나무 뿌리 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 대추나무 뿌리 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법 및 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
신장은 체내 대사산물 및 노폐물을 걸러서 소변으로 배출하는 주 기능 이외에 체내 수분량과 전해질, 산성도 등을 좁은 범위 안에서 일정하게 유지하는 생체 항상성 유지 기능, 그리고 혈압 유지, 빈혈 교정 및 칼슘과 인 대사에 중요한 여러 가지 호르몬을 생산하고 활성화시키는 내분비 기능 등을 갖는 기관이다. 이러한 신장 기능의 약화를 초래하는 신질환에는 사구체 신염, 만성 신부전, 급성 신부전, 신증후군, 신우신염, 신장결석, 신장암 등이 있다. 신장 기능의 악화가 진행되는 속도에 따라 크게 급성 신손상(AKI: acute kidney injury)과 만성 신질환(CKD: chronic kidney disease)으로 나눌 수 있다.
현대의학의 발전에도 불구하고 병원에 입원하는 많은 환자들이 신장 기능의 저하로 인하여 많은 고통을 받고 있으며, 특히 병의 중증도가 높은 환자는 신장 기능의 저하로 인하여 신대체요법이 필요한 경우가 많이 있다. 급성 신손상의 유병률은 입원환자의 약 5%에서, 중환자실에 입원하는 환자의 약 30-50%까지 보고되고 있으며 이러한 유병률은 새로운 치료법의 개발에도 불구하고 꾸준히 증가하고 있는 추세에 있다.
이와 같은 다양한 신장 질환 및 이의 기전 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 기존의 약물 치료의 경우 약품에 의한 위장 손상 등의 문제점들이 지적되고 있다. 따라서, 급속도로 증가하고 있는 신장질환을 치료하기 위해 위장 손상의 발생을 저해하면서 효율적으로 신장 세포를 보호할 수 있는 물질을 식물체로부터 개발하기 위한 노력이 많이 시도되고 있다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 대추나무 뿌리 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 대추나무 뿌리 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 조성물은 신장세포 손상 물질로부터 신장세포 사멸을 억제할 수 있어, 상기 추출물을 활용하면 효과적으로 신장 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있으므로, 상기 추출물을 조성물 내 유효물질로 포함하면 약학 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다. 또한, 상기 추출물의 분획물에 포함된 3-디하이드록시시노테트릭 산(dehydroxyceanothetric acid) 2-메틸 에스테르 화합물을 유효성분 역시 신장세포 보호 활성이 나타나므로, 상기 화합물을 포함하면 약학적 소재 또는 건강기능성 식품 소재로 효과적으로 활용이 가능하다.
도 1은 3-디하이드록시시노테트릭 산(dehydroxyceanothetric acid) 2-메틸 에스테르 화합물과 시스플라틴을 처리한 LLC-PK1 세포의 외형 및 세포사멸을 확인한 결과(도 1A)에, 이를 정량화하여 그래프로 확인한 결과(도 1B)에 나타내었다.
도 2는 3-디하이드록시시노테트릭 산(dehydroxyceanothetric acid) 2-메틸 에스테르 화합물과 시스플라틴을 처리한 LLC-PK1 세포의 P-P38, P38, P-JNK, JNK, P-ERK, ERK의 발현을 확인한 결과(도 2A) 및 C.C-3, -8, -9, Bax, Bcl-2 및 GAPDH의 발현량을 확인한 결과(도 2B)를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 대추나무 뿌리 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent)로 하여 추출된 것일 수 있다. 상기 친수성 용매는 물, C1 내지 C10의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C10, C1 내지 C6 또는 C1 내지 C4의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 대추나무 뿌리 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 대추나무 뿌리추출물의 추출용매는 메탄올 또는 열수일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 조성물은 대추나무 뿌리 추출물로부터 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 제조한 분획물을 포함할 수 있다. 구체적인 일 실시예에서 클로로포름의 분획물 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 수득한 분획물로부터 유래한 하기 화합식 1 내지 8을 가지는 화합물을 분리하였다.
[화학식 1]
Figure 112019041948639-pat00001
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 2α-methylcarboxy-A(1)-norlup-20(29)-en-27,28-dioic acid 또는 3-디하이드록시시노테트릭 산(dehydroxyceanothetric acid) 2-메틸 에스테르로 지칭될 수 있으며, CAS 넘버는 2002461-52-9에 해당한다.
[화학식 2]
Figure 112019041948639-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019041948639-pat00003
[화학식 4]
Figure 112019041948639-pat00004
[화학식 5]
Figure 112019041948639-pat00005
[화학식 6]
Figure 112019041948639-pat00006
[화학식 7]
Figure 112019041948639-pat00007
[화학식 8]
Figure 112019041948639-pat00008
상기 대추나무 뿌리 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 상기 대추나무 뿌리를 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않은 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추출물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들면, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 추출은 상기 대추나무 뿌리를 상기 추출 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 대추나무 뿌리는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 대추나무 뿌리의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 조추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 추출물은 초음파 조사하에 추출된 것일 수 있다. 상기 초음파 조사는 실온, 10 내지 25℃, 10 내지 30℃, 10 내지 40℃, 10 내지 45℃, 10 내지 50℃, 10 내지 55℃, 10 내지 60℃, 10 내지 65℃, 또는 10 내지 70℃에서 수행되는 것일 수 있다. 조사 시간은 10 내지 30분. 10 분 내지 1시간, 10 분 내지 2시간, 10 분 내지 3시간, 10 분 내지 4시간, 10 분 내지 5시간, 10 분 내지 6시간, 10 분 내지 9시간, 10 분 내지 12시간, 또는 10 분 내지 24시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 초음파 조사는 밀페된 용기 중에 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추출물은 유기 용매를 사용하여 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 클로로포름, 메탄올, 헥산, 디클로로메탄, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물은 대추나무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트 또는 클로로포름 분획분로부터 분리되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 대추나무 뿌리를 메탄올로 추출한 후, 클로로포름으로 분획하여 얻어진 클로로포름 분획층으로부터 얻어질 수 있다.
상기 추출은 조추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물은 세포사멸(apoptosis)를 억제하여 신장세포를 보호함으로써 신장질환 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 시스플라틴에 의하여 발생되는 신장 손상을 억제하여 신장질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 약학 조성물에는 상기 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 신장질환을 치료, 예방 또는 개선 목적에 맞게 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 예를 들어 0.1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 예를 들면, 0.1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 5μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 5 μg/mL 내지 100 μg/mL, 5 μg/mL 내지 50 μg/mL, 5 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 μg/mL 내지 50 μg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10 μg/mL 내지 350μg/mL, 12.5 μg/mL 내지 300μg/mL, 25 μg/mL 내지 270μg/mL, 50 μg/mL 내지 150μg/mL, 또는 100 μg/mL 내지 200μg/mL로 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 신장 질환은 신장 손상으로 인한 질환, 만성 신 질환 또는 급성 신 질환일 수 있고, 예를 들어 상기 만성 신 질환 또는 급성 신 질환은 신부전 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 양상에 따른 상기 조성물은 상기 화학식1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염 중 어느 하나 이상의 활성성분을 포함할 수 있으며, 구체적으로 2이상의 활성성분을 포함할 수 있으며, 또한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 활성성분으로 포함할 수 있다.
또한 상기 화학식1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염은 대추나무 뿌리로부터 추출 및 분리한 것일 수 있으며, 또한 인공적으로 합성된 것일 수 있다.
일 양상에 따른 상기 조성물은 조성물은 상기 화학식1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 단일, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 활성성분으로 구성된 것일 수 있다.
상기 조성물 중에 상기 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물은 신장 질환을 예방 또는 치료시키거나, 예컨대 신장 손상, 신부전 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택된 신장 질환을 예방 또는 치료시키거나, 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 조성물은 신장 손상과 관련한 신장 질환, 또는 신장질환이 직, 간접적 원인이 되어 발생하는 신장질환의 예방, 치료, 또는 개선에 이용될 수 있다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 대추나무 뿌리 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
일 양상에 따른 상기 제조방법은 수득한 추출물로부터 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분획물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 추출은 상기 대추나무 뿌리를 상기 추출 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 대추나무 뿌리는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
상기 분획물은 상기 조추출물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들면, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로, 식품적으로, 또는 의약외품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 약학, 식품 또는 의약외품 조성물일 수 있고, 또는 약학, 식품 또는 화장료의 유효성분으로 첨가되는 것인 조성물일 수 있다. 일 구체예서 상기 조성물은 상기 화대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물은 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 총 중량에 대하여 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 1중량 내지 15중량부, 1중량 내지 10중량부, 1중량 내지 5중량부, 또는 0.1중량 내지 15중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 식품 조성물은 예를 들어, 우유, 요플레 등의 식품 소재, 식음료, 기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 개체의 신장 질환 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 효율적으로 예방 또는 치료시키기 위해 스테로이드, 항염증제, 및 항생제와 같은 약물과 함께 복합적으로 투여될 수 있다. 상기 복합 투여는 순차적, 동시적, 또는 개별적으로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 투여는 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 개체당 일당 0.001 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 예를 들면, 0.01 μg/mL 내지 500 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 50 μg/mL, μ0.1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 5μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 5 μg/mL 내지 100 μg/mL, 5 μg/mL 내지 50 μg/mL, 5 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 μg/mL 내지 50 μg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 25 μg/mL을 투여하는 것일 수 있다.
용어 "유효성분으로 포함"은 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 대추나무 뿌리로부터 추출한 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 당업자는 조성물 중에 포함되는 대추나무 뿌리 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 양적 상한 또는 하한을 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물은 신장 질환 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
일 양상은 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 개체의 신장 질환 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 효율적으로 예방 또는 치료시키기 위해 스테로이드, 항염증제, 및 항생제와 같은 약물과 함께 복합적으로 투여될 수 있다. 상기 복합 투여는 순차적, 동시적, 또는 개별적으로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 투여는 대추나무 뿌리 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 개체당 일당 0.001 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 예를 들면, 0.01 μg/mL 내지 500 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 50 μg/mL, μ0.1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 5μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 5 μg/mL 내지 100 μg/mL, 5 μg/mL 내지 50 μg/mL, 5 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 μg/mL 내지 50 μg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 25 μg/mL을 투여하는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대추나무( Zizyphus jujuba MILL.)뿌리에서 유래된 트리테르페노이드(Triterpenoids) 화합물의 수득
1.1 대추나무( Zizyphus jujuba MILL.)뿌리로부터 추출물 및 분획물의 수득
서울대학교 약학대학 약초원으로부터 진주 소재에서 수득한 건조 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.)의 뿌리를 제공받았으며, 상기 건조된 대추나무의 뿌리 7.5 kg을 상온에서 30 L의 메탄올 용매로 3 시간씩 2회에 걸쳐 초음파 추출하여 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 메탄올 추출물을 진공 조건에서 농축하여 630.4 g의 조추출물을 제조하였다. 상기 조추출물을 물(H2O)에 현탁한 후, 클로로포름과 에틸아세테이트로 순차적으로 추출하여 각각103.5 g의 클로로포름 분획물 및 75.0 g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다.
1.2 클로로포름 분획물로부터 화합물의 수득
상기 클로로포름 분획물로 Kiesgel 60 silica gel(40-60㎛, 230-400 mesh, Merck, Whitehouse, NJ, USA)를 이용하여, 클로로포름과 메탄올을 100:1에서부터 3:1의 부피비로 점점 증가시켜 순차적으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여, 10 개의 분획물(C1 ~ C10)을 얻었다.
그 중, C3 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)을 수행하였다. 구체적으로 Kiesgel 60 silica gel(40-60㎛, 230-400 mesh, Merck, Whitehouse, NJ, USA), 클로로포름와 메탄올을 200:1에서부터 20:1의 부피비로 점점 증가시켜 순차적으로 실시하여, 6개의 분획물(c3a ~ c3f)을 얻었다. 그 중, c3e 및 c3f 분획물에 대하여 메탄올을 이용한 재결정(recrystallization)화를 수행하여 각각 화학식7의 화합물 124.6mg및 화학식 8의 화합물 26.4 mg 을 수득하였다.
다음으로, C5 분획물 중 메탄올에 용해되지 않는 백색의 고형 물질을 취득한 후 메탄올을 이용한 재결정(recrystallization)화를 수행하여 화학식 6의 화합물 12.5 g을 수득하였다.
C5 분획물의 나머지 부분에 대하여 Kiesgel 60 silica gel(40-60㎛, 230-400 mesh, Merck, Whitehouse, NJ, USA)을 이용하여, 클로로포름과 메탄올를 100:1에서부터 10:1의 부피비로 점점 증가시켜 순차적으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 를 실시하여, 10 개의 분획물(c5a ~ c5j)을 얻었다. 그 중, c5e 분획물에 대하여 메탄올을 이용한 재결정(recrystallization)화를 수행하여 화학식 1의 화합물 45.8mg을 수득하였다.
이후, c8 분획물에 대하여 세파덱스 LH-20 크로마토그래피(Sephadex LH-20(25-100㎛, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)를 클로로포름와 메탄올를 1:1 부피비로 하여 수행하여, 화학식 5의 화합물 5.8 mg를 수득하였다.
1.3 클로로포름 분획물로부터 화합물의 수득
상기 에틸아세테이트 분획물을 Kiesgel 60 silica gel(40-60㎛, 230-400 mesh, Merck, Whitehouse, NJ, USA)로 클로로포름과 메탄올을 50:1에서부터 1:1의 부피비로 점점 증가시켜 순차적으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여, 14개의 분획물(e1 ~ e14)을 얻었다.
그 중, e7 분획물에 대하여 메탄올을 이용한 재결정(recrystallization)화를 수행하여 화학식 2의 화합물 14.5 g을 수득하였다.
이후, e8 분획물에 대하여 메탄올을 이용한 재결정(recrystallization)화를 수행하여 화학식 3의 화합물 276.4 mg을 수득하였다.
다음으로, e9분획물에 대하여 다이클로로메테인(CH2Cl2)와 메탄올을 1:1 부피비로 세파덱스 LH-20 크로마토그래피(Sephadex LH-20(25-100㎛, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) 실시하여 화학식 4의 화합물 39.6 mg을 수득하였다.
실시예 2. 대추나무( Zizyphus jujuba MILL.)뿌리 유래 화합물의 구조 분석
2.1 화학식 1의 화합물 구조 분석
실시예 1에서 분리된 화학식 1의 화합물을 핵자기공명(NMR) 분석기(Bruker AMX 600 spectrometers)를 통하여 1H NMR, 13C NMR 스펙트럼을 얻어 분자구조를 결정하였으며, 하기 c5e 분획물에서 확인한 화합물의 구조를 하기 화학식 1로 결정하였으며, 상기 구조를 분석한 결과를 표 1에 정리하였고, 상기 화학식 1의 화합물은 3-dehydroxyceanothetric acid 2-methyl ester인 것을 확인하였다.
화학식 1의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00009
No. δ H
(600MHz,
pyridine-d 5)		 δ c
(150MHz,
pyridine-d 5)		 No. δ H
(600MHz,
pyridine-d 5)		 δ c
(150MHz,
pyridine-d 5)
1 2.69, d (7.6) 55.7 17 57.0
2 176.8 18 2.28, m 52.7
3 1.85, m
1.78, m		 42.6 19 3.71, m 48.3
4 38.6 20 151.6
5 1.80, m 56.5 21 2.18, m
1.53, m		 31.6
6 1.31, m 19.1 22 2.29, m
1.53, m		 38.1
7 1.99, m
1.81, m		 38.1 23 1.17, s 31.9
8 41.7 24 0.89, s 27.0
9 2.17, m 46.5 25 0.89, s 19.8
10 51.6 26 1.16, s 18.5
11 1.89, m
1.55, m		 24.4 27 178.9
12 2.62, m
2.05, m		 27.2 28 179.8
13 2.98, dt
(4.8, 12.9)		 40.7 29 5.08, s
4.82, s		 110.7
14 60.8 30 1.92, s 19.8
15 2.50, m
1.91, m		 29.3 -OMe 3.78, s 51.3
16 2.91, m
1.95, m		 35.8
2.2 화학식 2, 3, 4 및 5의 화합물의 구조분석
실시예 1에서 분리된 화학식 2, 3, 4 및 5의 화합물을 핵자기공명(NMR) 분석기(Bruker AMX 500 and 600 spectrometers)를 통하여 1H NMR, 13C NMR스펙트럼을 얻었으며, 이를 문헌치와 비교하여 하기와 같이 분자구조를 결정하였다.
화학식 2, 3, 4 및 5 의 화합물은 각각 ceanothic acid(화학식 2), epiceanothic acid(화학식 3), 24-hydroxy ceanothic acid (화학식 4) 및 3-O-protocatechuoylceanothic acid (화학식 5)임을 확인하였다.
화학식 2의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00010
화학식 3의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00011
화학식 4의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00012
화학식 5의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00013
2.3 화학식 6, 7 및 8의 화합물의 구조분석
실시예 1에서 분리한 화학식 6, 7, 및 8의 화합물을 핵자기공명(NMR) 분석기(Bruker AMX 500 and 600 spectrometers)를 통하여 1H NMR, 13C NMR스펙트럼을 얻었으며 이를 문헌치와 비교하여 하기와 같이 분자구조를 결정하였다.
화학식 6, 7 및 8 의 화합물은 각각 베툴린산(화학식 6), 2-O-트랜스-p-coumaroylalphitolic acid (화학식 7) 및 2-O-cis-p-coumaroylalphitolic acid (화학식 8) 인 것을 확인하였다.
화학식 6의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00014
화학식 7의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00015
화학식 8의 화합물 :
Figure 112019041948639-pat00016
실시예 3. 대추나무( Zizyphus jujuba MILL.)뿌리 유래 추출물, 분획물 및 화합물의 신장 독성에 대한 보호 효과의 확인
대추나무 뿌리의 추출물 및 분획물로부터 분리된 화합물이 시스플라틴으로 야기된 신 세뇨관 세포 손상에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였다. 신 세뇨관 상피세포 LLC-PK1 (ATCC CL-101TM)를 사용하여 신장 독성에 대한 보호 효과를 다음과 같이 평가하였다. LLC-PK1 세포를 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum; Gibco BRL Life Technologies), 페니실린 G 100 유닛/ml (Gibco BRL Life Technologies) 및 스트렙토마이신 (streptomycin; Gibco BRL Life Technologies) 100 ug/ml를 첨가한 DMEM (Cellgro, Manassas, VA, USA) 배지를 사용하여 37℃로 유지된 95% 공기/5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 배양된 LLC-PK1 세포를 동일 배지 100μl를 포함한 104 개씩 도입하고 24 시간 동안 세포가 안정되도록 한 후, 샘플을 지정된 농도로 동일 배지 90 ㎕ 중에 첨가하고 2 시간 동안 배양하였다. 이어서 동일 배지에 녹인 250 μM 시스플라틴을 10 ㎕ 씩 첨가하여 24 시간 배양한 후 10 ㎕의 CCK-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Japan) 시약을 각 웰에 첨가하였다. 이후 37℃에서 30분 동안 배양시킨 후, BIO-TEK (Winooski, VT, USA) 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)에서 450 nm 검출 파장을 이용하여 흡광도를 측정하여 25 uM 시스플라틴을 처리한 신 세뇨관 상피세포 LLC-PK1에 대추나무 뿌리 에탄올 및 열수 추출물과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물과 상기 분획물로부터 분리한 화학식 1 내지 8의 화합물을 다양한 농도로 접촉시킨 경우에 나타나는 신 세뇨관 상피세포의 생존율을 표 2에 나타내었다.
구분 농도 (μg/mL) 세포생존율 (%)
에탄올 추출물 0 57.2±4.1
12.5 58.3±3.4
25 59.5±2.9
50 66.3±1.4
100 83.1±0.3
200 88.8±3.5
열수 추출물 0 57.3±1.7
12.5 61.4±3.4
25 63.6±4.1
50 68.1±3.7
100 86.4±2.1
200 88.2±3.5
클로로포름 분획물 0 58.7±4.2
12.5 60.7±2.6
25 70.1±2.7
50 78.8±0.9
100 81.1±1.4
200 93.0±1.7
에틸아세테이트 분획물 0 58.7±4.2
12.5 61.9±4.5
25 77.6±2.0
50 78.8±0.7
100 80.7±1.6
200 91.2±2.3
부탄올 분획물 0 58.7±4.2
12.5 66.5±2.4
25 66.8±1.5
50 73.0±3.4
100 72.7±3.1
200 74.0±3.1
물 분획물 0 58.7±4.2
12.5 62.4±3.3
25 65.0±4.5
50 69.8±2.5
100 67.5±4.8
200 72.5±2.7
구분 농도 (μM) 세포생존율 (%)
화학식 1의 화합물 0 47.9±2.4
10 49.1±4.0
25 58.6±3.4
50 63.9±4.5
100 73.8±2.8
200 81.8±4.6
화학식 2의 화합물 0 53.8±1.4
10 41.9±4.6
25 34.7±4.9
50 31.0±2.7
100 30.2±2.3
200 26.0±4.0
화학식 3의 화합물 0 55.5±2.1
10 61.5±1.5
25 55.3±4.0
50 40.2±3.9
100 34.5±3.1
200 33.6±2.9
화학식 4의 화합물 0 53.8±3.9
10 53.5±2.0
25 62.5±3.0
50 62.5±1.5
100 67.7±1.5
200 76.5±4.3
화학식 5의 화합물 0 47.9±2.4
10 48.4±4.7
25 69.3±0.9
50 71.8±4.8
100 71.4±2.9
200 70.9±3.5
화학식 6의 화합물 0 52.9±2.0
10 58.6±0.8
25 59.6±1.0
50 59.2±3.0
100 58.4±3.1
200 61.0±2.6
화학식 7의 화합물 0 52.9±2.0
10 59.1±2.5
25 60.6±2.0
50 64.5±1.6
100 71.1±2.5
200 72.8±4.3
화학식 8의 화합물 0 52.9±2.0
10 58.8±2.0
25 57.5±2.4
50 61.7±1.8
100 63.4±2.0
200 67.3±1.4
상기 LLC-PK1는 시스플라틴을 처리한 경우 이를 처리하지 않은 비처리군 보다 생존세포의 수가 50% 이하로 감소하여, 시스플라틴으로 인한 신 세뇨관 세포 손상을 확인할 수 있었다. 다만, 시스플라틴 처리로 감소된 세포 생존율은 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 각각 대추나무 뿌리 에탄올 및 열수 추출물과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물을 처리하는 경우 처리된 농도 의존적으로 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 대추나무 뿌리 에탄올 및 열수 추출물은 에탄올, 열수 추출물, 클로로포름, 에틸아세테이트 분획물은 100μg/mL의 농도 이상에서 세포의 생존율을 80% 이상으로 나타나는 것을 확인할 수 있어, 우수한 신장독성 보호효과가 나타났다.
화합물에 있어서는 클로로포름 분획 또는 에틸아세테이트 분획물에서 분리한 화합물 에서 모두 신 세뇨관 세포의 생존율을 상승시키는 것을 확인하였다. 특히 클로로포름 분획물에서 수득한 화학식 1, 4, 5, 7 및 8의 화합물이 세포 생존율을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, 화학식 1의 화합물은 200 μM의 농도에서 세포의 생존율을 80% 이상 증가시켜 신장 독성에 대한 보호효과가 우수하게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 4. 대추나무 뿌리 추출물 유래 화학식 1의 화합물의 신장 독성에 대한 보호 효과의 확인
대추나무 뿌리 추출물 유래 화합물 중 화합물 1이 시스플라틴에 의한 신장 독성에 대한 보호 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 6-웰 배양 플레이트의 각 웰에 배양된 LLC-PK1 세포를 실시예 3의 배지 조성물 3ml을 포함한 배지에 4x105 개씩 도입하고 24 시간 동안 배양하여 세포가 안정되도록 한 후, 화학식 1의 화합물을 100, 200 μM의 농도로 동일 배지 조성물 2.7ml 중에 첨가하고 2 시간 동안 배양하였다. 이어서 용해시킨 25 μM의 시스플라틴을 0.3ml씩 동일 배지에 첨가하여 24 시간 동안 배양한 후, 트립신을 사용하여 세포 수가 5x105 내지 5x106 cells/mL 정도 되도록 세포를 배양시켰다. 원심분리하여 상등액을 버리고, 이후 pH 7.4의 100 mM HEPES, 140 mM NaCl 및 25 mM CaCl2를 포함하는 아넥신 바인딩 버퍼 100 μL 에 상기 배양시킨 세포를 재현탁(resuspension) 한 후, 5 μL의 아넥신 V Alexa Fluor 488 를 첨가하여 30분간 상온의 암실에서 고정 및 염색하였다. 이후 세포 현탁액을 원심분리하여 상등액은 버리고 침전된 세포 펠렛을 아넥신 바인딩 버퍼 100 μL 중에 재현탁한 후 프로피디움 1 μL을 첨가하여 1분간 상온 및 암실에서 세포를 고정 및 염색하였다. 염색된 세포의 분석은 Tali Image-based cytometer와 TaliPCApp (version 1.0)을 이용하여 수행하여 화학식 1의 화합물과 시스플라틴을 처리한 LLC-PK1 세포의 외형 및 세포사멸을 확인한 결과를 도 1A에, 이를 정량화하여 그래프로 확인한 결과를 도 1B 및 표 3에 나타내었다.
구분 농도 (μM) 아폽토시스(%)
화학식 1의 화합물 0 31.3±0.5
100 12.0±1.7
200 6.0±0.0
도 1A에 나타난 바와 같이, 대부분의 세포가 둥근 모양의 정상적인 핵과 손상 없는 원형질막을 가지고 있는 시스플라틴 미처리군인 대조군에 비해 25 μM의 시스플라틴을 처리한 경우에는 염색질의 농축, 핵의 응축과 함께 원형질막이 손상된 상태로 annexin V로 염색되어 녹색 형광을 띄는 세포, 즉 사멸된 세포들을 확인할 수 있었다. 100 및 200 μM의 화학식 1의 화합물을 처리한 군은 녹색 형광을 띄는 세포가 감소된 것이 확인되었다. 상기 세포 사멸율을 정량화하여 도 1B 및 표 2에서 확인한 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 LLC-PK1 세포에서 시스플라틴에 의한 세포 사멸을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 신장 세포의 세포 사멸율을 현저하게 감소시키므로 신장 보호 효과가 나타나는 것을 효과적으로 확인할 수 있었다.
실시예 5. 대추나무 뿌리 추출물 유래 화학식 1의 화합물의 신장 세포 사멸 억제 효과의 확인
대추나무 뿌리 추출물 유래 화합물 중 화합물 1의 세포 사멸 억제 효과가 세포 사멸에 관여하는 신호전달 물질들의 발현 변화에 의한 것임을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 각 웰에 배양된 LLC-PK1 세포를 실시예 3의 배지 조성물 3ml을 포함한 배지에 4x105 개씩 도입하고 24 시간 동안 배양하여 세포가 안정되도록 한 후, 화학식 1의 화합물을 100, 200 μM의 농도로 동일 배지 조성물 2.7ml 중에 첨가하고 2 시간 동안 배양하였다. 이어서 용해시킨 25 μM의 시스플라틴을 0.3ml씩 동일 배지에 첨가하여 24 시간 동안 배양한 후, 세포 스크래퍼를 사용하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포를 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 1회 세척한 후 세포 현탁액을 원심분리하여 상등액은 버리고 침전된 세포 펠렛에 1 mM 페닐메틸술포닐 플로리드(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 포함한 리파 버퍼(RIPA buffer, Cell Signaling, MA, USA)를 첨가하여 4 ℃에서 20분 동안 방치하였다. 반응물을 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 분리된 세포 용해물(cell lysate)에서 세포의 잔사를 제거한 상등액에 대하여 단백질 분석 키트(BCA protein detection kit, Thermo Scientific, Rockford, USA)를 사용하여 단백질을 정량을 실시하였다. 웰당 20 μg의 세포 용해물을 10 % 소디윰 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행하여 변성된 단백질을 전개시켰다. 전개된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오리드 막 (polyvinylidene difluoride membrane, PVDF 막)(Merck Millipore, 독일)으로 단백질을 이동시켰다. 폴리비닐리덴 플루오리드 막에 항체가 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위하여, 5 % 탈지분유(skim milk)를 포함한 TBST buffer (20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 및 0.05 % Tween-20, pH 7.5)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 방치, 비특이적 결합 부위를 차단(blocking)하였다. 이 후 막을 TBST buffer로 10분씩 3회 세척하였다. 다음으로, P-P38, P38, P-JNK, JNK, P-ERK, ERK, 세포 내 절단된 카스파제(cleaved caspase)-3, -8, -9, Bax, Bcl-2 및 GAPDH의 발현량을 측정하기 위해 각 단백질에 결합하는 토끼 1차 항체(Cell Signaling, Danvers, USA)를 1:1,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBST 버퍼로 10분간 3회 세척하였다. 이후 염소 항-토끼 IgG인 2차 항체(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 1:2,000으로 희석하여 상기 막과 상온에서 2시간 동안 반응시키고, 단백질을 ECL 검출 키트(GE healthcare)로 확인하였다. P-P38, P38, P-JNK, JNK, P-ERK, ERK의 발현을 확인한 결과를 도 2A 및 3, -8, -9, Bax, Bcl-2 및 GAPDH의 발현량을 확인한 결과를 도 2B에 나타내었다.
도 2A 및 B에서 확인한 바와 같이, LLC-PK1 세포에 시스플라틴을 처리한 경우, 시스플라틴 비처리 군 대비 세포 사멸을 유도하는 신호전달 물질 단백질이 발현되는 것을 확인하였으나, 화학식 1의 화합물을 처리한 경우에는 시스플라틴을 미처리한 대조군과 유사한 단백질 발현을 나타내는 것을 확인하였고, 특히 화합물 1을 200 μM의 농도로 처리한 경우에는 시스플라틴을 처리하지 않은 대조군과 거의 유사한 정도의 단백질 발현을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 대추나무 뿌리에서 추출한 추출물에 포함되어 있는 화학식 1의 화합물은 신장 세포 손상 물질에 의한 세포사멸을 유도하는 신호전달물질들을 효과적으로 억제함으로써 신장 세포를 보호하는 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 대추나무 뿌리 추출물의 클로로포름 분획물을 포함하는 것으로, 상기 클로로포름 분획물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것이며,
    상기 신장 질환은 신장 손상; 만성 또는 급성 신부전; 및 만성 또는 급성 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021044212617-pat00037
    .
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 대추나무 뿌리 추출물을 50 μg/mL 내지 200μg/mL로 포함하는 것인 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 대추나무 뿌리 추출물은 세포 사멸(apoptosis)을 억제하는 약학 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 대추나무 뿌리 추출물은 시스플라틴에 의한 세포 손상을 억제하는 약학 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 조성물은 대추나무 뿌리 추출물의 클로로포름 분획물을 포함하는 것으로, 상기 클로로포름 분획물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것이며,
    상기 신장 질환은 신장 손상; 만성 또는 급성 신부전; 및 만성 또는 급성 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 신장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021044212617-pat00038
    .
  17. 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 신장 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 조성물은 대추나무 뿌리 추출물의 클로로포름 분획물을 포함하는 것으로, 상기 클로로포름 분획물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것이며,
    상기 신장 질환은 신장 손상; 만성 또는 급성 신부전; 및 만성 또는 급성 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 의약외품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021044212617-pat00039
    .
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 대추나무(Zizyphus jujuba MILL.) 뿌리 추출물의 클로로포름 분획물을 포함하는 것으로, 상기 클로로포름 분획물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신장 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서,
    상기 신장 질환은 신장 손상; 만성 또는 급성 신부전; 및 만성 또는 급성 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112021044212617-pat00040
    .
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