KR100523562B1

KR100523562B1 - 손바닥선인장 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을함유하는 신경세포 보호용 조성물

Info

Publication number: KR100523562B1
Application number: KR10-2002-0065744A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 박호군; 진창배; 김형자; 조정숙; 박미정; 송윤선
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2005-10-25
Also published as: EP1448188A1; KR20030035974A; CN1823759A; US7563467B2; WO2003037324A1; HK1073075A1; JP2005508974A; EP1448188A4; HK1094868A1; US20050042311A1; NZ532628A; JP4418675B2; CN100379414C; CN1596110A; AU2002348598B2; CN1289079C; CA2465438A1

Abstract

본 발명은 손바닥선인장을 에틸 아세테이트로 추출하여 얻은 신경세포 보호효과를 갖는 추출물 및, 이 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경세포 보호용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물은 알쯔하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병과 같은 뇌신경질환에 의한 뇌신경세포 손상, 허혈로 인한 세포와 조직 손상 또는 심근경색과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

손바닥선인장 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 신경세포 보호용 조성물{NEUROPROTECTIVE COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT FROM OPUNTIA FICUS-INDICA AND COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 손바닥선인장을 에틸 아세테이트로 추출하여 얻은 신경세포 보호효과를 갖는 추출물, 및 이 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을 함유하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.

혈전이나 동맥 경화증에 의하여 뇌동맥 또는 관상동맥이 폐쇄되어 혈류량이 역치점 이하로 감소하면 허혈로 인해 뇌신경세포 및 심장세포가 손상을 입게되고 결국 세포사멸 (cell death)이 유발되어 뇌경색 (brain infarction) 및 심근경색 (myocardial infarction)이 나타나게 된다. 허혈에 의한 세포의 저산소증으로 인해 산화적 인산화반응은 감퇴되나 궁극적으로는 혐기성 해당작용 (glycolysis)이 정지됨으로써 세포내 에너지원으로 사용되는 아데노신 트리포스페이트가 고갈되게 된다. 에너지가 결정적인 역치점 아래로 떨어지게 되면 생명유지에 필수적인 세포기능이 저해되고 이로 인해 다방면의 퇴행성 과정들이 유발됨으로써 세포사멸을 초래하게 된다. 세포사멸은 허혈 기간 동안은 물론 재관류 시에도 일어난다.

특히, 뇌 허혈 (cerebral ischemia)은 임상적으로 심장정지 (cardiac arrest) 및 뇌졸중에서 가장 보편적으로 나타나는 형태로 난치성 뇌신경세포 손상이 야기되며, 이로 인해 불구가 되거나 혼수상태에 빠질 수 있으며, 심한 경우에는 사망에 이르게 된다. 상기 질환을 예방하기 위한 목적으로 약물로 고혈압 치료제, 항혈소판제, 뇌혈류 개선제 및 고지혈증 치료제 등이 사용되고 있으나, 허혈성 뇌졸중 발생 후에는 혈전용해제를 제외하고는 허혈에 의해 야기되는 뇌 손상을 경감시킬 수 있는 치료제가 현재까지는 없는 상태이다.

한편, 중추신경계 질환에 관여하는 병인과 기전은 매우 다양하고 복잡하나 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌신경질환의 병태생리에 있어서 자유 라디칼 (free radical)과 같은 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 중요한 역할을 함이 밝혀지져 있다. 즉, 산화적 스트레스에 의해 생성되는 각종 활성산소종은 이들 급·만성 퇴행성 신경질환에서 특정 신경세포군의 손상을 유발시키는 공통적인 기전으로 여겨지고 있다. 최근 허혈성 뇌졸중의 뇌 손상 기전 연구 동향 중에서 주목할 만한 것은 허혈 및 재관류 시 발생되는 라디칼들이 신경세포 손상에 중요한 역할을 한다는 것이다 (Koroshetz & Moskowitz, Trends Neurosci. 17:227, 1996).

더욱이, 자발적 또는 혈전용해제 등의 치료에 의해 허혈 부위의 혈액 공급이 회복되어져 재관류가 일어날 때 공급되는 산소가 라디칼들을 발생시키는 생화학적 반응을 증강시킬 수 있다. 그 예로, 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase)와 같은 효소들의 작용에 의해 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical)이 생성되며, 뇌 손상시에 유리되는 철 이온 (Fe²⁺)은 펜톤 (Fenton) 반응에 의해 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical)을 생성한다. 이와 같이 생성된 각종 형태의 활성산소종은 허혈부위의 지질, 단백질, 핵산 등 세포내 거대분자를 변성시킴으로써 결과적으로 세포사를 초래한다. 뇌는 에너지원인 ATP의 생성에 있어서 산화적 인산화반응에 전적으로 의존하며, 포도당 대사가 활발한 부위일 뿐만 아니라, 신경세포막을 구성하고 있는 다불포화 지방산 (polyunsaturated fatty acid)은 자유 라디칼에 의해 쉽게 과산화되고, 다른 조직에 비해 철의 함유량이 비교적 높은 반면 산화적 스트레스에 대응하는 항산화효소는 적게 분포되어 있기 때문에 특히 손상을 입기 쉬운 기관이다 (Halliwell and Gutteridge, Trends Neurosci. 8:22, 1985). 따라서, 최근에는 이런 라디칼들에 의한 뇌신경세포 손상을 방지하기 위한 노력이 점차 증가되고 있는 추세이다.

한편, 알쯔하이머병에서 관찰되는 특정 신경세포의 손실에 있어서도 활성산소종은 중요한 역할을 한다. 알쯔하이머병의 2대 특징 중의 하나인 노인 반점 (senile plaque)을 구성하는 베타아밀로이드 (A_β)는 응집하여 신경세포에 치명적인 손상을 유발한다. 즉, 응집된 베타아밀로이드 단백질은 신경세포에서 과산화수소를 축적하여 산화적 과정과 과산화 반응을 유도할 뿐만 아니라, 산화질소의 생성을 촉진하여 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼과 반응하여 반응성이 매우 강한 퍼옥시나이트라이트 (peroxynitrite)를 형성함으로서 라디칼에 의한 독성을 증가시킨다. 또한, 일단 진행되기 시작한 산화적 과정에 의해 베타아밀로이드의 응집은 더욱 증가하여 신경독성을 가중시킴으로서 악순환을 유발한다 (Behl, Prog. Neurobiol. 57:301, 1999).

파킨슨병의 경우에도 산화적 스트레스가 병인에 관여하는 것으로 여겨진다. 즉, 파킨슨병에서는 흑질에서 도출하는 도파민성 신경세포의 선택적 손실과 함께 과산화수소의 형성이 증가하여 강력한 신경독성 물질인 히드록실 라디칼의 생성을 유도함으로써 신경손상을 가속화시킨다고 한다 (Ebadi 등, Prog. Neurobiol. 48:1, 1996). 뿐만 아니라, 활성산소종은 퇴행성 신경질환 및 뇌 손상시에 유리되는 글루타메이트에 의해 발생하는 흥분성 신경독성과정에서도 세포사를 매개하는 중요한 인자로 알려져 있다 (Choi, Neuron 1:623, 1988).

이상에서 기술한 바와 같이, 산화적 스트레스에 의해 생성되는 각종 활성산소종은 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨병 등 다양한 퇴행성 신경질환에서 직접 또는 간접적으로 신경세포의 손상에 관여한다. 따라서, 이들 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 개발하기 위한 노력의 일환으로 항산화 작용을 나타내는 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그 대표적인 예로, α-토코페롤 유도체인 MDL 74,722를 비롯하여 21-아미노스테로이드인 티릴라자드 (Tirilazad), U-74389G, 엡셀렌 (ebselen) 등과 같은 많은 종류의 항산화 물질은 국소 또는 전체 뇌허혈 동물모델에서 효과를 발현하는 것으로 보고되었다 (Clemens, Free Radic. Biol. Med. 28:1526, 2000). 또한, α-토코페롤은 심한 기억력 손상을 수반한 알쯔하이머병 환자를 대상으로 한 임상시험에서 질병의 진행속도를 완화시키는 것으로 알려졌다. 마찬가지로, 파킨슨병 치료제로 사용되고 있는 셀레질린 (selegiline)은 모노아민 옥시다제 (monoamine oxidase)-B 억제제인 동시에 자유분자단 소거작용을 나타냄으로써 치료효과에 기여하는 것으로 알려져 있다 (Ebadi 등, Prog. Neurobiol. 48:1, 1996).

본 발명자들은 다양한 식물을 대상으로 항산화 물질을 연구하던 중, 손바닥선인장 (Opuntia ficus-indica (Linne Mill.)에서 항산화 작용 및 뇌신경세포 보호효과를 나타내는 물질을 확인하게 되었다.

손바닥선인장은 예로부터 민간에서 화상, 부종, 소화불량, 종기 및 기관지 천식 등에 사용되어 왔으며, 손바닥선인장의 열매 및 줄기의 에탄올 추출물은 진통 및 소염작용에 의한 위점막 보호효과, 혈당강하작용, 면역증강작용 등의 효능이 있는 것으로 알려졌다 (Trejo-Gonzalez 등, J. Ethnopharmacol. 55:27-33, 1996; 안덕균, 한국본초도감 497, 1998; Galati 등, J. Ethnopharmacol. 76:1-9, 2001). 최근에는 손바닥선인장의 라디칼 소거활성, 멜라닌 생합성에 관여하는 티로시나제 억제활성, 항알레르기 활성 (이남호 등, 생약학회지 31:412, 2000) 및 열매의 70% 메탄올 추출물의 신경손상 억제효과 (위명복 등, 약학회지 44:613, 2000) 등이 보고된 바 있다. 또한, 대한민국 특허 제6683836호 (2000년 11월 15일자 공개됨)에는 손바닥선인장의 열매부분이 줄기부분보다 약리학적 활성성분을 풍부하게 함유하고 있으며, 항암작용, 노화억제, 당뇨억제, 이뇨작용, 콜레스테롤저하, 골다공증, 관절염, 기침, 기관지 천식, 피부미용, 변비 등에 효과가 있다고 개시되어 있다.

그러나, 기존의 연구는 주로 손바닥선인장의 알콜 추출물의 활성에 관한 것으로, 손바닥선인장 추출물이 약리효과를 보일 수 있다는 막연한 가능성만을 제시하고 있다. 또한, 손바닥선인장의 각 부위별 효과, 다양한 용매 분획물의 활성, 손바닥선인장에 존재하는 활성성분 등에 대한 체계적인 연구가 진행되지 않았으며, 활성을 나타내는 화합물들에 대한 실험 결과 등은 전혀 제시되지 않았다.

이에 본 연구자들은 다양한 식물에 함유된 성분 중에서 항산화 작용 및 뇌신경세포 보호효과를 나타내는 물질을 연구하던 중, 손바닥선인장의 줄기, 열매 및 가공한 열매의 에틸 아세테이트 추출물뿐만 아니라 이들 추출물로부터 분리된 화합물이 항산화 작용 및 신경세포 보호활성을 나타냄을 발견하고 이들이 뇌졸중 및 치매와 같은 각종 퇴행성 신경질환과 심근경색과 같은 심장허혈의 예방 및 치료제로서 탁월한 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화 작용 및 신경세포 보호활성을 나타내는 손바닥선인장 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 허혈성 질환, 뇌신경계 질환 또는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 작용 및 신경세포 보호활성을 나타내는 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물로부터 분리한 항산화 작용 및 신경세포 보호활성을 나타내는 화합물 및 그의 분리방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환, 뇌신경계 질환 또는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 손바닥선인장 (Opuntia ficus-indica)의 에틸 아세테이트 추출물, 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1 내지 3의 캄페롤 (kaempferol), 디히드로퀘르세틴 (dihydroquercetin), 퀘르세틴 3-메틸 에테르 (quercetin 3-methyl ether), 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 이성체 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 함유하는, 허혈성 질환, 뇌신경계 질환 또는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다:

화학식 1 내지 3의 화합물들은 그 구조 내에 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으므로, 개개의 에난티오머 또는 부분입체이성체로 존재할 수 있고, 라세미체를 포함한 이들의 혼합물로도 존재할 수 있으며, 이러한 이성체 또는 이들의 혼합물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속 수산화물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염 (예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리금속 탄산염 (예: 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 탄산 칼슘) 등과 같은 무기염기와 1차, 2차 3차 아민 아미노산과 같은 유기염기가 포함된다.

본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어날 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

신경세포 보호활성을 갖는 본 발명의 손바닥선인장 추출물은 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 에틸 아세테이트로 추출하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 잘게 절단하여 그대로 사용하거나 냉동 건조시킨 후, 메탄올 (MeOH) 또는 에탄올과 같은 저급알콜, 60% 이상의 알콜 수용액 및 아세톤 등의 추출용매를 원료 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 7 ℓ의 양으로 가하고 상온에서 4 내지 5일 동안 방치한다. 이 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 알콜 추출물을 얻는다. 알콜 추출물 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 1 내지 4 ℓ의 물을 가한 후, 에틸 아세테이트 (EtOAc) 0.1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 2 ℓ로 충분히 추출하여 에틸 아세테이트 추출물을 얻을 수 있다. 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 직접 에틸 아세테이트로 추출하여도 유사한 조성을 갖는 추출물을 얻을 수 있다.

이렇게 얻은 추출물들의 항산화 작용을 조사하기 위하여 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 방법으로 라디칼 소거작용을 확인하고, 일차배양된 대뇌피질 신경세포에서 잔틴/잔틴 옥시다제에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 라디칼에 의해 유발된 신경세포의 손상을 억제하는 효능과 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상을 억제하는 효능을 각각 조사해보면, 손바닥선인장의 각 부위의 에틸 아세테이트 추출물이 메탄올, 부탄올 등의 알콜 용매를 이용한 추출물 및 디클로로메탄 등 다른 유기 용매를 이용한 추출물에 비해 현저히 우수한 효과를 나타낸다. 특히, DPPH 라디칼 소거작용은 손바닥선인장의 줄기, 열매 및 가공한 열매의 각 에틸 아세테이트 추출물이 유사한 정도의 우수한 효과를 보이며, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경세포 손상 억제효과 및 과산화수소-유발 신경세포손상 억제효과에 있어서는 손바닥선인장 줄기와 가공한 열매의 에틸 아세테이트 분획물이 가장 강력한 효과를 나타낸다.

본 발명의 결과에 따라, 손바닥선인장의 추출물을 알쯔하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병과 같은 뇌신경 질환에 의한 뇌신경세포 손상의 예방 및 치료와 심장 허혈로 인한 심근의 손상을 방지함으로써 심근경색의 예방 및 치료를 목적으로 사용하는 경우에는, 에틸 아세테이트 추출물이 메탄올과 같은 알콜 추출물보다 효과적인 약리작용을 나타낼 것이다.

상기에서 얻은 손바닥선인장 에틸 아세테이트 추출물에 대하여 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 (Toyopearl) 또는 XAD 수지 등의 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 뇌신경세포 보호효능을 나타내는 성분들을 분리 및 정제할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수 차례 실시할 수 있는데, 특히 세파덱스, RP-18 또는 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기의 칼럼 크로마토그래피 과정을 통해 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물로부터 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드, 캄페롤, 디히드로캄페롤, 캄페롤 3-메틸 에테르, 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 등 1종의 테르펜과 6종 이상의 플라보노이드 화합물들을 분리할 수 있었으며, 이 중 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드, 퀘르세틴 3-메틸 에테르, 캄페롤 3-메틸 에테르 등 3종은 본 발명자들에 의하여 손바닥선인장으로부터 처음으로 분리되었다.

상기 화합물 중 캄페롤, 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 잔틴/잔틴 옥시다제에 의하여 유발된 신경세포의 손상뿐만 아니라 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상을 효과적으로 억제하며, 우수한 DPPH 라디칼 소거능력을 나타낸다. 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상 억제효과는 퀘르세틴 3-메틸 에테르가 가장 강하고, 그 다음이 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴, 캄페롤의 순서이다. 따라서, 본 발명의 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획이 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상을 억제하는데 중요한 작용을 하는 유효활성성분들이 캄페롤, 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르임이 확인되었다.

또한, 디히드로퀘르세틴과 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 잔틴/잔틴 옥시다제에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 라디칼을 소거하는 효능이 탁월하며, NMDA의 활성화에 의하여 유발되는 신경세포의 손상을 억제하는 효능을 나타낸다. 특히, 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 성장인자 제거로 인해 초래되는 신경독성 (Growth factor withdrawal apoptotoic cytotoxicity) 시험에서도 탁월한 신경세포 보호효능을 나타낼 뿐만 아니라 뇌졸중의 임상에 매우 유사한 허혈성 뇌 손상 실험 동물모델에서도 탁월한 뇌신경 보호효능을 나타낸다. 따라서, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 뇌졸중 및 치매와 같은 각종 퇴행성 신경질환과 심근경색과 같은 심장 허혈의 예방 및 치료제로서 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.

기존에 개발되어 임상시험 중에 있던 NMDA 수용체 길항제들은 실험동물 모델에서 뇌손상을 감소시키기는 했지만 부작용 내지는 효능이 검증되지 않아서 거의 대부분은 개발이 중단된 실정이다. 뇌졸중의 병변 현상은 아주 복잡하고 다양한 기전을 통해 일어나는 것으로 알려진 반면, 현재 개발되고 있는 뇌졸중 치료제 후보물질들은 대부분 단일 작용기전을 목표로 하고 있기 때문에 비록 개발되더라도 효과적인 뇌졸중 치료제로 기대하기 어려운 실정이다. 이런 측면에서, 본 발명의 퀘르세틴 3-메틸 에테는 항산화 작용이 우수할 뿐만 아니라 NMDA 수용체의 활성화에 의하여 유발되는 뇌신경세포의 독성을 억제하며, 활성산소종에 의하여 유발되는 뇌신경세포의 독성을 억제하고, 세포사멸과정을 늦추는 등의 세 가지 이상의 작용기전을 가지고 있는 것으로 확인되었고, 뇌허혈 동물모델에서도 신경세포 보호효능이 입증되었으므로 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 이를 포함하는 손바닥선인장의 추출물은 알쯔하이머, 뇌졸중, 파킨슨병 등과 같은 뇌신경질환과 심근경색, 뇌경색과 같은 허혈성 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

아울러, 손바닥선인장 열매의 에틸 아세테이트 분획보다 손바닥선인장 줄기의 에틸 아세테이트의 분획에서 뇌신경 손상 억제효과를 보이는 성분인 디히드로퀘르세틴의 함량이 17배 정도, 그리고, 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 함량이 13배 정도로 훨씬 많이 검출되는데, 이는 손바닥선인장 줄기의 에틸 아세테이트 분획이 손바닥선인장 열매의 에틸 아세테이트 분획보다 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상을 보다 강력하게 억제한다는 본 발명의 결과를 더욱 입증하는 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물 및 이로부터 분리된 캄페롤, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 DPPH 라디칼 소거작용 및 슈퍼옥사이드 라디칼 소거작용을 나타내고, 잔틴/잔틴 옥시다제, 과산화수소, NMDA 활성화 및 성장인자 제거로 인한 세포사멸에 의해 유발되는 신경손상을 억제하고, 뇌졸중의 임상과 매우 유사한 허혈성 뇌 손상 실험 동물모델에서도 탁월한 뇌신경 보호효능을 나타내므로, 이들을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌신경질환에 의한 뇌신경세포 손상의 치료 및 예방, 허혈로 인한 신경세포와 조직 손상의 예방 및 치료, 특히 뇌신경세포 및 뇌조직 손상의 예방 및 치료, 또는 허혈성 심근경색증과 같은 허혈로 인한 기타 심혈관계 세포 손상의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 뇌 신경 보호제 또는 심장 보호제로서도 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭씨르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 손바닥선인장 에틸 아세테이트 추출물 또는 이로부터 분리된 캄페롤, 디히드로퀘르세틴 또는 퀘르세틴 3-메틸 에테르를 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 성인에게 투여될 총 일일용량은 약 10 내지 50,000 ㎎, 바람직하게는 50 내지 1,000 ㎎의 범위가 통상적이며, 근육내 또는 정맥내 투여시 하루에 통상 약 10 내지 5,000 ㎎, 바람직하게는 150 내지 3,000 ㎎의 범위이면 충분할 것이나, 일부 질환에 따라 더 높거나 더 낮은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물들을 임상적으로 투여하여 목적하는 허혈성 질환 치료효과를 얻고자 하는 경우에, 손바닥선인장으로부터 분리된 활성 화합물들은 공지의 신경보호제 중에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합하여 동시에 투여할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 화합물들과 혼합하여 투여될 수 있는 약제는 글루타치온 농도를 증가시키기 위한 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine), 칼슘 길항제인 니모디핀 (nimodipine), 항산화제인 비타민 C 및 E, 혈전용해제인 조직 플라즈미노겐 활성화제 (tissue plasminogen activator), 기타 뇌신경 및 심장혈관 보호용 약물 등을 들 수 있다.

그러나, 허혈성 질환 치료를 목적으로 하는 본 발명에 따른 화합물 함유 제제는 상술한 것으로 제한되는 것은 아니며, 허혈로 인한 신경세포와 조직 손상의 치료, 특히 뇌신경세포 및 뇌 조직 손상의 치료 및 예방 혹은 허혈로 인한 기타 심혈관계 세포 손상의 예방 및 치료에 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<참조예 1> DPPH 라디칼 소거능 측정

시험물질의 항산화 활성도는 블로이스의 방법 (Blois, Nature 181:1199, 1958)을 변형하여 전자 공여능 (Electron donating ability, EDA)으로 측정하였다. 즉, 시험물질을 99.9% 에탄올에 용해시킨 후 일련의 농도 변화를 주어 적정농도로 용해한 용액 10 ㎕를 100 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 (99.9 % 에탄올에 용해) 190 ㎕와 혼합하고 5초간 교반하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 515 ㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율로서 전자 공여능을 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 구하였다.

<참조예 2> 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정

잔틴 (Xanthine)과 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase, XOD)의 반응으로 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온 (superoxide anion) 생성을 억제시키는 효능을 평가하기 위하여 토다 등 (Toda, et al., Planta, Med. 57:8, 1991)의 방법을 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, 0.1 mM 잔틴, 0.1 mM EDTA, 50 ㎍/㎖ 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA), 25 mM 니트로블루 테트라졸린 (Nitroblue tetrazolium, NBT)과 40 mM Na₂CO₃용액, 각 농도별로 희석한 시험 화합물 용액, 그리고 7×10^-3 단위 XOD를 포함하는 최종부피가 200 ㎕인 용액을 혼합하여 25℃에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응용액에 6 mM CuCl₂ 6.6 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 생성된 포마잔 (formazan)을 560 ㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율로서 슈퍼옥사이드 음이온 생성 억제효과를 계산하여 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)를 구하였다.

<참조예 3> 흰쥐 대뇌피질 신경세포의 일차배양

흰쥐 태자의 대뇌로부터 분리한 신경세포의 배양은 조 등 (Life Sci. 68:1567, 2001)의 방법에 따라 수행하였다. 즉, 16 내지 18일 된 흰쥐 (스프래그-돌리) 태자의 대뇌피질 부분을 분리한 후 해부현미경을 이용하여 뇌막을 제거하였다. 이로부터 얻은 조직을 25 mM 포도당, 5% 소태자혈청, 5% 말혈청, 2 mM L-글루타민을 함유한 배지 (MEM, Gibco BRL)에서 알코올 램프로 입구의 크기를 조절한 파스테르 피펫을 이용하여 단일세포로 분리하였다. 분리된 세포를 폴리라이신 (poly-L-lysine)과 라미닌으로 코팅된 24-웰 (well) 세포배양 용기에 웰당 4 내지 5×10⁵ 세포의 밀도로 이식하여 37℃ 배양기에서 95% O₂/5% CO₂를 유지하면서 배양하였다. 주당 2회 배양액의 일부를 교환하였으며, 이식 후 7 내지 9일에 10 μM 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside)를 24 내지 72시간 동안 처리하여 신경세포 이외의 세포 성장을 억제시켰다. 배양세포는 이식 후 10 내지 14일 후에 실험에 사용하였다.

<참조예 4> 산화적 스트레스에 의한 신경세포 손상 유발

배양한 대뇌피질 신경세포를 HEPES-조절된 염 용액 (HCSS)으로 3회 세척한 후 잔틴 (0.5 mM) 및 잔틴 옥시다제 (10 mU/㎖)를 함유하는 무혈청배지 (serum-free MEM; 25 mM 포도당, 2 mM 글루타민을 첨가한 MEM)로 10분간 처리하여 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼에 의한 세포손상을 유발하였다. 이를 다시 HCSS로 세척하고 무혈청 MEM으로 배양액을 교환하여 37℃ 배양기에서 95% O₂/5% CO₂를 유지하면서 20 내지 24시간 동안 배양하였다. 과산화수소에 의한 신경세포 손상유발은 배양세포를 세척한 후 100 μM 과산화수소를 함유하는 HCSS로 5분간 처리한 다음 다시 세척하고 무혈청 MEM으로 배양액을 교환하여 20 내지 24시간 동안 배양하였다. 이와 같이 유발된 신경세포 손상에 대한 시험물질의 영향을 측정하기 위해서는 배양된 신경세포를 여러 농도의 시험물질로 1시간 동안 전처리한 후 손상 유발물질과 시험물질을 동시에 가하여 상기한 바와 같이 일정시간 동안 처리하고, 20 내지 24시간 동안 배양한 다음 손상정도를 하기 참조예 5에 명시한 바와 같이 측정하였다.

<참조예 5> 신경세포의 손상 측정

참조예 4와 같이 처리하여 배양한 신경세포를 위상차 현미경을 이용하여 형태학적으로 손상정도를 평가하거나, 배양액 상층에 유리되는 락테이트 디히드로게나아제 (lactate dehydrogenase, LDH)의 양을 피루베이트 (Sigma)를 기질로 하여 측정하였다. 산화적 신경손상에 대한 시험물질의 억제효과는 손상을 유발하지 않은 대조군에서의 LDH에 대한 백분율로 표시하였다. 실험 결과는 1회 2군씩 2 내지 4회 반복하여 얻은 데이타를 평균하여 나타내었으며, 50% 억제효과를 나타내는 농도 (IC₅₀)는 프리즘 (Prism; Graphpad software Inc., USA)을 이용한 비선형 회귀분석으로 계산하였다.

<참조예 6> 신경독성실험을 위한 랫트의 뇌 해마세포와 피질세포의 배양

랫트의 뇌조직 중 해마 (hippocampus)와 피질부위는 임신한지 17일된 SD 랫트의 태아의 뇌로부터 현미경 하에서 적출하였다. 적출한 해마와 피질은 각각의 세포로부터 분리되도록 피펫으로 잘게 분쇄한 후, 분쇄물을 원심분리하여 얻은 세포만을 폴리라이신 (poly-L-lysine)이 코팅된 96 웰 플레이트의 각 웰당 해마세포는 2.5×10⁴ 세포, 피질세포는 5×10⁴ 세포가 되도록 각각 첨가하였다. 각 웰에 B-27 보충영양액 (Life technologies) 2%, 글루타메이트 25 M, 글루타민 0.5 mM이 포함된 뉴로배이살 (Life technologies) 배양액 200 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 배양하였다. 72시간 후 클루타메이트가 결여된 혼합배양액으로 배양액을 교환한 후 계속 배양하였다. 신경독성실험은 7 내지 10일 후에 실시하였다.

<참조예 7> NMDA로 인한 신경독성에 대한 뇌 세포손상 보호실험

200 μM의 NMDA (Sigma)를 참조에 6의 배양세포에 2시간 동안 처리하여 뇌 세포손상을 유발하였다. 시험물질은 주어진 농도로 NMDA와 같이 처리한 후 제거하지 않고 실험 기간 (2시간) 내내 잔존하도록 하였다. NMDA 처리 후 24시간 뒤에 LDH 측정용 킷트 (Boehringer Mannheim)를 사용하여 배양액으로 유리된 LDH 양을 측정하였다.

<참조예 8> 성장인자 제거로 인한 신경독성에 대한 뇌 세포손상 보호실험

참조예 6에서 배양한 뇌 세포를 DMEM 배양액에 B27 보충 영양액을 2% 첨가한 배양액을 사용하여 배양하다가 B-27을 제거한 DMEM만으로 교환하여 영양부족으로 인한 세포사를 유도하였다. 24시간 후에 세포괴사에 의해 유리된 LDH를 LDH 측정용 킷트 (Boehringer Mannheim)로 측정하여 세포사 정도를 정량하였다.

<참조예 9> 중대뇌동맥 폐쇄 (middle cerebral artery occlusion, MCAO) 및 재관류에 의한 일시적 국소 허혈성 뇌 손상 백서 모델의 제작

체중 250∼300 g의 웅성 스프라그-다우리계 백서 (Sprague-Dawley, 대한실험동물센터)를 실험동물로 사용하였다. 수술은 실험 당일에 70% 아산화질소 (N₂O)와 30% 산소 (O₂)를 운반기체로 사용하는 1.5% 이소플루랜 (isoflurane, 중외제약 포란액) 흡입마취 하에서 보온 패드와 보온 램프를 사용하여 실험동물의 체온을 약 37±0.5℃로 유지하면서 나가사와와 고구레 (Nagasawa and Kogure, Stroke 20:1037, 1989)의 방법에 준하여 시행하였다.

구체적으로, 이소플루랜 흡입마취 하에서 목의 정중선을 따라 경부를 절개하고 미주신경에 손상을 주지 않도록 주의하면서 우측 총경동맥, 내경동맥, 그리고 외경동맥을 조심스럽게 분리하였다. 총경동맥과 외경동맥은 결찰하고 내외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥 내로 17 ㎜의 프로브를 삽입하여 삽입부위 바로 위쪽을 결찰함으로써 중대뇌동맥의 기저부를 폐쇄하였다. 프로브는 4-0 나일론 수술실 (Nitcho Kogyo Co., Ltd., Japan)의 한쪽 끝을 열에 의해 구형으로 만들어 그 부분을 제외하고 17 ㎜로 자른 후 실리콘 (Bayer Dental, Xantopren)을 경화제 (Optosil-Xantopren Activator, Bayer Dental)와 잘 혼합한 것에 다른 쪽 끝 부분 약 7 내지 9 ㎜ 정도를 넣어서 피복하며 두께는 0.3 내지 0.4 ㎜가 되도록 하였다. 뇌 허혈 유발 시작 후 약 25 내지 30분 경에 수술한 백서의 신경학적 결손을 측정하여 증상을 나타내는 백서만을 허혈군에 포함시켰다. 신경학적 결손은 주로 공중에서 백서의 꼬리를 완전히 들었을 때 좌측 전족 굴곡이 일어나는 지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 왼쪽으로 돌아가는 증상이 일어나는 지를 관찰하여 평가하였다. 120분 동안 일시적으로 중대뇌동맥을 폐쇄한 후 다시 이소플루랜 흡입마취 하에서 봉합 부위를 절개하여 구형의 프로브 끝을 다시 10 ㎜ 정도 밖으로 뽑아냄으로써 이를 재관류시켜 일시적 국소 뇌 허혈 백서 모델을 제작하였다. 그 후, 역시 수술부위를 봉합하고 약 1일 후 신경학적 결손을 측정하고 희생시켜서 적출한 뇌조직에 대하여 조직학적 염색법을 시행하였다.

부형제 (vehicle)인 0.9% 생리식염수 (1 ㎖/㎏), 또는 10 ㎎/㎏ 용량의 퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르, 또는 디히드로퀘르세틴을 허혈 유발 시작 후 30분에 복강 내로 투여하였다.

<실시예 1> 손바닥선인장 열매 추출물의 제조 및 신경세포 보호효과 확인

신선한 손바닥선인장의 열매 (제주도산, 경동시장에서 구입)를 잘게 세절하고 씨를 뺀 후 얻어진 열매 7.8 ㎏을 40 ℓ의 메탄올에 담가 상온에서 4 내지 5일 동안 추출한 후 여과하였다. 3번에 걸쳐 추출한 메탄올 용액을 40℃에서 회전 농축기로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 선인장 열매의 메탄올 추출물 498 g을 물 1 ℓ에 현탁시킨 후 디클로로메탄 (CH₂Cl₂, 600 ㎖×3)으로 추출하고, 물층을 에틸 아세테이트 (EtOAc, 600 ㎖×3)로 추출하였다. 상기 물층을 다시 부탄올 (BuOH, 600 ㎖×3)로 충분히 추출하여 각각의 용매 분획으로 나누었다. 나누어진 분획들에 대하여 참조예 1 내지 5의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과, 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 도 1 및 2와 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장 열매의 메탄올 추출물 (GM), 디클로로메탄 분획 (GD), 부탄올 분획 (GB), 물 분획 (GH)은 라디칼 소거능 및 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소 유발 신경독성 억제효능을 거의 보이지 않은 반면에, 에틸 아세테이트 분획 (GE)은 라디칼 소거능이 60.0 ㎍/㎖의 IC₅₀ 값을 나타내었고, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능이 67.7 ㎍/㎖, 과산화수소-유발 신경독성 억제효능이 115.9 ㎍/㎖인 IC₅₀ 값을 나타내어 현저한 신경세포 보호효과를 나타내므로 뇌졸중 또는 알쯔하이머 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다.

<실시예 2> 손바닥선인장의 가공한 열매 추출물의 제조 및 신경세포 보호효과 확인

손바닥선인장의 증숙하여 건조시켜 분쇄 가공한 열매 (제주도산, 경동시장에서 구입) 15 ㎏을 메탄올 20 ℓ에 담가 상온에서 4 내지 5일 동안 추출한 후 여과하였다. 메탄올 용액은 40℃에서 회전 농축기로 농축하여 메탄올 추출물 416.0 g을 얻었다. 이 중 412 g의 메탄올 추출물을 물 1.5 ℓ에 현탁시킨 후 디클로로메탄 (800 ㎖×3)으로 추출하고, 물 층을 에틸 아세테이트 (800 ㎖×3)로 추출하였다. 상기 물 층을 다시 부탄올 (800 ㎖×3)로 충분히 추출하여 각각의 용매 분획으로 나누었다. 나누어진 분획들에 대하여 참조예 1 내지 5의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과, 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장의 가공한 열매의 경우에는 물 분획 (SH)을 제외하고 전체적으로 활성을 보였으며, 그 중에서도 특히 에틸 아세테이트 분획 (SE)의 작용이 가장 강력하여 라디칼 소거능이 58.0 ㎍/㎖, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능이 22.2 ㎍/㎖, 과산화수소-유발 신경독성 억제효능이 21.2 ㎍/㎖의 IC₅₀ 값을 각각 나타내어 현저한 신경세포 보호효과를 나타내므로 뇌졸중 또는 알쯔하이머 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다.

<실시예 3> 손바닥선인장 줄기 추출물의 제조 및 신경세포 보호효과 확인

손바닥선인장의 신선한 줄기 (제주도산, 경동시장에서 구입) 32.6 ㎏을 20 ℓ의 메탄올에 담가 상온에서 4 내지 5일 동안 추출한 후 여과하였다. 3번에 걸쳐 추출한 메탄올 용액을 40℃에서 회전 농축기로 농축하여 각각의 메탄올 추출물을 얻었다. 선인장 줄기의 메탄올 추출물 819.9 g을 물 1 ℓ에 현탁시킨 후 디클로로메탄 (600 ㎖×3)으로 추출하고, 물 층을 에틸 아세테이트 (600 ㎖×3)으로 추출하였다. 상기 물 층을 다시 부탄올 (600 ㎖×3)로 충분히 추출하여 각각의 용매 분획으로 나누었다. 나누어진 분획들에 대하여 참조예 1 내지 3의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과, 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 도 3 및 4와 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장 줄기의 메탄올 추출물 (FH), 디클로로메탄 분획 (FD), 부탄올 분획 (FB), 물 분획 (FH)은 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소 유발 신경독성 억제효능을 거의 보이지 않은 반면에, 에틸 아세테이트 분획 (FE)은 라디칼 소거능이 60 ㎍/㎖, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능이 15.2 ㎍/㎖, 과산화수소 유발 신경독성 억제효능이 17.5 ㎍/㎖의 IC₅₀ 값을 나타내어 현저한 신경세포 보호효과를 나타내었다. 또한, 손바닥선인장 줄기의 에틸 아세테이트 분획 (FE)의 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능, 및 산화수소 유발 신경독성 억제효능은 손바닥선인장의 가공한 열매의 에틸 아세테이트 분획 (SE)과 유사하고, 손바닥선인장 열매의 에틸 아세테이트 분획 (GE) 보다는 월등히 우수하였다. 따라서, 특히 손바닥선인장 줄기 또는 가공한 열매의 에틸 아세테이트 분획들은 우수한 항산화효과 및 산화적 손상 (oxidative injury)에 대한 신경세포 보호효능이 우수하므로 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머 또는 파킨슨병과 같은 뇌신경계 질환의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다.

상기 실시예 1 내지 3에서 얻어진 각 추출물 분획의 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 하기 표 1에 정리하였다.

<실시예 4> 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획으로부터 뇌신경세포 보호성분의 분리

손바닥선인장의 열매, 가공한 열매, 줄기 모두에서 에틸 아세테이트 분획의 신경세포 보호활성이 가장 강하게 나타났으므로 이들 분획에서 뇌신경세포 보호 효능을 나타내는 성분을 분리하여 그 구조를 동정하고자 하였다.

<4-1> 손바닥선인장 줄기의 에틸 아세테이트 분획으로부터 뇌신경세포 보호성분의 분리

손바닥선인장 줄기의 에틸 아세테이트 분획 4.98 g을 메탄올을 전개용매로 사용하고 세파덱스 (Cat. No. LH-20-100, Sigma)를 고정상으로 이용한 칼럼 크로마토그래피 (4×5 ㎝)를 실시하여 분리하였다. 얻어진 분획들은 순상 실리카겔 TLC (전개용매로 디클로로메탄:메탄올=5:1을 사용)와 역상 실리카겔 TLC (전개용매로 물:메탄올=40:60을 사용)를 사용하여 관찰한 후, 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 17개의 소분획 (소분획 1 내지 17)으로 나누었다. 이 중 극성이 낮은 분획인 소분획 12를 역상 칼럼 크로마토그래피 (LiChroprep RP-18, 40 내지 63 ㎛, 2.5×35 ㎝, Cat. No. 13900, Merck)를 실시하여 정제하였다. 용출액은 40% 메탄올로 시작하여 60% 메탄올까지 점진적으로 극성을 높여가면서 실시하여 극성에 따라서 12개의 소분획 (소분획 12A 내지 12L)으로 나누었다. 이 중 순수한 화합물이 중점적으로 존재하는 화합물 분획인 두번째 분획 12B를 메탄올을 전개용매로 사용한 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (2.5×35 ㎝)를 실시하여 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드 (90 ㎎)를 얻었다. 중간정도의 극성을 나타내는 5번째 소분획 (12E)은 순수한 화합물로 디히드로캄페롤 (30.7 ㎎)을 얻을 수 있었다. 소분획 12C로부터 메탄올을 전개용매로 이용한 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (2.5×35 ㎝)를 실시하여 디히드로퀘르세틴 (77.5 ㎎)을 얻었다. 역시 소분획 12I로부터는 상기와 동일한 조건을 이용한 세파덱스 칼럼 크로마토그래피와 50% 메탄올을 이용한 역상 칼럼 크로마토그래피 (LiChroprep RP-18, 40 내지 63 ㎛, 2×35 ㎝, Cat. No. 13900, Merck)를 순차적으로 실시하여 퀘르세틴 3-메틸 에테르 (59.3 ㎎)를 얻었다. 가장 늦게 용출된 분획인 소분획 12K로부터는 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 실시하고, 이를 다시 역상 실리카겔 TLC (10×10 ㎝×0.25 ㎜, Cat. No. 15423, Merck, 50% MeOH)를 이용하여 UV 램프에서 단일 화합물로 보이는 화합물을 분취하여 캄페롤 3-메틸 에테르 (5.2 ㎎)를 얻었다.

또한, 상기에서 에틸 아세테이트 분획을 세파덱스 칼럼 및 TLC로 분리하여 얻은 분획 중에서 극성이 낮은 분획 15를 세파덱스 겔 칼럼 크로마토그래피 (2.0×30 ㎝, 메탄올)와 역상 실리카겔 TLC (10×10 ㎝×0.25 ㎜, Cat. No. 15423, Merck, 60% MeOH)으로 분리하여 캄페롤 (10 ㎎)과 퀘르세틴 (10 ㎎)을 얻었다.

<4-2> 손바닥선인장 열매 및 가공한 열매의 에틸 아세테이트 분획으로부터 뇌신경세포 보호성분의 분리

손바닥선인장 열매의 에틸 아세테이트 분획 1.82 g을 세파덱스를 이용한 칼럼 크로마토그래피 (4.0×26.5 ㎝, 메탄올)를 실시하여 분리하였다. 얻어진 분획을 순상 실리카겔 TLC와 역상 실리카겔 TLC를 병행하여 전개용매의 극성을 바꾸어가면서 전개시켜 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 13개의 소분획 (소분획 1 내지 13)으로 나누었다. 소분획 11은 순수한 화합물로 2.4 ㎎의 캄페롤을 얻을 수 있었고, 소분획 12로부터는 3.6 ㎎의 퀘르세틴을 얻을 수 있었다. 소분획 8은 실리카겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (2×30 ㎝)를 실시하여 분리하였다. 이때, 디클로로메탄과 메탄올 (20/1)의 혼합용매를 전개용매로 사용하여 점차로 극성을 높여서 디클로로메탄과 메탄올 (1/2)의 혼합용매로 칼럼을 용출시켜서 디히드로캄페롤 (6.1 ㎎)을 얻을 수 있었다. 소분획 9는 실리카겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피 (1×18.5 ㎝)를 실시하여 분리하였다. 이때, 디클로로메탄과 메탄올 (20/1)의 혼합용매를 전개용매로 사용하여 점차로 극성을 높여서 디클로로메탄과 메탄올 (5/1)의 혼합용매로 칼럼을 용출시켜서 디히드로퀘르세틴 (2.2 ㎎), 캄페롤 3-메틸 에테르 (0.6 ㎎), 퀘르세틴 3-메틸 에테르 (3.0 ㎎)를 각각 순수하게 분리하였다. 손바닥선인장의 가공한 열매의 에틸 아세테이트 분획들로부터 성분들을 분리한 결과, 손바닥선인장의 열매에서와 마찬가지로 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드는 분리되지 않았고 이외의 성분들은 함량의 차이는 약간 있었지만 모두 분리할 수 있었다.

<실시예 5> 뇌신경세포 보호성분들의 구조 결정

상기 실시예 4에서 얻은 각 성분들에 대한 ¹H-NMR (300 MHz)과 ¹³C-NMR (75 MHz) 스펙트럼을 측정하였고, 각 피크의 화학이동값 (chemical shift)을 잔류용매인 메탄올의 화학이동값 (3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다. ¹H-NMR (300 MHz), ¹³C-NMR (75 MHz) 및 ¹³C-¹H 상관관계 스펙트럼 데이터는 각각 하기 표 2 및 3에 나타내었다.

¹H 신호지정 (δ)^*

H	캄페롤	디히드로캄페롤	캄페롤3-메틸 에테르	퀘르세틴	디히드로퀘르세틴	퀘르세틴3-메틸 에테르
2		4.99 (11.59)			4.39 (11.54)
3		4.55 (11.59)			4.80 (11.54)
4
5
6	6.07 (1.72)	5.89 (2.09)	6.10 (1.41)	6.07 (1.79)	5.77 (1.79)	6.09 (1.82)
7
8	6.29 (1.82)	5.93 (2.13)	6.30	6.29 (1.72)	5.81 (1.79)	6.28 (1.82)
9
10
1'
2'	7.98 (8.81)	7.36 (8.57)	7.89 (8.67)	7.63 (1.75)	6.85 (1.22)	7.52 (1.96)
3'	6.79 (8.83)	6.84 (8.60)	6.82 (8.82)
4'
5'	6.79 (8.83)	6.84 (8.60)	6.82 (8.82)	6.78 (8.49)	6.69 (8.11)	6.80 (8.38)
6'	7.98 (8.81)	7.36 (8.57)	7.89 (8.67)	7.53(8.45, 1.83)	6.74(8.16, 1.52)	7.43 (8.46)
OMe			3.67			3.68
^*.괄호 안은 스핀결합상수 (Hz)

¹³C 신호지정

C	디히드로캄페롤	캄페롤 3-메틸 에테르		디히드로퀘르세틴	퀘르세틴 3-메틸 에테르
C	디히드로캄페롤		HMBC	디히드로퀘르세틴		HMBC
2	85.4	158.5		85.5	158.4
3	74.0	139.9		74.1	139.9
4	198.8	180.4		198.8	180.4
5	169.4	163.5		169.2	163.5
6	97.8	100.2	C5, C7, C8, C10	97.7	100.1	C5, C7, C8, C10
7	165.7	166.5		165.7	166.3
8	96.8	95.2	C6, C7, C9, C10	96.7	95.1	C6, C7, C9, C10
9	164.9	158.9		164.9	158.8
10	102.2	106.3		102.2	106.2
1'	129.7	123.0		130.3	123.3
2'	130.7	131.8	C2, C4', C6'	116.5	116.8	C2, C3', C4', C6'
3'	116.5	117.0	C1', C5', C4'	146.7	148.8
4'	159.6	162.1		147.5	150.3
5'	116.5	117.0	C1', C3', C4'	116.3	116.8	C1', C3', C4'
6'	130.7	131.8	C2, C2', C4'	121.3	122.7	C2, C2', C4,
OMe		60.9	C3		60.9	C3

분석 결과, 본 발명에서 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물로부터 분리한 캄페롤의 전체적인 구조는 공지의 캄페롤의 구조 (Okuyama 등, Chem. Pharm. Bull. 26:3071, 1978)와, 퀘르세틴은 공지의 퀘르세틴의 구조 (Grande 등, Planta Medica, 51:414, 1985)와, 디히드로캄페롤은 공지의 디히드로캄페롤의 구조 (Shen 등, Phytochemistry 24:155, 1985)와, 디히드로 퀘르세틴은 공지의 디히드로 퀘르세틴의 구조 (Nonaka 등, Chem. Pharm. Bull. 35:1105, 1987)와, 캄페롤 3-메틸 에테르는 공지의 캄페롤 3-메틸 에테르의 구조 (Grande 등, Planta Medica. 51:414, 1985)와, 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 공지의 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 구조 (Barbera 등, Phytochemistry 25:2357, 1986)와, 그리고 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드는 공지의 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드의 구조 (Pabst 등, Phytochemistry 31:1649, 1992)와 잘 일치함을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 손바닥선인장 열매, 가공한 열매 및 줄기로부터 분리된 성분들의 항산화 작용 및 뇌신경세포 보호효과 확인

상기에서 분리·동정된 활성성분들에 대하여 참조예 1 내지 8의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과, 과산화수소 유발 신경독성 억제효과, NMDA 활성화에 의한 신경독성 억제효과, 성장인자 제거로 인한 세포사멸에 대한 신경독성 억제효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 분리된 화합물 3-옥소-α-이오놀 β-D-글루코사이드, 캄페롤, 디히드로캄페롤, 캄페롤 3-메틸 에테르, 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르 중에서 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 3종 화합물들은 DPPH 라디칼 소거능력이 우수하였으며, 디히드로퀘르세틴과 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 잔틴/잔틴 옥시다제에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능이 우수하였다 (표 4). 캄페롤, 퀘르세틴, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 4종 화합물들은 표 5와 도 5 및 6 에 나타나 있듯이, 잔틴/잔틴 옥시다제에 의하여 유발된 신경세포의 손상뿐만 아니라 과산화수소에 의하여 유발된 신경세포의 손상을 가장 강력하게 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 디히드로퀘르세틴과 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 NMDA 활성화에 의한 신경독성 억제효과가 우수하였으며, 특히 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 성장인자 제거로 인해 초래되는 세포사멸에 의한 신경독성 억제효과 또한 우수하였다.

	DPPH 라디칼 소거능(IC₅₀, ㎍/㎖)	슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 (IC₅₀, ㎍/㎖)
캄페롤	>50	>50
디히드로캄페롤	>50	>50
캄페롤 3-메틸 에테르	>50	>50
퀘르세틴	2.89	>50
디히드로퀘르세틴	4.49	2.48
퀘르세틴 3-메틸 에테르	3.76	4.77

	잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경세포독성 억제효과 (IC₅₀, ㎍/㎖)	과산화수소-유발 신경세포독성 억제효과(IC₅₀, ㎍/㎖)	NMDA-유발신경세포독성 억제효과	성장인자제거-유발 신경세포독성 억제효과
캄페롤	24.9	29.7	-	-
디히드로캄페롤	>300	>300	-	-
캄페롤 3-메틸 에테르	-	>300	-
퀘르세틴	5.5	4.1	-	-
디히드로퀘르세틴	16.6	7.8	33% 억제 (9 ㎍/㎖)47% 억제(30 ㎍/㎖)	-
퀘르세틴 3-메틸 에테르	0.65	0.60	21% 억제 (9 ㎍/㎖)54% 억제(30 ㎍/㎖)	31% 억제(9 ㎍/㎖)86% 억제(30 ㎍/㎖)

<실시예 7> 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 신경세포 보호효과 측정

120분 동안의 일시적 국소 뇌 허혈 백서모델에서 허혈 유발 후 재관류에 의해 유발되는 뇌 손상을 평가하기 위하여 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색 (Bederson et al., Stroke 17:1304, 1986)을 시행하였다. 중대뇌동맥 폐쇄 후 약 1일이 경과한 후 단두대로 백서를 희생시키고 신속하게 뇌를 적출하였다. 뇌 주형 (ASI Instruments, Warren, MI, USA)을 이용하여 전두극으로부터 1 ㎜되는 지점부터 2 ㎜ 두께의 연속적으로 잘려진 뇌 관측 절편 각각에 0.9% 생리식염수로 제조된 2% TTC 용액을 가하고 37℃에서 60분간 배양하여 염색하였다. TTC로 염색된 뇌 절편을 10% 인산완충 포르말린 (phosphate-buffered formalin) 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒷면 영상을 CCD 비디오 카메라를 이용하여 컴퓨터에서 획득하였다. 이로부터 진한 적색으로 염색이 되지 않은 경색이 일어난 대뇌피질 및 선조체 지역의 면적 (㎣)은 영상분석용 소프트웨어 (Optimas, Edmonds, WA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 경색 용적 (㎣)은 절편들의 경색 면적의 총합계에 절편 두께를 곱함으로써 계산하였다. 이때, 총 경색 용적은 대뇌피질 및 선조체 지역 각각에서의 경색 용적의 합계로서 나타내었다. 한편, 부종의 효과를 보완하기 위하여 교정 경색 용적을 계산하였는데, 각 절편에 있어 교정 총 경색 면적은 허혈 반대측 (좌측) 대뇌 반구의 총 면적으로부터 허혈 동측 (우측) 대뇌 반구에 있어서의 정상조직의 면적을 빼줌으로써 계산하였고, 교정 총 경색 용적은 교정 총 경색 면적으로부터 상기와 같은 방식으로 계산하였다.

또한, 허혈이 유발된 대뇌 반구의 부종율은 하기 수학식 1에 의하여 산출되었다.

A: 총 관측 절편들에서 허혈이 유발된 대뇌 반구의 용적 (㎣)

B: 총 관측 절편들에서 정상 대뇌 반구의 용적 (㎣)

그 결과, 퀘르세틴 3-메틸 에테르를 허혈 유발 후 30분에 10 ㎎/㎏ 용량으로 복강 내로 투여한 군에서는 대뇌 피질 경색 용적 및 총 경색 용적, 교정 총 경색 용적 및 부종율 모두에서 생리식염수를 투여한 대조군에 비해 각각 55.3, 49.6, 45.6 및 54.7%의 유의성 있는 감소를 나타냄으로써 뚜렷한 신경세포 보호효과를 보여주었다. 이러한 모든 결과는 하기 표 6에 정리하였다.

처치	n	경색 용적			교정총 경색 용적	부종율(%)
처치	n	선조체	대뇌피질	총	교정총 경색 용적	부종율(%)
부형제(식염수)	6	36.7 ±2.0	181.8 ±11.4	218.6 ±12.5	150.0 ±7.1	12.8 ±1.0
퀘르세틴	9	30.1 ±4.9	130.5 ±18.6	161.1 ±21.4	110.6 ±15.8	9.1 ±1.1^*
퀘르세틴 3-메틸 에테르	11	28.9 ±3.1	81.2 ±20.8^*	110.1 ±22.9^*	81.6 ±17.8^*	5.8 ±0.7^*
디히드로퀘르세틴	8	30.1 ±4.3	169.4 ±12.7	199.5 ±16.5	130.7 ±13.1	11.9 ±0.5
n: 실험동물 수 ^*던칸의 다중 범위 검정 결과 (Duncan's multiple range test) 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05)

<실시예 8> 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 신경행동학적 회복효과 측정

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 처리된 백서의 신경행동학적 회복효과를 렐톤 (Relton) 등의 신경행동학적 점수 (neurological score) 측정법 (Stroke 28:1430, 1997)에 따라 하기와 같이 측정하였다.

구체적으로, 전족 굴곡 (forelimb flexion, 백서의 꼬리를 잡고 공중에 완전히 들었을 때의 좌측 전족 굴곡), 전곡 굴곡 기간 (duration of forelimb flexion, 10초까지의 측정기간 동안 전족 굴곡 기간) 및 움직임의 대칭 (백서의 꼬리를 잡고 뒷발을 공중에 둔 채로 앞발만으로 걷게 하였을 때 움직임의 대칭)을 검사항목으로 하여 각 반응에 따라 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 점수를 부여하였다.

검사항목	점수
검사항목	0	1	2	3	4
전족 굴곡	좌측 전족의 움직임이 전혀 없음	좌측 전족의 제한된 움직임	좌측 전족의 덜 뻗는 또는 더 느린 움직임	대칭적 움직임	-
전족 굴곡 기간	8-10초	6-8초	4-6초	2-4초	0-2초
움직임의 대칭	좌측 전족의 움직임이 전혀 없음	좌측 전족의 움직임이 극미하고 백서는 회전함	좌측 전족이 우측보다 덜 뻗음	전족을 뻗고 정상적으로 걸음	-

상기 표 7에 따라 부여된 각 검사항목의 점수를 모두 합산하여 각 투여군의 최종적인 신경행동학적 점수를 하기 표 8 (실험치는 평균치±표준오차로 표시함)에 나타내었으며, 이를 도 12에 그래프로서 나타내었다. 여기에서 10점은 정상인 상태, 즉 신경학적 결손이 전혀 없는 것을 의미하며, 점수가 작을수록 신경학적 결손이 크게 나타나는 것을 의미한다.

중대뇌동맥 폐쇄 후 측정 시까지의 시간	처치
중대뇌동맥 폐쇄 후 측정 시까지의 시간	부형제(식염수)	퀘르세틴	퀘르세틴 3-메틸 에테르	디히드로퀘르세틴
30분	2.33 ± 0.24	2.44 ± 0.24	2.36 ± 0.15	2.33 ± 0.16
24시간	2.50 ± 0.41	4.56 ± 0.53^*	4.81 ± 0.44^*	3.00 ± 0.33
^*던칸의 다중 범위 검정 결과 24시간에서 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05)

상기 표 8 및 도 12에서 나타난 바와 같이, 퀘르세틴 3-메틸 에테르를 투여한 군들은 대조군에 비해 신경행동학적 점수가 유의성 있게 증가됨으로써 신경행동학적 회복효과를 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 캄페롤, 디히드로퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 또는 이들을 포함하는 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물은 우수한 항산화 작용, 뇌신경세포 보호작용 및 뇌허헐 동물모델에서 뚜렷한 신경세포 보호효과를 나타내므로 뇌신경질환과 심장허혈의 예방 및 치료에 유효하다는 사실을 확인하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물 및 이로부터 분리된 캄페롤, 디히드로퀘르세틴 및 퀘르세틴 3-메틸 에테르는 DPPH 라디칼 소거능과 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능이 우수하며, 잔틴/잔틴 옥시다제, 과산화수소, NMDA 활성화-유발 신경독성, 성장인자 제거시 세포사멸에 의한 신경독성을 억제하고, 뇌허혈 동물모델에서 뚜렷한 신경세포 보호효과를 나타내므로 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머, 파킨슨병과 같은 뇌신경계 질환과 심근경색, 뇌경색과 같은 허혈성 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 손바닥선인장 열매 분획들의 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 2는 손바닥선인장 열매 분획들의 과산화수소-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 3은 손바닥선인장 줄기 분획들의 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 4는 손바닥선인장 줄기 분획들의 과산화수소-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 5는 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리된 성분들의 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 6은 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리된 성분들의 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,

도 7은 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리된 성분들의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이고,

도 8은 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리된 성분들의 잔틴/잔틴 옥시다제에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능을 나타낸 것이고,

도 9는 퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 디히드로퀘르세틴의 대뇌 피질, 선조체 및 총 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고.

도 10은 퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 디히드로퀘르세틴의 교정 총 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고,

도 11은 퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 디히드로퀘르세틴의 부종율에 대한 효과를 나타낸 것이고,

도 12는 퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 디히드로퀘르세틴의 신경행동학적 회복에 대한 효과를 나타낸 것이다.

Claims

유효성분으로서 손바닥선인장 (Opuntia ficus-indica)의 에틸 아세테이트 추출물을 함유하는, 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 심근경색 또는 뇌경색 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,

손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물이 유효성분으로서 캄페롤, 디히드로퀘르세틴 또는 퀘르세틴 3-메틸 에테르를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서,

손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물이 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 가공한 열매의 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 3항에 있어서,

손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물이

1) 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 가공한 열매 1 ㎏당 알콜용매 0.1 내지 10 ℓ를 첨가하고 상온에서 4 내지 5일 동안 방치하는 단계;

2) 단계 1)로부터 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 알콜 추출물을 얻는 단계; 및

3) 알콜 추출물 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ의 물을 가한 후, 에틸 아세테이트 (EtOAc) 0.5 내지 2 ℓ로 추출하여 얻는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 4항에 있어서,

단계 1)의 알콜용매가 저급알콜, 및 60% 이상의 알콜 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
유효성분으로서 디히드로퀘르세틴, 퀘르세틴 3-메틸 에테르, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 심근경색 또는 뇌경색 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
삭제