KR101164020B1 - 손바닥선인장 추출물을 함유하는 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 손바닥선인장 추출물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 손바닥선인장의 부탄올 추출물 또는 이 추출물의 산 가수분해물이 유효성분으로 함유되어 있음으로써 뇌신경 질환, 뇌혈관 질환 또는 심혈관 질환 보다 구체적으로는 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 심근경색 등의 치료 및 예방에 유효한 약학 조성물에 관한 것이다.
손바닥선인장, 부탄올 추출물, 뇌졸중, 허혈, 신경세포 보호, 뇌신경질환
Description
도 1은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 HPLC 분석패턴 및 주요성분과 표준품과의 패턴을 비교한 것이고,
도 2는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 HPLC 분석패턴 및 산 가수분해물의 패턴을 비교한 것이고,
도 3은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이고,
도 4는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 지질 과산화 억제효과를 나타낸 것이고,
도 5는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,
도 6은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 과산화수소-유발 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,
도 7은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 NMDA-유발 흥분성 신경독성 억제효과를 나타낸 것이고,
도 8은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 베타 아밀로이드-유발 신경독성 억제 효과를 나타낸 것이고,
도 9는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 7일간 경구투여 시의 교정 대뇌피질 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 10은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 7일간 경구투여 시의 교정 총 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 11은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 7일간 경구투여 시의 대뇌피질 위축율에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 12는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 7일간 경구투여 시의 총 위축율에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 13은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 7일간 경구투여 시의 신경행동학적 회복에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 14는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 14일간 경구투여 시의 교정 대뇌피질 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고.
도 15는 손바닥선인장 부탄올 추출물의 14일간 경구투여 시의 교정 총 경색 용적에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 16은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 14일간 경구투여 시의 대뇌피질 위축율에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 17은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 14일간 경구투여 시의 총 위축율에 대한 효과를 나타낸 것이고,
도 18은 손바닥선인장 부탄올 추출물의 14일간 경구투여 시의 신경행동학적 회복에 대한 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 손바닥선인장 추출물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 손바닥선인장의 부탄올 추출물 또는 이 추출물의 산 가수분해물이 유효성분으로 함유되어 있음으로써 뇌신경 질환, 뇌혈관 질환 또는 심혈관 질환 보다 구체적으로는 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 심근경색 등의 치료 및 예방에 유효한 약학 조성물에 관한 것이다.
혈전이나 동맥 경화증에 의하여 뇌동맥 또는 관상동맥이 폐쇄되어 혈류량이 역치점 이하로 감소하면 허혈로 인해 뇌신경세포 및 심장세포가 손상을 입게 되고 결국 세포사멸 (cell death)이 유발되어 뇌경색 (brain infarction) 및 심근경색 (myocardial infarction)이 나타나게 된다. 허혈에 의한 세포의 저산소증으로 인해 산화적 인산화반응은 감퇴되나 궁극적으로는 혐기성 해당작용 (glycolysis)이 정지됨으로써 세포내 에너지원으로 사용되는 아데노신 트리포스페이트가 고갈되게 된다. 에너지가 결정적인 역치점 아래로 떨어지게 되면 생명유지에 필수적인 세포기능이 저해되고 이로 인해 다방면의 퇴행성 과정들이 유발됨으로써 세포사멸을 초래하게 된다. 세포사멸은 허혈 기간 동안은 물론 재관류 시에도 일어난다.
특히, 뇌 허혈(cerebral ischemia)은 임상적으로 심장정지(cardiac arrest) 및 뇌졸중(stroke)에서 가장 보편적으로 나타나는 형태로서, 특히 고령인구에서 발생 빈도가 매우 높으며 이로 인해 난치성 뇌 손상이 야기되어 아주 중요한 의료상의 문제점으로 남아있다. 이 질환은 뇌신경세포 손상으로 인한 뇌 기능 소실로 불구가 되거나, 혼수상태에 빠질 수 있으며, 심한 경우에는 사망에 이르게 된다. 이 질환의 예방목적으로 사용되는 약물으로는 고혈압 치료제, 뇌혈류 개선제 및 고지혈증 치료제 등이 있으나, 뇌졸중 발생 후에는 혈전용해제를 제외하고는 허혈에 의해 야기되는 뇌신경세포 손상을 보호해 줄 수 있는 전 세계적으로 임상사용이 승인된 적절한 신경보호용 치료제가 현재로서는 없는 실정이다.
각국에서는 오래 전부터 뇌 허혈로부터 뇌 손상에 이르는 일련의 병인 기전 및 치료방법을 모색하기 위하여, 뇌 허혈의 실험동물 모델을 개발하는 연구 및 in vitro neuronal/glial cell culture system을 이용하는 연구가 활발히 진행되어 왔다. 이런 실험모델을 토대로 하여 1980년대에는 허혈(ischemia)에 의해 다량의 글루타메이트(glutamate)와 같은 흥분성 신경전달물질이 유리되어 수용체 작용을 통해 과량의 칼슘이 세포 내로 유입되어 흥분독성(excitotoxicity)을 일으킴으로서 궁극적으로 뇌신경세포를 사멸시킨다는 글루타메이트 캐스케이드(glutamate cascade) 가설이 제안되었다[Choi, D. W. J. Neurosci. 1987, 7, 369-379]. 이 가설을 근거로 개발된 약물들은 실험동물 모델에서 국소 허혈(focal ischemia)에 의한 뇌 손상을 감소시켜 일부가 현재 임상시험 중에 있으나, 거의 대부분은 임상에서 부작용 내지는 효능이 검증되지 않아서 개발이 중단되었다. 또한 증폭과 정에 관여하는 칼슘이온의 세포 내로의 유입을 막기 위하여 니모디핀(Nimodipine), 리파리진(Lifarizine, Syntex; 제2상에서 종료), SNX111, 이스라디핀(Isradipine)과 같은 칼슘 채널 길항제들이 시도되었으나, 그 효과가 일정하게 나타나지 않았으며 여전히 연구되어야 할 부분으로 남아있다.
허혈성 뇌 손상의 신경독 캐스케이드(neurotoxic cascade)에 있어 세포내 과량의 세포독성 칼슘이온은 NOS의 활성화 및 과량의 NO 생성을 통해 활성 산소종(ROS, RNS)을 발생시킨다. 또한 미토콘드리아에서는 증가된 칼슘이온이 산화적 인산화를 저해시킴으로써 에너지 공급을 더욱 감소시키고 자유 라디칼들의 생성 증가를 초래한다. 과다 생성된 자유 라디칼들은 DNA 손상 외에도 지질 과산화에 의해 세포막을 손상시킨다. 더욱이 자발적 또는 치료에 의해 허혈 부위의 혈류가 회복되어져 재관류(reperfusion)가 일어날 때는 공급되는 산소가 자유 라디칼들을 발생시키는 생화학적 반응을 증강시킬 수 있다.
최근에는 이 중에서도 신호전달물질 및 신경독소로서 작용할 수 있는 자유 라디칼인 NO가 허혈성 뇌 손상에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다는 보고가 증가 일로에 있는 추세이다[Iadecola, C. Trends in Pharmacol. Sci. 1997, 20, 132-9]. 그러나 기존에 진행되고 있는 연구방향은 주로 비타민 E 및 C의 구조 변형 등을 이용한 항산화제 합성을 통하여 뇌졸중 치료제로서 개발하는 분야에 초점이 맞추어져 있으나, 뇌 허혈 후 동반되는 뇌 손상의 속도를 늦추거나 예방을 위한 약품의 개발은 미진하였다.
손바닥선인장은 예로부터 민간에서 화상, 부종, 소화불량, 종기 및 기관지 천식 등에 사용되어 왔으며, 열매의 70% 메탄올 추출물의 신경손상 억제효과가 보고된 바 있다[이남호 등, Kor. J. Pharmacogn. 2000, 31, 412-415; 위명복, Yakhak Hoiji 2000, 44, 613-619]. 기존의 연구는 주로 손바닥선인장의 알콜 추출물이 in vitro에서 실험에 의한 활성에 관한 것으로, 손바닥선인장 추출물이 약리효과를 보일 수 있다는 막연한 가능성만을 제시하고 있을 뿐이었다.
이에 반하여, 본 발명자들은 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten Makino)의 에틸 아세테이트 추출물 및 이 추출물로부터 분리된 활성 화합물로서 퀘르세틴 3-메틸 에테르가 항산화 작용 및 뇌졸중 동물모델에서 정맥투여 시 뇌신경세포 보호효과를 나타낸다는 것을 확인하여 특허 등록받은 바 있다[대한민국 특허등록 제523,562호]. 즉, 대한민국 특허등록 제523,562호에서는 아래 도식표에 나타낸 바와 같이, 손바닥선인장의 줄기 또는 열매를 메탄올(MeOH), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에틸 아세테이트(EA) 및 부탄올(BuOH)을 추출용매로 사용하여 차례로 추출하여 얻은 각각의 분획물에 대해 라디칼 소거능, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능, 과산화수소 신경독성 억제효능 실험을 실시한 결과, 에틸 아세테이트(EA) 분획물이 가장 우수한 신경세포 보호효과를 나타내었음을 확인하였고, 그리고 에틸 아세테이트(EA) 분획물로부터 활성 화합물로서 퀘르세틴 3-메틸 에테르 등을 분리하였다.
그러나, 상기한 대한민국 특허등록 제523,562호 발명은 정맥투여용 주사제로서의 유용성을 밝히고 있을 뿐이고, 손바닥선인장의 에틸 아세테이트 추출물 또는 이로부터 분리한 활성 화합물을 경구투여용 제형으로 사용하는 것에 대해서는 전혀 고려치 않고 있다.
현재 각국의 뇌졸중 치료제 개발연구 방향은 뇌졸중 발생 시 주사제용으로 사용하기 위한 치료제의 개발연구가 대부분을 차지하고 있으며, 허혈에 의해 야기되는 뇌신경세포 손상을 보호해 줄 수 있는 경구용 약물 또한 현재로서는 거의 없는 실정이다. 한편, 천연 약물의 장점 중 하나는 천연물 추출물은 활성성분과 유사한 성분들을 다양하게 함유하고 있거나 상승효과로 인하여 활성성분을 단독으로 사용하는 것보다는 추출물 형태로 사용하는 것이 유리하다는 보고가 있다[M. Kaszkin 등, Phytomedicine 2004, 11, 585-595]. 그러나 이 경우에는 활성을 나타내지 않는 성분 또한 추출물에 포함되어 있어 활성성분의 함량이 상대적으로 감소하여 유의성 있는 효과를 입증하기 어려워 추출물 형태를 결정하는데 많은 어려움이 있다.
본 발명자들은 경구투여에 적합한 천연 약물로서 손바닥선인장 추출물을 개발하고자 연구하던 중, 손바닥선인장의 부탄올 추출물이 신경세포 보호효과가 우수 함은 물론이고 경구투여용 약물로 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 대한민국 특허등록 제523,562호에 개시된 부탄올(BuOH) 분획물은 메탄올, 디클로로메탄 및 에틸 아세테이트로 차례로 추출한 후의 여액을 부탄올(BuOH)로 추출하여 얻은 분획물으로, 신경세포 보호효과가 에틸 아세테이트(EA) 분획물에 비교하여 미약하여 천연 약물로서의 사용에 대해 고려할 수 없었다. 이에 반하여, 본 발명이 특허청구하는 부탄올 추출물은 손바닥선인장을 부탄올으로 추출하여 얻은 것으로, 상기 선등록된 발명에 개시된 부탄올 분획물과 달리 신경세포 보호효과가 우수하였고, 특히 동물모델에 경구투여하였을 때 유효한 효과를 나타내므로 경구투여용 치료제로서도 유용함을 확임으로서 본 발명을 완성하게된 것이다. 이러한 효과는 추출용매의 선정 등 추출방법상의 차이로 인하여 서로 다른 조성의 추출물을 얻은 결과로 인정되고, 실제로 본 발명자들의 HPLC 분석 결과에서도 본 발명의 부탄올 추출물이 선등록된 발명에 개시된 부탄올 분획물 또는 에틸 아세테이트(EA) 분획물과는 현격하게 다른 스펙트럼 경향을 나타내고 있음을 확인할 수 있었고, 뇌졸중 동물모델에서 경구투여 시 신경세포 보호활성 실험에서도 현격한 차이를 나타내고 있음도 확인하였다.
본 발명의 목적은 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica)의 부탄올 추출물을 유효성분으로서 함유하는 뇌신경 질환, 뇌혈관 질환 및 심혈관 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica) 부탄올 추출물의 산 가수분해물을 유효성분으로서 함유하는 뇌신경 질환, 뇌혈관 질환 및 심혈관 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica)의 부탄올 추출물 또는 이 추출물의 산 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 경구투여제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 작용 및 신경세포 보호활성을 나타내는 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten)의 부탄올 추출물을 함유하는, 허혈성 질환, 뇌 신경계 질환 또는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다:
신경세포 보호활성을 갖는 본 발명의 손바닥선인장 부탄올 추출물은 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 부탄올로 추출하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 잘게 절단하여 그대로 사용하거나 냉동 건조시킨 후, 메탄올 또는 에탄올과 같은 탄소수 1 내지 3의 저급 알콜을 추출용매로 사용하여 원료 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 7 ℓ의 양으로 가하고 20 내지 90 ℃에서 바람직하기로는 70 내지 80 ℃에서 3 내지 6시간 바람직하기로는 4시간동안 환류하여 추출한다. 이때, 상기한 저급 알콜은 무수 알콜 이외에도 50% 이상의 물이 포함된 알콜 수용액을 사용하여도 본 발명이 목적하는 효과는 충분히 달성될 수 있다. 상기한 추출 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 알콜 추출물을 얻는다. 알콜 추출물 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 1 내지 5 ℓ의 물을 가한 후, 부탄올(n-BuOH) 1 내지 5 ℓ, 바람직하게는 1 내지 5 ℓ로 충분히 추출하여 부탄올 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 부탄올로 직접 상기와 같은 방법으로 추출하여도 유사한 조성을 갖는 추출물을 얻을 수 있다. 즉, 손바닥선인장의 줄기, 열매 또는 증숙하여 건조한 열매를 잘게 절단하여 그대로 사용하거나 냉동 건조시킨 후, 부탄올을 추출용매로 사용하여 원료 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 0.5 내지 7 ℓ의 양으로 가하고 20 내지 90 ℃에서 바람직하기로는 70 내지 80 ℃에서 3 내지 6시간 바람직하기로는 4시간동안 환류하여 부탄올 추출물을 얻을 수 있다.
상기에서 얻은 손바닥선인장 부탄올 추출물에 포함된 성분들을 파악하기 위하여 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 또는 XAD 수지 등의 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 뇌신경세포 보호효능을 나타내는 퀘르세틴 3-메틸 에테르 유사구조의 성분들을 분리 및 정제할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수 차례 실시할 수 있는데, 특히 세파덱스, RP-18 또는 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.
상기의 칼럼 크로마토그래피 과정을 통해 손바닥선인장의 부탄올 추출물로부터 18종의 화합물을 분리하여 그 구조를 규명하였다. 그 결과 신규 화합물 이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일)네오헤스페리도사이드로 플라보노이드 배당체에 페루로일기가 결합한 화합물을 분리하였다. 그 이외의 화합물 중에서 6종은 탄닌 계열의 페놀성 화합물이었으며, 후라보노이드 계열의 화합물 중에서는 유효성분인 퀘르세틴 3-메틸 에테르를 비롯한 3종을 제외한 나머지는 모두 이 식물에서 처음 분리된 화합물임을 알았다. 이들 화합물은 이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일) 네오헤스페리도사이드(1), 2,3,4-트리히드록시벤조산(2), 4-히드록시벤조산(3), 페룰린산(4), 이소람네틴 3-O-글루코사이드 (5), 2,3-디히드로퀘르세틴 (6), 신남산 (7), 캄페롤 7-O-글루코피라노사이드(8), 자타로사이드-A(9), 4-O-글루코피라노실시나핀산(10), 이소람네틴 3-O-루티노실-4'-O-β-D-글루코사이드(11), 이소람네틴 3-O-(2,6-디람노실)글루코사이드(12), 이소람네틴 3-O-루티노사이드(nacissin)(13), 2,3-디히드로캄페롤(14), 퀘르세틴 3'-O-β-D-글루코사이드(15), 퀘르세틴 3-O-메틸 에테르 (16), 이소람네틴 3-O-네오헤스페리도사이드 (17), n-부틸-β-D-프럭토피라노사이드 (18)로 동정하였다.
첨부도면 도 1에는 손바닥선인장의 부탄올 추출물에 포함된 성분들의 HPLC 분석패턴 및 주요성분과 표준품과의 패턴을 비교하여 나타내었다.
한편, 본 발명은 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 산으로 가수분해한 가수분 해산물이 유효성분으로 함유된 약학 조성물을 권리범위로서 포함한다. 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 산으로 가수분해할 경우, 첨부도면 도 2에 나타낸 HPLC 패턴에서 보듯이 퀘르세틴 3-메틸 에테르의 함량이 증가하므로 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 다양한 조건에서 산으로 가수분해한 산물 또한 뇌신경보호제로 사용될 수 있을 것으로 보인다. 산 가수분해는 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 염산으로 산 가수분해한 후에, 알칼리로 중화한 다음에, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜으로 여과하여 여액을 얻는 과정으로 이루어진다. 보다 구체적으로는 다이옥산과 2 N 염산을 사용하여 산 가수분해한 다음, 5 N NaOH로 pH 6 내지 pH 8로 중화하고, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜으로 여과하여 여액의 산 가수분해물을 얻는다.
상기 제조한 손바닥선인장의 부탄올 추출물 및 이의 산 가수분해물은 뇌졸중의 임상에 매우 유사한 허혈성 뇌 손상 실험 동물모델에서 경구투여한 경우에도 탁월한 뇌신경 보호효능을 나타낸다. 따라서, 손바닥선인장의 부탄올 추출물 및 이의 산 가수분해물은 뇌졸중 및 치매와 같은 각종 뇌신경 질환, 뇌경색과 같은 뇌혈관 질환, 심근경색과 같은 심혈관 질환의 예방 및 치료제로서 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.
기존에 개발되어 임상시험 중에 있던 NMDA 수용체 길항제들은 실험동물 모델에서 뇌손상을 감소시키기는 했지만 부작용 내지는 효능이 검증되지 않아서 거의 대부분은 개발이 중단된 실정이다. 뿐만 아니라 기존의 치료제는 주사용을 주로 목표로 하고 있어 뇌줄중 발생 시 수술 후의 환자에 있어서는 신경세포 사멸을 늦추기 위한 경구용 치료제의 개발은 거의 이루어지고 있지 않는 상태이다. 이 런 측면에서, 본 발명의 손바닥선인장의 부탄올 추출물은 뇌 허혈 동물모델에서도 경구 투여 시 신경세포 보호효능이 입증되었으므로 알쯔하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병 등과 같은 뇌신경질환과 심근경색, 뇌경색과 같은 허혈성 질환의 예방 및 치료, 증상의 완화에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.
아울러, 손바닥선인장의 부탄올 추출물에 활성성분인 퀘르세틴 3-메틸 에테르 및 이와 유사구조의 성분들이 다양하게 존재한다는 것은 본 발명의 결과를 더욱 입증하는 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 손바닥선인장의 부탄올 추출물은 뇌졸중의 임상과 매우 유사한 허혈성 뇌 손상 실험 동물모델에 경구투여 시 탁월한 뇌신경 보호효능을 나타내므로, 이들을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병과 같은 뇌신경질환에 의한 뇌신경세포 손상의 치료 및 예방, 허혈로 인한 신경세포와 조직 손상의 예방 및 치료, 특히 뇌신경세포 및 뇌조직 손상의 예방 및 치료, 또는 허혈성 심근경색증과 같은 허혈로 인한 기타 심혈관계 세포 손상의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 뇌신경 보호제 또는 심장 보호제로서도 적용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭서제, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제 등의 경구투여용 제형으로 제제화할 수 있다. 또한, 주사용 제형으로서 용액 또는 현탁액 등의 형태로 제제화할 수 있고, 경피투여용 제형으로서 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태로 제제화할 수도 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 부탄올 추출물 및 이의 산 가수분해물을 임상적인 목적으로 투여 시에 단일용량 또는 분리용량으로 성인에게 투여될 총 일일용량은 약 200 ㎎ 내지 20 g, 바람직하게는 500 ㎎ 내지 10 g의 범위가 충분할 것이나, 일부 질환에 따라 더 높거나 더 낮은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물을 임상적으로 투여하여 목적하는 허혈성 질환 치료효과를 얻고자 하는 경우에, 손바닥선인장의 부탄올 추출물을 공지의 신경보호제 중에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합하여 동시에 투여할 수 있다. 이 러한 방식으로 본 발명의 화합물들과 혼합하여 투여될 수 있는 약제는 글루타치온 농도를 증가시키기 위한 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine), 칼슘 길항제인 니모디핀 (nimodipine), 항산화제인 비타민 C 및 E, 혈전용해제인 조직 플라즈미노겐 활성화제 (tissue plasminogen activator), 기타 뇌신경 및 심장혈관 보호용 약물 등을 들 수 있다.
그러나, 허혈성 질환 치료를 목적으로 하는 본 발명의 약학 조성물의 제제화는 상술한 것으로 제한되는 것은 아니며, 허혈로 인한 신경세포와 조직 손상의 치료, 특히 뇌신경세포 및 뇌 조직 손상의 치료 및 예방 혹은 허혈로 인한 기타 심혈관계 세포 손상의 예방 및 치료에 유용한 제형이라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
참조예 1. DPPH 라디칼 소거능 측정
시험물질의 DPPH 라디칼 소거능은 블로이스의 방법(Blois, Nature, 181: 1199 (1958))을 변형하여 측정하였다. 즉, 시험물질을 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해한 후 적정농도로 희석한 용액 10 ㎕와 메탄올에 용해한 150 μM DPPH (1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl) 용액 190 ㎕를 37 ℃에서 30분간 반응시킨 다음 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거율은 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율로 나타내었고 프리즘(Prism; Graphpad software Inc., USA)을 이용한 비선형 회귀분석으로 50 % 억제효과를 나타내는 농도 (IC50)를 계산하였다.
참조예 2. 지질과산화 억제효과 측정
수컷 흰쥐(스프래그-돌리)로부터 얻은 뇌 균질액에서 유도한 지질 과산화에 대한 작용은 Cho와 Lee (Cho J and Lee H-K, Eur. J. Pharmacol. 485: 105 (2004))의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 일정양의 뇌 균질액과 10 μM Fe2+, 100 μM 아스코르빈산 및 DMSO에 용해시킨 적정농도의 시험약물을 함유하는 반응액을 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 삼염화초산(trichloroacetic acid)과 2-티오바르비튜린산(2-thiobarbituric acid, TBA)을 차례로 가하여 혼합하고 100 ℃에서 15분 동안 가열한 후, 원심분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 532 nm에서 측정하였다. 시험약물에 의한 지질 과산화 억제율은 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율로 나타내었고 프리즘(Prism; Graphpad software Inc., USA)을 이용한 비선형 회귀분석으로 50 % 억제효과를 나타내는 농도 (IC50)를 계산하였다.
참조예 3. 흰쥐 대뇌피질 신경세포의 일차배양
흰쥐 태자의 대뇌로부터 분리한 신경세포의 배양은 조 등 (Life Sci., 68: 1567 (2001))의 방법에 따라 수행하였다. 즉, 16 내지 18일 된 흰쥐 (스프래그-돌리) 태자의 대뇌피질 부분을 분리한 후 해부현미경을 이용하여 뇌막을 제거한 다음, 25 mM 포도당, 5 % 소태자혈청, 5 % 말혈청, 2 mM L-글루타민을 함유한 배지 (MEM; 입수처: Gibco BRL)에서 알코올 램프로 입구의 크기를 조절한 파스테르 피펫을 이용하여 단일세포로 분리한 후, 폴리라이신 (poly-L-lysine)과 라미닌으로 피막을 입힌 24-웰 (well) 세포배양 용기에 웰당 4 내지 5 × 105 세포의 밀도로 이식하여 37 ℃ 배양기에서 95 % 공기/5 % 이산화탄소를 유지하면서 배양하였다. 주당 2회 배양액의 일부를 교환하였으며, 이식 후 7 내지 9일에 10 μM 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside)로 24 내지 72시간 동안 처리하여 신경세포 이외의 세포 성장을 억제시켰다. 배양세포는 이식 후 10 내지 14일에 실험에 사용하였다.
참조예 4. 산화적 스트레스에 의한 신경세포 손상 유발
배양한 대뇌피질 신경세포를 HEPES-조절된 염 용액 (HCSS)으로 3회 세척한 후 잔틴 (0.5 mM) 및 잔틴 옥시다제 (10 mU/㎖)를 함유하는 HCSS로 10분간 처리하여 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼에 의한 세포손상을 유발한 다음 다시 HCSS로 세척하고 무혈청 배지(serum-free MEM; 25 mM 포도당, 2 mM 글루타민을 첨가한 MEM)로 배양액을 교환하여 37 ℃ 배양기에서 95 % 공기/5 % CO2를 유지하면서 18-20시간동안 배양하였다. 과산화수소에 의한 신경세포 손상유발은 배양세포를 HCSS로 세척한 후 100 μM 과산화수소를 함유하는 HCSS로 5분간 처리한 다음 다시 세척하고 무혈청 MEM으로 배양액을 교환하여 18-20시간동안 배양하였다. 이와 같이 유발되는 신경세포손상에 대한 시험물질의 영향을 측정하기 위해서는, 손상 유발물질과 함께 여러 농도의 시험물질을 동시에 가하여 상기한 바와 같이 일정시간 동안 처리하고 18 내지 20시간동안 배양한 다음, 참조예 6에 명시한 바와 같이 신경세포의 손상정도를 측정하였다.
참조예 5. NMDA에 의한 흥분성 신경세포 손상 및 베타 아밀로이드에 의한 신경세포 손상 유발
배양한 대뇌피질 신경세포를 HEPES-조절된 염 용액 (HCSS)으로 3회 세척한 후 마그네슘을 함유하지 않은 HCSS 용액에서 300 μM NMDA (N-methyl-D-aspartic acid)로 15분간 처리하여 흥분성 세포손상을 유발한 다음 다시 HCSS로 세척하고 무혈청 MEM으로 배양액을 교환하여 37 ℃ 배양기에서 95 % 공기/5 % CO2를 유지하면서 18 내지 20시간동안 배양하였다. 베타 아밀로이드에 의한 신경세포 손상유발은 배양세포를 HCSS로 세척한 후 40 μM 베타 아밀로이드를 함유하는 무혈청 배지로 20 내지 24시간동안 처리하였다. 이와 같이 유발되는 신경세포손상에 대한 시험물질의 영향을 측정하기 위해서는 손상 유발물질과 여러 농도의 시험물질을 동시 에 가하여 상기한 바와 같이 20 내지 24시간동안 배양한 다음, 참조예 6에 명시한 바와 같이 신경세포의 손상정도를 측정하였다.
참조예 6. 신경세포의 손상 측정
참조예 4와 참조예 5와 같이 처리한 신경세포의 손상정도는 Hansen 등 (Hansen MB, Nielsen SE and Berg K, J. Immunol. Methods 119: 203 (1989))의 방법에 의하여 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; 입수처: Sigma) 환원법으로 측정하였으며, 위상차 현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하여 확인하였다. 실험결과는 용매로 처리한 대조군 세포에서의 MTT 환원력을 기준으로 하여 유발된 손상에 대한 백분율로 표시하였고, 1회 2군씩 3 내지 4회 반복하여 얻은 데이타를 평균하여 나타내었으며, 50 % 억제효과를 나타내는 농도 (IC50)는 프리즘(Prism; Graphpad software Inc., USA)을 이용한 비선형 회귀분석으로 계산하였다.
참조예 7. 중대뇌동맥 폐쇄 (middle cerebral artery occlusion, MCAO) 및 재관류에 의한 일시적 국소 허혈성 뇌 손상 백서 모델의 제작
체중 250 내지 300 그램의 웅성 스프라그-다우리계 백서 (Sprague-Dawley, 샘타코)를 실험동물로 사용하였다. 수술은 실험 당일에 70% 아산화질소 (N2O)와 30% 산소 (O2)를 운반기체로 사용하는 1.5% 이소플루랜 (isoflurane, 중외제약 포란 액) 흡입마취 하에서 보온 패드와 보온 램프를 사용하여 실험동물의 체온을 약 37± 0.5 ℃로 유지하면서 나가사와와 고구레 (Nagasawa and Kogure, Stroke 20:1037, 1989)의 방법에 준하여 시행하였다.
구체적으로, 이소플루랜 흡입마취 하에서 목의 정중선을 따라 경부를 절개하고 미주신경에 손상을 주지 않도록 주의하면서 우측 총경동맥, 내경동맥, 그리고 외경동맥을 조심스럽게 분리하였다. 총경동맥과 외경동맥은 결찰하고 내외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥 내로 17 ㎜의 프로브를 삽입하여 삽입부위 바로 위쪽을 결찰함으로써 중대뇌동맥의 기저부를 폐쇄하였다. 프로브는 4-0 나일론 수술실 (Nitcho Kogyo Co., Ltd., Japan)의 한쪽 끝을 열에 의해 구형으로 만들어 그 부분을 제외하고 17 ㎜로 자른 후 실리콘 (Bayer Dental, Xantopren)을 경화제 (Optosil-Xantopren Activator, Bayer Dental)와 잘 혼합한 것에 다른 쪽 끝 부분 약 7 내지 9 ㎜ 정도를 넣어서 피복하며 두께는 0.3 내지 0.4 ㎜가 되도록 하였다. 뇌 허혈 유발 시작 후 약 25 내지 30분 경에 수술한 백서의 신경학적 결손을 측정하여 증상을 나타내는 백서만을 허혈군에 포함시켰다. 신경학적 결손은 주로 공중에서 백서의 꼬리를 완전히 들었을 때 좌측 전족 굴곡이 일어나는 지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 왼쪽으로 돌아가는 증상이 일어나는 지를 관찰하여 평가하였다. 120분 동안 일시적으로 중대뇌동맥을 폐쇄한 후 다시 이소플루랜 흡입마취 하에서 봉합 부위를 절개하여 구형의 프로브 끝을 다시 10 ㎜ 정도 밖으로 뽑아냄으로써 이를 재관류시켜 일시적 국소 뇌 허혈 백서 모델을 제작하였다. 그 후, 역시 수술부위를 봉합하고 약 7 또는 14일 후 신경학적 결손을 측정하고 희 생시켜서 적출한 뇌조직에 대하여 조직학적 염색법을 시행하였다.
부형제 (vehicle)인 0.5% 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethyl cellulose, 3 ㎖/㎏), 또는 손바닥선인장 부탄올 추출물을 재관류 후 2시간에 처음으로 경구 투여를 시작하여 다음날부터 1일 2회씩 6 (1회 용량 100, 200, 300, 500 mg/kg) 또는 13일간 (1회 용량 100, 200, 300 mg/kg) 경구 투여하였다.
실시예
1.
손바닥선인장
추출물 및 이의
가수분해산물
제조
실시예 1-1. 손바닥선인장의 알콜 추출물로부터 부탄올 추출물의 제조
열풍건조에 의해 건조된 손바닥선인장에 50% 에탄올을 건조 생약 대비 7배수 가한 후 80 ℃에서 4 시간동안 환류 추출을 2회 반복한 후 농축 건조하였다. 이 추출물을 5%의 농도로 증류수에 용해한 후 부탄올 용액을 같은 양 사용하여 2회 반복 추출한 후 분획물을 감압 농축하여 손바닥선인장 부탄올 추출물을 획득하였다.
실시예 1-2. 손바닥선인장의 부탄올 추출물의 제조
열풍건조에 의해 건조된 손바닥선인장에 부탄올을 건조 생약 대비 7배수 가한 후 80 ℃에서 4 시간동안 환류추출을 2회 반복한 후 농축 건조하여 손바닥선인장 부탄올 추출물을 획득하였다.
실시예 1-3. 손바닥선인장의 부탄올 추출물의 산 가수분해물 제조
상기 실시예 1-1에서 얻은 부탄올 추출물 1 g에 다이옥산과 2 N HCl을 각각 40 ㎖ 가하여 100 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이 용액을 얼음물에 냉각시킨 후 5 N NaOH를 약 12.5 ㎖ 가하여 중화하였다. (pH = 7.3)
중화물을 완전 농축하고, 이에 메탄올 20 ㎖을 가하여(3회 반복) 생성된 고체는 여과하고 여액으로부터 가수분해물을 얻었다.
첨부도면 도 2에는 상기 실시예 1-1에서 손바닥선인장 부탄올 추출물의 HPLC 분석패턴 및 실시예 1-3에서 얻은 산 가수분해물의 패턴을 비교하여 나타내었다.
<HPLC 분석 조건>
- HPLC 기기 : Waters delta 600
- 컬럼의 종류 : J'sphere ODS-H80(250 × 4.6 mm I.D, S-4㎛, YMC사)
- 온도 : 30 ℃
- 검출조건 : UV 210 nm
- 흐름속도 : 1 mL/min
- 주입량 : 20 μL
- 전개용매(gradient system) :
| 시간(분) | 전개용매(v/v) | |
| 아세토니트릴 | 0.1% 인산수용액 | |
| 0 | 10 | 90 |
| 60.00 | 40 | 60 |
| 60.01 | 100 | 0 |
| 80.00 | 100 | 0 |
| 80.01 | 10 | 90 |
| 100.00 | 10 | 90 |
실시예 2. 손바닥선인장의 부탄올 추출물로부터 뇌신경세포 보호성분의 분리
상기 실시예 1-1에서 얻은 손바닥선인장의 부탄올 추출물에 함유되어 있는 성분들을 분리하여 그 구조를 동정하고자 하였다.
부탄올 분획 50 g으로부터 디클로로메탄에 녹는 비극성 화합물을 제거하여 35.9 g의 잔사를 얻었다. 부탄올 추출물 50 g을 1 ℓ의 증류수에 현탁시킨 후 디클로로메탄(1.6 ℓ× 3)를 이용하여 클로로필과 지방산 등 비극성 화합물 12.9 g을 제거하고 플라보노이드 배당체 등 극성 용매분획 35.9 g을 얻었다.
부탄올 극성 용매분획 35.9 g 중에서 14.5 g을 메탄올을 전개용매로 사용하고 세파덱스(Cat. No. LH-20-100, 시그마)를 고정상으로 이용하여 칼럼 크로마토그래피(6.5× 38 ㎝)를 실시하였다. 얻어진 분획들은 순상 실리카겔 TLC(전개용매: 디클로로메탄:메탄올:물 = 4:1:0.1, v/v/v)와 역상 실리카겔 TLC(전개용매: 물:메탄올 = 40:60, v/v)로 관찰한 후, 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 8개의 소 분획(Fr.1 내지 Fr.8)으로 나누었다. 소 분획 Fr.4(2.25 g)를 실리카젤을 이용한 칼럼크로마토그래피(2.5× 35 ㎝)를 실시하여 정제하였다. 용출액은 디클로로메탄:메탄올(95:5, v/v)의 혼합용매로부터 점차로 메탄올의 양을 높여 극성을 높여서 화합물을 용출하였으며, 극성에 따라서 18개의 소 분획(Fr.4.1 내지 Fr.4.18)으로 나누었다.
이중 순수한 화합물이 중점적으로 존재하는 화합물 분획인 14번째 분획(Fr.4.14, 860.0 ㎎)과 18번째 분획(Fr.4.18, 260.0 ㎎)을 30% 메탄올을 전개용매로 사용하여 역상 실리카젤을 이용한 칼럼 크로마토그래피(2× 18 ㎝)를 실시하 였으며, 두 번째 분획(Fr.4.14.2, 155.6 ㎎)은 분취용 역상 TLC를 실시하여(전개용매: 30% CH3CN) 화합물 1(이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일)네오헤스페리도사이드, 12.34 ㎎)을 순수하게 얻었다.
소 분획 Fr.4.6(56.5 ㎎)은 25% CH3CN를 전개로 사용하여 분취용 역상 TLC를 실시하여 3개의 순수한 화합물 2(2,3,4-트리히드록시벤조산, 8.32 ㎎), 화합물 3(4-히드록시벤조산, 4.71 ㎎), 화합물 4(페룰린산, 16.52 ㎎)를 얻을 수 있었다. 소 분획 Fr.4.12(188.06 ㎎)은 30% 메탄올을 전개용매로 사용하여 역상 실리카젤 컬럼크로마토그래피를 실시하여 화합물 5(이소람네틴 3-O-글루코사이드, 65.7 ㎎)을 얻었고 잔사로부터 분취용 역상 TLC를 실시하여 화합물 6(2,3-디히드로퀘르세틴, 27.65 ㎎)과 화합물 7(신남산, 6.21 ㎎)을 얻었다. 소 분획 Fr.4.14.1, 450.0 ㎎)은 분취용 역상 HPLC를 실시하여 분리를 하였다. 사용한 용매는 13% 메탄올부터 43% 메탄올까지 점진적으로 극성을 높여서 분리를 실시하여 화합물 7(신남산, 12.5 ㎎)을 추가로 얻을 수 있었으며, 화합물 8(캄페롤 7-O-글루코피라노사이드, 12.13 ㎎)을 분리하였다.
소 분획 Fr.1(5.35 g)은 역상 칼럼 크로마토그래피(LiChroprep RP-18, 40~63 ㎛, 4.5×30 ㎝)를 실시하여 7개의 소 분획(Fr.1.1 내지 Fr.1.7)으로 나누었다. 전개용매는 25% 메탄올로부터 5%씩 메탄올의 양을 점진적으로 증가시켜 65% 메탄올까지 흘려주었다. 두 번째 소 분획(Fr.1.2) 180.0 ㎎은 역상 실리카젤과 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 9(자타로사이드-A, 6.23 ㎎)와 화합물 18(n-부틸-β-D- 프럭토피라노사이드, 7.2 mg)을 순수하게 분리하였다. 소 분획 Fr.1.5(180.5 ㎎)는 22% 메탄올을 사용하여 분취용 HPLC를 실시한 결과 화합물 10(4-O-글루코피라노실시나핀산, 7.05 ㎎)를 분리하였다. 마지막 분획 Fr.1.7(165.7 ㎎)은 38% 메탄올을 사용하여 분취용 HPLC를 실시하여 화합물 11(이소람네틴 3-O-루티노실-4'-O-β-D-글루코사이드, 12.2 ㎎)과 12(이소람네틴 3-O-(2,6-디람노실)글루코사이드, 695 ㎎)를 분리하였다.
소 분획 Fr.2(4.74 g)와 Fr.3(3.5 g)은 70% 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스를 이용한 칼럼 크로마토그래피(6.5 × 38 ㎝)를 실시하여 8개의 소 분획으로 나누었다(Fr.2.1 내지 Fr.2.8). 이 분획 중에서 두 번째 분획 Fr.2.2(1.13 g)를 35% 메탄올을 전개용매로 역상 실리카젤을 사용하여 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 화합물 4(페룰린산), 화합물 6(2,3-디히드로퀘르세틴), 화합물 7(신남산)을 추가로 얻었으며, 화합물 13(이소람네틴 3-O-루티노사이드(nacissin))와 화합물 17(이소람네틴 3-O-네오헤스페리도사이드)를 순수하게 얻을 수 있었다. 소 분획 Fr.5(364.8 ㎎)을 실리카겔을 이용한 컬럼크로마토그래와 분취용 역상 실리카겔 TLC을 병행하여 화합물 14(2,3-디히드로캄페롤), 화합물 15(퀘르세틴 3'-O-β-D-글루코사이드), 화합물 16(퀘르세틴 3-O-메틸 에테르)을 얻을 수 있었다.
실시예 3. 손바닥선인장의 부탄올 추출물 함유성분들의 구조 결정
상기 실시예 2에서 얻은 각 성분들에 대한 1H-NMR (300 MHz)과 13C-NMR (75 MHz) 스펙트럼을 측정하였고, 각 피크의 화학이동값 (chemical shift)을 잔류용매인 메탄올의 화학이동값 (3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다.
실시예 3-1. 이소람네틴-3-
O
-(6"-
O
-
E
-페루로일)네오헤스페리도사이드(화합물 1)의 구조분석
화합물 1은 노란색의 무정형 분말로서 TLC에서 10% 황산 발색 시 노란색으로 발색되었다. 1H-NMR에서 δ 6.03 (1H, br s)과 6.20 (1H, br s)에서의 피크는 후라보노이드의 A 고리에서 기인한 H-6과 H-8 피크이고, δ 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz)의 피크는 H-5'에서 기인된 피크로 H-6'에서 기인한 δ 7.50 (1H, dd, J = 8.5, 2.0Hz) 피크와 오르토 결합을 하고 있고, δ 7.87 (H-6')에서의 피크는 H-2'에서 기인한 δ 7.63 (1H, d, J = 2.0 Hz) 피크와 메타 결합을 하고 있어 방향족 고리가 ABX system으로 치환된 화합물임을 알 수 있었다. 또한, δ 6.99 (d, J = 1.7 Hz)와 6.85 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz), 6.78 (d, J = 8.2 Hz)에서의 피크들은 다른 방향족 고리가 ABX system으로 치환된 화합물이 존재하고 있음을 알 수 있었고, δ 7.33 (d, J = 15.9 Hz)과 6.05 (d, J = 15.7 Hz)에서의 결합상수는 트랜스 바이닐에서 기인한 피크임을 예상할 수 있었다. δ 3.98과 3.88에서의 단일피크들은 각각 3개의 수소에 해당하는 피크들로 화학이동값(chemical shift)에서도 알 수 있듯이 후라보노이드와 페루로일 그룹에서 기인한 메톡시기임을 알 수 있었다. 그러므로 이 화합물은 퀘르세틴 모핵에 메톡시 그룹이 치환된 이소람네틴 골격에 페루로일기가 치환된 구조임을 예상 할 수 있었다. δ 5.80 (d, J = 7.3 Hz)과 5.20 (d, J = 1.1 Hz)에서의 피크들은 당(sugar)의 아노머 프로톤에서 기인한 피크들로 그들의 결합상수가 각각 β-형과 α-형으로 결합하고 있음을 알 수 있었고, 이 화합물이 이당류 임을 알 수 있었다. 13C-NMR로부터 이 화합물에 결합하고 있는 당(sugar)은 각각 글루코스와 람노스임을 알 수 있었으며, 글루코스의 6번 탄소에서 기인한 피크가 δ 63.9에서 나타나고 있어 글루코스의 6번 탄소에 치환기가 있음을 예상 할 수 있었다. δ 78.8에서의 피크는 글루코스의 2번 탄소에서 기인한 피크로 이 탄소 역시 다른 글루코스의 2번 탄소와 비교하였을 때 약 5.5 ppm 정도 저 자장으로 이동한 것으로 미루어 글루코스의 2번 탄소 역시 치환체가 있음을 알 수 있었다(Markham 등, Tetrahedron 34:1978, 1389). 이들 치환체의 정확한 치환위치를 규명하기 위하여 2D NMR인 HMBC 실험을 하였다. 그 결과 δ80.1에서의 글루코스의 2번 탄소와 δ 5.20에서의 람노스의 아노머 프로톤과 상관관계가 나타나고, δ 4.36과 4.29에서의 글루코스의 6번 수소는 페루로일기의 카보닐 탄소 피크와 상관관계가 있었으며, 글루코스의 아노머 수소는 배당체의 3번 탄소(δ 134.2)와 상관관계가 나타나고 있음을 알 수 있었다. 메톡시 그룹은 각각 ABX system의 방향족 고리와 상관관계가 나타나고 있어서 이 화합물의 치환기 위치를 정확하게 규명할 수 있었다. 그러므로 화합물 1은 글루코스의 6번 탄소에 페루로일기가 있으며, 글루코스의 2번 위치에는 람노스가 결합하고, 이 페루로 일 디사카라이드는 이소람네틴의 3번 탄소에 치환하고 있는 화합물로 이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일)네오헤스페리도사이드로 동정하였으며 자연계에서 처음으로 분리된 화합물이다.
노란색 무정형 분말; UV υmax (MeOH): 332, 300 (sh), 267(sh), 252 nm; IR max cm-1: 3401, 2925, 1655, 1605, 1514, 1453, 1430, 1357, 1284, 1205, 1179, 1126, 1055, 1031, 811; HRFABMS (positive ion mode): m/z 823.2086 (C38H40O19Na, calcd. 823.2061); 1H NMR (CD3OD, 300 MHz): δ 7.87 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 7.50 (1H, dd, J = 8.5 and 2.0 Hz, H-6'), 7.33 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-3""), 6.99 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-5""), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'), 6.85 (1H, dd, J = 8.1 & 1.7 Hz, H-8""), 6.78 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-9""), 6.20 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.05 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-2""), 6.03 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6), 5.80 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1"), 5.20 (1H, d, J = 1.1 Hz, H-1'"), 4.36 (1H, dd, J = 11.9 and 6.1 Hz, Ha-6"), 4.29 (1H, dd, J = 12.0 and 2,.8Hz, Hb-6"), 4.03 (1H, m, H-5'"), 4.01 (1H, dd, J = 3.0, 1.6 Hz, H-2'"), 3.98 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.77 (1H, dd, J = 9.6, 3.4 Hz, H-3'"), 3.68 (1H, dd, J = 8.3, 6.3 Hz, H-2"), 3.63 (1H, t, J = 9.1 Hz, H-3"), 3.57-3.50 (1H, m, H-5"), 3.30-3.36 (2H, m, H-4", 4'"), 0.90 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'").
13C NMR (CD3OD, 75 MHz): δ 168.7 (C, C-1""), 179.2 (C, C-4), 165.6 (C, C-7), 163.0 (C, C-5), 158.7 (C, C-2), 158.3 (C, C-9), 150.6 (2C, C-4', 7""), 148.4 (2C, C-3', 6""), 146.9 (CH, C-3""), 134.2 (C, C-3), 127.6 (C, C-4""), 124.3 (CH, C-6'), 123.7 (CH, C-9""), 123.4 (C, C-1'), 116.4 (CH, C-8""), 116.0 (CH, C-5'), 114.8 (CH, C-2""), 114.6 (CH, C-2'), 111.4 (CH, C-5""), 105.8 (C, C-10), 102.8 (CH, C-1'"), 100.2 (CH, C-1"), 99.8 (CH, C-6), 94.7 (CH, C-8), 80.1 (CH, C-2"), 78.8 (CH, C-3"), 75.7 (CH, C-5"), 74.0 (CH, C-4'"), 72.4 (3CH, C-4", 2'", 3'"), 70.0 (CH, C-5'"), 63.9 (CH2, C-6"), 57.0 (CH3, OMe), 56.5 (CH3, OMe), 17.5 (CH3, C-6'").
분석 결과, 본 발명에서 손바닥선인장의 부탄올 추출물로부터 분리한 구조는 공지의 2,3,4-트리히드록시벤조산(2), 4-히드록시벤조산(3), 페룰린산(4), 이소람네틴 3-O-글루코사이드 (Karl 등, Planta Med. 41:1981, 96)와, 2,3-디히드로퀘르세틴 (Nonaka 등, Chem. Pharm. Bull. 35:1987, 1105)와, 신남산 (7), 캄페롤 7-O-글루코피라노사이드 (Lee 등, J. Agric. Food Chem. 46:1998, 3325)와, 자타로사이드-A (Ali 등, Phytochemistry 52:1999, 685)와, 4-O-글루코피라노실시나핀산 (Materska 등, J. Agric. Food Chem. 53:2005, 1750)와, 이소람네틴 3-O-루티노실-4'-O-β-D-글루코사이드 (Aquino 등, Biochem. Syst. Ecol. 15:1987, 667)와, 이소람네틴 3-O-(2,6-디람노실)글루코사이드 (Liu 등, Zhongguo Yaoxue Zazhi 33:1998,587)와, 이소람네틴 3-O-루티노사이드(nacissin) (Nakano 등, Phytochemistry 28:1989, 301)와, 2,3-디히드로캄페롤 (Lee 등, Arch. Pharm. Res. 26:2003, 1018)와, 퀘르세틴 3'-O-β-D-글루코사이드 (Saito 등, Phytochemistry 35:1994, 687)와, 퀘르세틴 3-O-메틸 에테르 (Roitman 등, Phytochemistry 24:1985, 835)와, 이소람네틴 3-O-네오헤스페리도사이드 (Nㆈrbㅶk 등, Phytochemistry 51:1999, 1113)와, n-부틸-β-D-프럭토피라노사이드 (Xu 등, Arch. Pharm. Res. 28:2005, 395)의 알려진 문헌과 잘 일치함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 손바닥선인장 부탄올 추출물의 항산화 효과 확인
상기 실시예 1-1에서 얻은 손바닥선인장 부탄올 추출물에 대하여 참조예 1 내지 4의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능, 지질과산화 억제효과, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효과, 과산화수소 유발 신경독성 억제효과를 각각 측정하였다.
그 결과, 도 3 내지 6과 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 DPPH 라디칼 소거능 및 지질과산화 억제효과를 발현하는 것으로 나타나 현저한 항산화 작용이 확인되었으며, 배양한 대뇌피질 신경세포에서 잔틴/잔틴 옥시다제 또는 과산화수소로 유발한 산화적 신경독성을 효과적으로 억제하여 신경세포 보호작용을 나타내었다. 즉, 손바닥선인장 부탄올 추출물의 라디칼 소거능은 66.90 ㎍/㎖의 IC50 값을 나타내었고, 지질 과산화 억제능의 경우 80.30 ㎍/㎖, 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경독성 억제효능의 경우 61.54 ㎍/㎖, 과산화수소-유발 신경독성 억제효능은 94.82 ㎍/㎖의 IC50 값을 나타내었다. 따라서, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 현저한 항산화 작용 및 신경보호효과를 나타내는 것으로 보아 뇌졸중, 알쯔하이머 및 파킨슨병과 같은 산화적 요인에 의한 신경세포 손상을 수반하는 각종 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방에 유용할 것으로 밝혀졌다.
실시예 5. 손바닥선인장 부탄올 추출물의 흥분성 신경독성 억제효과 확인
상기 실시예 1-1에서 얻은 손바닥선인장 부탄올 추출물에 대하여 참조예 5의 방법을 이용하여 흥분성 신경독성에 대한 억제효과를 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 NMDA에 의해 유발되는 흥분성 신경독성을 강력하게 억제하였으며, IC50 값은 50.58 ㎍/㎖로 나타났다. 따라서, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 항산화작용에 의한 신경세포 보호효과 뿐만 아니라, 흥분성 신경독성을 억제함으로써 신경세포를 보호하는 것이 추가로 확인되었다. 이 결과로부터 손바닥선인장 부탄올 추출물은 과도하게 유리된 글루타민산에 의한 흥분성 신경독성이 관련된 뇌졸중, 알쯔하이머 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방에 유용할 것으로 밝혀졌다.
실시예 6. 손바닥선인장 부탄올 추출물의 베타 아밀로이드 유발 신경독성 억제효과 확인
상기 실시예 1-1에서 얻은 손바닥선인장 부탄올 추출물에 대하여 참조예 5의 방법을 이용하여 베타 아밀로이드에 의해 유발되는 신경독성에 대한 효과를 측정하였다.
그 결과, 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 베타 아밀로이드에 의해 유발되는 신경독성을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다. 베타 아밀로이드 유발 독성에 대한 세포의 최대 생존율은 100 ㎍/㎖에서 대조군 세포의 약 35%로 나타났다. 이와 같은 결과로부터 손바닥선인장 부탄올 추출물에서 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과 및 흥분성 신경독성 억제효과와 더불어 베타 아밀로이드에 의해 유발되는 신경독성 억제효과가 확인되어 뇌졸중, 알쯔하이머 및 파킨슨병과 같은 각종 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방에 유용할 것으로 밝혀졌다.
| IC50 값 (㎍/㎖) | |
| DPPH 라디칼 소거능 | 66.90 |
| 지질과산화 억제력 | 80.30 |
| 잔틴/잔틴 옥시다제-유발 신경세포독성 억제효과 | 61.54 |
| 과산화수소-유발 신경세포독성 억제효과 | 94.82 |
| NMDA-유발 흥분성 신경세포독성 억제효과 | 50.58 |
| 베타아밀로이드-유발 신경세포독성 억제효과 | 33.5%a |
| a100 ㎍/㎖에서의 대조군에 대한 세포생존 백분율 | |
실시예 7. 손바닥선인장 부탄올 추출물의 아급성 경구투여 시 뇌손상 신경보호 효과 측정
120분 동안의 일시적 국소 뇌 허혈 백서모델에서 허혈 유발 후 재관류에 의해 유발되는 뇌 손상을 평가하기 위하여 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색 (Bederson et al., Stroke 17:1304, 1986)을 시행하였다. 중대뇌동맥 폐쇄 및 재관류 후 약 7 또는 14일이 경과한 후 단두대로 백서를 희생시키고 신속하게 뇌를 적출하였다. 뇌 주형 (ASI Instruments, Warren, MI, USA)을 이용하여 전두극으로부터 1 ㎜되는 지점부터 2 ㎜ 두께의 연속적으로 잘려진 뇌 관측 절편 각각에 0.9% 생리식염수로 제조된 2% TTC 용액을 가하고 37 ℃에서 60분간 배양하여 염색하였다. TTC로 염색된 뇌 절편을 10% 인산완충 포르말린 (phosphate-buffered formalin) 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒷면 영상을 CCD 비디오 카메라를 이용하여 컴퓨터에서 획득하였다. 이로부터 진한 적색으로 염색이 되지 않은 경색이 일어난 대뇌피질 및 선조체 지역의 면적 (㎣)은 영상분석용 소프트웨어 (Optimas, Edmonds, WA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 경색 용적 (㎣)은 절편들의 경색 면적의 총합계에 절편 두께를 곱함으로써 계산하였다. 이때, 총 경색 용적은 대뇌피질 및 선조체 지역 각각에서의 경색 용적의 합계로서 나타내었다. 한편, 위축의 효과를 보완하기 위하여 교정 경색 용적을 계산하였는데, 각 절편에 있어 교정 총 경색 면적은 허혈 반대측 (좌측) 대뇌 반구의 총 면적으로부터 허혈 동측 (우측) 대뇌 반구에 있어서의 정상조직의 면적을 빼줌으로써 계산하였고, 교정 총 경색 용적은 교정 총 경색 면적으로부터 상기와 같은 방식으로 계산하였다.
또한, 허혈이 유발된 대뇌 반구의 위축율은 하기 수학식 1에 의하여 산출되었다.
상기 수학식 1에서, A는 총 관측 절편들에서 허혈이 유발된 대뇌 반구의 용적(㎣)을 나타내고, B는 총 관측 절편들에서 정상 대뇌 반구의 용적(㎣)을 나타낸다.
손바닥선인장 부탄올 추출물을 재관류 후 2시간에 처음으로 경구 투여를 시작하여 다음날부터 1일 2회씩 6일간 1회 용량을 300 mg/kg로 하여 경구 투여한 군에서는 교정 대뇌 피질 경색 용적 및 교정 총 경색 용적, 대뇌피질 위축율 및 총 위축율 모두에서 0.5% 카르복시메틸셀룰로스를 투여한 대조군에 비해 각각 27.5, 27.2, 39.2 및 35.6%의 유의성 있는 감소를 나타냄으로써 뇌 손상에 대한 신경보호 효과를 보여주었다. 한편 13일간 1회 용량을 200 mg/kg로 하여 경구 투여한 군에서는 교정 대뇌 피질 경색 용적 및 교정 총 경색 용적, 대뇌피질 위축율 및 총 위축율 모두에서 0.5% 카르복시메틸셀룰로스를 투여한 대조군에 비해 각각 31.4, 27.6, 44.4 및 37.4%의 유의성 있는 감소를 나타내었다. 또한 13일간 1회 용량을 300 mg/kg로 하여 경구 투여한 군에서는 교정 대뇌 피질 경색 용적 및 교정 총 경색 용적, 대뇌피질 위축율 및 총 위축율 모두에서 0.5% 카르복시메틸셀룰로스를 투여한 대조군에 비해 각각 40.4, 34.3, 61.7 및 46.7%의 유의성 있는 감소를 나타내었다. 따라서 약물 투여 기간이 길어질수록 뇌손상에 대한 신경보호 효과가 더 크게 나타남을 알 수 있었다. 이러한 모든 결과는 하기 도 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17과 표 2, 3 (실험치는 평균치±표준오차로 표시함)에 정리하였다.
| 1회 처치용량 | n | 교정 대뇌피질 경색 용적 | 교정 총 경색 용적 | 대뇌피질 위축율(%) | 총 위축율(%) |
| 부형제 | 21 | 144.8± 7.9 | 179.6± 10.2 | 7.4± 0.5 | 5.9± 0.4 |
| 100 mg/kg | 14 | 125.9± 14.0 | 152.8± 20.1 | 6.0± 1.1 | 4.5± 0.6 |
| 200 mg/kg | 6 | 113.6± 19.7 | 147.9± 23.8 | 6.2± 1.4 | 5.9± 1.2 |
| 300 mg/kg | 15 | 105.0± 12.4* | 130.8± 14.3* | 4.5± 0.8* | 3.8± 0.5* |
| 500 mg/kg | 10 | 131.7± 8.2 | 176.5± 11.5 | 4.7± 0.5* | 4.8± 0.5 |
| n: 실험동물 수 * 던칸의 다중 범위 검정 결과 (Duncan's multiple range test) 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05) |
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| 1회 처치용량 | n | 교정 대뇌피질 경색 용적 | 교정 총 경색 용적 | 대뇌피질 위축율(%) | 총 위축율(%) |
| 부형제 | 14 | 140.9± 6.1 | 196.8± 8.6 | 26.6± 2.2 | 19.5± 1.7 |
| 100 mg/kg | 11 | 123.9± 9.5 | 175.3± 14.8 | 15.7± 2.2* | 12.4± 1.9* |
| 200 mg/kg | 11 | 96.7± 14.0* | 142.5± 20.0* | 14.8± 3.8* | 12.2± 2.4* |
| 300 mg/kg | 11 | 84.0± 17.9* | 129.3± 25.1* | 10.2± 2.6* | 10.4± 1.9* |
| n: 실험동물 수 * 던칸의 다중 범위 검정 결과 (Duncan's multiple range test) 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05) |
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실시예 8. 손바닥선인장 부탄올 추출물의 신경행동학적 회복효과 측정
상기 실시예 7과 동일한 방법으로 처리된 백서의 신경행동학적 회복효과를 렐톤 (Relton) 등의 신경행동학적 점수 (neurological score) 측정법 (Stroke 28:1430, 1997)에 따라 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, 전족 굴곡 (forelimb flexion, 백서의 꼬리를 잡고 공중에 완전히 들었을 때의 좌측 전족 굴곡), 전곡 굴곡 기간 (duration of forelimb flexion, 10초까지의 측정기간 동안 전족 굴곡 기간) 및 움직임의 대칭 (백서의 꼬리를 잡고 뒷발을 공중에 둔 채로 앞발만으로 걷게 하였을 때 움직임의 대칭)을 검사항목으로 하여 각 반응에 따라 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 점수를 부여하였다.
| 검사항목 | 점수 | ||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 전족 굴곡 | 좌측 전족의 움직임이 전혀 없음 | 좌측 전족의 제한된 움직임 | 좌측 전족의 덜 뻗는 또는 더 느린 움직임 | 대칭적 움직임 | - |
| 전족 굴곡 기간 | 8-10초 | 6-8초 | 4-6초 | 2-4초 | 0-2초 |
| 움직임의 대칭 | 좌측 전족의 움직임이 전혀 없음 | 좌측 전족의 움직임이 극미하고 백서는 회전함 | 좌측 전족이 우측보다 덜 뻗음 | 전족을 뻗고 정상적으로 걸음 | - |
상기 표 4에 따라 부여된 각 검사항목의 점수를 모두 합산하여 각 투여군의 최종적인 신경행동학적 점수를 하기 표 5와 6 (실험치는 평균치±표준오차로 표시함)에 나타내었으며, 이를 도 13, 18에 그래프로서 나타내었다. 여기에서 10점은 정상인 상태, 즉 신경학적 결손이 전혀 없는 것을 의미하며, 점수가 작을수록 신경학적 결손이 크게 나타나는 것을 의미한다.
| 중대뇌동맥 폐쇄 후 측정 시까지의 시간 | 1회 처치용량 | ||||
| 부형제 | 100 mg/kg | 200 mg/kg | 300 mg/kg | 500 mg/kg | |
| 30분 | 2.00± 0.00 | 2.07± 0.07 | 2.00± 0.00 | 2.07± 0.07 | 2.20± 0.13 |
| 1일 | 2.14± 0.08 | 3.07± 0.44 | 3.00± 0.45 | 2.20± 0.11 | 2.30± 0.15 |
| 2일 | 2.24± 0.10 | 3.86± 0.51 | 3.50± 0.62 | 2.53± 0.19 | 2.40± 0.22 |
| 3일 | 2.43± 0.15 | 4.29± 0.55* | 3.83± 0.75 | 3.13± 0.34 | 2.60± 0.22 |
| 4일 | 2.62± 0.16 | 4.79± 0.52* | 4.33± 0.84 | 3.93± 0.48 | 2.80± 0.25 |
| 5일 | 2.90± 0.22 | 5.07± 0.53* | 4.83± 0.95 | 4.73± 0.54 | 3.10± 0.28 |
| 6일 | 3.29± 0.21 | 5.14± 0.56* | 5.00± 1.10 | 5.27± 0.53* | 3.90± 0.38 |
| 7일 | 3.48± 0.25 | 5.21± 0.57 | 5.33± 0.88 | 6.00± 0.51* | 4.30± 0.47 |
| * 던칸의 다중 범위 검정 결과 동일 시간에서 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05) | |||||
| 중대뇌동맥 폐쇄 후 측정 시까지의 시간 | 1회 처치용량 | |||
| 부형제 | 100 mg/kg | 200 mg/kg | 300 mg/kg | |
| 30분 | 2.14± 0.10 | 2.18± 0.12 | 2.28± 0.12 | 2.25± 0.13 |
| 1일 | 2.07± 0.07 | 2.55± 0.37 | 2.45± 0.21 | 2.67± 0.22 |
| 2일 | 2.14± 0.10 | 2.82± 0.38* | 3.18± 0.35* | 3.50± 0.26* |
| 3일 | 2.21± 0.11 | 3.27± 0.41* | 3.40± 0.41* | 4.50± 0.34* |
| 4일 | 2.36± 0.23 | 3.64± 0.39* | 4.09± 0.48* | 5.25± 0.43* |
| 5일 | 2.57± 0.23 | 3.91± 0.46* | 4.27± 0.52* | 5.75± 0.49* |
| 6일 | 3.00± 0.26 | 4.09± 0.56 | 5.00± 0.56* | 6.25± 0.63* |
| 7일 | 3.36± 0.27 | 4.27± 0.59 | 5.45± 0.58* | 6.75± 0.52* |
| 8일 | 4.21± 0.37 | 4.73± 0.57 | 6.09± 0.53* | 7.00± 0.46* |
| 9일 | 4.86± 0.46 | 4.91± 0.56 | 6.36± 0.47* | 7.67± 0.47* |
| 10일 | 5.29± 0.47 | 5.64± 0.73 | 6.91± 0.51* | 7.83± 0.46* |
| 11일 | 5.71± 0.47 | 6.00± 0.69 | 7.36± 0.51* | 8.00± 0.44* |
| 12일 | 6.14± 0.43 | 7.09± 0.72 | 7.73± 0.54* | 8.09± 0.51* |
| 13일 | 6.57± 0.41 | 7.73± 0.78 | 7.91± 0.56* | 8.18± 0.46* |
| 14일 | 6.86± 0.36 | 7.82± 0.74 | 8.00± 0.57 | 8.27± 0.45* |
| * 던칸의 다중 범위 검정 결과 동일 시간에서 대조군과 유의성 있는 차이 (p<0.05) | ||||
상기 표 5 및 도 13에서 나타난 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물을 100 또는 300 mg/kg 용량으로 7일간 경구로 반복 투여한 군들은 대조군에 비해 신경행동학적 점수가 유의성 있게 증가됨으로써 신경행동학적 회복효과를 나타냄을 알 수 있다.
또한 상기 표 6 및 도 18에서 나타난 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물을 200 또는 300 mg/kg 용량으로 14일간 경구로 반복투여한 군들은 대조군에 비해 신경행동학적 점수가 유의성 있게 현저히 증가됨으로써 신경행동학적 회복효과를 나타냄을 알 수 있다.
따라서, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 뇌허헐 동물모델에서 뇌손상에 대한 뚜렷한 신경보호 효과 및 신경행동학적 회복효과를 나타내므로 뇌신경질환과 심장허혈의 예방 및 치료에 유효하다는 사실을 확인하였다.
상기에서 설명한 바와 같이, 손바닥선인장 부탄올 추출물은 뇌허혈 동물모델에서 뚜렷한 신경세포 보호효과를 나타내므로 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머, 파킨슨병과 같은 뇌신경계 질환과 심근경색, 뇌경색과 같은 허혈성 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.
Claims (14)
- 삭제
- 유효성분으로서 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica) 부탄올 추출물의 산 가수분해물을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중, 뇌진탕, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌경색 및 심근경색으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제 2항에 있어서, 상기 손바닥선인장의 부탄올 추출물이1) 손바닥선인장의 줄기 또는 열매를 1 ㎏당 탄소수 1 내지 3의 저급 알콜용매 0.1 내지 10 ℓ를 첨가하고 20 내지 90 ℃에서 환류하여 추출하는 단계;2) 단계 1)로부터 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 저급 알콜 추출물을 얻는 단계; 및3) 저급 알콜 추출물 1 ㎏당 0.1 내지 10 ℓ의 물을 가한 후, 부탄올(n-BuOH) 1 내지 5 ℓ로 추출하여 얻는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 손바닥선인장의 부탄올 추출물이손바닥선인장의 줄기 또는 열매를 1 ㎏당 부탄올을 0.1 내지 10 ℓ를 첨가하고 20 내지 90 ℃에서 환류하여 추출하여 얻는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 산 가수분해물이손바닥선인장의 부탄올 추출물을 다이옥산과 염산으로 산 가수분해한 다음, 알칼리를 사용하여 pH 6 내지 pH 8로 중화한 후에, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜으로 여과하여 얻은 여액인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 4항에 있어서,상기 단계 1)의 저급 알콜용매가 무수 알콜 및 50% 이상의 알콜 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서,경구투여용 약물로 제형화된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 8항에 있어서,정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭서제, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 및 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제로 이루어진 군으로부터 선택된 경구투여용 제형으로 제제화된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서,주사용 용액 또는 현탁액으로 제형화된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 부탄올 추출물은이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일) 네오헤스페리도사이드 (1), 2,3,4-트리히드록시벤조산 (2), 4-히드록시벤조산 (3), 페룰린산 (4), 이소람네틴 3-O-글루코사이드 (5), 2,3-디히드로퀘르세틴 (6), 신남산 (7), 캄페롤 7-O-글루코피라노사이드 (8), 자타로사이드-A (9), 4-O-글루코피라노실시나핀산 (10), 이소람네틴 3-O-루티노실-4'-O-β-D-글루코사이드 (11), 이소람네틴 3-O-(2,6-디람노실)글루코사이드 (12), 이소람네틴 3-O-루티노사이드(nacissin) (13), 2,3-디히드로캄페롤 (14), 퀘르세틴 3'-O-β-D-글루코사이드 (15), 퀘르세틴 3-O-메틸 에테르 (16), 이소람네틴 3-O-네오헤스페리도사이드 (17), 및 n-부틸-β-D-프럭토피라노사이드 (18)로 이루어진 군으로부터 선택된 활성물질이 포함된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 이소람네틴-3-O-(6"-O-E-페루로일)네오헤스페리도사이드인 화합물.
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