CN101027069A - 神经酰胺酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供神经酰胺酶活性抑制剂、含有该神经酰胺酶活性抑制剂的药品、准药、化妆品、食品，其中所述的神经酰胺酶活性抑制剂的特征在于：抑制神经酰胺酶的活性，特别是中性/碱性神经酰胺酶活性，含有来源于植物的处理物作为有效成分，其中所述植物选自银杏科植物、葫芦科植物、芸香科植物、海带科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一种。

Description

神经酰胺酶抑制剂

技术领域

本发明涉及含有来源于植物的处理物、例如提取物的神经酰胺酶活性抑制剂、含有该抑制剂的药品、准药、化妆品、食品。

背景技术

鞘脂(鞘糖脂、鞘磷脂以及它们的代谢产物神经酰胺等)作为控制细胞增殖、分化、编程性细胞死亡等的信息分子，近年来迅速受到人们的关注。在癌症、自身免疫疾病、感染症等疾病中，鞘脂代谢发生很大变化，因此鞘脂作为制药的目标，受到人们的强烈关注。其中，可以认为神经酰胺是鞘脂的基本骨架脂质，是调控细胞的生与死的重要因子。目前已知至少有三种神经酰胺的产生路径。它们是1)由丝氨酸与棕榈酰CoA的缩合反应起始的从头合成路径、2)鞘磷脂的分解体系、3)葡糖神经酰胺的分解体系。其中，鞘磷脂的分解体系通过诱导细胞死亡的TNF-α、Fas等细胞因子、血清枯竭(血清枯渴)、紫外线、放射线照射、氧化胁迫而被激活。其它通过维生素D3、干扰素γ、白细胞介素1β等分化因子来分解鞘磷脂，由此使神经酰胺的生成亢进。另外，通过由细胞外添加神经酰胺类似物--C2-神经酰胺(D-赤型-N-乙酰基鞘氨醇)诱导编程性细胞死亡、诱导分化、抑制增殖等现象，或者通过用细菌的鞘磷脂酶对细胞进行处理，由于鞘磷脂酶的分解而使神经酰胺蓄积、与添加C2-神经酰胺同样地，可抑制细胞的增殖、诱导编程性细胞死亡，因此可认为细胞内的神经酰胺发挥着重要的细胞内信号的功能。

神经酰胺通过神经酰胺酶的作用而被分解为游离脂肪酸和长链碱--鞘氨醇。鞘氨醇的1位羟基被磷酸化，代谢为鞘氨醇-1-磷酸。已知鞘氨醇-1-磷酸与神经酰胺相反，显示细胞增殖促进作用，抑制由神经酰胺诱导的编程性细胞死亡。这样，可以认为：在细胞的增殖、分化、细胞死亡等的调控中，细胞内的神经酰胺及其代谢产物鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸等的平衡是非常重要的。因此，作为调控细胞增殖、分化、细胞死亡的药物，使细胞内神经酰胺的量增加且使鞘氨醇或鞘氨醇-1-磷酸水平减少的药物是极有用的。

神经酰胺由L-丝氨酸和棕榈酰CoA进行从头合成，已知抑制该合成体系的起始酶棕榈酰CoA：丝氨酸棕榈酰转移酶的物质有ISP-I(例如非专利文献1)或神经鞘真菌纤维素B(例如非专利文献2)。还已知由二氢鞘氨醇转换为二氢神经酰胺的转换酶--酰基CoA：二氢鞘氨醇N-酰基转移酶的抑制剂有伏马菌素(フモニシソ)B1(例如非专利文献3)。这些物质都抑制神经酰胺的从头合成，使细胞内神经酰胺量减少。

另一方面，已知作为使神经酰胺水平升高的物质，抑制UDP-葡萄糖：神经酰胺葡糖基转移酶的活性的物质D-苏型PDMP：神经酰胺葡糖基转移酶是将葡萄糖转移到神经酰胺上，合成葡糖神经酰胺(例如非专利文献4)，已知该物质引起细胞内神经酰胺的增加。但是，该酶是鞘糖脂生物合成的起始酶，因此鞘糖脂的合成也会受到抑制。

已知作为调节神经酰胺和鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸的平衡的代谢酶，中性/碱性神经酰胺酶(例如非专利文献5、非专利文献6和非专利文献7)、碱性神经酰胺酶(例如非专利文献8)的重要性受到人们的重视，但是，抑制这些酶的活性的物质几乎不为人所知。唯一已知的神经酰胺的类似物--D-赤型-2-(N-肉豆蔻酰氨基)-1-苯基-1-丙醇(D-赤型-MAPP)抑制碱性神经酰胺酶的活性，使细胞内的神经酰胺水平升高(例如参照专利文献1和非专利文献9)。但是，该物质对于中性/碱性神经酰胺酶的抑制活性不强，完全不能满足需要。非专利文献10中同样记载了神经酰胺的类似物(1R，2R)-2-N-肉豆蔻酰氨基-1-(4-硝基苯基)-1，3-丙二醇(D-NMAPPD或B13)，与抑制碱性神经酰胺酶相比，该化合物更有效地抑制酸性神经酰胺酶，并未报道对中性/碱性神经酰胺酶的有效的抑制物质。非专利文献9中记载了N-油酰基乙醇胺具有对酸性神经酰胺酶的抑制效果，但该物质对中性/碱性神经酰胺酶几乎不显示抑制效果。专利文献2中公开了抑制皮肤角层中神经酰胺分解、含有郁金、虎耳草、积雪草、海葱(カィソゥ)的提取液的神经酰胺酶活性抑制剂，以及含有这些的皮肤外用药，但没有记载这些植物提取物对中性/碱性神经酰胺酶的抑制效果，并且皮肤神经酰胺水平的升高效果也不充分。

另一方面，神经酰胺是皮肤中的主要细胞间脂质成分，对于皮肤的保湿性能、阻挡机制具有重要的作用。近年来，患者数量增加的特应性皮炎患者的皮肤角层中，神经酰胺含量减少，可以认为这是特应性皮炎的特征--皮肤干燥以及角层的阻挡功能异常的原因之一。最近有报道称：与健康人相比，从特应性皮炎患者中高频率地检出神经酰胺酶生产菌(例如非专利文献11)。另外，从特应性皮炎患者中分离出了神经酰胺酶生产菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)AN17菌株，并对该神经酰胺酶进行了纯化、克隆(例如非专利文献12和非专利文献13)。由于所述细菌生产的神经酰胺酶分解特应性皮炎患者皮肤中的神经酰胺，因此角层的神经酰胺减少，皮肤的阻挡功能降低，可导致疾病恶化。但是，对于抑制来源于微生物的神经酰胺酶的活性的特异性抑制物质尚完全不知晓。

专利文献1：国际公布第97/44019号小册子

专利文献2：日本专利公开第2002-308791号公报

非专利文献1：Miyake Y、另外4人、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第211卷、第396-403页(1995)

非专利文献2：Zweerink MM、另外4人、The Journal ofBiological Chemistry、第267卷、第25032-25038页(1992)

非专利文献3：Wang E、另外4人、The Journal of BiologicalChemistry、第266卷、第14486-14490页(1991)

非专利文献4：Inokuchi J、另外1人、J.Lipid Res.、第28卷、第565-571页(1987)

非专利文献5：Tani M、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第275卷、第11229-11234页(2000)

非专利文献6：Mitsutake S、另外8人、The Journal ofBiological Chemistry、第276卷、第26249-26259页(2001)

非专利文献7：E1 Bawab S、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第275卷、第21508-21513页(2000)

非专利文献8：Mao C、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第276卷、第26577-26588页(2001)

非专利文献9：Bielawska A、另外6人、The Journal ofBiological Chemistry、第271卷、第12646-12654页(1996)

非专利文献10：Raisova M、另外9人、FEBS Letters、第516卷、第47-52页(2002)

非专利文献11：Ohnishi Y、另外3人、Clin.Diagn.Lab.Immunol.、第6卷、第101-104页(1999)

非专利文献12：Okino N、另外3人、The Journal of BiologicalChemistry、第273卷、第14368-14373页(1998)

非专利文献13：Okino N、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第274卷、第36616-36622页(1999)

发明内容

如上所述，抑制动物或微生物所产生的中性/碱性神经酰胺酶的活性的有效的抑制剂尚不为人知，还没有进行产业应用，这是目前的现状。本发明的目的在于提供来自植物的神经酰胺酶活性抑制剂、其中特别是中性/碱性神经酰胺酶活性抑制剂，含有该抑制剂的药品、准药、化妆品、食品。

鉴于上述情况，本发明人进行了深入地研究，考虑到中性/碱性神经酰胺酶的抑制物质对于细胞内神经酰胺水平的调控、进而由细胞内神经酰胺而引起的抑制细胞的增殖、诱导分化、调节编程性细胞死亡有效，由此广范围地对各种物质的中性/碱性神经酰胺酶的抑制活性进行了调查，结果发现来源于各种植物的处理物、来源于该处理物的特定的化合物对中性/碱性神经酰胺酶具有特异性抑制活性。还确认了这些来源于植物的处理物、来源于植物的特定的化合物具有使动物培养细胞或皮肤角层的神经酰胺含量增加的活性，并基于上述发现完成了本发明。

即，本发明提供神经酰酶活性抑制剂、以及特征在于含有所述抑制剂的细胞内外神经酰胺水平调节剂、进而提供抗炎症药、抗癌药、皮肤外用药等药品、准药、化妆品、食品，其中所述神经酰酶活性抑制剂以来源于植物的处理物、来源于植物的特定的化合物作为有效成分，其中所述来源于植物的处理物为来源于选自银杏、葫芦(ゥリ，gourd)、橙、粘液海带(ガゴ メ)、黄瓜、葡萄柚、冬瓜、苦瓜、海带、桉、艾蒿、来檬以及裙带菜的至少一种植物的提取物、精油，例如水蒸气蒸馏物、压榨物等。

即，本发明的第1方面涉及神经酰胺酶活性抑制剂，其特征在于：含有来源于植物的处理物作为有效成分，其中所述植物选自银杏科植物、葫芦科植物、芸香科植物、海带科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一种。本发明的第1方面中，例如优选银杏科植物为银杏，葫芦科植物为选自菜瓜、黄瓜、冬瓜和苦瓜的至少一种，芸香科植物为选自橙、葡萄柚和来檬的至少一种，海带科植物为选自粘液海带、海带和裙带菜的至少一种，桃金娘科植物为桉，菊科植物为艾蒿，但并不受此限定。

本发明的第2方面涉及神经酰胺量调节剂，其特征在于：含有第1方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第3方面涉及药品，其特征在于：含有第1方面的神经酰胺酶活性抑制剂。本发明的第3方面中，药品可以是皮肤外用药、对于必须进行细胞增殖抑制的疾病的治疗药或预防药、癌症的治疗药或预防药。

本发明的第4方面涉及准药，其特征在于：含有第1方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第5方面涉及化妆品，其特征在于：含有第1方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第6方面涉及食品，其特征在于：含有第1方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第7方面涉及具有下述理化学性质的化合物、其衍生物、或它们的可药用的盐：

(1)质谱：m/z565(M+H)⁺；

(2)MS/MS分析：上述(1)为母离子时，子离子为：m/z547、m/z338；

(3)¹H-NMR(氘代氯仿)：σ

0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468

(4)¹³C-NMR(氘代氯仿)：σ

14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.83

本发明的第8方面涉及神经酰胺酶活性抑制剂，其特征在于：含有选自本发明的第7方面的化合物、衍生物及其盐的至少一种作为有效成分。

本发明的第9方面涉及神经酰胺量调节剂，其特征在于：含有本发明的第8方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第10方面涉及药品，其特征在于：含有本发明的第8方面的神经酰胺酶活性抑制剂。本发明的第10方面中，药品是皮肤外用药、对于必须进行细胞增殖抑制的疾病的治疗药或预防药、癌症的治疗药或预防药。

本发明的第11方面涉及准药，其特征在于：含有本发明的第8方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第12方面涉及化妆品，其特征在于：含有本发明的第8方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明的第13方面涉及食品，其特征在于：含有本发明的第8方面的神经酰胺酶活性抑制剂。

本发明可提供神经酰胺酶活性抑制剂，含有该抑制剂的神经酰胺量调节剂、药品、准药、化妆品、食品。

本发明的抑制剂有望得到对动物细胞的抑制增殖、诱导分化、诱导编程性细胞死亡等的效果，进而，含有本发明的抑制剂的药品、对增进健康有用的食品有望获得对炎症性疾病、恶性肿瘤等起因于细胞的增殖或分化异常的疾病的治疗效果。将含有本发明的抑制剂的乳剂、洗剂、或入浴剂涂布于皮肤，或使其接触，则有望使健康人或特应性皮炎患者的皮肤角质层的神经酰胺含量升高，获得使皮肤的保湿性、阻挡功能提高的效果。并且，通过抑制特应性皮炎相关微生物所产生的神经酰胺酶的活性，有望抑制特应性皮炎中皮肤神经酰胺的减少，获得改善干燥皮肤进而改善皮炎的效果。

附图简述

[图1]是表示本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的效果的图。

[图2]是表示本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的效果的图。

[图3]是表示本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的效果的图。

[图4]是表示本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的效果的图。

[图5]是表示本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的效果的图。

[图6]是表示本发明的化合物的质谱图。

[图7]是表示本发明的化合物的MS/MS分析的质谱图。

[图8]是表示本发明的化合物的¹H-NMR谱图。

[图9]是表示本发明的化合物的¹³C-NMR谱图。

具体实施方式

(1)本发明的神经酰胺酶活性抑制剂

本发明的神经酰胺酶活性抑制剂是抑制神经酰胺酶(セラミ一ダ)的酶活性的物质，但它不一定必须直接作用于神经酰胺酶来抑制该活性。本发明的神经酰胺酶活性抑制剂例如有神经酰胺酶抑制剂。以下，为了方便，也可将神经酰胺酶活性抑制剂称为神经酰胺酶抑制剂。

本发明的神经酰胺酶活性抑制剂对神经酰胺酶的酶活性的抑制作用是指：与神经酰胺酶本来的活性比较，使该活性降低的作用，例如可通过后述的参考例1的方法确认。关于神经酰胺酶的酶活性的抑制作用，只要是与神经酰胺酶本来的活性比较使其活性降低了即可，没有特别限定，例如可以是抑制5％，优选10％，更优选20％，进一步优选40％、60％、80％、90％。

本发明的神经酰胺酶抑制剂以来源于规定植物的处理物或来源于该处理物的特定的化合物等作为有效成分，对神经酰胺酶、特别是中性/碱性神经酰胺酶显示优异的抑制活性。本发明的神经酰胺酶抑制剂可以含有有效成分本身。另外，对于来源于处理物的化合物等的描述只是表示化合物等的起源，与植物没有关系、另外合成的与该化合物等相同的化合物等也包含在本发明的有效成分中。

本发明中作为有效成分使用的来源于植物的处理物(以下可称为本发明的处理物)只要是对植物实施人为处理而得到的即可，没有特别限定，例如有提取物、精油(例如水蒸气蒸馏物、榨汁液、压榨物、溶剂提取物、超临界流体提取物)。这些处理物可以分别单独或将2种或以上混合使用。本发明所使用的植物有选自银杏科植物、葫芦科植物、芸香科植物、海带科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一种。

这些来源于植物的处理物只要至少对中性/碱性神经酰胺酶显示抑制活性即可，没有特别限定。从植物的处理物的神经酰胺酶活性抑制作用优异的角度看，优选使用以下例举的植物。

例如，本发明所使用的银杏科(Ginkgoaceae)植物可优选使用银杏(Ginkgo biloba、Ginkgoaceae)，主要使用叶。

本发明所使用的葫芦科(Cucurbitaceae)植物可优选使用菜瓜(Cucumis melo L.var.conomon Makino)或香瓜(Cucumis melo L.var.makuwa Makino)、甜瓜(Cucumis meloL.)，主要使用果实。还可优选使用黄瓜(Cucumis sativus L.)、冬瓜(Benincasa ceriferaSavi)、苦瓜(Momordica charantiaL.)，主要使用果实。葫芦科植物更优选使用菜瓜、黄瓜、冬瓜和苦瓜的1种或2种或以上。

本发明所使用的芸香科(Rutaceae)植物优选使用橙(甜橙(Citrussinensis)、酸橙(Citrus aurantium)或桔(Citrus reticulate))、葡萄柚(Citrus Paraadisi)或来檬(Citrus aurantifolia)的1种或2种或以上，主要使用果实。也可以在本发明中使用从橙的皮中提取的油--苧烯。

本发明中使用的海带科植物、特别是褐藻类海带科(Laminariaceae)植物优选使用粘液海带(Kjellmaniellacrassifolia Miyabe)、海带(Laminaria japonica Areschoug)或裙带菜(Undaria pinnatifida)的1种或2种或以上，主要使用叶、茎或孢子叶。

本发明中使用的桃金娘科(Myrtaceae)植物可优选使用桉、即常绿高大树木桉树或其近缘植物(蓝桉(Eucalyptus globulus)、柠檬桉(Eucalyptus citriodora)或薄荷桉(Eucalyptus dives))，主要使用叶。

本发明中使用的菊科(Compositae)植物可优选使用艾蒿(Artemisi avulgaris L.var.indica Maxim.)，主要使用叶。

但是，使用上述植物时，对于本发明所使用的植物的组织并不限于上述，例如可以使用根茎、叶、果实、孢子叶或植物整体。本发明的处理物的原料可以使用切细物、破碎物、干燥物等加工品。本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的制备可以将上述植物单独或组合使用。

关于本发明所使用的这些植物或它们的处理物以及后述的本发明的特定的化合物具有中性/碱性神经酰胺酶抑制效果，这是完全不为人知的。

本发明中使用的植物的提取物的提取方法例如可为如下方法：将上述植物直接或将干燥粉碎品通过通常的植物成分提取用溶剂提取，馏去溶剂。提取溶剂例如可以将甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇等低级醇或乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇等多元醇，丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、二氯乙烷、甲苯、正己烷、石油醚等各种有机溶剂或水等单独或组合使用。从提取物的提取效率、收量的角度看，特别优选水、乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇或乙醇水溶液、丙二醇水溶液、1，3-丁二醇水溶液。

提取方法可以采用通常的植物成分提取所使用的条件，例如可在4-100℃下，将上述植物在提取溶剂中浸泡或加热回流数小时至数周，可根据所使用的原料植物、植物体的部位、形态等适当设定最佳方法。此时，可按照后述的参考例1的方法测定提取物对中性/碱性神经酰胺酶的抑制活性，设定提取方法，使抑制活性有最大值。

使用精油作为本发明的处理物时，也可以按照通常使用的方法制备。例如可采用水蒸气蒸馏法、榨汁法、压榨法、溶剂提取法、超临界流体萃取法等，从上述植物中制备。

植物的提取物的提取方法、精油的制备方法可按照公知的方法进行，例如可参照バィォセパレ一ショソ便览(1996年、化学工学会“生物分离工学特别研究会”编)。

以上的植物提取物、精油可作为本发明的处理物直接使用，还可采用吸附分配色谱、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、正相分配色谱、反相分配色谱等色谱进行纯化，通过测定所分离出的级分对中性/碱性神经酰胺酶的抑制活性，可以以高纯度分选活性高的组分，或分离具有中性/碱性神经酰胺酶抑制活性的物质并使用。还可单独使用中性/碱性神经酰胺酶抑制活性高的组分，也可以以将多种组分混合得到的混合物的形式使用。

本发明的神经酰胺酶活性抑制剂可以使用选自以下的化合物、其衍生物以及它们的可药用的盐的至少一种作为有效成分。该化合物是从具有神经酰胺酶活性抑制作用的裙带菜孢子叶中得到的新型化合物，图6表示其质谱，图7表示其MS/MS分析质谱、图8表示其¹H-NMR谱、图9表示其¹³C-NMR谱。该化合物的分离方法、各种谱的测定方法、测定结果、神经酰胺酶活性抑制作用等的详细情况可参照后述的实施例11。即，具有上述物理化学性质的化合物及其衍生物、以及它们的可药用的盐(本说明书中可称为化合物等)具有神经酰胺酶活性的抑制作用，可与本发明的处理物发挥同等的功能。这些化合物是在本发明中首次分离出的，也包含在本发明中。

本发明的化合物可例举以下的式(1)所示的化合物。

[化1]

本发明中，优选盐为可药用的盐。本发明所使用的上述式(1)所表示的化合物的衍生物例如有酯等容易在体内水解、并可发挥所希望的效果的衍生物(前药)。将本发明的化合物给予哺乳动物被代谢得到的衍生物也包含在本发明的衍生物中。所述前药的制备可按照公知的方法进行。所述衍生物可以是它们的盐。因此，只要可得到本发明所需的效果，本发明的有效成分中也包含本发明的化合物的衍生物及其它们的盐。只要是具有神经酰胺酶活性抑制作用，本发明中使用的化合物的旋光异构体、酮-烯醇互变异构体、几何异构体等各种异构体、各异构体的分离物都可在本发明中使用。

本发明中使用的盐例如有碱金属盐、碱土金属盐、与有机碱的盐等。所述盐优选可药用的盐。本发明中使用的可药用的盐是指对生物基本上无毒、且具有神经酰胺酶活性抑制作用的化合物的盐。该盐例如有钠、钾、钙、镁、铵或质子化的苄星青霉素(ベソザチソ)(N，N’-二-苄基乙二胺)、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)等的盐。

本发明的神经酰胺酶抑制剂只要是抑制神经酰胺酶活性的物质即可，其剂型没有特别规定。上述神经酰胺酶活性抑制剂中所使用的添加物没有特别限定，可以使用公知的基质。本发明的神经酰胺酶抑制剂可以将本发明的有效成分和公知的基质适当混合，例如可以以试剂的形式制备。本发明的神经酰胺酶抑制剂例如可以与作为神经酰胺量调节剂、药品(包括皮肤外用药、细胞增殖抑制剂、癌症治疗药或预防药)、准药、化妆品、食品使用的物质混合使用。

作为本发明的神经酰胺酶抑制剂中的有效成分的含量，当有效成分为本发明的处理物时，干燥重量优选0.000001-100重量％，更优选0.00001-20重量％；当有效成分为本发明的化合物等时，优选0.000001-100重量％，更优选0.00001-20重量％。将本发明的神经酰胺酶抑制剂与上述药品等混合时，其混合量并没有特别限定，干燥重量优选0.000001-100重量％，更优选0.00001-20重量％，进一步优选0.0001-10重量％左右的范围。

含有本发明的有效成分的神经酰胺酶活性抑制剂通过其生理作用，可用于细胞增殖、癌症、炎症、皱纹形成(皮肤弹性降低、皮肤的肥厚机理)、皮肤角质层阻挡功能、干燥皮肤、微生物感染、皮肤免疫的研究，另外，除本发明的药品外，还可用于鞘脂(神经酰胺)相关的疾病用药品、皮肤外用药、细胞增殖抑制剂、癌症治疗药或预防药的筛选。

本说明书中“含有”一词有时包括稀释和添加的意思使用。这里“添加”包括向原料中添加本发明中使用的有效成分的方式，“稀释”包含本发明中使用的有效成分被添加到原料中，或原料被添加到本发明中使用的有效成分中，由此使有效成分被稀释的方式。

(2)本发明的神经酰胺量调节剂

本发明的神经酰胺量调节剂只要是具有通过本发明的神经酰胺酶抑制剂所具有的神经酰胺酶抑制作用来调节神经酰胺量的效果即可，没有特别限定。这里，“调节神经酰胺量的效果”是指：例如如下述实施例6-10所记载，由神经酰胺酶抑制剂导致的培养细胞、人工皮肤中的神经酰胺量的升高、以及对于升高的神经酰胺量通过适当选择神经酰胺酶抑制剂的添加量来达到所需的神经酰胺量降低的效果。虽无特别限定，但本发明的神经酰胺量调节剂调节鞘脂的基本骨架--神经酰胺量，因此可以调节作为控制细胞的增殖、分化、编程性细胞死亡等的信息分子的鞘脂量，调节与皮肤的保湿功能、阻挡功能相关的主要细胞间脂质成分--神经酰胺量。本发明的神经酰胺量调节剂除调节神经酰胺量之外，还可通过参与神经酰胺的代谢来发挥鞘氨醇量、脂肪酸量、鞘氨醇-1-磷酸量调节剂的功能，因此可作为鞘氨醇量调节剂、脂肪酸量调节剂、鞘氨醇-1-磷酸量调节剂使用。

本发明的神经酰胺量调节剂的剂型没有特别规定，可以将本发明的神经酰胺酶抑制剂与公知的基质适当混合，例如可以以试剂的形式制备。本发明的神经酰胺量调节剂中，本发明的神经酰胺酶抑制剂(有效成分)的含量可以是将本发明的神经酰胺酶抑制剂与药品等混合时与该抑制剂的混合量同样的范围。本发明的神经酰胺量调节剂的用途没有特别限定，优选作为与神经酰胺相关的生物化学研究的试剂使用。

(3)本发明的药品等

本发明的药品含有本发明的神经酰胺酶活性抑制剂，可提供作为皮肤外用药(保湿剂、阻挡功能保持剂、皮肤弹性提高剂或保持剂、皮肤肥厚改善剂或预防剂、上述用途的软膏、乳膏、乳液、洗剂、面膜、浴用剂等)、细胞增殖抑制剂、抗炎症药、癌症治疗药或预防药、神经酰胺或其代谢产物介导的信号转导相关疾病的治疗药或预防药。其中，本发明的药品作为皮肤外用药、必须抑制细胞增殖的疾病的治疗药或预防药，或者癌症治疗药或预防药非常有用。

神经酰胺是皮肤中主要的细胞间脂质成分，对于皮肤的保湿功能、阻挡机制具有重要的作用。特应性皮炎患者的皮肤角层中，神经酰胺含量减少，这可认为是作为特异性皮炎特征的干燥皮肤以及角层阻挡功能异常的原因之一，有使疾病恶化的可能性。另外，已知神经酰胺量的减少会使皮肤弹性降低、增进皮肤肥厚。如后述实施例所示，本发明的有效成分可通过抑制分解神经酰胺的神经酰胺酶的活性，使细胞内外的神经酰胺量增加，或者抑制神经酰胺量的减少。因此，含有本发明的有效成分的本发明的药品有望具有上述的疾病、症状的治疗或预防效果。

关于与细胞的增殖、分化、编程性细胞死亡等的控制相关的鞘脂(鞘糖脂、鞘磷脂以及它们的代谢产物神经酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸等)，它们在癌症、自身免疫疾病、感染病、皮炎、关节炎等炎症等疾病中的代谢以及这些分子介导的信号、信号转导受到人们的注意。其中可认为神经酰胺是作为鞘脂的基本骨架的脂质，是调控细胞的生与死的重要的因子。因此，神经酰胺的代谢异常可引起细胞的增殖或分化的异常，成为炎症性疾病、恶性肿瘤(癌)等起因于上述异常的疾病的原因。例如，已知对癌细胞进行抗癌药处理、放射线照射，则细胞内的神经酰胺水平升高，癌细胞发生编程性细胞死亡，但有报道称：获得抗癌药耐性的癌细胞中，神经酰胺的代谢酶、例如用于将葡萄糖转移到神经酰胺上的葡糖基转移酶的活性升高，而细胞内的神经酰胺水平不升高(例如Lavie，Y.，Cao，H.，Bursten，S.L.，Giuliano，A.E.，和Cabot，M.C.(1996)J.Biol.Chem.271，19530-19536)。如后述实施例所示，本发明的有效成分通过对分解神经酰胺的神经酰胺酶活性的抑制，可以进行细胞的增殖抑制、编程性细胞死亡的诱导。因此，含有本发明的有效成分的本发明的药品有望抑制神经酰胺代谢异常的发生或改善该异常，有望获得上述疾病、症状的治疗或预防效果。本发明的药品可发挥细胞增殖的抑制效果，因此可作为细胞增殖抑制剂使用。

如上所述，葡糖基转移酶可能与神经酰胺的代谢异常有关，因此，本发明的药品通过与神经酰胺酶以外的神经酰胺代谢酶例如葡糖基转移酶的抑制剂一起使用，例如有望获得多药耐药性的癌症治疗或预防效果。

下面对本发明的药品的制备方法进行说明。本发明的药品以本发明的神经酰胺酶活性抑制剂作为有效成分，可将该有效成分与公知的药用的载体组合，制成制剂。通常，将本发明的有效成分与可药用的液态或固态载体混合，根据需要，添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋型剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂以及通常的溶液剂、混悬剂、乳剂等液体制剂。也可以制成在使用前添加适当的载体而成为液态的干燥品、外用药。

药用载体可根据本发明的药品的给药形式和剂型选择，为口服制剂时，例如可利用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在制备口服制剂时，还可以混合粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、促流剂、矫味剂、着色剂、香料等。

另一方面，当为非口服制剂时，可按照常规方法，将本发明的有效成分溶解或悬浮于作为稀释剂使用的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根据需添加杀菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等来制备。

皮肤外用药包含经皮给药用的固体、半固体或液态的制剂。另外也包含栓剂。例如可以制成乳剂、洗剂等乳浊剂，外用酊剂等液体制剂，油性软膏、亲水性软膏等软膏剂，薄膜剂、贴剂、泥敷剂等经皮给药用的贴剂等。

本发明中包含的细胞增殖抑制剂、癌症的治疗药或预防药有望获得本发明的神经酰胺酶活性抑制剂的编程性细胞死亡诱发作用、细胞增殖抑制或预防效果、癌症治疗效果。本发明的药品可通过制药领域公知的方法制造。本发明的药品中，本发明的神经酰胺酶抑制剂(有效成分)的含量可以是在将本发明的神经酰胺酶抑制剂与药品混合时，与该抑制剂的混合量同样的范围。

本发明的药品可根据制剂形式以适当的给药途径给药。给药方法没有特别限定，可以内服、外用和注射。注射剂例如可以通过静脉内、肌内、皮下、皮内等给药。

本发明的药品的给药量可根据其制剂形式、给药方法、使用目的以及该药品的给药对象患者的年龄、体重、症状来适当决定，并不是一成不变的。通常，对于制剂中含有的有效成分的给药量，以干燥重量计算，优选成人每天为0.1-2000mg/kg体重。当然，给药量根据各种条件而变动，因此有时以比上述给药量少的量也足够，或者有必须超过上述范围的情况。给药可以是在所需的给药量范围内，1天内一次给药或分数次进行。本发明的药品除可直接口服之外，还可以添加到任意的饮料食品中进行日常摄取。

作为皮肤外用药使用时，除本发明的有效成分外，可根据需要适当混合通常化妆品、药品等皮肤外用药所使用的成分，例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增粘剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、色素等。

本发明的准药的特征是含有本发明的神经酰胺酶活性抑制剂。本发明的准药没有特别限定，包括对人体作用缓慢的含漱剂、牙膏、口腔清凉剂、健胃清凉剂、含维生素保健剂、含片、防晒水、皂、毛发染色剂、生理卫生巾、浴用剂、防止口臭、体臭、痱子、毛发脱落并以育毛或脱毛为目的的物质以及它们的类似物。本发明的准药有望获得与本发明的药品同样的效果。

本发明的准药可将本发明的神经酰胺酶抑制剂和公知的基质适当混合，以任意的形式制备。本发明的准药中，本发明的神经酰胺酶抑制剂(有效成分)的含量可以是在将本发明的神经酰胺酶抑制剂与药品混合时，与该抑制剂的混合量同样的范围。

(4)本发明的化妆品

本发明的化妆品含有本发明的神经酰胺酶活性抑制剂，本发明的化妆品所希望的效果的表达基于所述化妆品中所含的该抑制剂(有效成分)所具有的上述生理作用。在包括角层和/或角质层的皮肤内部，如果神经酰胺量增加，则推断可提高保湿性、阻挡效果、皮肤的张力、弹性、保湿性(湿润)。因此，本发明的化妆品例如可以有效提高皮肤的张力、弹性。即，可以提供以本发明的神经酰胺酶活性抑制剂为有效成分的改善保湿性作用或预防其恶化作用、改善阻挡效果作用或预防其恶化作用、改善皱纹作用或预防作用、提高皮肤的弹性作用或保持作用、改善皮肤肥厚作用或预防作用、增强神经酰胺生成作用或抑制减少作用或者细胞增殖抑制作用优异的化妆品。该化妆品可制成标示如下意图的化妆品，即，所述化妆品用于表达例如由抗肿瘤活性、改善保湿性作用或预防其恶化作用、改善阻挡效果作用或预防其恶化作用、改善皱纹作用或预防作用、提高皮肤的弹性作用或保持作用、改善皮肤肥厚作用或预防作用、增强神经酰胺生成作用或抑制减少作用或者细胞增殖抑制作用所带来的所需效果。

本发明的化妆品中，作为本发明的有效成分的含量，干燥重量通常优选0.0001-20重量％，更优选0.001-5重量％，进一步优选0.03-3重量％。

本发明的化妆品中，作为本发明的有效成分以外的其它成分，可以根据需要含有1，3-丁二醇、吡咯烷酮羧酸盐等保湿剂，液体石蜡、凡士林、橄榄油、角鲨烷、羊毛脂、合成酯油等皮肤柔润剂，椰油、棕榈油等油脂类，维生素E等维生素类，蜜蜡、丙二醇单硬脂酸酯、硬脂酸等表面活性剂，硬脂基醇等乳化稳定助剂、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯氢化蓖麻子油等增溶剂，对羟基苯甲酸甲酯等防腐剂，颜料，香料，抗氧化剂，紫外线吸收剂，药理活性物质，基质，表面活性剂等。还可以结合使用以甘油、丙二醇、聚乙二醇、透明质酸为代表的多糖类等具有保水作用的物质。

关于本发明的化妆品的形状，只要可得到有效成分的上述生理作用即可，没有特别限定，例如优选化妆水类、乳液类、乳膏类、面膜类、浴用剂、洗面剂、浴皂、浴用洗剂或软膏。

本发明的化妆品可使用本发明的有效成分以及根据需要的上述其它成分作为原料，按照化妆品领域公知的方法适当地制备。例如，与后述的食品、饮料等同样，也可以按照饮料食品领域的公知的方法，制造适合口服摄取的化妆品。

例如，在上述含有量范围内含有本发明的有效成分的化妆品、例如化妆水类，按照各自的用途形式，将所需的量用于例如人的整个面部时，每次优选使用0.01-5g、更优选0.1-2g左右，这可得到以下的本发明所希望的效果：可得到保湿效果、阻挡效果、改善皱纹效果或预防效果、提高皮肤弹性的效果或保持效果、改善皮肤肥厚效果或预防效果、增强神经酰胺生成效果或抑制减少的效果以及细胞增殖抑制效果，使皮肤富有张力、光泽，得到美化肌肤的效果等。

本说明书中的皮肤包括面部、颈部、胸部、背部、腕部、手部、腿部、脚部、臀部以及头皮等包覆人、动物的外侧的所有部分。

(5)本发明的食品

本发明的食品含有本发明的神经酰胺酶活性抑制剂，本发明的食品的所希望的效果的表达基于所述食品中所含的该抑制剂(有效成分)所具有的上述生理作用。本发明提供含有本发明的神经酰胺酶抑制剂的食品，该食品的特征在于：与以往的食品相比，高浓度和/或高纯度含有本发明的神经酰胺酶抑制剂。也就是说，通过摄取本发明的食品，有望获得抑制细胞增殖、诱发编程性细胞死亡等的效果，可有效地发挥神经酰胺相关疾病的治疗或预防的作用。该食品可以制成标示如下意图的健康食品(特定保健用食品)，即，所述健康食品用于表达例如由细胞增殖抑制活性、编程性细胞死亡诱发活性带来的所希望的效果。本发明的食品也包含饮料，为了方便，可将饮用形式的食品称为饮料，将饮用形式以外的食品称为食品。

本发明的食品只要是含有本发明的神经酰胺酶活性抑制剂即可，没有特别限定。例如有：含有谷物加工制品(小麦粉加工制品、淀粉类加工制品、预混加工制品、面类、通心粉类、面包类、豆馅包类、荞麦面类、麦麸、米粉、粉丝、包装糯米糕点等)、油脂加工制品(塑性油脂、炸油、色拉油、蛋黄酱、调味酱等)、大豆加工制品(豆腐类、豆酱、纳豆等)、食用肉类加工制品(火腿、腊肉、压制火腿、红肠等)、水产制品(冷冻碎鱼肉、鱼糕、圆筒状鱼糕、鱼糕片、炸胡萝卜鱼肉片、氽鱼丸、筋、鱼肉火腿、肠、鲣鱼刨花、鱼卵加工制品、水产罐头、甜烹海味等)、乳制品(原料乳、奶油、酸乳酪、黄油、干酪、练乳、奶粉、冰激凌等)、蔬菜·果实加工制品(糊类、果酱类、咸菜类、果实饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)、糕点类(巧克力、饼干类、糕点面包类、蛋糕、糯米糕点(日本式)、糯米饼干类等)、酒精类(日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌、烧酒、伏特加、白兰地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉酒精饮料、果酒、利口酒等)、嗜好饮料(绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)、调料(酱油、酱汁、醋、甜料酒等)、罐装·瓶装·袋装食品(牛肉饭、盖浇饭、红豆饭、咖哩、其它各种加工食品等)、半干燥或浓缩食品(肝酱、其它调味酱、荞面·面条汁、浓缩汤类等)、干燥食品(快餐面类、快餐咖哩、速溶咖啡、果汁粉、汤粉末、快餐酱汤、加工食品、加工饮料、加工汤等)、冷冻食品(鸡素烧、蒸鸡蛋羹、烤鳗鱼、汉堡牛排、烧麦、饺子、各种浓肉汤、果汁鸡尾酒等)、固态食品、液体食品(汤等)、香辛料类等农产·林产加工制品、畜产加工制品、水产加工制品等。这些食品可使用本发明的神经酰胺酶活性抑制剂，按照公知的食品制造方法制造。

本发明的食品中，本发明的有效成分的含量没有特别限定，可从其感官和作用的表达的角度考虑适当选择。对于本发明的有效成分的含量，当为食品时，干燥重量例如每100重量份食品本身的原料中优选0.0001重量份或以上，更优选0.001-10重量份；当为饮料时，干燥重量例如每100重量份饮料本身的原料中优选0.0001重量份或以上，更优选0.001-10重量份。

本发明的食品中，上述有效成分可单独或含有、添加和/或稀释多种，根据其使用形式，有效成分的含量只要是相当于抑制神经酰胺酶活性所必需的量即可，对其形状没有特别限定，也包括片状、颗粒状、胶囊状、软胶囊状、液状、粉末状等形状的可口服摄取的形状物质。

(6)本发明的神经酰胺酶活性抑制方法

本发明的神经酰胺酶活性抑制方法是对生物体(例如哺乳动物、来自哺乳动物的组织、来自哺乳动物的细胞、真菌、酵母、担子菌等细胞)或来自生物体的试样(例如细胞提取物或其纯化物)使用本发明的有效成分，抑制神经酰胺酶活性的方法，通常，可根据它们的使用方式，将本发明的神经酰胺酶活性抑制剂、神经酰胺量调节剂、药品、准药、化妆品或食品用于生物体或来自生物体的试样来进行实施。使用的方法只要是将本发明的有效成分与生物体或来自生物体的试样接触即可，没有特别限定，例如有：将本发明的有效成分给予哺乳动物、将本发明的有效成分添加到来自哺乳动物的细胞培养液中等方法。

本发明的神经酰胺酶活性抑制方法例如可用于细胞增殖异常、癌症、自身免疫疾病、皮肤免疫异常、感染症、皮炎、关节炎等炎症、皱纹的形成(皮肤弹性降低、皮肤肥厚的机理)、皮肤角质层阻挡功能异常、干燥皮肤的治疗、症状的缓和及其研究，神经酰胺的制造、纯化。

本发明的神经酰胺酶活性抑制方法的实施方案只要是本发明的有效成分可发挥抑制活性即可，没有特别限定，可以抑制生物体、细胞、组织以及来自它们的试样的神经酰胺酶活性。

实施例

以下给出实施例，进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。

制备例1神经酰胺酶的制备

使用来源于绿脓杆菌((Pseudomonas aeruginosa AN17菌株)的神经酰胺酶和来源于大鼠脑的神经酰胺酶两种作为中性/碱性神经酰胺酶。

绿脓杆菌AN17菌株是从特应性皮炎患者的皮肤屑中分离的菌株，生产中性/碱性神经酰胺酶[Journal of Biological Chemistry、第273卷、第14368-14373页(1998)]。上述菌株被命名为AN17，于平成8年(1996年)6月26日(原保藏日)以保藏号FERM P-15699保藏于

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。神经酰胺酶粗制酶液如下制备。

将绿脓杆菌AN17菌株在含有鞘磷脂的蛋白胨酵母提取液培养基(0.5％蛋白胨、0.1％酵母提取物、0.5％NaCl、0.01％鞘磷脂(シグマ公司制造)、0.05％牛黄脱氧胆酸钠(TDC)、pH7.2)、在30℃培养3天，离心得到培养上清。将其过Q-琼脂糖FF(Pharmacia公司制造、2.5×20cm)，其中所述Q-琼脂糖FF预先用含有0.1％ルブロ一ル(Lubrol)PX(ナカラィテスク公司制造)的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡，然后用2mL/分钟的流速流入该缓冲液，洗涤柱子，然后用最高1M的NaCl梯度将酶洗脱出来。回收活性组分，添加牛血清白蛋白(BSA)，使终浓度为1mg/mL，用含有0.1％ルブロ一ルPX的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)进行透析，得到粗制酶标品。

另一方面，按照以下的方法制备来自大鼠脑的神经酰胺酶粗制酶液。首先，使用ポッタ一ェルベヅェム型匀浆器，将2个大鼠脑组织(3.5g)在30mL 0.25M蔗糖溶液中匀浆。将其以700×g离心10分钟，然后将上清以25,000×g离心10分钟，再将得到的上清以100,000×g离心60分钟，将得到的沉淀悬浮于3mL25mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中。向其中加入9mL含有0.5％Triton X-100的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，在冰上放置2小时，进行萃取。将其以100,000×g离心60分钟，回收上清，制成粗制酶标品。

实施例1裙带菜孢子叶提取物的制备

向10g干燥的裙带菜孢子叶片中加入100mL乙醇，轻轻地搅拌数次，静置一天。将其过滤，得到裙带菜孢子叶乙醇提取液。1mL提取物的干燥重量是4mg。

实施例2海带提取物、粘液海带提取物的制备

向10g干燥的海带片中加入100mL乙醇，轻轻地搅拌数次，静置一天。将其过滤，得到海带的乙醇提取液。1mL提取物的干燥重量是2.7mg。

对于粘液海带也同样地得到提取液。1mL提取物的干燥重量是1.8mg。

实施例3各种植物提取物的制备

将银杏叶、菜瓜果实、冬瓜果实、黄瓜果实、苦瓜果实、艾蒿叶用匀浆器制成汁液状，然后冷冻干燥，每1g中加入10mL乙醇，静置过夜，进行萃取。过滤，得到乙醇提取液。1mL银杏叶提取物的干燥重量是15mg，1mL菜瓜提取物的干燥重量是120mg，1mL冬瓜提取物的干燥重量是53mg，1mL黄瓜提取物的干燥重量是45mg，1mL苦瓜提取物的干燥重量是42mg，1mL艾蒿提取物的干燥重量是43mg。

橙油、葡萄柚油等植物精油使用山本香料(株)销售的产品。

参考例1神经酰胺酶抑制活性测定

对于来源于绿脓杆菌的中性/碱性神经酰胺酶(绿脓杆菌神经酰胺酶)的抑制活性的测定如下进行。首先，将绿脓杆菌神经酰胺酶用稀释缓冲液(含有5mM氯化钙、0.45％牛血清白蛋白的100mM Tris-盐酸缓冲液pH8.5)稀释至适当的酶浓度，将10μL该稀释酶液与5μL抑制剂混合，在37℃保温10分钟。向其中加入10μL含0.05mM或1.5mM NBD-C12-神经酰胺(マトレァ公司制造)、5mM CaCl₂、0.5％Triton X-100的Tris-盐酸缓冲液pH8.5的底物溶液，再在37℃反应30分钟。加入75μL甲醇，终止反应，将其中的25μL用于HPLC分析。

对于来源于大鼠脑的中性/碱性神经酰胺酶(大鼠脑神经酰胺酶)的抑制活性的测定如下进行。首先，将来源于大鼠脑的神经酰胺酶用稀释缓冲液(含有12.5mM氯化镁的100mM甘氨酸-NaOH缓冲液pH9.5)稀释至适当的酶浓度，将10μL该稀释酶液与5μL抑制剂混合，在37℃保温10分钟。向其中加入10μL含0.05mM或1.5mM NBD-C12-神经酰胺、1.25％牛黄脱氧胆酸的100mM甘氨酸-NaOH缓冲液pH9.5的底物溶液，再在37℃反应2小时。加入75μL甲醇，终止反应，将其中的50μL用于HPLC分析。

HPLC分析如下进行。柱使用Cosmosil 5C18-AR-II、4.6×50mm(ナカラィテスク公司制造)，洗脱液使用MeOH/1％TFA＝90∶10(v/v)，通过等度洗脱进行洗脱。流速1mL/分钟，检测使用荧光检测器，以激发光465nm、荧光535nm进行。

对于每种酶，样品以酶+抑制剂+底物、对照为酶+底物、空白为抑制剂+底物的组合进行反应，通过对照的活性为100％时的样品活性的比例来计算抑制率。

本说明书中，单指参照参考例1的方法时，意指使用来源于大鼠脑的中性/碱性神经酰胺酶的方法。

实施例4海藻提取物、植物提取物等对神经酰胺酶的抑制效果

采用参考例1的方法，使用终浓度为0.6mM的NBD-C12-神经酰胺为底物，测定实施例1-3中得到的各种海藻、植物提取物等对神经酰胺酶的抑制活性。结果如表1所示。海藻、植物提取物和橙油(苧烯)的稀释用二甲基亚砜进行。

[表1]

植物提取物等	稀释倍率	神经酰胺酶抑制率(％)
				绿脓杆菌神经酰胺酶	大鼠脑神经酰胺酶
		银杏	2510			77.928.18.5	63.153.153.9
冬瓜	2510			76.358.544.9	74.982.276.5
		苦瓜	2510			76.670.361.8	60.580.075.1
菜瓜	2510			69.169.049.9	69.385.083.0
		黄瓜	2510			34.331.715.6	65.957.449.4
艾蒿	2510			29.413.45.4	51.343.142.3
		海带	102050			83.869.941.4	83.382.678.4
粘液海带	102050			60.544.235.9	78.773.867.9
		橙油	1020			16.918.1	53.947.7

实施例5裙带菜孢子叶提取物对神经酰胺酶的抑制效果

分别用5mL100％乙醇、50％乙醇、25％乙醇溶液对各1g干燥的裙带菜孢子叶片萃取过夜，过滤，得到裙带菜孢子叶提取液。1mL提取物的干燥重量分别是8mg、72mg、74mg。采用参考例1的方法，使用终浓度为0.02mM的NBD-C12-神经酰胺作为底物，测定裙带菜孢子叶提取物的抑制活性。该提取物的10倍稀释液对神经酰胺酶的抑制率分别为71％、43％、11％。

实施例6海藻、植物提取物对人白血病培养细胞的效果(TLC)

将人前髓细胞性白血病细胞株HL60在含有10％胎牛血清和1％青霉素·链霉素液(GIBCO BRL公司制造，批号：20K1346)的RPMI-1640培养基中、在37℃、5％CO₂环境下培养。将培养细胞通过1500rpm的离心回收，将细胞粒用Ultra DOMA-PF培养基(BioWhittaker公司制造)清洗，计数细胞数，最终调节为2×10e⁷细胞/1.8mL的浓度，在6孔板中各分注1.8mL，再在相同环境下继续培养2小时。将2mL

实施例1-3中得到的各种海藻、植物提取物预先浓缩离心，馏去溶剂，然后加入40μL的二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，再加入1.8mLUltraDOMA培养基。此时，向1.8mL上述培养细胞中各添加0.2mL该提取物稀释液，在37℃、5％CO₂环境下培养3小时。对于对照组，只将与制备提取物稀释液时使用的相同的稀释成分加入到培养液中。如下所述进行测定取样，制备测定活细胞数和鞘脂用的样品。

用微量移液管将培养细胞液回收到10mL带有螺旋盖的玻璃管中，取40μL用于活细胞计数。向其中加入140μL Ultra DOMA培养基、20μL锥虫蓝，用血细胞计数板计测活细胞数。使用余下的细胞制备鞘脂测定用样品。将培养细胞以1500rpm离心5分钟，将细胞粒用1mL的PBS清洗3次。向洗净的细胞粒中加入1mL含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks缓冲液[HBSS、Life Technologies Inc.]，将其作为脂质分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。

由分析用样品中如下进行脂质的提取。

向1mL分析样品中加入3mL氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，用摇动器充分搅拌20分钟。将其以3,000rpm离心2分钟，将下层移入另外一个玻璃管中，用离心浓缩机完全馏去溶剂，使其干燥。将其作为薄层色谱(TLC)分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析在以下的条件下进行。

向TLC分析用样品中加入20μL氯仿/甲醇＝1∶1(v/v)，溶解，将其全量铺TLC板(メルク公司制造、HPTLC板硅胶60F254)。神经酰胺标准品使用无羟基脂肪酸神经酰胺(Non-hydroxy fatty acid ceramide)或无羟基神经酰胺(Non-hydroxyceramide)(III型神经酰胺、Sigma-Aldrich公司制造)和羟基脂肪酸神经酰胺(hydroxy fatty acidceramide)或羟基神经酰胺(hydroxyceramide)(IV型神经酰胺、Sigma-Aldrich公司制造)。以氯仿/甲醇/乙酸＝190∶9∶1(v/v)作为展开溶剂，进行2次展开，然后对TLC板进行磷酸-铜试剂(含有10％CuSO₃的8％磷酸溶液)喷雾，在160℃加热10分钟，用光密度计对显现出来的印迹进行定量。结果如图1所示。添加有冬瓜、苦瓜、艾蒿、葫芦、黄瓜、裙带菜孢子叶的提取物的组与对照组相比，细胞内的神经酰胺量增加。

实施例7裙带菜孢子叶提取物对人白血病培养细胞的效果(LCMS)

将人前髓细胞性白血病细胞株HL60在含有10％胎牛血清和1％青霉素.链霉素液(GIBCO BRL公司制造，批号：20K1346)的RPMI-1640培养基中、在37℃、5％CO₂环境下培养。将培养细胞通过1500rpm的离心分离回收，将细胞粒用Ultra DOMA-PF培养基(BioWhittaker公司制造)清洗，计数细胞数，最终调节为1×10e⁷细胞/1.8mL的浓度，在6孔板中各分注1.8mL，再在相同环境下继续培养2小时。将2mL裙带菜孢子叶提取物预先浓缩离心，馏去溶剂，然后加入40μL的二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，再加入1.8mLUltra DOMA培养基，将DMSO的浓度调节为2％。向1.8mL上述培养细胞中各添加0.2mL该植物提取物稀释液，在37℃、5％CO₂环境下培养24小时。对于对照组，只将与制备提取物稀释液时使用的相同的稀释成分加入到培养液中。如下所述在0小时、0.5小时、1小时、3小时进行测定取样，制备测定活细胞数和鞘脂用的样品。

用微量移液管将培养细胞液回收到10mL带有螺旋盖的玻璃管中，取40μL用于活细胞计数。向其中加入140μL Ultra DOMA培养基、20μL锥虫蓝，用血细胞计数板计测活细胞数。使用余下的细胞，按照真野等人的方法[Analytical Biochemistry、第244卷、第291-300页、1997年]对鞘脂进行定量。将培养细胞液以1500rpm离心5分钟，将细胞粒用1mL的PBS清洗3次。向洗净的细胞粒中加入1mL含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks缓冲液，将其作为脂质分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。

LCMS中使用的定量用鞘脂标准品如下制备。

鞘脂完全溶解于甲醇。将300μL1mg/mL的C18-鞘磷脂(C18-SM、マトレャ公司制造)、100μL10μg/mL的C18-神经酰胺(C18-Cer、マトレャ公司制造)、100μL10μg/mL的鞘氨醇(Sph、シグマ公司制造)、100μL3μg/mL的磷酸胆碱鞘氨苷(SPC、シグマ公司制造)、100μL1μg/mL的二甲基鞘氨醇(DMS、ァバソティリピッド公司制造)、100μL1μg/mL的鞘氨醇半乳糖苷(Psy、シグマ公司制造)和200μL甲醇混合，将总量制成1mL，以其作为标准液原液。在将其用甲醇稀释，制备10倍稀释液和100倍稀释液。取100μL各稀释液，加入到900μL含有0.1％BSA的HBSS中，充分搅拌，将其作为鞘脂标准混合液，使用之前一直保存在-30℃下。

如下从分析用样品和标准品中提取脂质。

向1mL分析样品中加入3mL氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，再加入作为内标的100μL1μg/mL的C2-神经酰胺(C2-Cer、マトレャ公司制造)甲醇溶液，用漩涡搅拌器充分搅拌10分钟。将其以3,000rpm离心2分钟，将下层移入另外的玻璃管中，用离心浓缩机完全馏去溶剂，使其干燥。将其作为LCMS分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。

LCMS在以下的条件下进行。

HPLC柱使用YMC公司制造的半微量短柱、YMC-Pack Pro C18(2.0×35mm，3μm、YMC公司制造)。洗脱液A为5mM甲酸铵/甲醇/四氢呋喃＝5∶2∶3(v/v/v)(含有终浓度为0.01％的甲酸)，洗脱液B为5mM甲酸铵/甲醇/四氢呋喃＝1∶2∶7(v/v/v)(含有终浓度为0.01％的甲酸)。经由分离机，将经HPLC流出的洗脱液导入离子喷雾式四极杆式质量分析装置(API300、ァプラィドバィォシステムズ公司制造)。喷嘴(ォレフィス)电压为70eV，离子喷雾电压为5000V、正向模式、使用氩气作为碰撞气体，以多重反应监测模式进行测定。监测离子如表2所示。

结果如图2所示。图中，裙带菜孢子叶提取物添加组用黑圆圈表示，对照组用白圆圈表示。A表示C18-鞘磷脂(C18-SM)、B表示C-16神经酰胺(C16-Cer)、C表示C18神经酰胺(C18-Cer)、D表示鞘氨醇(Sph)、E表示鞘氨醇-1-磷酸(SPP)、F表示HL60细胞数。裙带菜孢子叶提取物添加组与对照组比较，细胞内C16-Cer升高至约15倍，C18-Cer升高至约10倍。而神经酰胺的分解产物Sph与对照组比较增加了约4倍。裙带菜孢子叶提取物添加组与对照组比较，鞘氨醇的代谢产物鞘氨醇-1-磷酸显示稍微减少的倾向。C18-SM的水平没有变化。裙带菜孢子叶提取物添加组与对照组比较，HL60细胞的增殖得到显著抑制。使用ApopLadder Ex(宝生物工程公司制造)，从该细胞中提取DNA，进行使用1％琼脂糖凝胶的电泳，用溴化乙啶染色，裙带菜孢子叶添加组的细胞中检出片段DNA序列梯，表明细胞发生编程性细胞死亡。由这些结果表明，由于裙带菜孢子叶提取物的神经酰胺酶抑制效果，细胞内的神经酰胺量增加，细胞增殖受到抑制，细胞发生了编程性细胞死亡。

             [表2]

     LCMS多重反应监测(MRM)

化合物	监测离子
			先驱离子	产物离子
	C20-SM	760			184
C18-SM			732	184
	C16-SM	704			184
C20-Cer			594	264
	C18-Cer	566			264
C16-Cer			538	264
	C17：1-Cer	550			264
C2-Cer			342	264
	SPC	465			184
Psy			462	282
	DMS	328			310
Sph			300	282
	SPP	380			264

实施例8神经酰胺酶抑制剂对人工培养皮肤的效果

使用市售的正常人皮肤立体培养模型(クラボゥ公司制造、EPI-100)，测定神经酰胺酶抑制剂对皮肤细胞的效果。首先，预先向六孔培养板各孔中加入2mL EPI-100用维持培养基(无庆大霉素培养基)，再向各孔内加EPI-100的微型杯(ミニカップ)，在37℃、5％CO₂环境下培养72小时。将培养基更换为4mL新的培养基，然后向微型杯中加入50μL实施例1中得到的裙带菜孢子叶乙醇提取物的稀释液。裙带菜孢子叶乙醇提取物使用以下：先用旋转蒸发器除去溶剂，然后再溶解于载体(含有0.5％聚氧乙烯氢化蓖麻籽油的80％丙二醇)，使提取物的浓度为0.05％-0.001％(w/v)。将只添加载体的组作为对照。在37℃、5％CO₂环境下培养24小时，然后更换培养基，向微型杯中加入乙醇提取物，继续培养24小时。再更换一次培养基、添加乙醇提取物、培养24小时，然后取出微型杯，进行皮肤细胞中神经酰胺的测定。首先，将杯用生理盐水清洗，然后用镊子取出培养皮肤，转移至带有螺旋盖的玻璃试管中，冷冻干燥。向其中加入2mL氯仿/甲醇(2∶1)，一边时常搅拌，一边在室温下进行2小时的神经酰胺组分的萃取。以2,000rpm离心5分钟，然后将上清转移至另外的玻璃管中(上清1)。用浓缩离心装置干燥沉淀后，再次用2mL氯仿/甲醇(2∶1)进行萃取操作，离心得到上清(上清2)。将上清1和2合并，除去溶剂，将其作为薄层色谱(TLC)分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析按照与实施例6同样的方法进行。结果如图3所示。图中，黑柱表示无羟基神经酰胺，白柱表示羟基神经酰胺。裙带菜孢子叶乙醇提取物添加组与对照组相比，人工培养皮肤中的无羟基神经酰胺、羟基神经酰胺都随所添加的提取物的浓度而显著增加。图3中，相对于对照的t检验中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.005。

实施例9神经酰胺酶抑制剂对感染绿脓杆菌的人工培养皮肤模型的效果

有人指出：特应性皮炎患者的皮肤表面，埋于角层细胞的细胞间的神经酰胺减少，该减少引起皮肤阻挡功能不全，即外界抗原容易侵入到体内、以及过量的水分丧失到体外，进而可能与上述病症的发病和恶化有关。最近日本九州大学的伊东等人报告：在特应性皮炎患者的皮肤上统计学上显著高频率地检测出生产神经酰胺酶的细菌，这些细菌多数是绿脓杆菌[J.Biol.Chem.，273，14368-14373(1998)以及Clinc.Diagnost.Lab.Immun.，6，101-104(1999)]。另一方面，已知特应性皮炎患者的皮肤上高频率可见金黄色葡萄球菌的感染。伊东等人还报告：神经酰胺酶生产菌可生产溶解金黄色葡萄球菌的蛋白酶，溶解的金黄色葡萄球菌会溶出激活神经酰胺酶的心磷脂、磷脂酰甘油等阴离子性甘油磷脂[Biochem.J.，362，619-626(2002)]。由此可认为如果神经酰胺酶分泌菌绿脓杆菌感染特应性皮炎患者的皮肤，则可溶解金黄色葡萄球菌，由此溶出的甘油磷脂激活神经酰胺酶，皮肤角质层的神经酰胺水平降低。

这里，使绿脓杆菌感染正常人皮肤立体培养模型(EPI-100)，向该体系中添加神经酰胺酶抑制剂，评价其效果。

首先，用L-broth(宝生物工程公司制造)，在30℃培养绿脓杆菌(绿脓杆菌AN17菌株)，在A660nm的值为0.6时，终止培养，回收菌体。将其用PBS清洗，悬浮于PBS，达到4×10⁷cfu/mL。另一方面，用L-broth在30℃液体培养金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，在A660nm的值为0.6时，终止培养，回收菌体。将菌体用PBS清洗，悬浮于PBS，达到20×10⁷cfu/mL，将悬浮液在100℃处理5分钟，制备死菌。将该金黄色葡萄球菌死菌悬浮液用PBS稀释5倍，将其与绿脓杆菌的PBS悬浮液在用前等量混合使用。预先向六孔培养板各孔中加入0.9mL EPI-100用维持培养基(无庆大霉素培养基)，再向各孔内加EPI-100的微型杯，在37℃、5％CO₂环境下预备培养2小时。更换为2mL新的维持培养基，然后向微型杯中加入50μL细菌悬浮液，在37℃、5％CO₂环境下培养72小时。更换为4mL新的维持培养基，添加50μL实施例8中使用的裙带菜孢子叶乙醇提取物稀释液。将只添加载体的作为对照使用。在37℃、5％CO₂环境下培养24小时，然后更换培养基，向微型杯中加入乙醇提取物，继续培养24小时。在更换一次培养基、添加乙醇提取物、培养24小时后，取出微型杯，进行皮肤细胞中神经酰胺的测定。首先，将杯用生理盐水清洗，然后用镊子取出培养皮肤，转移至带螺旋盖的玻璃试管中，冷冻干燥。向其中加入2mL氯仿/甲醇(2∶1)，一边时常搅拌，一边在室温下进行2小时的神经酰胺组分的萃取。以2,000rpm离心5分钟，然后将上清转移至另外的玻璃管中(上清1)。用浓缩离心装置干燥沉淀后，再用2mL氯仿/甲醇(2∶1)进行萃取操作，离心得到上清(上清2)。将上清1和2合并，除去溶剂，将其作为薄层色谱(TLC)分析用样品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析按照与实施例6同样的方法进行。结果如图4所示。图中，黑柱表示无羟基神经酰胺，白柱表示羟基神经酰胺。0.05％裙带菜孢子叶乙醇提取物添加组与对照组相比，人工培养皮肤中的无羟基神经酰胺显著增加，羟基神经酰胺也可见增加倾向。0.05％裙带菜孢子叶乙醇提取物添加组的神经酰胺水平比未添加绿脓杆菌的实施例8的对照(参照图3)的神经酰胺水平增加，因此显示：裙带菜孢子叶提取物可恢复由于绿脓杆菌的神经酰胺酶导致的皮肤角层神经酰胺的减少，并且也抑制皮肤角层中的神经酰胺酶，并有使角层中的神经酰胺量增加的效果。图4中，相对于对照的t检验中，*表示p＜0.05。实施例10神经酰胺酶抑制剂对感染绿脓杆菌的人工培养皮肤模型的效果

通过与实施例9同样的方法评价来源于各种植物的提取物的效果。裙带菜孢子叶乙醇提取物如下使用：从实施例1得到的物质中除去溶剂，然后再溶解于载体(含有0.5％聚氧乙烯氢化蓖麻籽油的80％丙二醇)中，使提取物的浓度为0.05％(w/v)。海带提取物如下使用：从实施例2得到的物质中除去溶剂，然后用载体稀释，使提取物的浓度为0.05％(w/v)。冬瓜提取物如下使用：从实施例3得到的物质中除去溶剂，然后用载体稀释，使提取物的浓度为0.5％(w/v)。橙油(山本香料公司制造)使用用载体稀释1000倍的物质。葡萄柚提取物(80％丙二醇提取、山本香料公司制造)直接使用原液。以只添加载体的作为对照。其它方法与实施例9相同。结果如图5所示。图中，黑柱表示无羟基神经酰胺，白柱表示羟基神经酰胺。裙带菜孢子叶提取物添加组、海带提取物添加组、冬瓜提取物添加组、橙油添加组与对照组相比，人工培养皮肤中的无羟基神经酰胺显著增加，羟基神经酰胺也可见增加倾向。另外，葡萄柚提取物添加组也可见神经酰胺量增加的倾向。图5中，相对于对照的t检验中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.005。

实施例11从裙带菜孢子叶提取物中纯化神经酰胺酶抑制物质

(1)在不锈钢容器中加入10kg干燥裙带菜孢子叶片和20L乙醇，轻轻地搅拌数次，静置一天。将其过滤，用乙醇清洗，得到34.4L裙带菜孢子叶乙醇提取液。

(2)将三菱化学制造的DIAION HP20装入玻璃柱(2.5L)，用乙醇洗涤，然后用50％乙醇平衡。在34.4L裙带菜孢子叶乙醇提取液中加入等量的水，制成50％乙醇溶液(68.8L)，将其通入上述柱。全部过柱后，用12.5L50％乙醇洗涤，用25L乙醇洗脱。测定过柱(素通り)、洗涤、洗脱得到的各组分的抑制活性，可见乙醇洗脱组分具有活性，因此，浓缩该组分，除去乙醇。收量为136g。

(3)将硅胶60(Merk公司制造)填充到玻璃柱中(3.5×37cm、350mL)，用1L的正己烷平衡。向(2)的活性组分中加入正己烷，制成300mL，添加到柱中。用500mL的正己烷和1L的氯仿洗涤，然后分别用1LC/M＝9∶1、C/M＝8∶2洗脱。约80％的抑制活性洗脱到C/M＝9∶1组分中。

(4)将Ultrapack硅胶60(Yamazen公司制造、37×300mm、322mL)用1L正己烷以流速10mL/分钟洗涤，然后用1L氯仿平衡，将(3)的活性组分(溶剂蒸发干燥固化，然后溶解于氯仿，制成50mL)过该柱。用1.5L的氯仿洗涤，然后进行由氯仿至乙酸乙酯的梯度洗脱(0-100％乙酸乙酯/150分钟)。最后用150mL的乙酸乙酯清洗。抑制活性分成两种级分洗脱出来。

收集各级分，馏去溶剂。

级分I：收量1925mg

级分II：收量440mg

(5)将由上述硅胶柱层析得到的级分I进一步通过反相HPLC纯化。最初使用Cosmosil 5C18AR(10mm×250mm、ナカラィテスク公司制造)。将级分I溶解于10mL 50％异丙醇，分5次进行层析。洗脱溶剂使用溶剂A(50％异丙醇)和溶剂B(100％异丙醇)，溶剂B的比例如下：0分钟至20分钟为0％、20分钟至60分钟在0-100％之间变化、60分钟至80分钟保持100％。流量为2mL/分钟，每隔1分钟取一次洗脱液。通过参考例1的方法(使用终浓度为0.02 mM的NBD-C12-神经酰胺，以下同样)测定各级分的神经酰胺酶抑制活性。在级分51-70中检测出抑制活性。收集活性组分，除去溶剂。收量为450mg。

(6)使用YMC AM-322(10mm×150mm、YMC公司制造)，继续对由上述(5)得到的组分的3/10进行纯化。样品溶解于异丙醇中。洗脱溶剂使用溶剂A(50％异丙醇)和溶剂B(100％异丙醇)，溶剂B的比例如下：0分钟至10分钟为0％、10分钟至50分钟在0-100％之间变化、50分钟至55分钟保持100％。流量为2mL/分钟，注入样品后，从第20分钟开始每隔1分钟取一次洗脱液。通过参考例1的方法测定各级分的神经酰胺酶抑制活性。在级分15-35中检测出抑制活性。收集活性组分，除去溶剂。收量为32mg。

(7)使用XTerra RP18(4.6mm×150mm、ゥォ一タ一ズ公司制造)，继续对由上述(6)得到的组分进行纯化。样品溶解于异丙醇中，分两次进行层析。洗脱溶剂使用溶剂A(50％异丙醇)和溶剂B(100％异丙醇)，溶剂B的比例如下：0分钟至10分钟为0％、10分钟至50分钟在0-100％之间变化、50分钟至55分钟保持100％。流量为1mL/分钟，注入样品后，从第20分钟开始每隔30秒钟取一次洗脱液。通过参考例1的方法测定各级分的神经酰胺酶抑制活性。在组分I(级分13-30)和组分II(级分21-25)两种组分中检测出抑制活性。收集活性组分，除去溶剂。收量为组分I：10mg、组分II：6mg。

(8)使用Symmetry Shield RP18(4.6mm×150mm、ゥォ一タ一ズ公司制造)，继续对由上述(7)得到的组分I进行纯化。样品溶解于氯仿/乙醇(1∶1)中。洗脱溶剂使用溶剂A(50％异丙醇)和溶剂B(100％异丙醇)，溶剂B的比例如下：0分钟至30分钟为30％-70％、30分钟至35分钟保持100％。流量为1mL/分钟，检测采用220nm，注入样品后，从第10分钟开始每隔15秒钟取一次洗脱液。通过参考例1的方法测定各级分的神经酰胺酶抑制活性。在组分I-I(级分26-29)、组分I-II(级分30-35)和组分I-III(级分36-42)三种组分中检测出抑制活性。收集活性组分，除去溶剂。对组分I-III(收量为3.3mg)进行NMR分析和质量分析，由此进行结构分析。

(9)使用离子喷雾式质量分析仪(API-III、ァプラィドバィォシステムズ公司制造)对由上述(8)得到的组分I-III进行质量分析。测定溶剂使用含有0.1％甲酸的80％乙腈，用正向模式测定。结果，检测出m/z565(M+H)+的信号。图6表示质谱。以该离子作为母离子进行MS/MS分析，子离子检测出m/z547和m/z338的信号，图7表示MS/MS分析的质谱。图6和图7中，横轴表示m/z轴，纵轴表示信号的相对强度。

使用核磁共振(NMR)谱分析装置(ブルッカ一公司制造)测定各种NMR谱，进行结构分析。以下给出各种NMR的信号。

¹H-NMR：σ

0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468

¹H-NMR中，样品溶解于氘代氯仿，氘代氯仿中的残留质子的化学位移值为7.24ppm。图8表示¹H-NMR谱。图8中，横轴表示化学位移值，纵轴表示信号强度。

¹³C-NMR：σ

14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.83

¹³C-NMR中，样品溶解于氘代氯仿，氘代氯仿中的残留质子的化学位移值为77.0ppm。图9表示¹³C-NMR谱。图9中，横轴表示化学位移值，纵轴表示信号强度。

由以上结果推定的作为神经酰胺酶抑制物质的化合物的一个例子是下式(1)所示的化合物。

[化2]

通过参考例1的方法测定纯化物的神经酰胺酶抑制活性，本物质以5μM的低浓度即可50％抑制来源于大鼠脑的中性/碱性神经酰胺酶活性。而以往作为神经酰胺酶抑制剂销售的D-e-MAPP在5mM的浓度下的抑制率为28％。

产业实用性

本发明提供神经酰胺酶活性抑制剂、含有该神经酰胺酶活性抑制剂的药品、准药、化妆品、食品。

Claims (20)

1.神经酰胺酶活性抑制剂，其特征在于：含有来源于植物的处理物作为有效成分，其中所述植物选自银杏科植物、葫芦科植物、芸香科植物、海带科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一种。

2.权利要求1的神经酰胺酶活性抑制剂，其中，银杏科植物为银杏，葫芦科植物为选自菜瓜、黄瓜、冬瓜和苦瓜的至少一种，芸香科植物为橙、葡萄柚和来檬的至少一种，海带科植物为选自粘液海带、海带和裙带菜的至少一种，桃金娘科植物为桉，菊科植物为艾蒿。

3.神经酰胺量调节剂，其特征在于：含有权利要求1或2的神经酰胺酶活性抑制剂。

4.药品，其特征在于：含有权利要求1或2的神经酰胺酶活性抑制剂。

5.权利要求4的药品，该药品是皮肤外用药。

6.权利要求4的药品，该药品是对于必须进行细胞增殖抑制的疾病的治疗药或预防药。

7.权利要求4的药品，该药品是癌症的治疗药或预防药。

8.准药，其特征在于：含有权利要求1或2的神经酰胺酶活性抑制剂。

9.化妆品，其特征在于：含有权利要求1或2的神经酰胺酶活性抑制剂。

10.食品，其特征在于：含有权利要求1或2的神经酰胺酶活性抑制剂。

11.具有下述理化学性质的化合物、其衍生物、或它们的可药用的盐：

(1)质谱：m/z 565(M+H)⁺；

(2)MS/MS分析：上述(1)为母离子时的子离子为：m/z 547、m/z338；

(3)¹H-NMR(氘代氯仿)：δ

0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468

(4)¹³C-NMR(氘代氯仿)：δ

14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.83

12.神经酰胺酶活性抑制剂，其特征在于：含有选自权利要求11的化合物、衍生物及其盐的至少一种作为有效成分。

13.神经酰胺量调节剂，其特征在于：含有权利要求12的神经酰胺酶活性抑制剂。

14.药品，其特征在于：含有权利要求12的神经酰胺酶活性抑制剂。

15.权利要求14的药品，该药品是皮肤外用药。

16.权利要求14的药品，该药品是对于必须进行细胞增殖抑制的疾病的治疗药或预防药。

17.权利要求14的药品，该药品是癌症的治疗药或预防药。

18.准药，其特征在于：含有权利要求12的神经酰胺酶活性抑制剂。

19.化妆品，其特征在于：含有权利要求12的神经酰胺酶活性抑制剂。

20.食品，其特征在于：含有权利要求12的神经酰胺酶活性抑制剂。

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