CN107753475A

CN107753475A - 山奈酚在神经细胞保护中的应用

Info

Publication number: CN107753475A
Application number: CN201711136802.5A
Authority: CN
Inventors: 张宁; 耿放; 刘国良; 刘斌; 王发善; 宋垚辰
Original assignee: Heilongjiang Bao Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Bao Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2018-03-06

Abstract

本发明公开了山奈酚在神经细胞保护中的应用。本发明通过实验证实山奈酚可以促进Aβ_25‑35致损的PC‑12细胞的增殖率与活性，同时可以抑制Aβ_25‑35致损的PC‑12细胞的凋亡，本发明的研究成果为体内、体外保护神经细胞细胞提供了新的方法，为神经系统疾病的临床研究和基础研究提供了新的思路。

Description

山奈酚在神经细胞保护中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及山奈酚在神经细胞保护中的应用，具体的涉及山奈酚在Aβ_25-35致损的PC-12细胞保护中的应用。

背景技术

山奈酚(Kaempferol)属黄酮类化合物，是一种植物雌激素成分，广泛分布在柚子、巫榛子、茶叶等绿色植物，各种水果、蔬菜以及骨碎补等中药中。有研究表明，山奈酚可明显促进乳腺癌细胞MCF-7增殖，表现出雌激素样活性；山奈酚促进成骨样细胞UMR-106的增殖，具有雌激素样活性；山奈酚与异鼠李素较倾向作用于ERβ，提示山奈酚对骨细胞发挥雌激素样和抗雌激素样作用。研究表明，山奈酚具有抗氧化、抗炎、保护神经元、抵抗癌症、抗动脉硬化、降低血糖和增殖骨细胞等作用。近几年，山奈酚的抗炎作用和神经保护作用越来越受到研究学者的关注。

细胞凋亡是在一定条件下细胞接受刺激信号并受基因调控的一种死亡过程，可以发生在生理和病理条件下。关于细胞凋亡的机制，越来越多的证据表明，线粒体参与了凋亡过程，并在细胞凋亡中起最基本的作用；现在人们普遍认为，线粒体是凋亡的执行者，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。研究表明，细胞凋亡在癌症发生、各种自身免疫性疾病以及神经退化性疾病中中扮演着中重要的角色。

目前山奈酚对神经保护的作用机制尚不明确，本申请拟通过Aβ_25-35致记忆缺失的神经细胞PC-12，在细胞活性和细胞凋亡水平上对山奈酚进行机理探究，为神经系统的基础研究提供实验积累以及理论依据。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种保护神经细胞的方法，其在与促进神经细胞增殖及增加其活性；或抑制神经细胞的凋亡。本发明通过实验发现，山奈酚可以促进Aβ_25-35致损的PC-12细胞的增殖以及降低其凋亡率。

具体地，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种保护神经细胞的方法，所述方法为施用山奈酚。

进一步，所述保护神经细胞的方法包括促进神经细胞增殖或抑制神经细胞凋亡。其中，所述方法为非诊疗目的的方法，例如该方法可以用于神经系统的基础研究，获得中间产物。

进一步，所述神经细胞为Aβ_25-35致损的PC-12细胞。

优选的，所述山奈酚的浓度为10^-1～10^-4μmol/L。

更为优选的，所述山奈酚的浓度为10^-2μmol/L。

在本发明的一种实施方式，所述抑制神经细胞凋亡为抑制神经细胞中的Bax 或Caspase-3的表达。

在本发明的另外一种实施方式，所述抑制神经细胞凋亡为促进神经细胞细胞中的Bcl-2、或ERβ、或p-ERK1/2的表达。

本发明提供了山奈酚在制备保护神经细胞的药物组合物中的应用。

进一步，所述细胞为PC-12细胞。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或者载体。

药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体是本领域技术人员所公知的，包括但不限于能够被用作治疗药物给药载体的任何无活性物质。

本发明提供了一种阻断山奈酚作用的方法，所述方法为施用ER拮抗剂或 MAPK阻断剂。

进一步，所述阻断剂为ERK阻断剂。

术语“拮抗剂”指能够阻断、中和、抑制、取消、降低和/或干扰靶标的一种或多种活性和/或降低如此处所述一个或更多靶蛋白的表达(或编码一个或更多靶蛋白的核酸的表达)。它们包括例如，抗体、多肽、肽、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)和其它抑制性RNAs、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、适体和肽体。

本发明中的ER拮抗剂包括本领域常用的拮抗剂，包括但不限于纯拮抗剂如氟维雌醇(Fulvestrant)、选择性拮抗剂如他莫昔芬(Tamoxifen/Nolvadex)等。在本发明的具体实施方式中，所述拮抗剂为氟维雌醇。

本发明中的MAPK阻断剂可以是阻断ERK通路、或JNK通路、或p38MAPK 通路或ERK5通路的试剂，在本发明的具体实施方式中，所述阻断剂为ERK阻断剂。ERK阻断剂包括本领域常用的阻断剂，包括但不限于U0126、P98059，在本发明的具体实施方式中，所述阻断剂为U0126。

附图说明

图1是山奈酚对Aβ_25-35损伤的PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响图；

图2是山奈酚对Aβ_25-35损伤的PC-12细胞ERβ和p-ERK1/2蛋白表达的影响图；

图3是拮抗ER或阻断MAPK途径对山奈酚作用的影响图；

图4是拮抗ER对山奈酚促进PC-12细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照实验试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1MTT法检测雌二醇(E₂)对Aβ_25-35对PC-12细胞活力的影响

1、细胞培养

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞系(购自中国科学院细胞库)，以含10％FBS和1％P/S的DMEM培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，24h后细胞贴壁，弃掉旧培养液。

2、细胞分组

将PC-12细胞分为两组，每组设置5个复孔，分组情况如下：

空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。

模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度的(20μmol/L、 10μmol/L、1μmol/L)Aβ_25-35，继续培养24h。其中，Aβ_25-35购自BIOSYNTHESIS BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.。

雌二醇组：给予不同浓度的(10^-1μmol/L、10^-2μmol/L、10^-3μmol/L、10^-4μmol/L、 10^-5μmol/L、10^-6μmol/L)雌二醇，完全培养液培养4h后，加入适量Aβ_25-35，控制Aβ_25-35终浓度为20μmol/L，继续培养24h。其中，雌二醇的纯度98％，生产批号为L750N46，购自北京百灵威科技有限公司。

3、MTT检测

1)加入MTT溶液(5g/L)20μL/孔，37℃继续孵育4h。

2)弃掉废液，加入DMSO 200μL/孔，恒温振荡器上振荡10min。

3)酶标仪570nm处检测各孔吸光度值。

4、统计学处理

所有得出的数据结果均表示为平均值±标准差使用SPASS 18.0 软件对各组数据进行单因素方差分析，通过Tukey检验进行组间比较分析显著性，P<0.05为显著性水平，P<0.01为极显著性水平。

5、实验结果

结果如表1所示，与空白组相比，Aβ_25-35组细胞增殖率显著降低(P<0.01)；与模型组比较，除10μmol/L剂量组外各剂量E₂组细胞增殖率显著升高(P<0.01)；其中10^-3μmol/L和10^-4μmol/L E₂组的细胞增殖率且与空白组无显著差异。 10^-3μmol/L的E₂对Aβ_25-35损伤PC-12细胞的保护作用更为显著，是对细胞无毒性作用的最大药物浓度，因此选择10^-3μmol/L作为阳性药物浓度进行后续实验。

表1E₂对Aβ_25-35损伤PC-12细胞活性的影响(n＝6)

注：与空白组比较，*为P<0.05**为P<0.01；与Aβ_25-35组比较，##为P<0.01。

实施例2MTT法检测山奈酚对Aβ_25-35对PC-12细胞活力的影响

1、细胞培养步骤同实施例1

2、细胞分组

具体步骤同实施例1，细胞分组时，将雌二醇组改为山奈酚组，其中山奈酚纯度99.8％，生产批号为MUST-14110508，购自成都曼思特生物技术有限公司。

3、MTT检测步骤同实施例1

4、统计学处理

5、结果

实验结果如表2所示，与空白组相比，Aβ_25-35组细胞增殖率显著降低(P<0.01)；与模型组比较，10^-1μmol/L、10^-2μmol/L、10^-3μmol/L和10^-4μmol/L山奈酚组的细胞增殖率显著升高(P<0.01)。其中，10^-2μmol/L山奈酚组可显著提高细胞的增殖率且与空白组细胞增值率无显著差异(P<0.01)对Aβ_25-35损伤PC-12细胞的保护作用最强，因此选择该药物浓度进行后续实验。

表2山奈酚对Aβ_25-35损伤PC-12细胞活性的影响(n＝6)

实施例3QPCR法检测PC-12细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达水平

1、实验分组

将实验分为6组，包括分组空白组、模型组、雌二醇组、山奈酚组、山奈酚 +Fulvestrant组和山奈酚+U0126组，具体分组情况如下：

空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。

模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入20μmol/L的Aβ_25-35，继续培养24h。

雌二醇组：给予10^-3μmol/L雌二醇，完全培养液培养4h后，加入适量Aβ_25-35，控制Aβ_25-35终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

山奈酚组：给予10^-2μmol/L山奈酚，完全培养液培养4h后，加入适量Aβ_25-35，控制Aβ_25-35终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

山奈酚+Fulvestrant组：预先给予浓度为1μmol/L的Fulvestrant完全培养液处理细胞1h后，弃掉废液，加入相应山奈酚储存液，孵育4h后，加入适量Aβ25-35，控制Aβ_25-35终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

山奈酚+U0126组：预先给予浓度为10μmol/L的U0126完全培养液1mL处理细胞20min后，弃掉废液，加入相应山奈酚储存液，孵育4h后，加入适量Aβ_25-35，控制Aβ_25-35终浓度为20μmol/L，继续培养24h。

2、QPCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达

1、引物设计

根据Bax、Bcl-2、Caspase-3及内参基因β-actin的序列设计引物。

β-actin的引物序列：

正向引物序列为5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物序列为5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’(SEQ ID NO.2)。

Bax的引物序列：

正向引物序列为5’-TGCTACAGGGTTTCATCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物序列为5’-ATGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3’(SEQ ID NO.4)。

Bcl-2的引物序列：

正向引物序列为5’-AGCCTGAGAGCAACCGAAC-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物序列为5’-AGCGACGAGAGAAGTCATCC-3’(SEQ ID NO.6)。

Caspase-3的引物序列：

正向引物序列为5’-TAAGACATACTCCTTCCATCA-3’(SEQ ID NO.7)；

反向引物序列为5’-ATCACTGTAACTTGCTAATCAT-3’(SEQ ID NO.8)。

2、QPCR反应

采用Fermentas公司的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，具体步骤参照说明书。在Mx3000P型型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)_处理组 -(Ct目的基因-Ct内参基因)_对照组，目的基因相对表达量＝2^-ΔΔCt

3、统计学处理

4、结果

结果如表3所示，与空白组比较，模型组促凋亡基因Bax和Caspase-3mRNA 的表达显著增加(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，雌二醇和山奈酚组促凋亡基因Bax和Caspase-3mRNA的表达显著降低(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表达显著增加(P<0.01)。与山奈酚组比较，山奈酚+Fulvestrant、山奈酚+U0126组促凋亡基因Bax和Caspase-3 mRNA的表达显著增加(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表达显著降低 (P<0.01)。由此可知，山奈酚能够抑制Aβ_25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因mRNA 的表达，促进抑凋亡基因mRNA的表达，拮抗ER或阻断ERK途径，山奈酚对促凋亡基因mRNA表达的抑制作用和对抑凋亡基因mRNA表达的促进作用明显减弱。

表3 PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达

注：与空白组比较，**为P<0.01；与模型组比较，^##为P<0.01；与山奈酚组比较， ^△△为P<0.01。

实施例4Western blot检测PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK1/2 及ER亚型蛋白表达

1、实验分组具体情况同实施例3

2、Western blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、ERβ、p-ERKI/2蛋白的表达，采用Lane ID凝胶分析系统分析条带灰度(IOD)，分析并获得各条带的灰度值，目的蛋白的表达水平根据靶条带的灰度值与内参的灰度值的比值来反映。

3、统计学处理

所有得出的数据结果均表示为平均值±标准差使用SPASS 18.0 软件对各组数据进行单因素方差分析，通过Tukey检验进行组间比较分析显著性， P<0.05为显著性水平，P<0.01为极显著性水平。

4、结果

1)PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况如图1和表4所示，与空白组比较，模型组促凋亡基因Bax和Caspase-3蛋白的表达显著增加(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，雌二醇和山奈酚组促凋亡基因Bax和Caspase-3蛋白的表达显著降低(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表达显著增加(P<0.01)。由此可知，雌二醇和山奈酚能够抑制 Aβ_25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因蛋白的表达，增加抑凋亡基因蛋白的表达。

表4PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达(n＝3)

注：与空白组比较，**为P<0.01；与模型组比较，##为P<0.01。

2)PC-12细胞ERβ和p-ERK1/2蛋白的表达如图2和表5所示，经检测各组均未能测出ERα蛋白条带。与空白组比较，模型组ERβ和p-ERK1/2蛋白的表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，山奈酚和雌二醇组ERβ和p-ERK1/2 蛋白的表达显著升高(P<0.01)。由此可知，雌二醇和山奈酚能够促进Aβ_25-35损伤PC-12细胞ERβ和p-ERK1/2蛋白的表达。

表5PC-12细胞ERβ、p-ERK1/2蛋白的表达(n＝3)

注：与空白组比较，**为P<0.01；与模型组比较，##为P<0.01。

3)拮抗ER或阻断MAPK途径对药物作用的影响结果如图3和表6所示，与模型组比较，山奈酚组PC-12细胞中促凋亡基因Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表达显著降低(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-蛋白的表达显著升高(P<0.01)；与山奈酚组比较，山奈酚+Fulvestrant、山奈酚+U0126组促凋亡基因Bax和Caspase-3 蛋白的表达显著增加(P<0.01)，抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表达显著降低(P<0.01)。由此可知，山奈酚能够抑制Aβ_25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因蛋白的表达，促进抑凋亡基因蛋白的表达，拮抗ER或阻断ERK途径，山奈酚对促凋亡基因蛋白表达的抑制作用和对抑凋亡基因蛋白表达的促进作用明显减弱。

表6拮抗ER或阻断MAPK途径对药物作用的影响(n＝3)

注：与模型组比较，**为P<0.01；与山奈酚组比较，##为P<0.01。

4)拮抗ER对山奈酚促进PC-12细胞p-ERK1/2产生的影响结果如图4所示，未予ER拮抗剂处理的山奈酚组的PC-12细胞经Aβ_25-35处理后仍能产生一定量的 p-ERK1/2，加入ER拮抗剂后未测出p-ERK1/2。由此结果可知，ER参与了山奈酚上调p-ERK1/2表达的过程。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 黑龙江葆纳生物科技有限责任公司

<120> 山奈酚在神经细胞保护中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtcaccaac tgggacgata 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggtgttga aggtctcaaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctacaggg tttcatccag 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttgttgt ccagttcatc g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcctgagag caaccgaac 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcgacgaga gaagtcatcc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagacatac tccttccatc a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcactgtaa cttgctaatc at 22

Claims

1.一种保护神经细胞的方法，其特征在于，所述方法为施用山奈酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，促进神经细胞的增殖或抑制神经细胞凋亡。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述神经细胞为Aβ_25-35致损的PC-12细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述山奈酚的浓度为10^-1～10^-4μmol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述山奈酚的浓度为10^-2μmol/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抑制神经细胞凋亡为抑制神经细胞中的Bax或Caspase-3的表达。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抑制神经细胞凋亡为促进神经细胞细胞中的Bcl-2、或ERβ、或p-ERK1/2的表达。

8.山奈酚在制备保护神经细胞的药物中的应用。

9.一种阻断山奈酚作用的方法，其特征在于，所述方法为施用ER拮抗剂或MAPK阻断剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述阻断剂为ERK阻断剂。